KR101795655B1 - 어류부산물을 이용한 의료용 마린콜라겐과 이의 제조방법 - Google Patents
어류부산물을 이용한 의료용 마린콜라겐과 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 어류부산물을 이용한 의료용 마린콜라겐과 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 어류부산물인 어피로부터 추출되어 창상치료 효과를 갖는 의료용 마린콜라겐과 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 어류부산물을 이용한 의료용 마린콜라겐은 어류 부산물인 어피로부터 추출되며, 창상치료 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 어류부산물을 이용한 의료용 마린콜라겐은 어류 부산물인 어피로부터 추출되며, 창상치료 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 어류부산물을 이용한 의료용 마린콜라겐과 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 어류부산물인 어피로부터 추출되어 창상치료 효과를 갖는 의료용 마린콜라겐과 이의 제조방법에 관한 것이다.
콜라겐은 동물 체내에 가장 풍부하게 존재하는 단백질로서 체단백질의 약 30% 이상을 차지하며, 최소 19종류 (Type Ⅰ-ⅩⅨ) 이상인 것으로 밝혀져 있다(Nakamura, Y.N. et al., Relationship among collagen amount, distribution and architecture in the M. Longissimus thoracis and M. pectoralis profundus from pigs. Meat Science, 64, pp 43-50, 2003). 또한, 콜라겐은 동물의 결합조직의 주요 단백질이며, 조직이나 장기를 지탱하게 하고 체표를 둘러싸고 있어 체형을 유지시키는 역할을 한다. 특히 생체에서 피부, 연골, 뼈 등의 결합조직의 주요한 구성성분으로 40%는 피부, 20%는 뼈와 연골, 그 외 혈관과 내장 등 전신에 넓게 분포되어 있다.
콜라겐은 2중 나선구조를 하고 있는 근원섬유단백질과는 달리 3중 나선구조로, 그 직경이 약 14~15 nm, 길이는 280~300nm, 평균 분자량은 약 300KDa이며(Lehninger, A.L. Biochemistry, 2nd ed., pp.145, 1975), (Gly-X-Y)n과 같은 규칙적인 형태의 아미노산 배열을 가지며 섬유상 단백질의 기본단위 분자인 트로포콜라겐(tropocollagen) 분자 내 또는 트로포콜라겐(tropocollagen) 분자 간의 공유결합성 교차결합(crosslinking)에 의해 물리적, 생물학적으로 안정한 구조를 형성하고 있다(McClain, P.E. et al., Amino acid composition and cross-linking characteristics of collagen intramuscular connective tissue of striated muscle(Bos taurus). International Journal of Biochemistry, 2(7), pp 121-124, 1971).
콜라겐은 예전부터 피혁이나 젤라틴의 원료로서 응용되어 왔고 최근에는 그 응용분야가 더욱 다양해지고 있다. 식품 산업에서는 가식성 케이징(casing) 원료로 소세지(sausage), 살라미(salami) 등 육의 포장재에 이용되고 있다. 의약품에 응용되는 콜라겐은 화상이나 상처에 의해 손상된 피부에 대해 치유 효과가 있는 것으로 보고되고 있다(Jeyanthi, R. et al., Solid tumour chemotherapy using implantable collagen-poly (HEMA) hydrogel containing 5-fluorouracil. Journal of Pharmacy & Pharmacology, 43, pp.60-62, 1991). 이처럼 콜라겐은 식품, 의약품의 기능성 소재로 이용되고 있을 뿐만 아니라 피부의 보습성을 높이는 기능이 있어 화장품의 기초 재료 등 다양한 분야에 널리 이용되고 있다.
최근의 여러 논문을 통하여 단백질 가수분해물로부터 얻어진 펩타이드가 주름 개선, 보습 증진, 탄력 증가와 특정 피부 효능을 나타낼 수 있는 잠재적인 소재로 활용되고 있으며, 대표적인 것이 콜라겐 가수분해물이다.
콜라겐 펩타이드라는 명칭으로 불리는 콜라겐 가수분해물은 돈피, 어류의 비늘 등에서 고분자 콜라겐을 추출한 후, 효소 분해 등의 후처리 과정을 통해 가수분해시켜 펩타이드 형태로 저분자화시킨 것을 말하며 최근에는 분자량을 1,000~5,000 정도까지 낮춘 콜라겐 제품들이 판매되고 있다.
한편, 현재까지 어피부산물은 음식물쓰레기로 분류되어 일반음식물과 같이 퇴비로 대부분 활용되었다. 건조한 어피는 단백질 및 유용물질이 90%이상이어서 활용도가 매우 높아 콜라겐 추출, 화장품, 건강보조식품, 접착제 등 다양하게 이용할 수 있다. 근래 콜라겐을 이용한 건강보조제, 화장품 등 다양한 상품이 상용화되고 있으나 많은 부분 수입에 의존하고 있다.
국내 1인당 수산물소비가 세계 1위인 일본과 앞뒤를 다투는 상황에서 점차 증가하는 어피부산물의 활용은 수입대체 및 양질의 수산단백질, 콜라겐의 공급으로 경제적 상승효과 및 친환경적 산업개발에 매우 적합하다.
또한, 콜라겐, 알부민, 미오신, 엘라스틴 등 다양한 고분자 단백질을 다량으로 함유하고 있어, 고품질의 콜라겐으로 활용이 가능하며, 어피 부산물의 단백질원으로서 이용은 생선회의 소비가 높은 국내에서 수거가 용이하며, 국내 해산어 양식도 꾸준히 이루어지고 있는 만큼 안정된 수량 확보를 기대할 수 있어 어류부산물의 유효이용 가능성에 대한 평가가 절실한 상황이다.
본 발명은 상기의 문제점을 개선하고자 창출된 것으로서, 어류 가공시 발생하는 어류부산물인 어피로부터 추출되어 창상치료 효과를 갖는 의료용 마린콜라겐과 이의 제조방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 어류부산물을 이용한 의료용 마린콜라겐은 어류 부산물인 어피로부터 추출되며, 창상치료 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.
그리고 상기의 목적을 달성하기 위한 어류부산물을 이용한 의료용 마린콜라겐의 제조방법은 어류 부산물인 어피를 건조시키는 건조단계와; 건조된 상기 어피를 분쇄하여 어피분말을 수득하는 분쇄단계와; 상기 어피분말로부터 콜라겐을 분리하는 분리단계;를 포함하고, 상기 분리단계는 a)상기 어피분말에 수산화나트륨 용액을 가하여 비콜라겐성 단백질이 제거된 알칼리잔사를 수득하는 단계와, b)상기 알칼리잔사에 초산용액을 가하여 교반한 후 원심분리기로 상등액을 분리하여 산가용화 콜라겐을 추출하는 단계와, c)상기 산가용화 콜라겐에 펩신을 가하여 교반한 후 원심분리기로 상등액을 분리한 다음 염화나트륨 용액을 가하여 침전시킨 침전물을 증류수로 투석하여 펩신 가용화 콜라겐을 추출하는 단계를 포함하며, 창상치료 효과를 갖는 것을 특징으로 한다.
상기 어류는 넙치, 우럭, 농어, 참돔 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
상기 분리단계 후 펩신가용화 콜라겐을 20mM Na2HPO4에서 투석하여 펩신을 불활성화시킨 다음 2M 요소를 포함한 50mM 초산에서 투석한 후 이온크로마토그래피를 이용하여 용출시킨 분획을 2M NaCl을 포함한 0.5M 초산용액으로 투석하여 회수한 다음 증류수로 투석 후 동결건조시키는 정제단계;를 더 포함한다.
상기 건조단계는 상기 어피를 수산화나트륨 용액에 혼합하여 6 내지 12시간 동안 교반하여 어피에 부착된 비늘을 탈리시킨 후 건조시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 어류로부터 분리한 어피를 저온에서 건조시켜 수분을 제거한 후 분말상태로 가공하여 마린 콜라겐을 추출함으로써 어피의 변질을 방지함과 동시에 콜라겐의 열변성을 방지하고 추출수율을 증대시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 저분자화된 콜라겐 펩타이드가 아닌 고분자의 콜라겐 구조가 그대로 유지되는 마린 콜라겐을 함유하여 창상치료 효과를 갖는 의료 용도의 마린콜라겐을 제공할 수 있다.
도 1은 동결건조한 넙치 어피의 전자현미경 사진이고,
도 2는 4종 어류의 등쪽 피부조직을 나타내는 사진이고,
도 3은 4종 어류의 배쪽 피부조직을 나타낸 사진이다.
도 4 및 도 5는 어피 내 산가용화 콜라겐(ASC)의 비율을 측정한 결과이고,
도 6은 넙치 어피로부터 분리한 산가용화 콜라겐(ASC)의 열변성온도를 측정한 결과이고,
도 7 내지 도 10은 각 어종별 어피 및 어피로부터 추출한 RS-AL, ASC의 SDS-PAGE의 분석결과이고,
도 11은 펩신가용화 콜라겐으로부터 분리한 고순도 마린콜라겐의 SDS-PAGE 의 분석결과이고,
도 12는 창상부위의 조직병리학적 검사 결과를 나타낸 사진이고,
도 13 내지 도 16은 4종 어류로부터 분리한 고순도 콜라겐의 납, 비 소, 일반생균수, 대장균, 진균수에 대한 조사 결과이다.
