JP2022554263A - 美白機能を有する米ペプチド及びその調製方法 - Google Patents

Abstract

美白機能を有する米ペプチド及びその調製方法及び応用であって、前記米ペプチド組成には少なくともペプチドフラグメントＧＳ、ＧＬおよびＧＦを含み、米ペプチドの質量に基づいて、前記ペプチドフラグメントＧＳの含有量≧２００．００ｍｇ／１００ｇで、ペプチドフラグメントＧＬの含有量≧２００．００ｍｇ／１００ｇで、ペプチドフラグメントＧＦの含有量≧１００．００ｍｇ／１００ｇである。前記米ペプチドは米タンパク原料に対して順次に蒸気爆発処理、酵素加水分解処理および分離精製処理を行うことによって取得されたものである。前記米ペプチドは、抗酸化能力及び美白能力が強い。【選択図】図３

Description

本発明は、美白機能を有する米ペプチド及びその調製方法や応用に関し、米深加工技術分野に属する。

米は栄養が非常に豊富であり、中国のほとんどの地域の人々の主要食品である。米は主にスタ－チやタンパク質によって構成され、含有量がそれぞれ約８０％と８％である。米内のタンパク質の生物学的価値が大豆に相当し、リジン、スレオニン等の含有量が非常に豊富であるため、通常に、米を加工処理してその中のタンパク質を抽出する。

米タンパクとは、米から抽出されたタンパク質が粉砕、精製、乾燥等の工程を経て形成される粉末物質であり、優れた栄養品質を有し、穀物タンパク質の中で高品質植物性タンパクとして認められている。米タンパクに、アルブミンが総量の２－５％を占め、グロブリンが総量の２－１０％を占め、グリアジンが総量の１－５％を占め、グルテンが総量の８０％以上を占める。米タンパクは、トウモロコシタンパク質、小麦タンパク質に比べて、優れた栄養価値及びヒトによる高吸収利用率等の特徴を有するほか、低アレルギー性、色素干渉なし、柔らかな味及び刺激なし等の利点も有する。

現段階に、米のタンパクの利用率をさらに向上させることができるために、米タンパク含有の原料、例えば米タンパク粉末を原料として酵素加水分解を行うことが多く、製造されたポリペプチド生成物は、米ペプチドとも呼ばれ、米ペプチドの各種類の機能効果はタンパク質高分子が切断されて形成されるいくつかの短いペプチドから由来し、その中に生物有機体の生命活動に有益な又は生理学的作用を有する、異なる小さいペプチドが含まれていると思われる共通認識がある。既存の研究報道に記載したように、米ペプチド内のいくつかの短いペプチドは一定のヒト代謝や生理学的調整機能を有し、腸内直接に吸収され、これにより米ペプチドは米タンパクに比べてより容易で迅速に吸収されるようになるため、米タンパクが酵素加水分解を経て得られた米ペプチドは米深加工の新たな研究方向である。

現在、米ペプチドに対する研究や開発応用は、多くがヒトにより容易に吸収される栄養を提供し、身体健康状態を維持することや向上させることを方向としており、米タンパクに対する酵素加水分解工程探索も米タンパクによる従来の機能効果に関連する結果により多く注目しており、酵素加水分解による生成物は吸収促進のみを果たさないペプチドフラグメントが存在するかどうか、および他の機能を有するペプチドフラグメントを得ることによって米ペプチド応用範囲を拡大できるかどうかについて、研究や報道はいまだにそれほど多くないので、米原料深加工の研究進展も影響されている。

本発明は、美白機能を有する米ペプチド提供し、該米ペプチドは、その中に含有する特定質量含有量の機能ペプチドフラグメントであるグリシルセリン（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、ＧＳ）、グリシルロイシン（Ｇｌｙ－Ｌｅｕ、ＧＬ）およびグリシルフェニルアラニン（Ｇｌｙ－Ｐｈｅ、ＧＦ）によって、フリーラジカル消去、メラニン合成阻害等の面で優れた機能効果を表現することができる。

本発明はさらに、上記米ペプチドの調製方法を提供し、生成物が特定質量含有量のグリシルセリン（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ、ＧＳ）、グリシルロイシン（Ｇｌｙ－Ｌｅｕ、ＧＬ）およびグリシルフェニルアラニン（Ｇｌｙ－Ｐｈｅ、ＧＦ）等の機能性ペプチドフラグメントを含有するように、米タンパクの酵素加水分解および分離精製プロセスを制御する。

本発明はさらに、抗酸化製品や美白製品における上記米ペプチドの応用を提供する。

本発明は、米ペプチドを提供し、前記米ペプチド組成にはペプチドフラグメントグリシルセリンＧＳ、グリシルロイシンＧＬおよびグリシルフェニルアラニンＧＦが少なくとも含まれる。

具体的に、本発明に係る米ペプチドには、米ペプチドの総質量（乾燥ベース）に基づいて、ＧＳの質量含有量≧２００．００ｍｇ／１００ｇで、ＧＬの質量含有量≧２００．００ｍｇ／１００ｇで、ＧＦの質量含有量≧１００．００ｍｇ／１００ｇである。

このほかにも、上記米ペプチドはまた、平均分子量が小さくて吸収されやすい特徴があり、具体的に、米ペプチドには、分子量が１０００ｕより小さいペプチドの質量含有量≧９０％である。

さらに、上記米ペプチドは、米タンパク原料、例えば米タンパク粉末に対して、順次に蒸気爆発処理、酵素加水分解処理および分離精製処理を行うことによって取得され、ここで、酵素加水分解処理は、４０－６０℃で、順次にペプシン、パパインおよびアミノペプチダーゼを利用して３段階の酵素加水分解を行う処理である。

具体な実施過程で、米タンパク原料が蒸気爆発処理された生成物は水と混ぜて混合液を得て、そして順次にペプシン、パパインおよびアミノペプチダーゼを使用して混合液に対して３段階の酵素加水分解を行い、具体的に、まず、ペプシンを利用して第一酵素加水分解を行い、第一酵素加水分解液を得て、次に、パパインを利用して第一酵素加水分解液に対して第二酵素加水分解を行い、第二酵素加水分解液を得て、最後に、第二酵素加水分解液へアミノペプチダーゼを加えて第三酵素加水分解を行い、酵素を不活性化させた後に、第三酵素加水分解液を得る。ここで、三回の酵素加水分解のｐＨ環境や温度はそれぞれの酵素の最良酵素加水分解条件で決定されるが、三回の酵素加水分解の時間は、それぞれ３ｈ内に制御され、例えば第一酵素加水分解時間が１．５－３ｈに、第二酵素加水分解の時間が１－２ｈに、第三酵素加水分解の時間が０．５－１ｈに制御されてもよい。上記酵素不活性化操作は本分野常用の高温酵素不活性化技術を利用してもよい。

酵素加水分解処理には、酵素加水分解の温度、ｐＨ環境および時間を制御するほか、酵素の投与量を制御して生成物におけるペプチドフラグメントＧＳ、ＧＬおよびＧＦが高い質量含有量を有するようにできるだけ確保する必要がある。米タンパク原料内の米タンパクの有効質量を基準として、米タンパク１００ｇあたりに、６００－１５００Ｕペプシン、１０００００－２０００００Ｕパパイン、５０－１５０ＬＡＰＵアミノペプチダーゼを利用することができる。

酵素加水分解終了後に、第三酵素加水分解液に対して分離精製処理を行い、上記米ペプチドを得る。

ここで、分離精製処理は、順次にろ過精製および樹脂精製処理を含み、ここで、樹脂精製処理は順次に陽イオン交換樹脂を使用する精製処理と陰イオン交換樹脂を使用する精製処理とを含む。

ここで、陽イオン交換樹脂として、水素型陽イオン交換樹脂を選択してもよく、粒子サイズが０．３１５－１．２５ｎｍであり、陰イオン交換樹脂として、水酸化物型陰イオン交換樹脂を選択してもよく、粒子サイズが０．３１５－１．２５ｎｍである。

さらに、ろ過処理は、少なくとも二次ろ過処理であってもよい。ここで、第一次ろ過処理は、孔径が５０－２００ｎｍのろ過膜等、孔径が比較的大きいろ過膜を選択してろ過し、不溶の固体粒子を除去する。第二次ろ過処理は、分子量カットオフが２０００－５０００ｕのナノろ過膜を選択して第一次ろ過で得られたろ液に対して再度ろ過を行い、溶性高分子物質を除去し、ターゲットペプチドフラグメントの含有量をさらに増加することができる。

