CN109575106A - 一种从大米多肽中制备抗氧化三肽的方法及应用 - Google Patents
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本发明涉及多肽技术领域，尤其涉及一种从大米多肽中制备抗氧化三肽的方法及应用。本发明提供的从大米多肽中制备的抗氧化肽含有Ser‑Ile‑Arg、Ser‑Leu‑Arg、Val‑Pro‑Arg三种三肽，该抗氧化三肽的制备依次经过酶解、纤维素玻璃柱纯化和葡聚糖凝胶柱纯化，该抗氧化三肽能够耐受胃肠消化，自由基吸收能力(ORAC)较强，说明其具有良好的抗氧化活性。本发明所述多肽的制备方法简单，不采用有害试剂，所得产品更安全。
Description
技术领域
本发明涉及多肽技术领域，尤其涉及一种从大米多肽中制备抗氧化三肽的方法及应用。
背景技术
大米是我国第一大粮食品种，年产量约2亿吨，占全球粮食总种植面积的30％左右。大米蛋白以其较高的生物利用率、合理的氨基酸组成、特有的低敏性等特点被认为是优质蛋白质，与牛乳、豆类蛋白相比更适合于饲料、婴幼儿、老年人及特殊人群。但长期以来，我国大米加工仅处于满足人们口粮需求的初级加工状态，稻米加工产品结构单一，深加工率仅20％，高附加值产品少。
多肽是介于大分子蛋白质和氨基酸之间的一段最具活性、最易吸收、生理功能效价高的一种营养物质。在一定条件下，蛋白经酶解可以得到多种生物活性肽，它们大多以非活性状态存在于蛋白质长链中，一旦经过酶解成为适当长度的肽，就可表现出调节机体免疫力的生理活性，并保持低过敏性。在已获得的生物肽中，动物源活性肽占大多数，而植物源活性肽逐渐成为研究的新亮点。
在大米活性肽经口服在体内发挥生理活性之前，会受到一系列阻碍，如胃中的低酸环境和胃蛋白酶；肠道中碱性环境和胰蛋白酶、肽酶以及小肠对其吸收的屏障作用等。这些因素都会影响大米多肽的吸收从而影响其在生物体内的生理活性，大米多肽进入血液循环到达靶点是其发挥功能的前提条件。
目前已有发明专利设计酶解大米蛋白制备大米多肽的技术，但均从不同方面体现出一定的不足：例如，不能在胃肠道中保持稳定，在吸收前结构被破坏，丧失活性；在制备过程中特别是干燥过程中，被破坏活性受到影响；提取过程中的提取试剂对产品安全性存在不利影响。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种从大米多肽中制备抗氧化三肽的方法及应用，该多肽能够耐受胃肠消化，且具有良好的抗氧化活性。
本发明提供了含有三肽Ser-Ile-Arg、Ser-Leu-Arg和/或Val-Pro-Arg的大米多肽。
其中，Ser为丝氨酸的氨基酸相应残基，Ile为异亮氨酸的氨基酸相应残基，Arg为精氨酸的氨基酸相应残基，Leu为亮氨酸的氨基酸相应残基，Val为缬氨酸的氨基酸相应残基，Pro为脯氨酸的氨基酸相应残基。一些具体实施例中，本发明提供的大米多肽含有三肽Ser-Ile-Arg、Ser-Leu-Arg和Val-Pro-Arg。
本发明所述大米多肽的制备方法，包括：
45～55℃，pH值为5.5～6.5，大米蛋白以风味蛋白酶酶解3～5h，制得多肽A；
35～40℃，pH值为1～2，所述多肽A以胃蛋白酶酶解80～100min，制得多肽B；
35～40℃，pH值为7～8，所述多肽B以胰蛋白酶酶解1～3h，制得所述大米多肽。
本发明中，所述风味蛋白酶又称为风味酶，是由米曲霉菌株发酵提纯、复配而成的酶制剂。一些具体实施例中，所述风味蛋白酶为市售产品。
在风味蛋白酶酶解的步骤中，所述大米蛋白的浓度为100g/mL，风味蛋白酶的质量分数为0.75％。一些实施例中，风味蛋白酶酶解的条件为50℃，pH值为6.0，4h。风味蛋白酶酶解后，沸水浴灭酶。所得酶解液8000rpm离心20min，上清液经浓缩、冻干获得多肽A。
在胃蛋白酶酶解的步骤中，胃蛋白酶的质量分数为1.7％。一些实施例中，胃蛋白酶酶解的条件为37℃，pH值为1.5，1.5h。胃蛋白酶酶解后，沸水浴灭酶。所得酶解液经浓缩、冻干，获得多肽B。