도 2는 4종 어류의 등쪽 피부조직을 나타내는 사진이고,
도 3은 4종 어류의 배쪽 피부조직을 나타낸 사진이다.
도 4 및 도 5는 어피 내 산가용화 콜라겐(ASC)의 비율을 측정한 결과이고,
도 6은 넙치 어피로부터 분리한 산가용화 콜라겐(ASC)의 열변성온도를 측정한 결과이고,
도 7 내지 도 10은 각 어종별 어피 및 어피로부터 추출한 RS-AL, ASC의 SDS-PAGE의 분석결과이고,
도 11은 펩신가용화 콜라겐으로부터 분리한 고순도 마린콜라겐의 SDS-PAGE 의 분석결과이고,
도 12는 창상부위의 조직병리학적 검사 결과를 나타낸 사진이고,
도 13 내지 도 16은 4종 어류로부터 분리한 고순도 콜라겐의 납, 비 소, 일반생균수, 대장균, 진균수에 대한 조사 결과이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 어류부산물을 이용한 의료용 마린콜라겐과 이의 제조방법에 대하여 구체적으로 설명한다.
본 발명의 마린콜라겐은 어류 부산물인 어피로부터 추출된다. 본 발명의 마린콜라겐은 우수한 창상치료 효과를 가지므로 의료용으로 사용할 수 있다. 본 발명의 마린콜라겐은 창상치료를 위한 약학조성물로 제공될 수 있다.
창상치료를 위한 약학조성물은 마린콜라겐을 유효성분으로 함유할 수 있다. 이러한 약학조성물은 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다.
이를 위한 약학조성물은 마린콜라겐에 약학적으로 허용가능한 적절한 담체, 부형제 및 희석제 등을 첨가하여 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 유화제, 시럽제와 같은 경구제제, 주사제, 흡입제, 패치제 등의 형태로 제형화하여 사용할 수 있음은 물론이다. 이 경우 약학 조성물 총 중량에 대하여 마린콜라겐을 0.01 내지 40중량% 함유할 수 있다.
경구 투여용으로 제조하는 경우, 예를 들어 결합제(예: 예비 젤라틴화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈, 하이드록시프로필 메틸셀루로즈 등); 충전제(예: 락토즈, 미세결정성 셀루로즈, 인산 칼슘 등); 윤활제(예: 마그네슘 스테아레이트, 활석, 실리카 등), 붕해제(예: 감자 전분, 나트륨 전분 글리콜레이트 등); 또는 습윤제(예: 나트륨 라우릴 설페이트 등)와 같은 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하여 제조될 수 있다. 대표적으로는 고체 투여형인 과립제, 산제, 정제, 캡슐제, 등의 형태이며, 정제 또는 캡슐제는 이 기술 분야에 알려진 방법에 의해 코팅될 수 있다.
경구 투여용 액체 제제는 예를 들어 용액, 시럽, 에멀젼, 또는 현탁액 등의 형태를 취할 수 있고, 사용 전에 물 또는 다른 적절한 비히클과 함께 구성되기 위한 건식 생성물로서 존재할 수 있다.
이러한 액체 제제는, 임의로 약제학적으로 허용되는 첨가제, 예를 들어 현탁화제(예: 소르비톨 시럽, 메틸셀루로즈, 하이드록시-프로필 메틸셀루로즈, 수소화 식용성 지방 등); 유화제(예: 레시틴, 아라비아 검 등); 비수성 비히클(예: 알몬드 오일, 오일성 에스테르, 에틸 알콜 등); 방부제(예: 메틸 또는 프로필 p-하이드록시벤조에이트, 소르브산 등)를 추가적으로 포함할 수 있으며 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 감미료는 바람직하게는 적어도 하나의 감미료, 예를 들어 사카린, 소디움 사카린, 칼슘 사카린, 아스팔탐, 아세설팜 포타시움, 소디움 사이클라메이트, 알리탐, 디하이드로찰콘 감미료, 모넬린, 스테비오시드 또는 슈크랄로즈(4,1',6'-트리클로로-4,1',6'-트리데옥시갈락토슈크로즈), 임의의 벌크 감미료 (예: 소르비톨, 만니톨, 프럭토즈, 슈크로즈, 말토즈, 이소몰트, 글루코즈, 수소화 글루코즈시럽, 크실리톨, 카라멜 또는 꿀 등), 바람직하게는 사카린, 소디움 사카린, 칼슘 사카린, 및 임의의 벌크 감미료(예: 소르비톨, 만니톨, 프럭토즈 등을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 가령, 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 마린콜라겐은 어류 부산물인 어류의 껍질(어피)로부터 추출된다.
본 명세서에서 '어류'는 척추동물문의 연골어강, 경골어강, 먹장어강, 두갑강, 조기강을 통틀어 이르는 의미이다. '껍질'은 어류의 몸의 겉을 싸고 있는 외피를 뜻하며, 피부와 동일한 의미이다. 따라서 껍질은 어류의 상피(epithelium), 진피(corium) 조직을 포함하며, 표피가 변형된 비늘 등을 포함한다.
어피는 지질, 회분 및 색소 등이 일부 함유되어 있으나, 콜라겐을 주성분으로 한다. 이러한 콜라겐은 구조 단백질의 일종으로, 일정 온도 이상의 열을 가하게 되면 변성된다. 따라서 어피의 주성분인 콜라겐을 이용을 극대화하기 위해 콜라겐의 변성온도 미만으로 가공처리하는 것이 바람직하다.
본 발명에 적용된 어피는 모든 어류의 껍질이 적용될 수 있으나, 바람직하게는 넙치, 우럭, 농어, 참돔 중에서 선택된 어느 하나이다. 4종류의 어류는 소비가 많아 상대적으로 어피의 공급이 용이하다.
본 발명의 일 실시 예에 따른 어류부산물을 이용한 의료용 마린콜라겐의 제조방법은 어류 부산물인 어피를 건조시키는 건조단계와, 건조된 상기 어피를 분쇄하여 어피분말을 수득하는 분쇄단계와, 상기 어피분말로부터 콜라겐을 분리하는 분리단계;를 포함한다. 이하, 단계별로 살펴본다.
1. 건조단계
먼저 어피를 준비한다. 어류로 자연산 내지 양식산 모두 이용 가능하다. 껍질은 깨끗한 물로 2 내지 3회 정도 씻어 어피에 묻은 각종 이물질이나 혈분 등을 제거한다.
어피를 세척한 다음 분쇄하여 건조시킨다. 바람직하게 분쇄 전 어피에 붙은 비늘을 제거하는 처리과정을 거칠 수 있다. 이를 위해 세척한 어피를 0.1M 수산화나트륨 용액에 혼합하여 6 내지 12시간 동안 교반한다. 수산화나트륨 용액과 교반하게 되면 생선종류에 따라 다소 차이가 있으나 80 내지 90%의 비늘이 제거될 수 있다.
비늘을 제거하지 않고 어피를 분쇄하게 되면 비늘로 인하여 분쇄기 토출구가 막히는 현상이 발생하여 분쇄작업시 많은 시간이 소요될 뿐만 아니라 막힘현상에 기인한 분쇄물 압력 증가로 분쇄기 토출부 부품이 파손된 현상이 일어나는 등 여러가지 문제점이 발생한다. 하지만, 본 발명은 수산화나트륨 용액을 이용하여 비늘을 매우 용이하게 제거함으로써 껍질 분쇄시 분쇄기 토출부의 막힘현상이 없을 뿐만 아니라 막힘현상에 의한 분쇄기 부품 파손 현상이 발생하지 않는다. 그리고 비늘을 제거하기 위한 수작업을 생략할 수 있어서 제조시간을 단축하고 비용 및 인력을 절감할 수 있다.
비늘을 분리한 후 다시 물로 세척한 다음 수분을 제거하기 위해 건조시킨다. 콜라겐의 추출수율을 증대시키고 변질 방지 및 분쇄를 위해 건조시킨다. 건조단계에서 어피는 수분 함량 7중량% 미만, 바람직하게 2 내지 5중량%로 건조시킨다. 건조방식으로 동결건조 및 열풍건조 방식 등을 적용할 수 있다. 바람직하게는 콜라겐의 변성을 방지하기 위해 동결건조(freeze drying, FD) 방식을 이용한다.
동결건조 방법으로 -50 내지 -40℃의 온도에서 10 내지 20시간 어피를 급속동결시킨 다음, 0.1 내지 0.5torr의 진공도를 가진 동결건조기에서 약 -40℃에서 48시간 동안 건조시킨다. 이외에도 식품을 제조하는 데 있어서 적용되는 통상적인 동결건조법을 적용할 수 있음은 물론이다.
어피를 동결건조시키는 경우 동결된 상태에서 승화에 의하여 수분이 제거되기 때문에 건조된 제품은 가벼운 다공성 구조를 가지며 모양과 크기도 원래의 상태를 유지하고, 열을 가하지 않고 저온에서 처리되기 때문에 고온의 열풍건조에서 일어나는 가용성 성분의 이동, 비효소적 갈변, 단백질의 변성 등이 거의 일어나지 않는다.