上記分離精製処理によって、酵素加水分解生成物内のＧＳ、ＧＬおよびＧＦという３つのペプチドフラグメントを保留することができる。この後に、分離精製された液体生成物に対して濃縮乾燥を行い、必要とされる米ペプチド製品を得て、その中には少なくともペプチドフラグメントＧＳ、ＧＬおよびＧＦを含有する。

研究により、特定質量含有量のペプチドフラグメントＧＳ、ＧＬおよびＧＦを含有する上記米ペプチドはＤＰＰＨフリーラジカルおよびＯＨフリーラジカルを明らかに消去し、人の皮膚メラノサイト内ＲＯＳ含有量、メラニン合成速率、チロシナーゼ活性を低下させることができ、抗酸化能力や美白能力が強いことが表明されている。

本発明はさらに、上記いずれかの米ペプチドの調製方法を提供し、
米タンパク原料に対して蒸気爆発処理を行った後に、水を加えて混合液を製造するステップと、
前記混合液のｐＨを酸性に調整した後にペプシンを加えて第一酵素加水分解を行い、１．５－３ｈ後に、第一酵素加水分解液を得るステップと、
前記第一酵素加水分解液のｐＨを弱酸又は中性に調整した後に、パパインを加えて第二酵素加水分解を行い、１－２ｈ後に、第二酵素加水分解液を得るステップと、
前記第二酵素加水分解液へアミノペプチダーゼを加えて第三酵素加水分解を行い、０．５－１ｈ後に、酵素を不活性化させ、第三酵素加水分解液を得るステップと、
前記第三酵素加水分解液に対して順次にろ過および樹脂精製処理を行い、前記米ペプチドを得るステップと、を含む。

本発明において、米ペプチドを調製する原料は、米タンパクを提供できる任意の原料、例えば米タンパク粉末であり、本発明において、酵素加水分解処理の効率を確保するために、純度が６０－９０％で、粒度が６０－２００メッシュの米タンパク粉末を原料として選択してもよい。

酵素加水分解を行う前に、米タンパク原料に対して前処理を行う必要があり、本発明での前処理は、蒸気爆発装置を利用して米タンパク原料に対して蒸気爆発処理を行うことである。具体的に、蒸気爆発処理は、飽和水蒸気環境でターゲット物に対して圧力を加えて、且つ高圧を一定の時間維持した後に、非常に短時間内にターゲット物の圧力を常圧（爆発放出）に低下させる。該過程により、飽和水蒸気および過熱液体がターゲット物内部を充満するようになり、高圧が瞬時に解放された後に、ターゲット物内部の過熱液体が気化して膨張し、これによりターゲット物が爆発し、米蒸気爆発粒子を得る。

蒸気爆発処理によって、粒子表面は非常に緻密な細孔を持つようになり、これにより酵素加水分解過程で有効成分放出に有利であるのみならず、酵素と原料との接触面積も増大し、酵素加水分解効率が向上するようになる。

具体的に、下記条件にしたがって蒸気爆発処理を行うことができる。米タンパク原料は０．５－１．５Ｍｐａの蒸気圧で３０－１２０ｓ保たれた後に、前記米タンパク粉末が３．０－８．５ｍｓ内に常圧に戻り、米蒸気爆発粒子を得る。蒸気爆発を実施する装置は例えば、済南思明特ＳＭＴ－ＢＰＸＴ－２１型蒸気爆発実験台である。

米蒸気爆発粒子を収集し、水と米タンパク原料との質量比が（５－２０）：１であるように米蒸気爆発粒子へ水を加え、酵素加水分解に用いられる混合液を調製する。混合液を調製するとき、水を少なすぎて加えると、混合液の流動性が悪くなり、酵素加水分解効率が低下するが、水を多すぎて加えると、反応体積が大きすぎて、この後の処理（例えば濃縮等）に影響を与えるほか、コストも相応に増加する。ここで、水は、精製水、蒸留水、脱イオン水等を採用してもよいが、本発明において精製水を採用する。

本発明者は、いかにして米タンパク粉末の酵素加水分解生成物に予想質量含有量のＧＳ、ＧＬおよびＧＦペプチドフラグメントを含有するかについて大量の研究を行った結果、酵素製剤の選択及び相応の分離工程が結果に対して肝心な影響を与えていることが証明された。発明者は研究過程で意外にも、ペプシン、パパインおよびアミノペプチダーゼを採用して順次に３段階の酵素加水分解を行うことが、ＧＳ、ＧＬおよびＧＦペプチドフラグメントを同時に得ることに有利であるのみならず、他の酵素加水分解生成物の含有量を低下させることもできるから、これにより、この後にＧＳ、ＧＬおよびＧＦペプチドフラグメントに対する分離精製により、ＧＳの質量含有量≧２００．００ｍｇ／１００ｇで、ＧＬの質量含有量≧２００．００ｍｇ／１００ｇで、ＧＦの質量含有量≧１００．００ｍｇ／１００ｇであるようにすることに寄与する。

本発明の３段階の酵素加水分解はいずれも４０－６０℃の温度で行われ、且つ各段階の酵素加水分解の時間を制御し、酵素加水分解時間が短すぎてタンパクの分解に不利であること、又は時間が長すぎて（例えば８ｈを超える）ターゲットペプチドフラグメントのさらなる分解が引き起こされることを防止する。

ペプシンを加える前に、濃塩酸を利用して混合液のｐＨ値を２－３等、酸性に調整し、そしてペプシンを加えて、１．５－３ｈ後に、第一酵素加水分解液を得て、この後に水酸化ナトリウムを利用して第一酵素加水分解液のｐＨ値が６－７になるように調整し、パパインの適宜酵素加水分解温度でパパイヤを加えて第二酵素加水分解を行い、第二酵素加水分解液を得る。

最後に、アミノペプチダーゼの適宜酵素加水分解温度で、直接に第二酵素加水分解液へアミノペプチダーゼを加えて第三酵素加水分解を行い、０．５－１ｈ後に、体系温度を９０－９５℃まで昇温して酵素を不活性化させ、第三酵素加水分解液を得る。

本発明の酵素加水分解において、ペプシンの投与量は６００－１５００Ｕ／１００ｇで、前記パパインの投与量は１０００００－２０００００Ｕ／１００ｇで、前記アミノペプチダーゼの投与量は５０－１５０ＬＰＡＵ／１００ｇである。具体的には、各酵素の投与量は米タンパク原料内の有効な米タンパクの質量に応じるものであり、即ち、米タンパク１００ｇあたりに、ペプシンを６００－１５００Ｕ、パパインを１０００００～２０００００Ｕおよびアミノペプチダーゼを５０－１５０ＬＰＡＵ使用する。

以下、酵素加水分解液の後処理について詳細に紹介する。

まず、孔径が５０－２００ｎｍのろ過膜を採用して第三酵素加水分解液に対して一次ろ過を行い、一次ろ液を収集し、続いて、分子量カットオフが２０００－５０００ｕのナノろ過膜を採用して一次ろ液に対して二次ろ過を行い、二次ろ液を得る。多段階ろ過工程によって分子量が大きい成分をさらにカットオフし、これにより米ペプチド内の３種のターゲットペプチドフラグメントの質量含有量を増加させることができる。

多段階ろ過終了後に、二次ろ液に対して樹脂精製処理を行い、具体的に二次ろ液に対して順次に陽イオン交換樹脂精製処理及び陰イオン交換樹脂精製処理を行う。

ここで、陽イオン交換樹脂精製処理は、ろ液を１～１０ｍＬ／ｍｉｎの直線流量で陽イオン交換樹脂カラムに通過させ、紫外線検出値が２００ｍＡｕに達したとき、流出液収集を開始し、材料や液体がすべて処理された後に、ろ液の代わりに精製水を用いて樹脂を流し、紫外線検出値が２００ｍＡｕより小さいとき、流出液収集を停止することを含む。
陰イオン交換樹脂精製は、陽イオン交換樹脂によって精製された流出液を１～１０ｍＬ／ｍｉｎの直線流量で陰イオン交換樹脂カラムに通過させ、紫外線検出値が２００ｍＡｕに達したとき、流出液収集を開始し、材料や液体がすべて処理された後に、陽イオン交換樹脂によって精製された流出液の代わりに精製水を用いて樹脂を流し、紫外線検出値が２００ｍＡｕより小さいとき、流出液収集を停止することを含む。

上記陽イオン交換樹脂カラムは、予め平衡化された水素型陽イオン交換樹脂カラムであってもよく、粒子サイズが０．３１５－１．２５ｎｍであり、陰イオン交換樹脂カラムは、予め平衡化された水酸化物型陰イオン交換樹脂カラムであってもよく、粒子サイズが０．３１５－１．２５ｎｍである。

