CN117965668A

CN117965668A - 一种具有抗氧化和抗衰老功能的牛骨胶原蛋白肽及其制备方法与应用

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Publication number: CN117965668A
Application number: CN202410116185.6A
Authority: CN
Inventors: 张恒; 罗永康; 刘怀高
Original assignee: People's Peptide Group Co ltd
Current assignee: People's Peptide Group Co ltd
Priority date: 2024-01-26
Filing date: 2024-01-26
Publication date: 2024-05-03

Abstract

本发明涉及功能肽技术领域，具体公开了一种具有抗氧化和抗衰老功能的牛骨胶原蛋白肽及其制备方法与应用。本发明的制备牛骨胶原蛋白酶解制品的方法，通过牛骨的两次酶解，获得牛骨胶原蛋白酶解制品；第一次酶解使用的为复合蛋白酶，所述复合蛋白酶由中性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成；第二次酶解使用的为风味蛋白酶。通过本发明酶解方法获得的牛骨胶原蛋白酶解液和牛骨胶原蛋白肽具有抗氧化和抗衰老的功能，制备简便，利于工业化推广。

Description

一种具有抗氧化和抗衰老功能的牛骨胶原蛋白肽及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及功能肽技术领域，具体地说，涉及一种具有抗氧化和抗衰老功能的牛骨胶原蛋白肽及其制备方法与应用。

背景技术

衰老又称为老化，是一种普遍存在的、机体不可避免的自然生理现象。当人们年龄增长时，机体的各个系统会逐渐失去功能，随之而来的是多种慢性炎症和老化有关疾病的发生，进而影响各个器官之间的协作。衰老变化可以在细胞与分子水平上发生，其中包括DNA损伤、蛋白质、脂质和碳水化合物的积累，以及细胞凋亡等，此外，神经递质、介质因子、其他生物大分子等之间的通信也会受到影响，进而影响器官之间的协作和整体健康状况。衰老理论之一的自由基理论表示，衰老是由于体内活性氧(ROS)过多而引起的。与年龄相关的功能丧失是由于ROS的积累，从而导致氧化损伤和组织受损。ROS是一组不稳定的分子，它们在呼吸过程中形成，在细胞增殖、凋亡和信号传导中起重要作用。ROS在人体内的过量积累通过氧化还原反应破坏不同的生物分子，导致细胞损伤、突变、死亡并导致机体衰老。

研究表明，胶原蛋白肽具有良好的抗氧化活性，可以清除过剩自由基、抑制氧化损伤、提高机体的抗氧化能力，并通过调控衰老过程中重要基因的表达及相关途径的相互作用来延缓衰老。而分子量越小的胶原蛋白肽，更易被机体吸收，并在体内发挥生物活性，抗氧化、延缓衰老效果更好。经常通过口服的方式来发挥对皮肤、软骨和骨质的有益作用，因此常被用于开发功能性食品和膳食补充剂，在日常食品、功能性食品和特膳食品中得到广泛应用。已有研究显示，摄取特定的胶原蛋白肽有促进身体健康的作用,例如可以改善皮肤健康，减轻轻度高血压以及关节状况、治疗高脂血症,也被用于预防和治疗肥胖及I型糖尿病，重建血脂和血糖水平。通过添加外源抗氧化剂来对抗氧化应激损伤,以保持机体内的氧化还原平衡。已有研究表明，许多天然抗氧化剂可以提高机体抵抗氧化应激的能力，在很多领域都有广泛应用，例如生产功能性食品以及作为营养补充物。随着人们对健康的要求不断提高,胶原多肽类的产品越来越受到广大群众的青睐，使其在食品保健、化妆品、医用材料等领域都有很大的发展空间。胶原蛋白肽具有易被人体消化吸收、提高骨骼强度、保护胃黏膜、抗高血压、抗衰老和美容护肤等生理功能。衰老不可避免的会带来氧化损伤、疾病，最终死亡。胶原蛋白肽能够保护组织和器官的结构，同时具有抗氧化、抗衰老等多种功效，在抗衰老领域具有悠久的研究和应用历史。在最近的研究中显示出抗衰老功能性和有益作用的胶原蛋白肽已经成为了一种新型、有前景的抗衰老全身性补充剂，多项研究表明其具有延缓衰老的功能和有益作用。