열풍건조의 경우 30 내지 80℃의 열풍으로 어피를 건조시킬 수 있다. 열풍건조시 콜라겐의 변성을 최대한 방지하기 위해서 열풍의 온도는 65℃이하, 바람직하게 40 내지 60℃이다. 어피에 함유된 콜라겐은 분리된 상태에 비해 변성온도가 높다.
2. 분쇄단계
건조된 어피는 분쇄기를 이용하여 적당한 크기로 분쇄하여 어피분말을 수득한다. 가령 50 내지 150메쉬 입도 크기로 분쇄할 수 있다.
3. 분리단계
어피분말의 수득 후 어피분말로부터 콜라겐을 분리한다.
분리단계는 일 예로 a)상기 어피분말에 수산화나트륨 용액을 가하여 비콜라겐성 단백질이 제거된 알칼리잔사를 수득하는 단계와, b)상기 알칼리잔사에 초산용액을 가하여 교반한 후 원심분리기로 상등액을 분리하여 산가용화 콜라겐을 추출하는 단계와, c)상기 산가용화 콜라겐에 펩신을 가하여 교반한 후 원심분리기로 상등액을 분리한 다음 염화나트륨 용액을 가하여 침전시킨 침전물을 증류수로 투석하여 펩신 가용화 콜라겐을 추출하는 단계로 이루어진다.
어피분말에 수산화나트륨 용액을 가하여 비콜라겐성 단백질이 제거된 알칼리잔사를 수득하는 단계는 구체적으로 다음과 같다.
어피분말과 수산화나트륨 용액을 1:5 내지 10의 중량비로 혼합한 다음 실온(20~25℃)에서 12 내지 24시간 동안 교반한 후 원심분리기를 이용하여 비콜라겐성 단백질이 제거된 알칼리잔사를 수득할 수 있다.
그리고, 알칼리잔사에 초산용액을 가하여 산가용화 콜라겐을 추출하는 단계는 구체적으로 다음과 같다.
알칼리잔사를 증류수로 세척한 다음 초산용액을 가해 콜라겐을 추출한다. 알칼리잔사와 초산용액을 1:5 내지 10의 중량비로 혼합한 다음 실온(20~25℃)에서 12 내지 24시간 동안 교반한 후 원심분리기를 이용하여 상등액을 분리하여 산 가용화 콜라겐을 수득한다.
그리고, 산가용화 콜라겐에 펩신을 가하여 펩신 가용화 콜라겐을 추출하는 단계는 구체적으로 다음과 같다.
산가용화 콜라겐에 펩신을 가하여 10 내지 20시간 동안 교반한 후 원심분리기로 상등액을 분리한 다음 2M의 염화나트륨 용액을 가하여 침전시킨 침전물을 증류수로 투석하여 펩신 가용화 콜라겐을 얻을 수 있다.
4. 정제단계
정제단계는 생략하거나 추가로 진행할 수 있다.
정제단계를 통해 펩신 가용화 콜라겐으로부터 고순도의 마린 콜라겐을 제조할 수 있다.
펩신가용화 콜라겐은 20mM Na2HPO4에서 투석하여 펩신을 불활성화시킨 다음 2M 요소를 포함한 50mM 초산용액(pH 4.8)에 대해 투석한 후 이온크로마토그래피를 이용하여 분획을 용출시킨다. 가령, 인산셀률로오스(P11, Whatman, Maidstone, UK)를 충진한 컬럼에서 0~600mM NaCl의 linear gradient(60ml/h)로 정제를 진행하고, 230nm에서 용출된 분획을 2.0M NaCl을 포함한 0.5M 초산용액으로 투석하여 회수한 다음 증류수로 투석, 동결건조하여 고순도 마린콜라겐을 얻는다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 이는 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리 범위를 하기의 실험예로 한정하는 것은 아니다.
<어피의 특성>
넙치, 우럭, 농어, 참돔으로부터 분리한 어피를 대상으로 이화학적 및 생화학적 특성을 규명하였다.
1. 일반성분 분석
4종류의 어피에 대해 일반성분을 분석하여 건중량에 대한 함량(중량%)을 하기 표 1에 나타냈다. 각 어종별 어피를 약 1cm 크기로 자른 후, 상압가열건조방식의 수분측정기(HR 73 halogen moisture analyzer, Switzerland)를 이용해 수분을 측정하였으며, 세절된 어피는 dry oven(Jesco, Japan) 60℃에 48시간 건조시켜, 고속분쇄기 (ZM-1000, Retch co., Japan)로 분쇄하여 AOAC법(1995)에 따라 일반성분을 분석하였다. 조단백질은 Kjeldahl 질소정량법(N×6.25)을 이용한 자동 분석기(KJELTEK auto sampler system 1035 analyzer, Switzerland)를, 조지방은 자동 추출기(Soxtec 2050 auto extraction unit, Switzerland)를 이용하여 ether추출법으로 분석하였고, 조회분은 550℃에서 태우는 직접회화법(EYELA Electric furnace TMF-3100, Japan)을 사용하였다.
| 구 분 | 수 분(%) | 조단백질(%) | 조지방(%) | 회분(%) |
| 넙 치 | 81.18±0.97 | 87.51±3.54 | 16.07±0.85 | 1.77±0.43 |
| 우 럭 | 78.87±0.46 | 84.47±2.32 | 6.11±0.88 | 8.90±1.69 |
| 농 어 | 81.18±1.85 | 73.75±1.03 | 24.58±1.99 | 1.94±0.98 |
| 참 돔 | 77.11±1.06 | 94.43±0.71 | 5.22±1.45 | 1.07±0.47 |
주요 해산양식어류 중 수산시장에서 주로 소비되어 배출되는 넙치, 우럭, 농어, 참돔 어피의 일반성분 분석 결과는 상기 표 1에 나타내었다. 각 어종별 어피의 수분함량은 77.11~81.18%를 나타내었으며, 조단백질에서 참돔 어피가 건중량 기준으로 94.43±0.71%로 가장 높은 값을 나타내었으며 넙치, 우럭, 농어 어피가 각각 87.51±3.54, 84.47±2.32, 73.75±1.03%를 나타내어 농어 어피가 가장 낮은 값을 보였다.
조지방에서 농어 어피가 24.58±1.99%로 가장 높았으며, 참돔 어피가 5.22±1.45%로 가장 낮은 값을 보였고, 우럭, 넙치 어피는 각각 6.11±0.88, 16.07±0.85%를 나타내었다. 회분에서는 우럭 어피가 8.90±1.69%로 넙치, 농어, 참돔 어피의 1.07~1.94% 보다 상대적으로 높은 값을 나타내었다.
2.아미노산 분석
구성아미노산을 분석하기 위해 시료 0.5g을 18ml test tube에 칭량하여 6N HCl 3ml를 가한 다음 진공펌프를 이용하여 test tube를 sealing하였다.
sealing한 test tube는 121℃로 setting된 heating block에 24시간 동안 가수분해시킨다. 가수분해가 끝난 시료는 50℃, 40 psi의 rotary evaporator로 산을 제거한 후 Sodium loading buffer로 10ml 정용한 다음, 이 중 1ml를 취하여 membrane filter로 여과하여 아미노산 분석기로 정량분석하여 그 결과를 하기 표 2에 나타냈다.
| 구성아미노산 (mg/100g) |
넙 치 | 우 럭 | 농 어 | 참 돔 |
| Asp | 3.25 | 3.46 | 3.23 | 3.21 |
| Thr | 1.42 | 1.40 | 1.53 | 1.48 |
| Ser | 2.24 | 2.59 | 2.01 | 2.36 |
| Glu | 5.32 | 5.38 | 5.58 | 4.42 |
| Pro | 5.85 | 5.43 | 6.80 | 5.91 |
| Gly | 11.07 | 10.59 | 11.15 | 11.41 |
| Ala | 4.72 | 4.29 | 5.06 | 4.99 |
| Cys | 0.15 | 0.19 | 0.11 | 0.20 |
| Met | 1.34 | 1.48 | 1.34 | 1.25 |
| Val | 1.15 | 1.01 | 1.09 | 1.15 |
| Ile | 0.77 | 0.83 | 0.81 | 0.60 |
| Leu | 1.66 | 1.70 | 1.77 | 1.45 |
| Tyr | 0.45 | 0.46 | 0.48 | 0.45 |
| Phe | 1.35 | 1.36 | 1.47 | 1.31 |
| His | 1.02 | 1.11 | 1.08 | 9.34 |
| Lys | 1.96 | 1.97 | 2.03 | 1.99 |
| Amo | 1.63 | 1.90 | 2.17 | 2.05 |
| Arg | 4.24 | 4.09 | 4.54 | 4.24 |
| Total | 49.61 | 49.24 | 52.24 | 57.81 |
| *EAA | 14.91 | 14.95 | 15.66 | 22.81 |
*EAA(필수아미노산):Thr, Val, Met, Ile, Leu, Phe, His,Lys, Arg
상기 표 2의 결과를 살펴보면, AOAC(1990)에 따라 아미노산 분석기를 이용하여 구성아미노산을 분석한 결과 주요 해산양식어인 넙치, 우럭, 농어, 참돔 어피의 구성아미노산 총량에서 참돔 어피가 57.81g/100g로 가장 높은 값을 나타내었으며, 농어의 어피는 52.24g/100g이었고, 넙치 49.61g/100g, 우럭 49.24g/100g을 나타내 참돔, 농어, 넙치, 우럭 순으로 나타났다.