さらに、陰イオン交換樹脂から収集された流出液に対して蒸発濃縮を行ってもよく、例えば真空蒸発濃縮装置を採用して蒸発濃縮を行い、濃縮液の濃度が２０％±２％になるように制御してもよい。さらに、濃縮後に乾燥を行ってもよく、例えば噴霧乾燥塔を採用し、乾燥塔入口温度を１４０－１６０℃に制御し、出口温度を６０－８０℃に制御し、これにより本発明の米ペプチドを調製して得る。

上記酵素加水分解工程及び分離精製工程によって、米タンパク粉末におけるＧＳ、ＧＬおよびＧＦを保留することができるのみならず、また、適宜な工程パラメータによってペプチドフラグメントＧＳの質量含有量≧２００．００ｍｇ／１００ｇに、ペプチドフラグメントＧＬの質量含有量≧２００．００ｍｇ／１００ｇに、ペプチドフラグメントＧＦの質量含有量≧１００．００ｍｇ／１００ｇになるようにさせることもできる。

本発明はさらに、抗酸化製品及び美白製品における上記いずれかの米ペプチドの応用を提供する。

大量の研究データによって、本発明のＧＳの質量含有量≧２００．００ｍｇ／１００ｇで、ＧＬの質量含有量≧２００．００ｍｇ／１００ｇで、ＧＦの質量含有量≧１００．００ｍｇ／１００ｇの米ペプチドが優れたフリーラジカル消去能、特にＤＰＰＨフリーラジカル及びＯＨフリーラジカルに対する消去能を示しており、且つメラニン合成が効果的に阻害されることが証明され、本発明に係る米ペプチドは著しい抗酸化機能及び美白機能を有しており、従来の意義上の保健応用以外に、抗酸化製品及び美白製品等にも応用することができ、これにより米タンパク粉末の応用範囲は広くなり、米原料の深加工に新たな研究方向が提供されると考えられる。

且つ、該米ペプチドにおいて、分子量が１０００ｕより小さい成分が占める割合は９０％よりも高くし、これによりヒトの腸によって完全に吸収されることに有利であり、体内で作用を発揮することが容易になる。

本発明の実施は、少なくとも以下の利点を有する。
１、本発明に係る米ペプチドは、ＧＳ、ＧＬおよびＧＦペプチドフラグメントを明確に含有し、ＧＳの質量含有量≧２００．００ｍｇ／１００ｇで、ＧＬの質量含有量≧２００．００ｍｇ／１００ｇで、ＧＦの質量含有量≧１００．００ｍｇ／１００ｇであるため、本発明の米ペプチドは著しい抗酸化機能及び美白機能を有し、関連機能製品の原料に用いられ、米ペプチド製品により広範な応用見通しを提供する。
２、本発明に係る米ペプチドの調製方法において、特殊な前処理、酵素加水分解および分離精製工程を採用することによって、特定質量含有量のペプチドフラグメントＧＳ、ＧＬおよびＧＦペプチドフラグメントを有する米タンパク深加工生成物を得る。

本発明の実施例１において米ペプチドの分子量分布ゲルクロマトグラムである。 本発明の実施例及び比較例においてＧＳ、ＧＬ及びＧＦ同定に用いられる１μｇ／ｍＬ標準サンプルマススペクトルの図である。 本発明の１００μｇ／ｍＬ実施例１において米ペプチド内のＧＳ、ＧＬ及びＧＦのマススペクトルの図である。 本発明の実施例２において米ペプチドの分子量分布ゲルクロマトグラムである。 本発明の１００μｇ／ｍＬ実施例２において米ペプチド内のＧＳ、ＧＬ及びＧＦのマススペクトルの図である。 本発明の実施例３において米ペプチドの分子量分布ゲルクロマトグラムである。 本発明の１００μｇ／ｍＬ実施例３において米ペプチド内のＧＳ、ＧＬ及びＧＦのマススペクトルの図である。 本発明の１００μｇ／ｍＬ比較例１において米ペプチド内のＧＳ、ＧＬ及びＧＦのマススペクトルの図である。 本発明の１００μｇ／ｍＬ比較例２において米ペプチド内のＧＳ、ＧＬ及びＧＦのマススペクトルの図である。 本発明の１００μｇ／ｍＬ比較例３において米ペプチド内のＧＳ、ＧＬ及びＧＦのマススペクトルの図である。 本発明の実施例１、２、３の米ペプチドおよび比較例１、２、３の米ペプチドが異なる質量濃度でＤＰＰＨフリーラジカルを消去する曲線図である。 本発明の実施例１、２、３の米ペプチドおよび比較例１、２、３の米ペプチドが異なる質量濃度でＯＨフリーラジカルを消去する曲線図である。 各試験組とＲＯＳ含有量との関係図である。 本発明の実施例１の米ペプチドが異なる質量濃度でＲＯＳ含有量との関係図である。 各試験組とＰＩＧ１細胞メラニン合成促進率との関係図である。 本発明の実施例１の米ペプチドが異なる質量濃度でＰＩＧ１細胞メラニン合成促進率との関係図である。 各試験組とＰＩＧ１細胞チロシナーゼ活性化率との関係図である。 本発明の実施例１の米ペプチドが異なる質量濃度でＰＩＧ１細胞チロシナーゼ活性化率との関係図である。

本発明の実施例の目的、技術的解決手段及び利点をより明瞭にするために、以下、本発明の実施例を参照しながら、本発明の実施例における技術的解決手段を明瞭で、且つ完全に説明し、当然ながら、記載される実施例は本発明の実施例の一部にすぎず、すべての実施例ではない。当業者が本発明における実施例に基づいて創造的な労働なしに取得されたその他のすべての実施例は、いずれも本発明の保護範囲に属する。

以下の実施例及び比較例において、米タンパク粉末は江西金農生物科技有限公司から購入し、８０グレードで、ペプシンはＳＩＧＭＡ社から購入し、３０００Ｕ／ｇで、パパインは南寧厖博から購入し、１００００００Ｕ／ｇで、アミノペプチダーゼはＮｏｖｏｚｙｍｅｓから購入し、５００ＬＡＰＵ／ｇ（1グラムあたりの製品でのロイシンアミノペプチダーゼの単位）で、アルカリプロテアーゼは南寧厖博から購入し、２０００００Ｕ／ｇで、中性プロテアーゼは南寧厖博から購入し、２０００００Ｕ／ｇで、ブロメラインは南寧厖博から購入し、５０００００Ｕ／ｇである。

実施例１

本実施例の米ペプチドは、以下の方法によって調製して得られる。
１、米タンパク粉末（タンパク含有量８０％、６０メッシュ）５００ｇを蒸気爆発反応タンクに加え、蒸気を注入し、圧力を０．６５Ｍｐａに制御し、１００ｓ保たれ、そして５．０ミリ秒で圧力を放出し、米蒸気爆発粒子を得て、
米蒸気爆発粒子へ精製水を５Ｌ加え、混合液を得る。
２、混合液を５０℃まで昇温し、濃塩酸を１０ｍＬ加えてｐＨが３．０になるように調整した後に、ペプシンを２ｇ加えて第一酵素加水分解を行い、酵素加水分解３ｈ後に第一酵素加水分解液を得て、
そして第一酵素加水分解液へ水酸化ナトリウムを４ｇ加えてｐＨが７．０になるように調整した後に、パパインを１ｇ加えて第二酵素加水分解を行い、酵素加水分解１ｈ後に第二酵素加水分解液を得て、
第二酵素加水分解液へアミノペプチダーゼを０．５ｇ加えて、酵素加水分解１ｈ後に、体系を９５℃まで昇温して３０ｍｉｎ保温して酵素不活性化を行い、第三酵素加水分解液を得る。
３、孔径が２００ｎｍのセラミック膜を採用して第三酵素加水分解液に対してろ過を行い、固体不純物を除去し、初歩的に酵素加水分解液を清澄化し、一次ろ液を得て、そして、分子量カットオフが２０００ｕのナノろ過膜を用いて一次ろ液に対して二次ろ過を行い、可溶性高分子不純物を除去し、二次ろ液を収集し、
二次ろ液を１０ｍＬ／ｍｉｎの流量で予め平衡化された水素型陽イオン交換樹脂カラムに通過させ、紫外線検出値が２００ｍＡｕより高いとき、流出液収集を開始し、サンプルを注入し終わった後に引き続き脱イオン水を用いて陽イオン交換樹脂カラムを洗浄し、紫外線検出値が２００ｍＡｕより小さいとき、流出液収集を停止し、陽イオン交換樹脂カラムから収集された流出液を１０ｍＬ／ｍｉｎの流量で予め平衡化された水酸化物型陰イオン交換樹脂カラムに通過させ、紫外線検出値が２００ｍＡｕより高いとき、収集を開始し、サンプルを注入し終わった後に引き続き脱イオン水を用いて陰イオン交換樹脂カラムを洗浄し、紫外線検出値が２００ｍＡｕより小さいとき、流出液収集を停止する。
４、真空蒸発濃縮装置を使用してイオン交換樹脂カラムによって収集された流出液に対してボーム値が２２％になるまで濃縮を行い、そして、濃縮液を噴霧乾燥塔に送り、乾燥塔入口温度が１４０℃で、本実施例の米ペプチドを得る。