在胰蛋白酶酶解的步骤中，胰蛋白酶的质量分数为1.6％。一些实施例中，胰蛋白酶酶解的条件为37℃，pH值为7.5，2h。pH值的调节先用0.9mol/LNaHCO3调节pH值为5.3，再用1.0mol/LNaOH调pH值为7.5。胰蛋白酶酶解后，沸水浴灭酶。所得酶解液经浓缩、冻干，获得大米多肽。
风味蛋白酶酶解后获得多肽A。经ORAC实验验证，未经模拟消化的多肽A已经具有良好的抗氧化活力。而经过体外胃消化和胃肠模拟消化，消化前后蛋白质回收率无显著性差异，p>0.05。且经过体外模拟消化后，蛋白质ORAC活性也无显著性差异，p>0.05。这说明本发明的大米多肽能够较好的耐受胃肠道的消化，结构不受破坏，从而在吸收后能够保持良好的生理活性。并且，本发明采用冻干技术对大米多肽进行干燥，从而避免了现有技术中喷干对所得多肽品质的影响，能够最大限度的保留大米多肽的生理活性。
经酶解后的大米多肽已经具有良好的抗氧化活性，为了提高大米多肽的抗氧化活性，本发明对酶解后的大米多肽进行纯化。因此本发明所述的制备方法中，还包括纤维素玻璃柱纯化的步骤。
一些实施例中，所述纤维素玻璃柱为DEAE-52纤维素玻璃柱。纤维素玻璃珠的平衡采用蒸馏水。大米多肽的上样溶液为蒸馏水，上样浓度为50mg/mL。采用2倍柱体积蒸馏水洗脱。
本发明实验中，以200mL蒸馏水和浓度为0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L和0.4mol/L的NaCl溶液各200mL进行梯度洗脱。洗脱的流速皆为0.5mL/min。最终获得六个组分，分别进行ORAC抗氧化活性。
为了进一步提高大米多肽的抗氧化活性，本发明对经过纤维素玻璃柱的大米多肽进行纯化。因此，本发明所述的制备方法，还包括葡聚糖凝胶柱纯化的步骤。
一些实施例中，所述葡聚糖凝胶柱为Sephadex G-15以蒸馏水预平衡。大米多肽的上样溶液为蒸馏水，上样浓度为30mg/mL，洗脱的流速为0.5mL/min。采用1倍柱体积蒸馏水洗脱，洗脱组分分子量范围为280Da-380Da。
本发明实验中，以水进行洗脱，最终获得三个组分，分别进行ORAC抗氧化活性。
依次经过酶解、纤维素玻璃柱纯化和葡聚糖凝胶柱纯化，所得的多肽能够具有良好的抗氧化活性，对其进行ESI-MS/MS分析。鉴定所得多肽含有Ser-Ile-Arg、Ser-Leu-Arg和Val-Pro-Arg这三种三肽。
本发明所述制备方法制得的大米多肽。
本发明所述大米多肽在制备抗氧化的产品中的应用。
本发明还提供了一种抗氧化的产品，其包括本发明所述大米多肽。
所述抗氧化的产品为药物或食品。
本发明提供的药物还包含药学上可接受的辅料。
本发明所述的药物还包含其他治疗剂，所述其他治疗剂选自其他具有抗氧化活性的物质。
所述药物的剂型包括膏剂、颗粒剂、丸剂、散剂、片剂、胶囊剂、口服液或糖浆剂。
本发明提供的食品中还包含食品中可接受的配料。
所述食品为保健食品，剂型包括颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂、片剂、粉剂、软糖、乳剂或口服液。
本发明还提供了一种抗氧化的治疗方法，其为给予本发明所述的抗氧化产品。
本发明提供的大米多肽含有Ser-Ile-Arg、Ser-Leu-Arg、Val-Pro-Arg三种三肽，该多肽的制备依次经过酶解、纤维素玻璃柱纯化和葡聚糖凝胶柱纯化，该多肽能够耐受胃肠消化，在体外消化前后，收率和活性皆未见显著性差异。而所得的多肽自由基吸收能力(ORAC)较强，说明其具有良好的抗氧化活性。本发明所述多肽的制备方法简单，不采用有害试剂，所得产品更安全。
附图说明
图1a示本发明的胃肠模拟消化对大米蛋白肽蛋白质回收率的影响图；
图1b示本发明的胃肠模拟消化对大米蛋白肽氧自由基吸收能力(ORAC)的影响图；
图1c示本发明的胃肠模拟消化对大米蛋白肽分子量分布的影响图；
图2a示本发明的经酶解后的大米蛋白DEAE-52洗脱曲线图；