Glycine, proline이 어류에 있어 비필수아미노산으로 분류되지만 콜라겐 구조(Gly-X-Y)유지에 중요한 요소로 농어, 넙치, 우럭, 참돔 순으로 각각 구성아미노산 함량이 34.37%, 34.11%, 32.53%, 29.97%로 나타났다. 필수아미노산(Essential amino acid, EAA)에서 참돔 어피가 22.81g/100g으로 가장 높았으며, 농어, 우럭, 넙치 어피 순이었으며 각각 15.66, 14.95, 14.91g/100g으로 참돔을 제외하고 비교적 큰 차이를 보이지 않았다.
4.조직학적 특성조사
효율적 콜라겐 추출에 적합한 재료를 조사하기 위하여 시료는 모두 1㎏ 이상의 주요 양식대상 어종(넙치, 우럭, 농어, 참돔)에서 조직학적 특성을 조사하였으며, 조직표본은 어피를 1cm2를 절취하여 Drury and Wallington (1980)의 방법에 따라 제작하였다.
광학현미경 관찰을 위한 조직표본을 제작하기 위해 살아있는 어류로부터 피부를 채집 즉시 가로, 세로 1cm를 절취하였으며, 절취한 시료들은 즉시 Drury and Wallington(1980)의 방법에 따라 aqueous Bouin′s fluid(포화 picric acid solution(=75㎖, formaldehyde = 25㎖, acetic acid 5㎖)에 18시간 동안 고정하고, 36시간 동안 흐르는 물에 수세하였다. 그 후 70%부터 100%까지 각각 40분 동안 ethanol 탈수과정을 순차적으로 진행한 후 xylene에 의한 치환 과정(xylene I, II, III; 각각 40분씩)을 거쳐서 paraplast(McCormick, USA)에 포매하였다. 포매된 시료는 microtome (RM2235, Leica, Germany)을 이용하여 4~6㎛ 두께로 연속 절편하여 slide glass에 부착하였다.
광학현미경 표본제작에 사용한 염색 및 반응에 있어서 기관계의 구조와 세포형태를 관찰하기 위해 Mayer's hematoxylin-eosin(H-E) 염색을 실시하였고, 조직 및 세포 함유물의 성분은 Masson's trichrome 염색으로 확인하였다. 또한 당 점액 성분을 관찰하기 위해 alcian blue-periodic acid and Schiff's solution(AB-PAS, pH2.5) 반응을 실시하였다. H-E 염색은 xylene에서 파라핀이 제거된 절편을 단계별로 수세한 후 Mayer's hematoxylin과 0.5% eosin으로 비교염색을 하였다. 염색이 끝난 절편은 단계별 탈수 및 xylene을 이용한 투명화 과정을 거쳐 Canada balsam으로 봉입하였다. Masson's trichrome 염색은 xylene에서 파라핀이 제거된 조직을 100, 90, 80, 70% alcohol로 단계별 수세한 후 Weigert's iron hematoxylin (10분) → Washing (20~30분) → Beibrich scarlet-acid fuchsin(15분) → Phosphomolybdic acid -phosphotuncstic acid (10~15분) → Aniline blue (5~10분) → 1% Acetic water(3~5분)의 순으로 진행하였으며, 염색이 끝난 절편들은 ethanol을 이용한 단계별 탈수 및 xylene을 이용한 투명화 과정을 거쳐 Canada balsam으로 봉입하였다. AB-PAS (pH 2.5) 반응은 xylene에서 파라핀을 제거한 절편을 90% alcohol로 수세 한 후 periodic acid에 5분, Schiff's solution에 10분 그리고 sodium sulfite water (Ⅰ~Ⅲ)에 각각 10분씩 반응시킨 후 Mayer's hematoxylin에 5분간 염색하였다. 반응이 끝난 절편은 ethanol을 이용한 단계별 탈수 및 xylene을 이용한 투명화 과정을 거쳐 Canada balsam으로 봉입하였다. 완성된 조직표본들은 광학현미경(CX31, Olympus, Japan)으로 관찰하였으며, Image Measurement System(FOCUS technology, 205)을 이용하여 각 어류의 피부 두께를 조사하였다.
도 2는 4종 어류의 등쪽 피부조직을 나타내는 사진이고, 도 3은 4종 어류의 배쪽 피부조직을 나타낸 사진이다.
도 2에서 각 기호의 의미는 다음과 같다.
A: 넙치, HE stain, A-1; AB-PAS(pH 2.5) reaction, A-2; Masson's trichrome stain. B: 우럭, HE stain, B-1; AB-PAS(pH 2.5) reaction, B-2 and 3; Masson's trichrome stain. C: 농어, HE stain, C-1; AB-PAS(pH 2.5) reaction, C-2 and 3; Masson's trichrome stain. D: 참돔, HE stain, D-1; AB-PAS(pH 2.5) reaction, D-2 and 3; Masson's trichrome stain. Cc: 곤봉상세포(club cell), Cf: 교원섬유(collagen fiber), Dl: 진피층(dermal layer), El: 상피층(epidermal layer), Mc: 점액세포(mucous cell), Mf: 근섬유(muscle fiber), Ml: 근육층(muscle layer), S: 비늘(scale).
도 2를 참조하면, 4종 경골어류(넙치, 우럭, 농어, 참돔)의 등쪽 피부조직은 모두 외부로부터 상피층과 진피층으로 이루어져 있었다(A, B, C and D).
4종 경골어류 등쪽의 피부상피층은 지지세포들 외에 점액세포, 곤봉상 세포 등의 분비세포들이 분포하고 있었으며, 넙치의 점액세포의 점액성상은 중성의 점액다당류로 확인되었고(A-1), 농어의 경우 주로 산성의 점액다당류를 함유하고 있는 것으로 확인되었다(C-1).
우럭과 참돔의 경우는 산성과 중성의 점액다당류를 함유하고 있는 것으로 관찰되었다(B-1, D-1). 진피층과 근육층은 4종 경골어류 모두 잘 발달된 교원질섬유와 근섬유들로 이루어져 있었다(도 2).
진피는 콜라겐섬유가 다량 분포했으며, 넙치, 우럭, 점농어, 참돔 어피의 등과 배의 진피 내에서 모두 collagen 섬유층이 확인되었고, 특히 넙치와 참돔은 다른 어종에 비해 피부조직이 두껍고 진피층 비율도 각각 약 94%, 97%를 나타내어 4종 어피 중 가장 우수한 재료원적 특성이 기대되었다.
도 3에서 각 기호의 의미는 다음과 같다.
A: 넙치, HE stain, A-1; AB-PAS(pH 2.5) reaction, A-2; Masson's trichrome stain. B: 우럭, HE stain, B-1; AB-PAS(pH 2.5) reaction, B-2 and 3; Masson's trichrome stain. C: 농어, HE stain, C-1; AB-PAS(pH 2.5) reaction, C-2 and 3; Masson's trichrome stain. D: 참돔, HE stain, D-1; AB-PAS(pH 2.5) reaction, D-2 and 3; Masson's trichrome stain. Cc: 곤봉상세포(club cell), Cf: 교원섬유(collagen fiber), Dl: 진피층(dermal layer), El: 상피층(epidermal layer), Mc: 점액세포(mucous cell), Mf: 근섬유(muscle fiber), Ml: 근육층(muscle layer), S: 비늘(scale).
도 3을 참조하면, 4종 경골어류(넙치, 우럭, 농어, 참돔)의 배쪽 피부계는 모두 외부로부터 상피층과 진피층으로 이루어져 있었다(A, B, C and D). 4종 경골어류 배쪽의 피부상피층은 지지세포들 외에 점액세포, 곤봉상 세포 등의 분비세포들이 분포하고 있었으며, 넙치의 점액세포 점액성상은 중성의 점액다당류로 확인되었고(A-1), 농어의 경우 주로 산성의 점액다당류를 함유하고 있는 것으로 관찰되었다(C-1).
우럭과 참돔의 경우는 산성과 중성의 점액다당류를 함유하고 있는 것으로 관찰되었다(B-1, D-1). 진피층과 근육층은 4종 경골어류 모두 잘 발달된 교원질섬유와 근섬유들로 이루어져 있었다(도 3).
배쪽 피부조직 역시 참돔과 넙치가 가장 높은 비율을 보였으나 참돔 약 92%, 넙치 약 92%, 농어 약 91%로 우럭을 제외하고 모두 90% 이상의 진피층 비율을 보였다. 우럭은 등과 배쪽 피부조직의 진피층이 비교적 낮은 약 89%, 87% 였으나 어종별 특성에 의한 것으로 콜라겐 추출에 적합하지 않은 것으로 보기는 힘들다고 판단된다.