生成物測定

１、米ペプチドの分子量分布検出
ＧＢ／Ｔ ２２４９２－２００８大豆ペプチド粉末の付録に規定された実験方法を採用して米ペプチドの分子量分布を検出する。

図１は、本発明の実施例１において米ペプチドの分子量分布ゲルクロマトグラムである。

表１は、実施例１において米ペプチドの分子量分布データである。

２、米ペプチド内の機能ペプチドフラグメントＧＳ、ＧＬおよびＧＦの含有量検出

超高速液体クロマトグラフＮｅｘｅｒａ Ｘ２及びトリプル四重極質量分析計複合システム（島津製作所製、日本）を利用して本実施例における米ペプチドにおけるペプチド組成を同定する。

液体クロマトグラフィー条件について、クロマトグラムカラムはＩｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ－３ （５μｍ、 ２．１＊２５０ｍｍ）で、移動相は、Ａが０．１％ギ酸水溶液で、Ｂが０．１％ギ酸アセトニトリル溶液で、グラジエント溶出プロセスは、０－１５ｍｉｎ、 Ｂ ０－５０％で、１５－２０ｍｉｎ、Ｂ ５０－１００％で、２０－２５ｍｉｎ、 Ｂ １００％で、２５．１－３５ｍｉｎ、 Ｂ ０％で、流量は０．２ｍＬ／ｍｉｎで、サンプル注入体積は１μＬで、カラム温度は４０℃である。

マススペクトル条件について、イオン化モードがＥＳＩ、陽イオンモードで、イオン噴霧電圧が＋４．５ｋＶで、噴霧ガス流量が窒素 ３．０ Ｌ／ｍｉｎで、加熱ガス流量が窒素 １０ Ｌ／ｍｉｎで、乾燥ガス流量が窒素１０ Ｌ／ｍｉｎで、ＤＬ温度が２５０℃で、加熱モジュール温度が４００℃で、イオン源温度が３００℃で、走査モードがマルチプルリアクションモニタリング（ＭＲＭ）で、滞留時間が１００ ｍｓで、遅延時間が３ ｍｓで、ＭＲＭパラメータが表２を参照する。

ペプチドフラグメント標準品の調製において、ＧＳ、ＧＬ及びＧＦ標準品粉末をそれぞれ２０．０ｍｇ正確に量り、水を加えて溶解させ、ボルテックスして均一に混ぜ、容積を１００ ｍＬまで定め、２００μｇ／ｍＬの標準ストック溶液になる。上記標準ストック溶液をそれぞれ５００μＬ取り、容積を１０ｍＬまで定め、混合標準母液１０μｇ／ｍＬを得る。上記混合標準母液を純水で次第に０．０６２５、０．１２５、０．２５、０．５、１、２．５、５及び１０μｇ／ｍＬの一連の標準作業溶液まで希釈する。

図２は、本発明の実施例及び比較例においてＧＳ、ＧＬ及びＧＦ同定に用いられる１μｇ／ｍＬ標準サンプルマススペクトルの図であり、図３は、本発明の１００μｇ／ｍＬ実施例１において米ペプチド内のＧＳ、ＧＬ及びＧＦのマススペクトルの図である。

図３と図２との比較によって、本実施例１における米ペプチド内にペプチドフラグメントＧＳ、ＧＬ及びＧＦが同時に存在することが分かる。検出により、本実施例１で調製された米ペプチド内にＧＳ含有量が２０８．３５ｍｇ／１００ｇで、ＧＬ含有量が２０８．７４ｍｇ／１００ｇで、ＧＦ含有量が１０５．６３ｍｇ／１００ｇである。

実施例２

本実施例の米ペプチドは以下の方法によって調製して得られる。
１、米タンパク粉末（タンパク含有量８０％、６０メッシュ）２００ｇを蒸気爆発反応タンクに加え、蒸気を注入し、圧力を０．６Ｍｐａに制御し、１００ｓ保たれ、そして５．０ミリ秒に圧力を放出し、米蒸気爆発粒子を得て、
米蒸気爆発粒子へ精製水を２Ｌ加え、混合液を得る。
２、混合液を５０℃まで昇温し、濃塩酸を４ｍＬ加えてｐＨが３．０になるように調整した後に、ペプシンを１ｇ加えて第一酵素加水分解を行い、酵素加水分解３ｈ後に第一酵素加水分解液を得て、
そして第一酵素加水分解液へ水酸化ナトリウムを１．５ｇ加えてｐＨが６．５になるように調整した後に、パパインを０．４ｇ加えて第二酵素加水分解を行い、酵素加水分解１．５ｈ後に第二酵素加水分解液を得て、
第二酵素加水分解液へアミノペプチダーゼを０．２ｇ加え、酵素加水分解１ｈ後に、体系を９５℃まで昇温して３０ｍｉｎ保温して酵素不活性化を行い、第三酵素加水分解液を得る。
３、孔径が５０ｎｍのセラミック膜を採用して第三酵素加水分解液に対してろ過を行い、固体不純物を除去し、初歩的に酵素加水分解液を清澄化し、一次ろ液を得て、そして分子量カットオフが５０００ｕのナノろ過膜を用いて一次ろ液に対して二次ろ過を行い、可溶性高分子不純物を除去し、二次ろ液を収集し、
二次ろ液を５ｍＬ／ｍｉｎの流量で予め平衡化された水素型陽イオン交換樹脂カラムに通過させ、紫外線検出値が２００ｍＡｕより高いとき、流出液収集を開始し、サンプルを注入し終わった後に引き続き脱イオン水を用いて陽イオン交換樹脂カラムを洗浄し、紫外線検出値が２００ｍＡｕより小さいとき、流出液収集を停止し、陽イオン交換樹脂カラムから収集された流出液を５ｍＬ／ｍｉｎの流量で予め平衡化された水酸化物型陰イオン交換樹脂カラムに通過させ、紫外線検出値が２００ｍＡｕより高いとき、収集を開始し、サンプルを注入し終わった後に引き続き脱イオン水を用いて陰イオン交換樹脂カラムを洗浄し、紫外線検出値が２００ｍＡｕより小さいとき、流出液収集を停止する。
４、真空蒸発濃縮装置を使用してイオン交換樹脂カラムによって収集された流出液に対してボーム値が２０％になるまで濃縮を行い、そして、濃縮液を噴霧乾燥塔に送り、乾燥塔入口温度が１４０℃で、本実施例の米ペプチドを得る。

生成物測定

１、実施例１と同じ方法を採用して本実施例の米ペプチドの分子量分布を検出する。

図４は、本発明の実施例２において米ペプチドの分子量分布ゲルクロマトグラムである。

表３は、実施例２において米ペプチドの分子量分布データである。

２、実施例１と同じ方法を採用して米ペプチド内の機能ペプチドフラグメントＧＳ、ＧＬ及びＧＦの含有量を検出する。

図５は、本発明の１００μｇ／ｍＬ実施例２において米ペプチド内のＧＳ、ＧＬ及びＧＦのマススペクトルの図である。

図５と図２との比較によって、本実施例２における米ペプチド内にペプチドフラグメントＧＳ、ＧＬ及びＧＦが同時に存在することが分かる。検出により、本実施例２で調製された米ペプチド内には、ＧＳ含有量が２０５．５８ｍｇ／１００ｇで、ＧＬ含有量が２１０．７５ｍｇ／１００ｇで、ＧＦ含有量が１０３．９５ｍｇ／１００ｇである。