图2b示本发明的大米多肽经DEAE-52后各活性组分氧自由基吸收能力(ORAC)比较图；
图2c示本发明的大米多肽中F1组分经Sephadex G-15洗脱曲线图；
图2d示本发明的大米多肽中F1组分经Sephadex G-15纯化后各活性组分氧自由基吸收能力(ORAC)比较图；
图3a示本发明的大米多肽BCP图谱；
图3b示本发明的大米多肽BCP图谱及多肽Ser-Ile-Arg和Ser-Leu-Arg的二级质谱图；
图3c示本发明的大米多肽BCP图谱及多肽Val-Pro-Arg的二级质谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种从大米多肽中制备抗氧化三肽的方法及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材以及大米蛋白、风味蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1大米蛋白的酶解
一、酶解：
1、风味蛋白酶解：大米蛋白以蒸馏水溶剂，配制成浓度为100mg/mL的溶液，加风味蛋白酶至0.75wt％，温度50℃，pH 6.0，酶解4h后，采用沸水浴灭酶，8000rpm离心20min，上清液经浓缩、冻干获得多肽A。
2、模拟胃消化：多肽A以蒸馏水溶剂，配制成浓度为100mg/mL的溶液，加胃蛋白酶至1.7％wt％，温度37℃，pH 1.5，酶解1.5h后，采用沸水浴灭酶，8000rpm离心20min，上清液经浓缩、冻干获得多肽B。
3、模拟胃肠消化：多肽A酶解后经过灭酶的酶解液，先用0.9mol/L NaHCO3调节pH5.3，再用1.0mol/L NaOH调pH 7.5，然后加入胰蛋白酶至1.6％wt％，温度37℃，酶解2h后，采用沸水浴灭酶，8000rpm离心20min，上清液经浓缩、冻干获得大米多肽。
二、回收率检验：
采用凯氏定氮法(GB/T 5009.5-2003)测定原料大米蛋白的总蛋白质氮含量以及各步骤获得多肽的蛋白氮含量，并按照公式计算各多肽的蛋白质回收率：
结果如图1a所示，制得的多肽经过模拟胃消化和胃肠消化后，蛋白质回收率无显著性差异，具有较好的耐受胃肠模拟消化性；
三、抗氧化能力测定：
采用氧自由基吸收能力法(ORAC)测定大米多肽的抗氧化能力，具体操作如下：在96孔荧光板各微孔中加入20μL pH7.4磷酸盐缓冲溶液、待测多肽以及Trolox标准溶液，于37℃孵育10min后，用多道移液器迅速在各孔中加入200μL荧光素钠溶液，继续于37℃下孵育20min，立即在各孔中加入20μL AAPH激活反应，37℃恒温反应，设置激发波长和发射波长分别为485和538nm，每隔2min测定一次各孔的荧光强度，共测定3h。
结果如图1b所示，制得的多肽经过模拟胃消化和胃肠消化后氧自由基吸收能力(ORAC)增加，特别是胃消化后，其抗氧化能力显著优于未经消化的多肽或经过胃肠消化的多肽，p<0.05。
四、分子质量分布测定
采用凝胶色谱法测定多肽的相对分子质量分布。分离柱为TSK G2000 SWXL，液相系统为岛津LC-20A，进样体积为20μL，检测波长设为214nm。流动相为0.1mol/L PBS+0.1mol/L Na2SO4，洗脱流速为0.5mL/min。
结果如图1c所示，制得的多肽经过模拟胃消化和胃肠消化后，小分子肽(MW<1kDa)占比增加，更易被人体吸收利用。
实施例2纤维素玻璃柱纯化
用蒸馏水预平衡DEAE-52纤维素玻璃柱(1.6×30cm)，实施例1制得的大米多肽，以蒸馏水配制成浓度为50mg/mL的溶液，上样DEAE-52柱。
取200mL蒸馏水和浓度为0.05mol/L、0.1mol/L、0.2mol/L和0.4mol/L的NaCl溶液各200mL进行梯度洗脱，流速为0.5mL/min。收集洗脱的每个级分并在214nm处监测、收集纯化产物，如图2a所示。