牛骨屠宰企业，每年有大量牛骨未经精细化处理而销售，研究表明，牛骨胶原蛋白经酶解后生成的小分子肽和氨基酸不仅更利于人体的消化吸收，还具有多种功能特性。但牛骨中的蛋白经酶解后的多肽产物组成十分复杂，其中包含大量未知序列、未知功能的多肽，且具有特定功能的活性肽可能包含具有不同氨基酸组成、不同分子量大小的多种肽，较难通过某些共性特征将其区分，且现有技术中的牛骨肽很多并不具有特定的功能，这些给具有特定功能的牛骨肽的开发造成了较大困难。此外，现有技术在酶解过程中，多需要添加酸碱调节pH，这不仅增加了工艺的复杂性和成本，而且，也可能会影响产品的功能特性，增加产品灰分含量，难以得到高质量产品。

若可成功开发具有抗氧化、抗老功效的骨蛋白制品和功能性食品，不仅可以产生很高的经济效益，同时解决了资源浪费和环境污染的问题，可形成一个健康、持续发展的产业。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种以检疫合格的(冻)鲜牛骨为原料制备的牛骨胶原蛋白酶解制品，其具有抗氧化和抗衰老的功效，且制备简单，便于工业化生产。

为了实现该目的，本发明的技术方案如下：

一种制备牛骨胶原蛋白酶解制品的方法，其通过牛骨的两次酶解，获得牛骨胶原蛋白酶解制品；第一次酶解使用的为复合蛋白酶，所述复合蛋白酶由中性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成；第二次酶解使用的为风味蛋白酶。

本发明提出了一种牛骨胶原蛋白酶解制品的制备方法，其在不添加任何酸碱辅助的条件下，利用特定的蛋白酶及处理顺序将牛骨中的胶原蛋白成功转化为含有特定功能的小分子牛骨胶原蛋白肽制品，拓展了牛骨原料的利用领域，提升了产品价值。

优选，本发明在酶解时可采用固定化酶在酶解柱中进行(固定化载体为惰性物质，不参与催化作用，本发明对具体载体材料不做限制)，从而通过固定化酶的反复使用，节约生产成本。

本发明方法所述复合蛋白酶中，中性蛋白酶、木瓜蛋白酶的质量之比为(1-3)：1，所述中性蛋白酶的酶活为250,000-400,000U/g，所述木瓜蛋白酶的酶活为350,000-600,000U/g(优选为350,000-550,000U/g)；所述风味蛋白酶的酶活为150,000-200,000U/g；

和/或，所述第一次酶解中，所述复合蛋白酶的质量为牛骨重量的0.08-0.3wt％(优选为0.09-0.2wt％)，酶解的温度为40～65℃(优选为43-62℃)，酶解的时间为3～6h(优选为4-6h)；所述第二次酶解中，所述风味蛋白酶的质量为牛骨重量的0.05-0.1wt％(优选为0.07-0.1wt％)，酶解的温度为50～60℃，酶解的时间为1～2h。

本发明方法在两次酶解前，还包括对牛骨预处理的步骤；所述预处理包括：清洗、破碎、蒸煮和分离；

优选地，所述蒸煮是将破碎后的牛骨置于水中，于0.1-0.3MPa、100-130℃下蒸煮2-6h。

本发明方法在所述第一次酶解后，先将获得的第一次酶解反应液进行微孔过滤，获得透过液后，再对所述透过液进行第二次酶解，获得第二次酶解反应液；之后对所述第二次酶解反应液进行再次微孔过滤、灭酶、离心取上清，获得牛骨胶原蛋白酶解液。