実施例３

本実施例の米ペプチドは以下の方法によって調製して得られる。
１、米タンパク粉末（タンパク含有量８０％、６０メッシュ）１００ｇを蒸気爆発反応タンクに加え、蒸気を注入し、圧力を０．６Ｍｐａに制御し、１００ｓ保たれ、そして５．０ミリ秒で圧力を放出し、米蒸気爆発粒子を得て、
米蒸気爆発粒子へ精製水を５Ｌ加え、混合液を得る。
２、混合液を５０℃まで昇温し、濃塩酸を２ｍＬ加えてｐＨが３．０になるように調整した後に、ペプシンを０．３ｇ加えて第一酵素加水分解を行い、酵素加水分解３ｈ後に第一酵素加水分解液を得て、
そして第一酵素加水分解液へ水酸化ナトリウム１．０ｇを加えてｐＨが７．５になるように調整した後に、パパインを０．２ｇ加えて第二酵素加水分解を行い、酵素加水分解１．５ｈ後に第二酵素加水分解液を得て、
第二酵素加水分解液へアミノペプチダーゼを０．１ｇ加え、酵素加水分解０．５ｈ後に、体系を９５℃まで昇温して３０ｍｉｎ保温して酵素不活性化を行い、第三酵素加水分解液を得る。
３、孔径が２００ｎｍのセラミック膜を採用して第三酵素加水分解液に対してろ過を行い、固体不純物を除去し、初歩的に酵素加水分解液を清澄化し、一次ろ液を得て、そして分子量カットオフが５０００ｕのナノろ過膜を用いて一次ろ液に対して二次ろ過を行い、可溶性高分子不純物を除去し、二次ろ液を収集し、
二次ろ液を１ｍＬ／ｍｉｎの流量で予め平衡化された水素型陽イオン交換樹脂カラムに通過させ、紫外線検出値が２００ｍＡｕより高いとき、流出液収集を開始し、サンプルを注入し終わった後に引き続き脱イオン水を用いて陽イオン交換樹脂カラムを洗浄し、紫外線検出値が２００ｍＡｕより小さいとき、流出液収集を停止し、陽イオン交換樹脂カラムから収集された流出液を１ｍＬ／ｍｉｎの流量で予め平衡化された水酸化物型陰イオン交換樹脂カラムに通過させ、紫外線検出値が２００ｍＡｕより高いとき、収集を開始し、サンプルを注入し終わった後に引き続き脱イオン水を用いて陰イオン交換樹脂カラムを洗浄し、紫外線検出値が２００ｍＡｕより小さいとき、流出液収集を停止する。
４、真空蒸発濃縮装置を使用してイオン交換樹脂カラムによって収集された流出液に対してボーム値が１８％になるまで濃縮を行い、そして、濃縮液を噴霧乾燥塔に送り、乾燥塔入口温度が１４０℃で、本実施例の米ペプチドを得る。

生成物測定

１、実施例１と同じ方法を採用して本実施例の米ペプチドの分子量分布を検出する。

図６は、本発明の実施例３において米ペプチドの分子量分布ゲルクロマトグラムである。

表４は、実施例３において米ペプチドの分子量分布データである。

２、実施例１と同じ方法を採用して米ペプチド内の機能ペプチドフラグメントＧＳ、ＧＬ及びＧＦの含有量を検出する。

図７は、本発明の１００μｇ／ｍＬ実施例３において米ペプチド内のＧＳ、ＧＬ及びＧＦのマススペクトルの図である。

図７と図２との比較によって、本実施例３における米ペプチド内にペプチドフラグメントＧＳ、ＧＬ及びＧＦが同時に存在することが分かる。検出により、本実施例３で調製された米ペプチド内には、ＧＳ含有量が２０３．６７ｍｇ／１００ｇで、ＧＬ含有量が２０７．８５ｍｇ／１００ｇで、ＧＦ含有量が１０４．５４ｍｇ／１００ｇである。

比較例１

本比較例の米ペプチドは、以下の方法によって調製して得られる。
１、米タンパク粉末（タンパク含有量８０％、６０メッシュ）５００ｇを５Ｌの精製水に加え、混合液を得る。
２、混合液を５０℃まで昇温し、濃塩酸１０ｍＬを加えてｐＨが３．０になるように調整した後に、ペプシン２ｇを加えて第一酵素加水分解を行い、酵素加水分解３ｈ後に第一酵素加水分解液を得て、
そして第一酵素加水分解液へ水酸化ナトリウム４ｇを加えてｐＨが７．０になるように調整した後に、パパイン１ｇを加えて第二酵素加水分解を行い、酵素加水分解１ｈ後に第二酵素加水分解液を得て、
第二酵素加水分解液へアミノペプチダーゼ０．５ｇを加え、酵素加水分解１ｈ後に、体系を９５℃まで昇温して３０ｍｉｎ保温して酵素不活性化を行い、第三酵素加水分解液を得る。
３、孔径が２００ｎｍのセラミック膜を採用して第三酵素加水分解液に対してろ過を行い、固体不純物を除去し、初歩的に酵素加水分解液を清澄化し、一次ろ液を得て、そして、分子量カットオフが２０００ｕのナノろ過膜を用いて一次ろ液に対して二次ろ過を行い、可溶性高分子不純物を除去し、二次ろ液を収集し、
二次ろ液を１０ｍＬ／ｍｉｎの流量で予め平衡化された水素型陽イオン交換樹脂カラムに通過させ、紫外線検出値が２００ｍＡｕより高いとき、流出液収集を開始し、サンプルを注入し終わった後に引き続き脱イオン水を用いて陽イオン交換樹脂カラムを洗浄し、紫外線検出値が２００ｍＡｕより小さいとき、流出液収集を停止し、陽イオン交換樹脂カラムから収集された流出液を１０ｍＬ／ｍｉｎの流量で予め平衡化された水酸化物型陰イオン交換樹脂カラムに通過させ、紫外線検出値が２００ｍＡｕより高いとき、収集を開始し、サンプルを注入し終わった後に引き続き脱イオン水を用いて陰イオン交換樹脂カラムを洗浄し、紫外線検出値が２００ｍＡｕより小さいとき、流出液収集を停止する。
４、真空蒸発濃縮装置を使用してイオン交換樹脂カラムによって収集された流出液に対してボーム値が２１％になるまで濃縮を行い、そして、濃縮液を噴霧乾燥塔に送り、乾燥塔入口温度が１４０℃で、本比較例の米ペプチドを得る。

生成物測定

１、実施例１と同じ方法を採用して米ペプチド内の機能ペプチドフラグメントＧＳ、ＧＬ及びＧＦの含有量を検出する。

図８は、本発明の１００μｇ／ｍＬ比較例１において米ペプチド内のＧＳ、ＧＬ及びＧＦのマススペクトルの図である。

図８と図２との比較によって、本比較例１における米ペプチド内にペプチドフラグメントＧＳ、ＧＬ及びＧＦが同時に存在することが分かる。検出により、本比較例１で調製された米ペプチド内には、ＧＳ含有量が１４５．８６ｍｇ／１００ｇで、ＧＬ含有量が１５３．６１ｍｇ／１００ｇで、ＧＦ含有量が７６．８４ｍｇ／１００ｇである。

比較例２

本比較例の米ペプチドは、以下の方法によって調製して得られる。
１、米タンパク粉末（タンパク含有量８０％、６０メッシュ）５００ｇを蒸気爆発反応タンクに加え、蒸気を注入し、圧力を０．６５Ｍｐａに制御し、１００ｓ保たれ、そして５．０ミリ秒で圧力を放出し、米蒸気爆発粒子を得て、
米蒸気爆発粒子へ精製水を５Ｌ加え、混合液を得る。
２、混合液を５０℃まで昇温し、水酸化ナトリウムを４ｇ加えてｐＨが８．０になるように調整し、アルカリプロテアーゼを５ｇ、中性プロテアーゼを２ｇ加え、ともに酵素加水分解３ｈ後に、ブロメラインを１ｇ加え、引き続き酵素加水分解１ｈ後に、体系を９５℃まで昇温して３０ｍｉｎ保温して酵素不活性化を行い、酵素加水分解液を得る。
３、孔径が２００ｎｍのセラミック膜を採用して酵素加水分解液に対してろ過を行い、固体不純物を除去し、初歩的に酵素加水分解液を清澄化し、一次ろ液を得て、そして分子量カットオフが２０００ｕのナノろ過膜を用いて一次ろ液に対して二次ろ過を行い、可溶性高分子不純物を除去し、二次ろ液を収集し、
二次ろ液を１０ｍＬ／ｍｉｎの流量で予め平衡化された水素型陽イオン交換樹脂カラムに通過させ、紫外線検出値が２００ｍＡｕより高いとき、流出液収集を開始し、サンプルを注入し終わった後に引き続き脱イオン水を用いて陽イオン交換樹脂カラムを洗浄し、紫外線検出値が２００ｍＡｕより小さいとき、流出液収集を停止し、陽イオン交換樹脂カラムから収集された流出液を１０ｍＬ／ｍｉｎの流量で予め平衡化された水酸化物型陰イオン交換樹脂カラムに通過させ、紫外線検出値が２００ｍＡｕより高いとき、収集を開始し、サンプルを注入し終わった後に引き続き脱イオン水を用いて陰イオン交換樹脂カラムを洗浄し、紫外線検出値が２００ｍＡｕより小さいとき、流出液収集を停止する。
４、真空蒸発濃縮装置を使用してイオン交換樹脂カラムによって収集された流出液に対してボーム値が２０％になるまで濃縮を行い、そして、濃縮液を噴霧乾燥塔に送り、乾燥塔入口温度が１４０℃で、本比較例の米ペプチドを得る。