4종의 어류의 피부두께는 하기 표 3과 같다.
| 구분 | 부위 | 상피~진피층(㎛) | 상피층(㎛) |
| 넙 치 |
등쪽 | 862.37±21.35 | 48.64±2.67 |
| 배쪽 | 578.38±8.27 | 45.10±1.55 | |
| 우 럭 |
등쪽 | 508.11±6.49 | 75.67±3.15 |
| 배쪽 | 647.29±17.22 | 70.27±3.91 | |
| 농 어 |
등쪽 | 406.76±10.08 | 52.70±2.57 |
| 배쪽 | 675.67±19.87 | 60.66±4.25 | |
| 참돔 |
등쪽 | 875.67±12.68 | 20.27±2.22 |
| 배쪽 | 494.59±22.67 | 39.19±7.38 |
넙치의 등쪽과 배쪽 상피층의 두께는 각각 48.64±2.67㎛, 45.10±1.55㎛였으며, 상피부터 진피층까지의 두께는 등쪽이 862.37±21.35㎛, 배쪽이 578.38±8.27㎛로 상피층에서는 등쪽과 배쪽의 차이가 비교적 낮았으나, 상피부터 진피층까지의 두께는 등쪽이 배쪽보다 상대적으로 높게 나타났다.
우럭의 등쪽과 배쪽 상피층의 두께는 각각 75.67±3.15㎛, 70.27±3.91 ㎛였으며, 상피부터 진피층까지의 두께는 등쪽이 508.11±6.49㎛, 배쪽이 647.29±17.22㎛로 상피층에서는 등쪽과 배쪽의 차이가 비교적 낮았으나 등쪽이 상대적으로 두꺼웠고, 상피부터 진피층까지의 두께는 넙치와 달리 등쪽보다 배쪽이 상대적으로 높게 나타났다.
농어에서는 등쪽과 배쪽 상피층의 두께가 각각 52.70±2.57㎛, 60.66±4.25 ㎛였으며, 상피부터 진피층까지의 두께는 등쪽이 406.76±10.08㎛, 배쪽이 675.67±19.87㎛로 상피층에서는 등쪽과 배쪽의 차이가 넙치, 우럭보다는 높으나 비교적 낮은 차이를 보였고, 상피부터 진피층까지의 두께는 넙치, 조피볼락과 같이 큰 차이를 보였는데 우럭과 같이 배쪽이 두껍게 조사되었다.
참돔의 경우 등쪽과 배쪽 상피층의 두께가 각각 20.27±2.22㎛, 39.19±7.38 ㎛였으며, 상피부터 진피층까지의 두께는 등쪽이 875.67±12.68㎛, 배쪽이 494.59±22.67㎛로 상피층에서 등쪽과 배쪽의 차이가 타 어종보다 높은 차이를 보였고, 상피부터 진피층까지의 두께 역시 큰 차이를 보였다.
콜라겐이 주로 존재하는 상피부터 진피층까지의 두께는 등쪽과 배쪽이 각각 넙치에서 862.37±21.35㎛, 578.38±8.27㎛, 우럭 508.11±6.49 ㎛, 647.29±17.22 ㎛, 농어 406.76±10.08㎛, 675.67±19.87㎛, 참돔 875.67±12.68㎛, 494.59±22.67㎛로 나타나 단일 어종으로 콜라겐을 추출할 때에는 넙치와 참돔이 가장 우수할 것으로 예상됐으며, 우럭, 농어의 순으로 판단되었다.
또한, 방추형 어류인 우럭, 농어와 달리 측편형 어류인 넙치, 참돔에서 상피부터 진피층까지의 높은 두께를 나타내 측편형 어류의 피부조직이 타 어종보다 콜라겐을 추출하는데 적합하다고 추정된다.
<실시예>
4종의 어류로부터 분리된 어피를 세척한 후 -45℃에서 15시간 동안 급속동결시킨 다음 0.5torr의 진공도를 가진 동결건조기에서 -40℃로 48시간 동안 건조시킨 후 분쇄하여 어피 분말을 제조하였다. 그리고 어피 분말에 0.1M의 수산화나트륨 용액을 10배의 중량비로 가한 다음 실온(20℃)에서 16시간 동안 교반한 후 원심분리기를 이용하여 비콜라겐성 단백질이 제거된 알칼리잔사(RS-AL)를 수득하였다.
수득한 알칼리잔사를 증류수로 세척한 다음 0.5M의 초산용액을 10배의 중량비로 혼합한 다음 실온(20℃)에서 16시간 동안 교반한 후 원심분리기를 이용하여 상등액을 분리하여 산가용화 콜라겐(ASC)을 수득하였다. 그리고 산가용화 콜라겐에 펩신(EC 3.4.23.1;crystallized and lyophilized, Sigma, MO)을 가하여 14시간 동안 교반한 후 원심분리기로 상등액을 분리한 다음 2M의 염화나트륨 용액을 가하여 침전시킨 침전물을 증류수로 투석하여 펩신 가용화 콜라겐을 수득하였다.
펩신가용화 콜라겐은 20mM Na2HPO4에서 투석하여 펩신을 불활성화시킨 다음 2M 요소를 포함한 50mM 초산용액(pH 4.8)에서 투석한 후 이온크로마토그래피를 이용하여 인산셀률로오스(P11, Whatman, Maidstone, UK)를 충진한 컬럼에서 0~600mM NaCl의 linear gradient(60 ml/h)로 정제를 진행하고, 230nm에서 용출된 분획을 2.0M NaCl을 포함한 0.5M 초산용액으로 투석하여 회수한 다음 증류수로 투석, 동결건조하여 고순도 마린콜라겐을 얻었다.
1. 어피내 산가용화 콜라겐(acid soluble collagen, ASC) 비율 조사
각 어종별 어피에서 확보된 ASC의 어피 내 비율을 조사하기 위하여, 투석이 완료된 ASC를 1.5㎖ tube에 1㎖ 넣어 동결건조시킨 후 무게를 측정하였고, 1.5㎖ tube 내 동결 건조 전후의 무게 측정과 투석된 ASC내 비율을 조사하여, 다음 식과 같이 어피 내에서 추출된 ASC의 비율을 산출하였다.
S={(Y1×Y2)/X}×100
S: 어피 내 ASC 비율(%)
Y1: 투석 전 염침전물의 중량(g)
Y2: 투석 동결건조한 겔에 대한 ASC 비율(%)
X: 최초 사용한 어피의 습중량(g)
실험결과를 도 4에 나타내었다.
도 4를 참조하면, 넙치, 우럭, 농어, 참돔의 산가용성 콜라겐(ASC)의 비율을 조사한 결과 어피 습중량에서는 참돔이 9.88%로 가장 높았고, 넙치가 8.01±0.19%, 농어가 5.75%이었으며 우럭이 2.69%가장 낮은 값을 나타내었다.
경골어류 4종의 콜라겐 함량을 비교하였을 때 어종별로 큰 차이를 나타내어 조직학적 관찰을 뒷받침해주는 경향을 나타내었으나 우럭이 상대적으로 매우 낮은 값을 나타내어 콜라겐 추출에 있어 적합하지 않을 것으로 판단된다.
SircolTM Soluble Collagen Assay kit(Biocolor, UK)를 이용하여 어피 내 ASC 콜라겐 비율을 분석하였다. 스탠다드 용액의 검량선을 작성하여 분석하고자 하는 시료의 콜라겐 함량을 구하여 도 5에 나타내었다.
Collagen Assay kit를 이용하여 어피 내 콜라겐 함량을 측정한 결과 넙치 9.73%, 우럭 3.46%, 농어 6.96%, 참돔 11.83%로 나타났다.
2. 어피 콜라겐 열변성 안정성 조사
Micro DSC(Setaram, France)를 이용해 넙치 어피로부터 분리한 산가용화 콜라겐에 대한 일정가열비율(0.5℃/1분)로 열변성 온도를 측정하였으며, 이때, 육상척추동물인 쥐의 꼬리힘줄 ASC를 구입하여 동일한 방법으로 열변성온도를 측정하고 어류의 data와 비교분석하여 도 6에 나타내었다.
Micro DSC(Setaram, France)를 이용해 일정가열비율(0.5℃/1분)로 열변성온 도 측정하였고, 동시에 대조구로서 육상척추동물인 쥐의 꼬리힘줄 ASC(Sigma Aldrich, USA)를 구입하여 동일한 방법으로 열변성온도를 측정하고 어류의 data와 비교분석한 결과, 어류 콜라겐(도6; ○, ●)은 육상척추동물인 쥐 콜라겐(도6; ▲)보다 12℃가 낮았다.
낮은 변성온도는 어류 콜라겐의 프로린 히드록실화(proline hydroxylation) 정도가 낮기 때문이라는 것을 시사했다. 또한, 넙치 피부 ASC는 무지개송어 근육 ASC보다 열변성온도가 3.9℃가 높아 열변성에 대한 저항이 높다는 것을 보여 줬다.
3. 분자적 특성조사
구성 아미노산 조사와 SDS-PAGE 분석을 통한 콜라겐 분자적 특성을 분석하였다.
구성 아미노산은 산가용화 콜라겐 0.5g을 18㎖ test tube에 칭량하여 6N HCl 3 ㎖를 가한 다음 진공펌프를 이용하여 test tube를 sealing하였다. Sealing한 test tube는 121℃로 heating block에 24시간동안 가수분해시킨 후, 50℃, 40psi의 rotary evaporator로 산을 제거한 후 Sodium loading buffer로 10㎖ 정용한 다음, 이중 1㎖를 취하여 membrane filter(0.2 ㎕)로 여과하여 아미노산분석기(S-433H, SYKAM GmbH, Germany)로 정량분석하였다. 분석 조건은 column에서 cation separation column(LCA K06/Na)을 사용하였고, column size는 4.6 × 150㎜, column temperature는 57~74℃, buffer의 flow rate는 0.45㎖/min, reagent의 flow rate는 0.25㎖/min 이었으며, 이때 buffer pH range는 3.45~10.85이었고, wavelength는 440㎚과 570㎚이었다.