以本发明方法获得的牛骨胶原蛋白酶解液中含有功能性目标肽，已具有了明显的抗氧化和抗衰老功效，优选，对牛骨胶原蛋白酶解液进行进一步纯化，以获得目标肽占比更大的产品。

本领域技术人员也可将本发明方法获得的牛骨胶原蛋白酶解液直接制备为冻干粉等固态产品进行直接应用。

本发明方法还包括对所述牛骨胶原蛋白酶解液进行过滤、目标肽分离的步骤；

所述牛骨胶原蛋白酶解液的过滤包括：将所述牛骨胶原蛋白酶解液经过陶瓷膜进行过滤处理，对收集到的滤液进行纳滤处理(优选，截留分子量为200Da)，收集未透过液；

对所述未透过液进行二步超滤处理：先利用孔径为5000道尔顿的超滤膜超滤，收集过滤液，再将所述过滤液通过孔径为2000道尔顿的超滤膜，收集透过液，获得含分子量小于2000道尔顿的目标肽的溶液；

所述目标肽分离包括：将所述目标肽的溶液经过SephadexG-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行分离，收集13-15分钟分离的蛋白肽溶液；分离条件如下：采用C18色谱柱，柱温为40℃，流动相A为含0.1％TFA的水溶液，流动相B为含0.1％TFA的乙腈溶液；流速为1mL/min；洗脱程序为：0-5min内，5％的流动相B；5-45min内，5-45％的流动相B；45-55min，45-5％的流动相B，流动相A随流动相B的体积变化而变化，流动相A和B两者体积加和始终为100％。

通过本发明的特定分离方法，可提升产品中目标肽的含量，从而获得抗氧化和抗衰老功效更佳的产品。

作为一个优选实施方式，本发明牛骨胶原蛋白酶解制品的制备方法，具体操作为：牛骨清洗→破碎→蒸煮提取牛骨胶原蛋白→牛骨胶原蛋白酶解→牛骨胶原蛋白肽过滤→分离→浓缩干燥。

作为其中一种优选方案，本发明牛骨胶原蛋白酶解制品的制备方法包括以下步骤：

(1)牛骨清洗：取新鲜或冷冻牛骨，冷水浸泡、清洗除血污；

(2)破碎：牛骨洗净后破骨机中破碎处理至1-7cm(优选2-6cm)；

(3)蒸煮：将破碎牛骨置于3.0～5.0倍符合饮用水卫生标准的水中，于0.1-0.3MPa、100-130℃下高温蒸煮2-6h，冷却，分离获得牛骨胶原蛋白汤液；

(4)牛骨胶原蛋白酶解：将牛骨胶原蛋白汤液通过二次酶解柱酶解，第一次酶解柱中酶为复合固定化蛋白酶，在40～65℃条件下匀速通过固定化蛋白酶柱进行酶解，用有机聚丙烯微孔滤膜(0.8μm)过滤反应液，未透过液返回再次进入复合固定化蛋白酶柱，透过液进入下一步酶解，此步酶解反应3～6h；透过液进入第二次酶解柱，酶解柱中装填固定化风味蛋白酶，柱温50-60℃，用混合纤维素酯膜(0.45μm)过滤反应液，未透过液返回再次进入固定化风味蛋白酶柱，收集透过液，此步酶解反应1～2h，酶解完成后将酶解液高温灭酶，离心取上清液，得到牛骨胶原蛋白酶解液；

(5)过滤：将牛骨酶解液经过陶瓷膜进行过滤处理，收集过滤液；过滤后的澄清过滤液再经过纳滤处理，收集未透过液；

将上述步骤所收集的未透过液通过二步超滤方法进行处理，首先利用孔径为5000道尔顿的超滤膜超滤，收集过滤液；再将过滤液通过孔径为2000道尔顿的超滤膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来，收集透过液并冻干。

(6)分离：取分子量为小于2000的蛋白肽冻干粉，用去离子水溶解成20mg/mL溶液，再经过SephadexG-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到牛骨胶原蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，取13-15分钟收集的分离蛋白肽溶液；

(7)浓缩干燥：将上述得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到牛骨胶原蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为SGARGER(SEQ ID No.1)、GSEGPQ(SEQ ID No.2)或GQPGAK(SEQ ID No.3)的肽的含量为62.5-72％。

本发明优选通过固定化蛋白酶与生物膜耦合酶解技术对牛骨深度酶解提取，可充分将牛骨中的胶原蛋白转化为特定牛骨胶原蛋白肽，并减少了蛋白酶的用量和牛骨胶原蛋白肽在生产过程中的损失，利于工业化生产。