生成物測定

１、実施例１と同じ方法を採用して米ペプチド内の機能ペプチドフラグメントＧＳ、ＧＬ及びＧＦの含有量を検出する。

図９は、本発明の１００μｇ／ｍＬ比較例２において米ペプチド内のＧＳ、ＧＬ及びＧＦのマススペクトルの図である。

図９と図２との比較によって、本比較例２における米ペプチド内にペプチドフラグメントＧＳ、ＧＬ及びＧＦが同時に存在することが分かる。検出により、本比較例２で調製された米ペプチド内には、ＧＳ含有量が９５．３５ｍｇ／１００ｇで、ＧＬ含有量が１０８．９８ｍｇ／１００ｇで、ＧＦ含有量が４９．８３ｍｇ／１００ｇである。

比較例３

本比較例の米ペプチドは、以下の方法によって調製して得られる。
１、米タンパク粉末（タンパク含有量８０％、６０メッシュ）５００ｇを蒸気爆発反応タンクに加え、蒸気を注入し、圧力を０．６５Ｍｐａに制御し、１００ｓ保たれ、そして５．０ミリ秒で圧力を放出し、米蒸気爆発粒子を得て、
米蒸気爆発粒子へ精製水を５Ｌ加え、混合液を得る。
２、混合液を５０℃まで昇温し、濃塩酸を１０ｍＬ加えてｐＨが３．０になるように調整した後に、ペプシンを２ｇ加えて第一酵素加水分解を行い、酵素加水分解３ｈ後に第一酵素加水分解液を得て、
そして第一酵素加水分解液へ水酸化ナトリウムを４ｇ加えてｐＨが７．０になるように調整した後に、パパインを１ｇ加えて第二酵素加水分解を行い、酵素加水分解１ｈ後に第二酵素加水分解液を得て、
第二酵素加水分解液へアミノペプチダーゼを０．５ｇ加え、酵素加水分解１ｈ後に、体系を９５℃まで昇温して３０ｍｉｎ保温して酵素不活性化を行い、第三酵素加水分解液を得る。
３、孔径が２００ｎｍのセラミック膜を採用して第三酵素加水分解液に対してろ過を行い、固体不純物を除去し、初歩的に酵素加水分解液を清澄化し、一次ろ液を得て、そして、分子量カットオフが２０００ｕのナノろ過膜を用いて一次ろ液に対して二次ろ過を行い、可溶性高分子不純物を除去し、二次ろ液を収集する。
４、真空蒸発濃縮装置を使用して二次ろ液に対してボーム値が２３％になるまで濃縮を行い、そして、濃縮液を噴霧乾燥塔に送り、乾燥塔入口温度が１４０℃で、本比較例の米ペプチドを得る。

生成物測定

１、実施例１と同じ方法を採用して米ペプチド内の機能ペプチドフラグメントＧＳ、ＧＬ及びＧＦの含有量を検出する。

図１０は、本発明の１００μｇ／ｍＬ比較例３において米ペプチド内のＧＳ、ＧＬ及びＧＦのマススペクトルの図である。

図１０と図２との比較によって、本比較例３における米ペプチド内にペプチドフラグメントＧＳ、ＧＬ及びＧＦが同時に存在することが分かる。検出により、本比較例３で調製された米ペプチド内には、ＧＳ含有量が７１．３９ｍｇ／１００ｇで、ＧＬ含有量が７５．８１ｍｇ／１００ｇで、ＧＦ含有量が３４．６８ｍｇ／１００ｇである。

下記方法を利用してサンプルの抗酸化機能及び美白機能を評価する。

抗酸化機能評価

ａ．ＤＰＰＨフリーラジカル消去能の測定

質量濃度が異なるサンプル溶液と０．１ｍＭのＤＰＰＨ－無水エタノール溶液とを１:３の体積比率で均一に混ぜて、遮光条件で、室温で３０ｍｉｎ反応し、５１７ｎｍで吸光度（Ａ_１）を計測する。相応的に、質量濃度が異なるサンプル溶液と無水エタノール溶液とを１:３の体積比率で均一に混ぜて、遮光条件で室温で３０ｍｉｎ保存され、５１７ｎｍで吸光度（Ａ_２）を計測する。蒸留水と０．１ｍＭのＤＰＰＨ－無水エタノール溶液とを１:３の体積比率で均一に混ぜて、遮光条件で室温で３０ｍｉｎ保存され、５１７ｎｍで吸光度（Ａ_０）を計測する。以下の式にしたがってサンプルのＤＰＰＨフリーラジカルに対する消去率を計算して得る。

ｂ．ＯＨフリーラジカル消去能の測定

質量濃度が異なるサンプル溶液と５ｍＭのＦeＳＯ_４と５ｍＭのサリチル酸－無水エタノール溶液とを１:２:２の体積比率で均一に混ぜて、１体積の５ｍＭのＨ_２Ｏ_２溶液で反応を始動し、３７℃の恒温水で反応を１ｈインキュベートし、５１０ｎｍで吸光度（Ａ_１）を計測する。相応的に、１体積の水で５ｍＭのＨ_２Ｏ_２溶液を代替し、残る試薬比率が変わらず、３７℃の恒温水で反応を１ｈインキュベートし、５１０ｎｍで吸光度（Ａ_２）を計測する。蒸留水でサンプル溶液を代替し、残る試薬比率が変わらず、３７℃の恒温水で反応を１ｈインキュベートし、５１０ｎｍで吸光度（Ａ_０）を計測する。以下の式にしたがって米ペプチドによるＯＨフリーラジカルの消去率を計算して得る。

ｃ．ＲＯＳ含有量低下能力の測定

密度１．０×１０^５個／ｍＬのヒト皮膚メラノサイト（ＰＩＧ１細胞）でウェルあたり２ｍＬの６ウェル細胞培養プレートに接種し、３７℃で置いて、５％ＣＯ_２の細胞インキュベーターで２４ｈ培養する。この後に６ウェルでの細胞上清液を注意深く取り除き、ＰＢＳで洗浄し、サンプル含有の不完全な培地を加え、４ｈインキュベートする。インキュベート完了後に、サンプル含有の培養液を注ぎ出し、ＰＢＳで洗浄し、ウェルあたりに０．５ｍＬのＰＢＳ緩衝液を加えて底面を覆い、ＵＶＢを照射する（照射線量が７００ｍＪ／ｃｍ^２である）。最終濃度が１０μｍｏｌ／Ｌの蛍光染料ＤＣＦＨ－ＤＡを加え、３７℃で、５％ＣＯ_２の細胞インキュベーターで３０ｍｉｎインキュベートし、そして上清液を吸引して取り除き、ＰＢＳで注意深く３回洗浄する。消化し、完全な培地まで終了し、フローサイトメーターにおいて相対蛍光値を測定する。人の皮膚メラノサイト内抗酸化能力はＲＯＳ含有量で示され、計算式は、以下の通りである。

美白機能評価

ａ． メラニン合成促進率の測定

細胞密度を２．０×１０^５個／ｍＬに調整し、２ｍＬ／ウェルで６ウェルプレートに入れて、２４ｈ細胞接着した後に、培養液を捨てる。ウェルあたりに０．５ｍＬのＰＢＳ緩衝液で底面を覆い、ＵＶＢを照射し、照射線量が７００ｍＪ／ｃｍ^２である。照射完了後に、ＰＢＳ溶液を捨て、サンプル含有のＤＭＥＭ不完全な培地を加えて２４ｈインキュベートする。細胞インキュベーターから取り出し、上清液を捨て、ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、各ウェルに２００μＬの１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００溶液を加え、－８０℃冷蔵庫に入れて３０ｍｉｎ後に溶解し、１２０００ｒ／ｍｉｎで１０ｍｉｎ遠心分離し、沈殿に１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ（１０％ＤＭＳＯ含有）を加えて溶解して均一に混ぜ、９０℃で３０ｍｉｎ水浴し、４０５ｎｍで吸光値を読み取り、遠心分離された上清液はＢＣＡ法でタンパク含有量を測定する。各組の吸光値を測定した後に、それぞれ各組の上清液のタンパク含有量で割って、平均吸光値になり、平均吸光値でメラニン合成促進率を計算し、式は以下の通りである。

b． Ｌ－ＤＯＰＡ法によるチロシナーゼ活性の活性化率の測定

ａ．実験方法における上清液を取り、同量の０．１％レボドパ（Ｌ－ＤＯＰＡ）を加えて３７℃で１ｈインキュベートし、４７５ｎｍでの吸光値を計測し、計算式は以下の通りである。