收集得到的六个组分(F1、F2、F3、F4、F5和F6)，将各组分分别冻干，测量它们的ORAC抗氧化活性。各组分ORAC检测结果如图2b所示，其中组分F1的ORAC值为4.412±0.161，显著高于其它其他组分，故对F1进行下一步纯化。
实施例3葡聚糖凝胶柱纯化
使用蒸馏水预平衡Sephadex G-15柱(1.6×60cm)。将实施例3制得的多肽F1，以蒸馏水配制成浓度为30mg/mL的溶液，上样平衡好的Sephadex G-15柱，进行进一步纯化。用蒸馏水以0.5mL/min的流速洗脱级分，收集各洗脱级分，然后在214nm处检测。
二次纯化结果如图2c所示，F1经二次纯化得到三个级分(F1-a，F1-b，F1-c)，该纯化方法能对大米多肽各组分进行有效分离；各组分ORAC检测结果如图2d所示，其中组分F1-a的ORAC值为6.815±0.298，显著高于其它其他组分，经纯化后的大米多肽氧自由基吸收能力(ORAC)显著增加，纯化后的产品具有较好的抗氧化活性。
实施例4多肽鉴定
将Sephadex G-15分离后具有最高ORAC值的级分F1-a进行ESI-MS/MS分析。首先用安捷伦SB-C18RRHD柱(1.8C1，2.1C18RR)通过超高效液相色谱系统分离5通过多肽溶液(1mg/mL)，流速为0.2mL/min。使用梯度洗脱，其由流动相A(乙腈)和B(0.1％甲酸水溶液)组成：0-1min，0％v/v至15％v/v；1-4min，15％v/v至85％v/v；4-8min，85％v/v；8-9min，85％v/v至15％v/v；9-10min，15％v/v。以正离子模式(ESI+)从50到3000m/z获得扫描，甲酸钠溶液作为内标，以此所得大米多肽一级和二级质谱图，采用布鲁克DataAnalysis进行鉴定。其BPC图谱如图3a所示，鉴定所得多肽Ser-Ile-Arg、Ser-Leu-Arg和Val-Pro-Arg的图谱如图3b和3c所示，多肽Ser-Ile-Arg和Ser-Leu-Arg为BPC图谱中的组分26，其二级质谱图如图3b所示，同理多肽Val-Pro-Arg为BPC图谱中的组分87，二级质谱图如图3c所示。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.含有三肽Ser-Ile-Arg、Ser-Leu-Arg和/或Val-Pro-Arg的大米多肽。
2.权利要求1所述大米多肽的制备方法，其特征在于，包括
45～55℃，pH值为5.5～6.5，大米蛋白以风味蛋白酶酶解3～5h，制得多肽A；
35～40℃，pH值为1～2，所述多肽A以胃蛋白酶酶解80～100min，制得多肽B；
35～40℃，pH值为7～8，所述多肽B以胰蛋白酶酶解1～3h，制得所述大米多肽。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述酶解的溶剂是水，其中，所述大米蛋白的浓度为100g/mL，风味蛋白酶的质量分数为0.75％。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述酶解后，酶解液8000rpm离心20min，上清液经浓缩、冻干获得所述大米多肽。
5.根据权利要求2～4任一项所述的制备方法，其特征在于，还包括纤维素玻璃柱纯化的步骤，采用2倍柱体积蒸馏水洗脱。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括葡聚糖凝胶柱纯化的步骤，采用蒸馏水洗脱，采用1倍柱体积蒸馏水洗脱，洗脱组分分子量范围为280Da-380Da。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，还包括浓缩、冻干的步骤。
8.权利要求2～7任一项所述制备方法制得的大米多肽。
9.权利要求1或8所述大米多肽在制备抗氧化的产品中的应用。
10.一种抗氧化的产品，其特征在于，包括权利要求1或8所述大米多肽。
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