단백질 분자량을 확인하기 위하여 SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electorphoresis)를 Laemmli(1970)의 방법에 따라 실시 하였다.
각 시료를 Sample buffer(50mM Tris-HCL, pH 7.5; 50% glycerin, 1% SDS, 0.02% bromophenol blue, BPB)에 1㎎/㎖ 농도로 조제하여 vortex시킨 후, 95℃에서 5분간 가열하여 열 변성시킨 후 10분간 실온에서 방냉시켜 시료 를 준비하였다. 준비된 시료는 3% stacking gel과 7.5% separate gel로 구성 된 40% polyacrylamide을 이용하여 7.5% gel을 제조하였으며, 전기영동장치는 Bio-RAD Power Pac Basic(USA)을 사용하여 200V, 35mA/gel의 조건으로 실시하였다. 단백질 band의 염색은 Fairbanks et al.,(1971)에 따라 Coomassie brilliant blue(CBB)와 2-propanol, 초산을 단계적으로 섞은 염색 액을 총 4단계로 준비해, 1단계는 30분, 2~4단계는 각각 2시간씩 실시하였다. 이때 시료의 분자량을 확인하기 위해 사용된 Marker는 SDS-PAGE Molecular Weight Stadards(Bio-rad Laboratirories, High range, USA)를 이용하였다.
각 어종별 SDS-PAGE 결과를 도 7 내지 도 10에 각각 나타내었다. 도 7은 넙치어피 및 넙치어피로부터 추출한 RS-AL, ASC의 SDS-PAGE 패턴이고, 도 8은 우럭 어피 및 우럭 어피로부터 추출한 RS-AL, ASC의 SDS-PAGE 패턴이고, 도 9는 농어 어피 및 농어 어피로부터 추출한 RS-AL, ASC의 SDS-PAGE 패턴이고, 도 10은 참돔 어피 및 참돔어피로부터 추출한 RS-AL, ASC의 SDS-PAGE 패턴이다. 도 7 내지 도 10에서 MP는 마커단백질(maker protein)을 의미한다.
각 어종별 SDS-PAGE 결과 4종 모두가 subunit구조인 α1(I), α2(I)과 그 이량체인 β-chain으로 구성되어 있었고, β-chain 위로 2개의 고분자 밴드가 확인었다. 이것은 모두 전형적인 I형 콜라겐의 SDS-PAGE 패턴을 보였으며, 분자량은 어 피와 RS-AL, ASC 모두 116.2 k보다 약간 위쪽에 α1(I)과 α2(I)가 단백질 band가 형성되어 있음을 확인할 수 있었고, 200k부근에서는 β-chain 단백질 band가 주로 분포되어 있었다.
구성아미노산 분석결과는 하기 표 4와 같다.
| 구성아미노산 (mg/100g) |
넙 치 | 우 럭 | 농 어 | 참 돔 |
| Asp | 4.31 | 4.75 | 4.41 | 4.02 |
| Thr | 1.94 | 1.91 | 2.31 | 1.93 |
| Ser | 3.32 | 4.07 | 3.12 | 2.85 |
| Glu | 7.27 | 7.36 | 7.56 | 7.01 |
| Pro | 10.86 | 10.53 | 12.46 | 10.50 |
| Gly | 17.64 | 17.52 | 18.37 | 17.20 |
| Ala | 7.02 | 6.63 | 7.62 | 7.13 |
| Cys | 0.05 | 0.06 | 0.05 | 0.04 |
| Met | 1.74 | 1.90 | 1.68 | 1.52 |
| Val | 1.35 | 1.33 | 1.49 | 1.38 |
| Ile | 0.80 | 0.72 | 0.74 | 0.71 |
| Leu | 1.85 | 1.71 | 1.83 | 1.80 |
| Tyr | 0.27 | 0.15 | 0.33 | 0.37 |
| Phe | 1.69 | 1.71 | 1.64 | 1.42 |
| His | 0.76 | 0.80 | 0.78 | 0.70 |
| Lys | 2.68 | 2.58 | 2.61 | 2.45 |
| Amo | 1.21 | 1.36 | 1.07 | 1.02 |
| Arg | 5.38 | 5.58 | 5.93 | 5.37 |
| Total | 70.15 | 70.67 | 74.02 | 67.41 |
상기 표 4는 넙치, 우럭, 농어, 참돔의 어피에서 추출된 산가용성 콜라겐(ASC)의 구성아미노산 결과이다.
넙치와 우럭, 농어, 참돔 어피 ASC에서 총 구성아미노산은 70.15g/100g, 70.67g/100g, 74.02g/100g, 67.41g/100g으로 농어의 구성아미노산이 가장 높았으며, 이중 콜라겐의 삼중나선의 영역 내 반복적인 Gly-X-Y 아미노산배열의 특징을 확인할 수 있는 glycine이 각각 17.64g/100g, 17.52g/100g, 18.37g/100g, 17.20g/100g으로 약 25%를 차지하고 있었고, proline이 10.86g/100g, 10.53g/100g, 12.46 g/100g, 10.50g/100g으로 약 15%를 차지하고 있었다.
4. 고순도 마린콜라겐의 분석
펩신가용화 콜라겐으로부터 분리한 고순도 마린콜라겐의 SDS-PAGE 분석결과를 도 11에 나타내었다. 4종 어류의 고순도 마린 콜라겐에서 모두 콜라겐이 검출되었다. 콜라겐은 ASC와 같은 subunit구조인 α1(I), α2(I)과 그 이량체인 β-chain으로 구성되어 있었으며, β-chain 위로 2개의 고분자 밴드가 확인되었다. 도 11에서 MP: marker protein; A: 넙치; B: 우럭; C: 농어; D: 참돔을 의미한다.
콜라겐은 다른 단백질과는 달리 히드록실화(hydroxylation)된 아미노산인 hydroxyproline, hydroxylysine을 포함하고 있으며, 삼중나선영역 부위에는 Gly-X-Y의 반복 아미노산 배열로 구성되어 있는데 X와 Y의 위치에는 proline과 hydroxyproline이 자주 위치하며 glycine, proline, hydroxyproline 함량으로 콜라겐의 유무를 확인할 수 있다.
고순도 마린콜라겐에 대한 glycine, proline, hydroxyproline 등의 함량을 확인하기 위하여 아미노산잔기를 분석한 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
| 구성아미노산 (mg/100g) |
residues | (%) |
| Hydroxyproline | 75 | 8% |
| Asp | 36 | 4% |
| Thr | 36 | 4% |
| Ser | 46 | 5% |
| Glu | 77 | 8% |
| Pro | 84 | 8% |
| Gly | 353 | 35% |
| Ala | 114 | 11% |
| Half-Cys | 0 | 0% |
| Val | 25 | 3% |
| Met | 9 | 1% |
| Ile | 17 | 2% |
| Leu | 22 | 2% |
| Tyr | 2 | 0% |
| Phe | 12 | 1% |
| Hydroxylysine | 9 | 1% |
| Lys | 25 | 3% |
| Histidine | 8 | 1% |
| Arg | 50 | 5% |
| Total | 1,000 | 100% |
상기 표 5를 참조하며, 고순도 마린콜라겐에 대한 glycine, proline, hydroxyproline 등의 함량을 확인하기 위하여 아미노산잔기를 분석한 결과 1,000잔기당 glycine 353(35%), hydroxyproline 75(7%), proline 84(8%), hydroxylysine 9(1%) 등으로 조사되었다.
<마린콜라겐의 창상치유 실험>
1. 인체첩포시험
실시예에서 넙치의 어피로부터 분리한 고순도 마린콜라겐에 대한 안전성을 농도별 인체첩포 시험을 통하여 피부자극을 조사하였다.
피험자 선정은 과거 알레르기성 질환이나 아토피 피부염 등 병력이 없는 건강한 성인 남녀를 대상으로 하였다. 검사 전 최소 일주일 동안 경구 부신피질 호르몬제나 항히스타민제, 항염제를 복용하지 않았으며, 검사 부위에 국소 부신피질 호 르몬제를 바르지 않았다.
인체첩포에 대한 피부자극을 평가하기 위해 국제접촉피부염연구회 (International Contact Dermatitis Research Group: ICDRG)의 판정기준에 따랐다. 첩포 부위인 상완을 70% 에틸알코올로 닦아내고 건조시킨 후 시험물질 이 적용된 patch를 시험부위에 첩포하였다. 24시간 후에 첩포를 제거하고 자극 유무를 조사하였다. 자극 유무는 홍반 없음, 아주 경도의 홍반, 명료한 홍반, 중 증도에서 강한 홍반, 심홍색의 강한 홍반 및 가피형성 등으로 구별하여 평가하였 다.
판정기준은 하기 표 6과 같다.
| 기호 | 판정기준 |
| - | Negative |
| ± | Doubtful or slight reaction and erythema |
| + | Erythema + Induration |
| ++ | Erythema +Induration + Vesicle |
| +++ | Erythema + Induration + Bullae |
2.동물실험을 통한 마린콜라겐의 창상치유 유효성평가
(시험개요)
Rat에 창상유발 후 음성대조군, 양성대조물질 투여군, 시험물질 투여군으로 나누어서 3주 동안 각 그룹별 창상치유의 유효성을 관찰하였다.