実施例１－３における米ペプチドおよび比較例１－３における米ペプチドをサンプルとして以下の試験を行う。

試験例１

ＤＰＰＨは、安定した有機フリーラジカルで、サンプルのＤＰＰＨフリーラジカルに対する消去能を検出することによってその抗酸化性の強弱を示すことができる。

図１１は、本発明の実施例１、２、３の米ペプチドおよび比較例１、２、３の米ペプチドが異なる質量濃度でＤＰＰＨフリーラジカルを消去する曲線図である。図１１に示すように、米ペプチド濃度の増大につれて、実施例および比較例の米ペプチドのＤＰＰＨフリーラジカルに対する消去率も徐々に増大するが、実施例の米ペプチドのＤＰＰＨフリーラジカル消去率は比較例の米ペプチドのＤＰＰＨフリーラジカル消去率より著しく優れている。実施例１の場合、ＤＰＰＨフリーラジカル消去率が７０％程度に安定しており、且つＩＣ_５０＝５ｍｇ／ｍＬである。

試験例２

ＯＨフリーラジカル（－ＯＨ）は、酸化能力が非常に強いフリーラジカルで、生命活動における酸化代謝過程に参加しやすく、ＤＮＡ鎖の切断、タンパク質の酸化、脂質の酸化等を引き起こし、ひいては細胞のアポトーシス、色素沈着等一連の反応を引き起こす。

図１２は、本発明の実施例１、２、３の米ペプチドおよび比較例１、２、３の米ペプチドが異なる質量濃度でＯＨフリーラジカルを消去する曲線図である。図１２に示すように、米ペプチド濃度の増大につれて、実施例および比較例の米ペプチドの－ＯＨに対する消去能が徐々に増強できるが、実施例の米ペプチドの－ＯＨ消去能は比較例の米ペプチドの－ＯＨ消去能より著しく優れている。実施例１の場合、その－ＯＨ消去率が５０％程度に安定している。

試験例３

ＲＯＳは、酸素を必要としている生物が代謝過程で生成した酸素より活性が高い酸素含有活性物質で、ＲＯＳが過量になると、有機体組織細胞の酸化ストレス反応を引き起こし、生物学的高分子物質に損傷を与え、正常な生物学的機能に影響を与え、ＲＯＳ含有量変化が抗酸化能力の重要な指標の１つである。

本試験例において、２種類の異なる試験方法を採用して米ペプチドとＲＯＳ含有量との関係について試験して説明する。

第１種の試験方法（方法１）は、ＵＶＢ誘導を先にして、サンプル注入をその次にする方法で、即ち、１．０×１０^５個／ｍＬの密度でヒト皮膚メラノサイト（ＰＩＧ１細胞）をウェルあたり２ｍＬで６ウェル細胞培養プレートに接種し、３７℃で置いて、５％ＣＯ_２の細胞インキュベーターで２４ｈ培養する。この後に６ウェルでの細胞上清液を注意深く取り除き、ＰＢＳで洗浄し、ウェルあたりに０．５ｍＬのＰＢＳ緩衝液を加えて底面を覆い、ＵＶＢを照射（照射線量が７００ｍＪ／ｃｍ^２である）した後に、サンプル含有の不完全な培地を加え、４ｈインキュベートする。インキュベート完了後に、サンプル含有の培養液を注ぎ出し、ＰＢＳで洗浄し、最終濃度が１０μｍｏｌ／Ｌの蛍光染料ＤＣＦＨ－ＤＡを加え、３７℃で、５％ＣＯ_２の細胞インキュベーターで３０ｍｉｎインキュベートし、そして上清液を吸引して取り除き、ＰＢＳで注意深く３回洗浄する。消化し、完全な培地まで終了し、フローサイトメーターにおいて相対蛍光値を測定する。

第２種の試験方法（方法２）は、サンプル注入を先にして、ＵＶＢ誘導をその次にする方法で、即ち、１．０×１０^５個／ｍＬの密度でヒト皮膚メラノサイト（ＰＩＧ１細胞）をウェルあたり２ｍＬで６ウェル細胞培養プレートに接種し、３７℃で置いて、５％ＣＯ_２の細胞インキュベーターで２４ｈ培養する。この後に６ウェルでの細胞上清液を注意深く取り除き、ＰＢＳで洗浄し、サンプル含有の不完全な培地を加え、２ｈインキュベートする。インキュベート完了後に、サンプル含有の培養液を注ぎ出し、ＰＢＳで洗浄し、ウェルあたりに０．５ｍＬのＰＢＳ緩衝液を加えて底面を覆い、ＵＶＢを照射する（照射線量が７００ｍＪ／ｃｍ^２である）。サンプル含有の不完全な培地を加え、引き続き２ｈインキュベートする。インキュベート完了後に、サンプル含有の培養液を注ぎ出し、ＰＢＳで洗浄し、最終濃度が１０μｍｏｌ／Ｌの蛍光染料ＤＣＦＨ－ＤＡを加え、３７℃で、５％ＣＯ_２の細胞インキュベーターで３０ｍｉｎインキュベートし、そして上清液を吸引して取り除き、ＰＢＳで注意深く３回洗浄する。消化し、完全な培地まで終了し、フローサイトメーターにおいて相対蛍光値を測定する。

図１３は、各試験組とＲＯＳ含有量との関係図である。図１３で、空白組にはＰＩＧ１細胞でＵＶＢ光照射を提供せず、モデル組にはＰＩＧ１細胞でＵＶＢ（７００ｍＪ／ｃｍ^２）光照射を提供し、陽性対照組には１０μｇ／ｍＬアルブチン＋ＰＩＧ１細胞でＵＶＢ（７００ｍＪ／ｃｍ^２）光照射を提供し、サンプル組１には１００μｇ／ｍＬの実施例１における米ペプチド＋ＰＩＧ１細胞でＵＶＢ（７００ｍＪ／ｃｍ^２）光照射を提供し、サンプル組２には１００μｇ／ｍＬの実施例２における米ペプチド＋ＰＩＧ１細胞でＵＶＢ（７００ｍＪ／ｃｍ^２）光照射を提供し、サンプル組３には１００μｇ／ｍＬの実施例３における米ペプチド＋ＰＩＧ１細胞でＵＶＢ（７００ｍＪ／ｃｍ^２）光照射を提供し、サンプル組４には１００μｇ／ｍＬの比較例１における米ペプチド＋ＰＩＧ１細胞でＵＶＢ（７００ｍＪ／ｃｍ^２）光照射を提供し、サンプル組５には１００μｇ／ｍＬの比較例２における米ペプチド＋ＰＩＧ１細胞でＵＶＢ（７００ｍＪ／ｃｍ^２）光照射を提供し、サンプル組６には１００μｇ／ｍＬの比較例３における米ペプチド＋ＰＩＧ１細胞でＵＶＢ（７００ｍＪ／ｃｍ^２）光照射を提供する。図１３に示すように、モデル組から分かるように、方法１と方法２により、細胞内ＲＯＳ含有量を極めて著しく向上させ、酸化ストレス反応が発生することができ、方法１によって生成されたＲＯＳは方法２によって生成されたＲＯＳよりも多くし、それぞれ１８６．５％と１６３．３％であり、陽性対照組とサンプル組１－６は、ＲＯＳ含有量を著しく低下させ、サンプル組４－６でのＲＯＳ含有量および陽性対照組でのＲＯＳ含有量はいずれもサンプル組１－３でのＲＯＳ含有量よりも高くし、即ち、比較例１－３と陽性対照組での抗酸化効果は実施例１－３よりも劣っていることが分かる。

図１４は、本発明の実施例１の米ペプチドが異なる質量濃度でＲＯＳ含有量との関係図である。図１４では、空白組にはＰＩＧ１細胞でＵＶＢ光照射を提供せず、モデル組にはＰＩＧ１細胞でＵＶＢ（７００ｍＪ／ｃｍ^２）光照射を提供し、陽性対照組には１０μｇ／ｍＬアルブチン＋ＰＩＧ１細胞でＵＶＢ（７００ｍＪ／ｃｍ^２）光照射を提供し、サンプル組１には５０μｇ／ｍＬの実施例１における米ペプチド＋ＰＩＧ１細胞でＵＶＢ（７００ｍＪ／ｃｍ^２）光照射を提供し、サンプル組２には１００μｇ／ｍＬの実施例１における米ペプチド＋ＰＩＧ１細胞でＵＶＢ（７００ｍＪ／ｃｍ^２）光照射を提供し、サンプル組３には２００μｇ／ｍＬの実施例１における米ペプチド＋ＰＩＧ１細胞でＵＶＢ（７００ｍＪ／ｃｍ^２）光照射を提供する。
図１４に示すように、実施例１における米ペプチド濃度の増大につれて、ＲＯＳ含有量を低下させる能力が強くなり、方法２における２００μｇ／ｍＬの米ペプチドによる酸化ストレス反応低下効果が最も優れており、このときＲＯＳ含有量が１１３％である。