本发明还提供一种牛骨胶原蛋白酶解液，其由上述方法制备获得。

本发明另提供一种牛骨胶原蛋白肽，其由上述方法制备得到；优选地，所述牛骨胶原蛋白肽含有质量百分含量为62.5-72％的功能肽，所述功能肽的序列如SEQ ID NO.1-3任一所示。

本发明再提供一种功能性多肽，其具有如SEQ ID NO.1-3任一所示的氨基酸序列。

本发明另提供一种上述牛骨胶原蛋白酶解液或牛骨胶原蛋白肽或功能性多肽在制备药品、食品或食品添加剂中的应用；

优选地，所述药品或所述食品具有抗氧化和抗衰老的功能。

本发明还提供一种含有上述牛骨胶原蛋白酶解液或牛骨胶原蛋白肽或功能性多肽的药品、食品或食品添加剂。

本发明的有益效果至少在于：

(1)本发明制备的牛骨胶原蛋白酶解制品中，目标肽含量高，平均分子量主要分布在200-2000Da之间，水溶性好，易被人体吸收，无不良气味，具有抗氧化和抗衰老的功效；

(2)本发明的制备方法，操作简单，利于工业化推广。

附图说明

图1为HepG2细胞ROS荧光染色图(n＝3)，其中，A.空白组，B.H₂O₂模型组，C.实施例1样品-BBC组，D.实施例1样品-BBCH组，E.实施例1样品-BBCPs组。各图中标尺为50微米。

图2为实施例1中牛骨胶原蛋白肽的HPLC图。

图3为实施例1中牛骨胶原蛋白肽的质谱图。

图4为实施例2中牛骨胶原蛋白肽的HPLC图。

图5为实施例2中牛骨胶原蛋白肽的质谱图。

图6为实施例3中牛骨胶原蛋白肽的HPLC图。

图7为实施例3中牛骨胶原蛋白肽的质谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到或按本领域常规方法制备。

以下实施例中，反相HPLC的分离条件具体如下：

液相系统：岛津LC-16；检测器：紫外检测器220nm；

流动相：A-含0.1％TFA的水溶液，B-含0.1％TFA的乙腈溶液；

色谱柱：Cosmosil 5C18-PAQ column(4.6×250mm，Nacalai Tesque，Kyoto，Japan)；

柱温：40℃；流速：1mL/min；

洗脱程序：0-5min内，5％的流动相B；5-45min内，5-45％的流动相B；45-55min，45-5％的流动相B。流动相A随流动相B的体积变化而变化，流动相A和B两者体积加和始终为100％。

固定化中性蛋白酶、固定化木瓜蛋白酶、固定化风味蛋白酶中的固定化载体为多孔壳聚糖。

实施例1

本实施例提供一种抗氧化和抗衰老牛骨胶原蛋白肽的制备方法，具体如下：

(1)牛骨清洗：取新鲜冷冻牛骨，冷水浸泡、清洗除血污；

(2)破碎：牛骨洗净后破骨机中破碎处理至1-7cm；

(3)蒸煮：将破碎牛骨置于3.0倍符合饮用水卫生标准的水中，于0.15MPa、110℃下高温蒸煮3h，冷却，分离获得牛骨胶原蛋白汤液；

(4)牛骨胶原蛋白酶解：将牛骨胶原蛋白汤液通过二次酶解柱酶解，第一次酶解柱中酶为复合固定化蛋白酶，所述复合固定化蛋白酶由固定化中性蛋白酶和固定化木瓜蛋白酶组成，其中所含中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的总质量为原料牛骨重量的0.2wt％，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为1:1，中性蛋白酶酶活为400,000U/g，木瓜蛋白酶酶活为350,000U/g。将牛骨胶原蛋白汤液在43℃条件下匀速通过固定化蛋白酶柱进行酶解，用有机聚丙烯微孔滤膜(孔径0.8μm)过滤反应液，未透过液返回再次进入复合固定化蛋白酶柱，透过液进入下一步酶解，此步酶解反应4h；透过液进入第二次酶解柱，柱温50℃，酶解柱中装填固定化风味蛋白酶，所述固定化风味蛋白酶中的风味蛋白酶的质量为原料牛骨重量的0.1wt％，酶活为200,000U/g。用混合纤维素酯膜(0.45μm)过滤反应液，未透过液返回再次进入固定化风味蛋白酶柱，收集透过液，此步酶解反应2h，酶解完成后将酶解液高温灭酶(95℃，12分钟)，离心(12000rpm，5分钟)取上清液，得到牛骨胶原蛋白酶解液；