동물보호법[시행 2015-01-20][법률 제13023호(2015-01-20, 일부개정)] 및 실험동물에 관한 법률[시행 2013-07-30][법률 제11987(2013-07-30, 일부개정)]에 근거한 전남대학교의 동물윤리위원회에 의해 승인되었다.
(재료 및 방법)
가. 시험물질, 양성대조물질
-시험물질
실시 예에서 넙치의 어피로부터 분리한 고순도 마린콜라겐을 멸균증류수(㈜대한약품공업)에 용해시켜 조제한 농도 3%의 콜라겐 수용액을 시험물질로 이용하였다.
-양성대조물질
시판 중인 저분자 마린콜라겐 펩타이드(젤텍)를 멸균증류수(㈜대한약품공업)에 용해시킨 농도 3%의 콜라겐 수용액을 양성대조물질로 이용하였다.
나. 시험계
- 계통 및 종 : Crl:CD(SD), Rat, SPF
- 공급원 : ㈜오리엔트 바이오(경기도 가평군 북면 화악산로 124번길 8)
- 도입 시 성별, 동물수 : 수컷, 30 마리
- 도입 시 주령, 체중범위 : 5 주령, 수컷 117.8 g 135.3 g
- 투여 시 성별, 동물수 : 수컷, 27 마리
- 투여 시 주령, 체중범위 : 6 주령, 수컷 169.1 g 194.3 g
(1)검역 및 순화
동물을 입수 후 7일 동안 전남대학교 여수캠퍼스의 동물사육실의 환경 하에서 검역 및 순화시키면서 일반 건강상태를 관찰한 후, 건강한 개체를 선별하여 시험에 사용하였다.
(2)개체식별
유성펜을 이용하여 꼬리에 표시하였고, Cage는 개체식별카드를 부착하여 식별하였다.
(3)군 분리
순화 후 건강한 개체를 선별하여, 각 군간 평균체중 및 표준편차가 균일하도록 무작위법으로 군 분리를 실시하였다.
(4)잔여동물의 처리
군 분리 후 잔여동물은 실험 종료 시 안락사 처리하였다.
다. 사육환경
(1)환경 및 사육조건
- 온도 : (21.6 22.4)℃
- 상대습도 : (53.4 60.7)% R.H.
- 환기횟수 : (10 - 20)회/h
- 조명주기 : 광조건 12 시간 (08:00 - 20:00)
- 암조건 12 시간 (20:00 - 08:00)
- 조도 : (150 - 300)Lux
- Cage 종류 : Stainless steel wire cage
- Cage 크기 : (310W ×500D ×200H)mm
- Cage당 수용마리 수 : 1 마리
- 동물실의 온·습도는 자동 온습도 측정기에 의하여 매 30분마다 측정되었으며, 조도 등의 환경조건은 표준작업지침서에 따라 측정하였다. 동물실의 환경 측정 결과, 시험에 영향을 미치는 요인은 발견되지 않았다.
(2)사료 및 음수 공급
- 사료는 방사선 멸균된 Rodent Diet 20 5053 [Labdiet, USA]를, 음수는 R/O수를 자유섭취시 시켰다.
(3)사료 및 음수 검사
사료는 제조업체의 정기적 검사에 따른 분석성적서를 사료공급자로부터 받아 확인하였고, 음수는 전남대학교 소동물윤리위원회의 표준작업지침서에 따른 정기적 검사를 통해확인한 결과 시험에 영향을 미치는 요인은 발견되지 않았다.
3. 군 구성
동물실험의 군 구성은 하기 표 7과 같이 설정하였다.
| 군 | 물질 | 동물번호 | 성 | 투여량 (mg/kg B.W.) |
투여액량 (mL/kg B.W.) |
투여 경로 |
| 음성대조군(G1) | 멸균증류수 | 1101-1109 | 수컷 | 0 | 10 | 경구 |
| 양성대조물질투여군(G2) | 양성대조물질 | 1201-1209 | 수컷 | 2000 | 10 | |
| 시험물질투여군(G3) | 시험물질 | 1301-1309 | 수컷 | 2000 | 10 |
4. 물질의 투여 횟수 및 투여기간
7 일/주, 1회/일로 하여 3 주(21일)간 매일 투여하였다.
5. 투여액량 계산
주 1회 체중을 측정하여 이를 기준으로 투여액량을 계산하였고, 투여액량은 10 mL/kg B.W.로 산출하였다.
6. 창상유발
창상 유발모델은 순화기간 종료 후 케타민 50으로 마취한 뒤, 등 부위의 털을 제모한 다음 요오드팅크를 사용하여 표피를 소독한 후 피혁용 punch(biopsy punch; 8 mm)를 이용하여 좌우대칭의 원형 절제 창을 4개소 만들어 창상을 유발하였다.
7. 관찰항목
- 일반증상
실험기간 중, 모든 동물에 대하여 매일 1회 이상 일반증상의 변화, 독성증상 및 사망유무의 관찰을 실시하였다.
- 체중
체중은 도입 시, 군 분리 시, 투여 개시 후 매주 1 회 및 부검 당일에 측정하였고, 사망 또는 빈사동물 관찰 시에 측정하였다.
- 창상 면적 측정
창상 부위의 치유과정을 관찰하기 위해 창상 유발 직후 및 유발 후 2일 간격으로 digital camera를 이용, 각 군별로 일정거리에서 촬영하여 상처의 변화를 육안으로 관찰하였다. 또한 객관적 지표로 나타내기 위해 microcaliper를 이용하여 창상 부위의 면적을 측정하였다.
- 조직병리학적 검사
모든 동물을 개체별로 장기를 적출한 다음 10% neutral buffer formalin에 고정하였다. 다만 이외에 육안 소견상 용량에 따른 변화가 인정되는 장기의 경우 추가로 고정시켰다.
고정된 장기·조직 중, 음성대조군, 양성대조물질 투여군 및 시험물질 투여군의 모든 개체, 빈사 및 모든 군의 사망개체의 장기에 대해서는 탈수·파라핀침투, 조직의 파라핀 포매, 박절 등의 일반적인 조직처리과정을 거쳐 검체슬라이드를 제작하여 Hematoxylin & Eosin (H&E)염색을 실시하였다. 검체제작 후 잔여 장기·조직 및 고정 장기·조직은 10% neutral buffer formalin에 보존하였다. 조직병리학적 검사는 모든 투여군에 대해서 실시하였다.
<실험결과>
1. 인체첩포시험
피부는 외부로부터 내부기관을 보호하는 가장 큰 기관으로 수분, 호흡 및 유용성분의 유출방지, 노폐물의 분비, 체온조절 등 다양한 생리적 역할을 수행하고 있다.
피부자극 유형은 알레르기성 및 자극성피부염, 광독성접촉피부염, 접촉성두드러기 등 매우 다양하며, 이러한 문제점을 밝히기 위하여 주로 화장품에서는 인체첩포시험을 하고 있다. 화장품의 경우 피부에 문제를 유발하는 주 항원으로 fragrance mix, balsam of Peru, cinnamic alcohol, cinnamic aldehyde, benzyl salicylate, jasmine absolute 등이 보고되고 있으나 collagen의 경우 양 쪽 말단의 telopeptide 가 원인으로 작용하게 된다. 고순도 마린콜라겐은 이러 한 telopeptide를 제거하여 항원반응을 일으키지 않게 하기 위하여 pepsine을 처리하며, 이 과정에 telopeptide가 제거된다.
- 어피에서 추출 및 정제된 마린콜라겐을 각각 0.1%, 0.5%, 1%의 농도로 조제하여 25㎕씩 Finn Chamber에 적하시킨 후 시험부위인 상박에 얹어 고정시킨 후 24시간 동안 도포하여 첩포를 제거한 후에 홍반 유무를 조사한 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
| 피험자(명): 15(남:11명; 여:9명) 제품명 : 고순도 콜라겐 | ||||||
| No | 성 명 | 나 이 | 성 별 | 30분 후 반응 | 24시간 후 반응 | 48시간 후 반응 |
| 1 | KHJ | 33 | F | - | - | - |
| 2 | KEH | 22 | F | - | - | - |
| 3 | LMG | 25 | M | - | - | - |
| 4 | KSJ | 28 | F | - | - | - |
| 5 | KKD | 28 | M | - | - | - |
| 6 | KSY | 39 | M | - | - | - |
| 7 | KJY | 28 | M | - | - | - |
| 8 | PJM | 29 | M | - | - | - |
| 9 | PJY | 31 | M | - | - | - |
| 10 | BJI | 28 | M | - | - | - |
| 11 | LGH | 25 | M | - | - | - |
| 12 | JHJ | 25 | M | - | - | - |
| 13 | 츄ㄱ | 25 | F | - | - | - |
| 14 | HJH | 29 | M | - | - | - |
| 15 | HCK | 35 | M | - | - | - |
| 반응도 |
± | 0 | 0 | 0 | ||
| + | 0 | 0 | 0 | |||
| ++ | 0 | 0 | 0 | |||
| +++ | 0 | 0 | 0 | |||
| Mean score | 0.00 | |||||
| 판 정 | 무자극 | |||||
상기 표 8을 참조하면, 시험결과 20~30대 남녀 모두 첩포 제거 후 30분, 24시간, 48시간 모두 면역반응 또는 홍반이 발생하지 않은 것으로 나타났다. 시험자들 중 일부는 패치 부착 동안 약간의 가려움을 느꼈다고 하였으나 패치 제거 후 면역반응 또는 홍반이 발견되지 않아 일부 이물질 또는 패치를 감은 부착 제에 대한 심리적 거부반응으로 판단된다. 따라서 고순도 마린 콜라겐은 무자극으로 판단된다.