試験例４

人間の肌の色はメラノサイトによって生成されたメラニンが皮膚における含有量や分布状態に関連し、肌の色の発色過程は、メラノサイトにおけるメラノソームがメラニンを合成してメラニンを包んで角質細胞に転送し、角質細胞がメラニンを摂取して発色し、上に皮膚角質層に移動し、最終の肌の色を形成することである。

図１５は、各試験組とＰＩＧ１細胞メラニン合成促進率との関係図である。図１５では、空白組、モデル組、陽性対照組、サンプル組１－６はいずれも図１３と同じである。図１５に示すように、モデル組から分かるように、方法１と方法２は、いずれもメラニン含有量を極めて著しく向上させることができ、メラニン合成促進率がそれぞれ１２．２％と８．０％であり、陽性対照組では、メラニン合成促進率を極めて著しく低下させることができ、サンプル組１－３では、メラニン合成促進率を極めて著しく低下させることができ、サンプル組４－６では、メラニン合成促進率を極めて著しく低下させることができないため、実施例１－３において、メラニン合成促進率の低下効果は比較例１－３より強い。

図１６は、本発明の実施例１の米ペプチドが異なる質量濃度でＰＩＧ１細胞メラニン合成促進率との関係図である。図１６では、空白組、モデル組、陽性対照組、サンプル組１－３はいずれも図１４と同じである。

図１６に示すように、方法１で処理されるとき、実施例１の２００μｇ／ｍＬの米ペプチドによるメラニン合成促進率低下の能力が最も強く、このとき促進率が１．１％であり、方法２で処理されるとき、米ペプチド濃度の増大につれて、メラニン合成促進率が徐々に低下し、２００μｇ／ｍＬのとき、２．４％である。総合的に、方法２によるメラニン合成促進率がより低くし、効果がより優れる。

試験例５

メラニンの合成に必要とされる３種の物質は、基質チロシン、反応の肝心な酵素－チロシナーゼおよび酸素元素である。チロシナーゼは、銅含有の酸化還元酵素で、生命体に広く存在しており、メラニン生成のための律速酵素であり、Ｌ－チロシンをＬ－レボドパ（Ｌ－ＤＯＰＡ）に触媒し、さらに酸化によってＬ－ドーパキノンになり、メラニンを合成する。

図１７は、各試験組とＰＩＧ１細胞チロシナーゼ活性化率との関係図である。図１７では、空白組、モデル組、陽性対照組、サンプル組１－６はいずれも図１３と同じである。図１７に示すように、モデル組では、チロシナーゼ活性化率を極めて著しく向上させることができ、それぞれ２１．０％と１７．６％であり、陽性対照組とサンプル組１－３では、いずれもチロシナーゼ活性化率を極めて著しく低下させることができ、サンプル組４－６では、チロシナーゼ活性化率を低下させることができないため、比較例１－３でのチロシナーゼ活性低下能力は実施例１－３より劣っている。

図１８は、本発明の実施例１の米ペプチドが異なる質量濃度でＰＩＧ１細胞チロシナーゼ活性化率との関係図である。図１８では、空白組、モデル組、陽性対照組、サンプル組１－３はいずれも図１４と同じである。

図１８に示すように、実施例１における米ペプチド濃度の増大につれて、ＰＩＧ１細胞チロシナーゼ活性化率が徐々に低下し、方法１で処理されるとき、２００μｇ／ｍＬの米ペプチドによるチロシナーゼ活性化率低下能力は最も強い。このとき、方法２によるチロシナーゼ活性化（１０．２％）率とほぼ同じである。

図１３－図１８では、「＊」は空白組に比べて、Ｐ＜０．０５であることを表し、「＊＊」は空白組に比べて、Ｐ＜０．０１であることを表し、「＃」はモデル組に比べて、Ｐ＜０．０５であることを表し、「＃＃」はモデル組に比べて、Ｐ＜０．０１であることを表す。

最後に説明すべきものとして、以上の各実施例は、本発明の技術的解決手段を説明するためのものだけであり、これを制限するものではなく、前述の各実施例を参照しながら本発明を詳細に説明したが、当業者であれば、依然として前述の各実施例に記載の技術的解決手段を修正するか、又はそのうちの一部又はすべての技術的特徴に対して等価置換を行うことができ、これらの修正又は置換は、対応する技術的解決手段の本質を本発明の各実施例の技術的解決手段の主旨から逸脱しないと理解すべきである。

Claims (10)

1. 美白機能を有する米ペプチドであって、前記米ペプチドの組成には少なくともペプチドフラグメントＧＳ、ＧＬおよびＧＦが含まれ、
   米ペプチドの質量に基づいて、前記ペプチドフラグメントＧＳの含有量≧２００．００ｍｇ／１００ｇで、ペプチドフラグメントＧＬの含有量≧２００．００ｍｇ／１００ｇで、ペプチドフラグメントＧＦの含有量≧１００．００ｍｇ／１００ｇであることを特徴とする米ペプチド。
2. 前記米ペプチド内には、分子量が１０００ｕより小さいペプチドの質量含有量≧９０％であることを特徴とする請求項１に記載の米ペプチド。
3. 前記米ペプチドは米タンパク原料に対して順次に蒸気爆発処理、酵素加水分解処理および分離精製処理を行うことによって取得されたものであり、
   ここで、前記酵素加水分解処理は、順次にペプシン、パパインおよびアミノペプチダーゼを利用して３段階の酵素加水分解を行うことを含むことを特徴とする請求項１又は２に記載の米ペプチド。
4. 請求項１－３のいずれか１項に記載の米ペプチドの調製方法であって、
   米タンパク原料に対して蒸気爆発処理を行った後に、水を加えて混合液を製造するステップと、
   前記混合液のｐＨを酸性に調整した後にペプシンを加えて第一酵素加水分解を行い、１．５－３ｈ後に、第一酵素加水分解液を得るステップと、
   前記第一酵素加水分解液のｐＨを弱酸又は中性に調整した後に、パパインを加えて第二酵素加水分解を行い、１－２ｈ後に、第二酵素加水分解液を得るステップと、
   前記第二酵素加水分解液へアミノペプチダーゼを加えて第三酵素加水分解を行い、０．５－１ｈ後に、酵素を不活性化させ、第三酵素加水分解液を得るステップと、
   前記第三酵素加水分解液に対して順次にろ過および樹脂精製処理を行い、前記米ペプチドを得るステップと、を含むことを特徴とする米ペプチドの調製方法。
5. 前記蒸気爆発処理は、前記米タンパク原料が０．５－１．５Ｍｐａの蒸気圧で３０－１２０ｓ保たれた後に、前記米タンパク粉末が３．０－８．５ｍｓ内に圧力を放出し、米蒸気爆発粒子を得ることを含むことを特徴とする請求項４に記載の米ペプチドの調製方法。
6. 水と前記米タンパク原料との質量比が（５－２０）：１であるように、前記米蒸気爆発粒子へ水を加え、前記混合液を得ることを特徴とする請求項５に記載の米ペプチドの調製方法。
7. 前記米タンパク原料におけるタンパク含有量に基づいて、前記ペプシンの投与量が６００－１５００Ｕ／１００ｇで、前記パパインの投与量が１０００００－２０００００Ｕ／１００ｇで、前記アミノペプチダーゼの投与量が５０－１５０ＬＡＰＵ／１００ｇであることを特徴とする請求項４に記載の米ペプチドの調製方法。
8. 前記第三酵素加水分解液を多段階ろ過で処理するステップは、
   孔径が５０－２００ｎｍのろ過膜を採用して前記第三酵素加水分解液に対して一次ろ過を行い、一次ろ液を収集するステップと、
   分子量カットオフが２０００－５０００ｕのナノろ過膜を採用して前記一次ろ液に対して二次ろ過を行い、二次ろ液を得るステップと、を含むことを特徴とする請求項４に記載の米ペプチドの調製方法。
9. 前記樹脂精製処理は、前記二次ろ液に対して順次に陽イオン交換樹脂精製処理及び陰イオン交換樹脂精製処理を行うことを含むことを特徴とする請求項８に記載の米ペプチドの調製方法。
10. 抗酸化製品及び美白製品における、請求項１－３のいずれか１項に記載の米ペプチドの応用。

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