2. 창상실험
(1)일반증상
- 실험기간 동안 사망동물은 발견되지 않았다.
- 일반증상 관찰 결과, 모든 시험군에서 투여에 의한 일반증상의 변화는 관찰되지 않았다.
(2)체중변화
- 체중 측정 결과, 투여기간동안 양성물질 투여군 및 시험물질 투여군에서 음성대조군에 비교하여 체중변화는 관찰되지 않았다. 하기 표 9는 동물실험 군별 체중을 나타낸 것이다.
| Group |
G1 | G2 | G3 | |||||||
| Mean | S.D. | N | Mean | S.D. | N | Mean | S.D. | N | ||
| Body weight(g) on weeks | 1 | 184.0 | 7.1 | 9 | 183.4 | 6.0 | 9 | 182.9 | 6.2 | 9 |
| 2 | 240.3 | 10.8 | 9 | 235.5 | 8.8 | 9 | 234.2 | 10.1 | 9 | |
| 3 | 337.3 | 28.5 | 3 | 350.8 | 16.7 | 3 | 327.2 | 4.5 | 3 | |
(3)창상부위 면적
투여기간에 따른 창상부위 면적을 측정한 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
| Group |
G1 | G2 | G3 | ||||||||
| Mean | S.D. | N | Mean | S.D. | N | Mean | S.D. | N | |||
| Wound area (㎟) weeks |
0 |
area | 8.0 | 0.0 | 9 | 8.0 | 0.0 | 9 | 8.0 | 0.0 | 9 |
| % | 100.0 | 0.0 | 9 | 100.0 | 0.0 | 9 | 100.0 | 0.0 | 9 | ||
| 4 |
area | 7.1 | 0.4 | 9 | 7.2 | 0.1 | 9 | 7 | 0.2 | 9 | |
| % | 89.1 | 4.8 | 9 | 90.5 | 1.5 | 9 | 88.5 | 1.9 | 9 | ||
| 7 |
area | 6.7 | 0.5 | 9 | 6.4 | 0.4 | 9 | 6.6 | 0.3 | 9 | |
| % | 83.8 | 5.7 | 9 | 80.4 | 4.8 | 9 | 82.7 | 3.8 | 9 | ||
| 10 |
area | 4.7 | 0.5 | 6 | 5.0 | 0.2 | 6 | 5.1 | 0.4 | 6 | |
| % | 58.6 | 5.9 | 6 | 62.4 | 2.8 | 6 | 63.6 | 5.0 | 6 | ||
| 14 |
area | 4.6 | 0.4 | 6 | 4.3 | 0.3 | 6 | 4.6 | 0.4 | 6 | |
| % | 57.1 | 4.7 | 6 | 53.7 | 3.6 | 6 | 57.1 | 5.4 | 6 | ||
| 17 |
area | 4.1 | 0.6 | 3 | 3.9 | 0.1 | 3 | 4.0 | 0.1 | 3 | |
| % | 51.4 | 7.7 | 3 | 49.2 | 1.0 | 3 | 50.3 | 0.9 | 3 | ||
| 21 |
area | 3.2 | 0.5 | 3 | 3.0 | 0.1 | 3 | 3.2 | 0.1 | 3 | |
| % | 40.3 | 5.7 | 3 | 37.8 | 0.9 | 3 | 39.2 | 1.3 | 3 | ||
상기 표 10을 참조하면, 창상부위의 면적크기는 시간의 경과에 따라 모든 군에서 점진적으로 감소함이 관찰되었다. 군간의 유의적인 큰 차이는 육안으로 관찰되지 않으나 면적의 크기를 백분율로 환산하였을 때 음성대조군에 비하여 양성물질 투여군 및 시험물질 투여군은 더 감소하였고, 그 중 시험물질 투여군의 면적이 더 감소하였다.
(4)조직병리학적 검사
조직병리학적 검사 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12를 참조하면, 창상 유발부위 피부에서 창상 유발 후 1주차의 경우, 음성대조군에서 가피 형성, 표피의 재생, 염증세포의 침윤, 혈관 신생 및 섬유화 소견 등이 관찰되었고, 이들 소견들은 양성대조물질 투여군 및 시험물질 투여군에서 비슷한 양상으로 관찰되었다.
창상 유발 후 2 주차 및 3 주차의 경우, 음성대조군에서 표피 재생 및 섬유화가 관찰되었고, 이들 소견들 역시 양성대조물질 투여군 및 시험물질 투여군에서도 비슷한 양상으로 관찰되었으나 가피 형성, 염증세포의 침윤, 혈관 신생 소견들의 차이가 시험물질 투여군에서 더 관찰되지 않아 차이가 있는 것으로 사료되었다.
상술한 실험결과, 창상부위 치유에 따른 면적의 변화 결과에서는 모든 군에서 시간의 경과에 따라 면적이 감소함이 관찰되었지만 시험물질 투여군에서 면적감소의 군간 유의적인 변화가 관찰되어 시험물질에 의한 영향이 있는 것으로 사료된다. 또한, 조직병리학적 검사 결과에서는 창상유발 후 1 주차에 비해 2 주차 및 3 주차에서 가피 형성, 염증세포의 침윤, 혈관 신생 소견들이 관찰되지 않아 창상 치유가 진행되고 있는 것으로 판단되며, 각 주차별 군간의 조직병리학적 소견으로는 시험물질 투여군에서 관찰정도의 차이가 있었다.
이상의 결과로부터, 창상유발 동물 모델에서 마린콜라겐 수용액은 창상부위 면적변화 및 조직병리학적 검사 결과 등 전체적인 결과로 봤을 때 음성대조군 및 양성대조물질 투여군에 비해 차이가 있었다.
<안전성 조사>
고순도 콜라겐의 안전성을 검증하기 위하여 국내 인증기관 중 한국화학융 합시험연구원(Korea Technology Research, KTR)에 의뢰하여 중금속(납), 비 소, 일반생균수, 대장균수, 진균수에 대한 조사를 의뢰하였다.
시험결과는 도 13 내지 도 16에 나타내었다. 도 13은 넙치로부터 분리한 고순도 콜라겐에 대한 시험결과이고, 도 14는 우럭으로부터 분리한 고순도 콜라겐에 대한 시험결과이고, 도 15는 농어로부터 분리한 고순도 콜라겐에 대한 시험결과이고, 도 16은 참돔으로부터 분리한 고순도 콜라겐에 대한 시험결과이다.
4종의 어류로부터 분리하여 정제한 고순도 콜라겐 모두 납과 비소가 검출되지 않았다. 그리고 일반세균수, 대장균, 진균수(사상균수 및 효모) 역시 불검출되어 안전성 기준에 합당하였다.
이상, 본 발명은 일 실시 예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 실시 예에 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 보호범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 정해져야 할 것이다.
Claims (5)
- 삭제
- 어류 부산물인 어피를 건조시키는 건조단계와;
건조된 상기 어피를 50 내지 150메쉬 입도 크기로 분쇄하여 어피분말을 수득하는 분쇄단계와;
상기 어피분말로부터 콜라겐을 분리하는 분리단계;를 포함하고,
상기 분리단계는 a)상기 어피분말에 수산화나트륨 용액을 가하여 비콜라겐성 단백질이 제거된 알칼리잔사를 수득하는 단계와, b)상기 알칼리잔사에 초산용액을 가하여 교반한 후 원심분리기로 상등액을 분리하여 산가용화 콜라겐을 추출하는 단계와, c)상기 산가용화 콜라겐에 펩신을 가하여 교반한 후 원심분리기로 상등액을 분리한 다음 염화나트륨 용액을 가하여 침전시킨 침전물을 증류수로 투석하여 펩신 가용화 콜라겐을 추출하는 단계를 포함하며,
상기 어류는 넙치, 우럭, 농어, 참돔 중에서 선택된 어느 하나이고,
상기 건조단계는 상기 어피를 수산화나트륨 용액에 혼합하여 6 내지 12시간 동안 교반하여 어피에 부착된 비늘을 탈리시킨 후 건조시키며,
창상치료 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 어류부산물을 이용한 의료용 마린콜라겐의 제조방법. - 삭제
- 제 2항에 있어서, 상기 분리단계 후 펩신가용화 콜라겐을 20mM Na2HPO4에서 투석하여 펩신을 불활성화시킨 다음 2M 요소를 포함한 50mM 초산에서 투석한 후 이온크로마토그래피를 이용하여 용출시킨 분획을 2M NaCl을 포함한 0.5M 초산용액으로 투석하여 회수한 다음 증류수로 투석 후 동결건조시키는 정제단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 어류부산물을 이용한 의료용 마린콜라겐의 제조방법.
- 삭제
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