(5)过滤：将牛骨胶原蛋白酶解液经过陶瓷膜(孔径50nm)进行过滤处理，收集过滤液；过滤后的澄清过滤液再经过纳滤(截留分子量200Da)处理，收集未透过液；

(6)分离：取分子量为小于2000的蛋白肽冻干粉5g，用去离子水溶解成20mg/mL溶液，再经过SephadexG-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到牛骨胶原蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，取13-15分钟收集的分离蛋白肽溶液；本实施例中牛骨胶原蛋白肽的HPLC图见图2。

(7)浓缩干燥：将上述得到的蛋白肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到具有特定功能的牛骨胶原蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为SGARGER的肽的含量为67.7％。本实施例中牛骨胶原蛋白肽的质谱图见图3。

实施例2

(1)牛骨清洗：取新鲜冷冻牛骨，冷水浸泡、清洗除血污；

(2)破碎：牛骨洗净后破骨机中破碎处理至1-7cm；

(3)蒸煮：将破碎牛骨置于4.0倍符合饮用水卫生标准的水中，于0.2MPa、120℃下高温蒸煮4h，冷却，分离获得牛骨胶原蛋白汤液；

(4)牛骨胶原蛋白酶解：将牛骨胶原蛋白汤液通过二次酶解柱酶解，第一次酶解柱中酶为复合固定化蛋白酶，所述复合固定化蛋白酶由固定化中性蛋白酶和固定化木瓜蛋白酶组成，其中所含中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的总质量为原料牛骨重量的0.09wt％，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为1.5:1，中性蛋白酶酶活为300,000U/g，木瓜蛋白酶酶活为450,000U/g。将牛骨胶原蛋白汤液在55℃条件下匀速通过固定化蛋白酶柱进行酶解，用有机聚丙烯微孔滤膜(孔径0.8μm)过滤反应液，未透过液返回再次进入复合固定化蛋白酶柱，透过液进入下一步酶解，此步酶解反应5h；透过液进入第二次酶解柱，柱温55℃，酶解柱中装填固定化风味蛋白酶，所述固定化风味蛋白酶中的风味蛋白酶的质量为原料牛骨重量的0.08wt％，酶活为180,000U/g。用混合纤维素酯膜(0.45μm)过滤反应液，未透过液返回再次进入固定化风味蛋白酶柱，收集透过液，此步酶解反应1h，酶解完成后将酶解液高温灭酶(95℃，12分钟)，离心(12000rpm，5分钟)取上清液，得到牛骨胶原蛋白酶解液；

(6)分离：取分子量为小于2000的蛋白肽冻干粉5g，用去离子水溶解成20mg/mL溶液，再经过SephadexG-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到牛骨胶原蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，取13-15分钟收集的分离蛋白肽溶液；本实施例中牛骨胶原蛋白肽的HPLC图见图4。

(7)浓缩干燥：将上述得到的蛋白肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到具有特定功能的牛骨胶原蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为GSEGPQ的肽的含量为71.5％。本实施例中牛骨胶原蛋白肽的质谱图见图5。

实施例3

(1)牛骨清洗：取新鲜冷冻牛骨，冷水浸泡、清洗除血污；

(2)破碎：牛骨洗净后破骨机中破碎处理至1-7cm；

(3)蒸煮：将破碎牛骨置于5.0倍符合饮用水卫生标准的水中，于0.25MPa、127℃下高温蒸煮5h，冷却，分离获得牛骨胶原蛋白汤液；

(4)牛骨胶原蛋白酶解：将牛骨胶原蛋白汤液通过二次酶解柱酶解，第一次酶解柱中酶为复合固定化蛋白酶，所述复合固定化蛋白酶由固定化中性蛋白酶和固定化木瓜蛋白酶组成，其中所含中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的总质量为原料牛骨重量的0.1wt％，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为3:1，中性蛋白酶酶活为250,000U/g，木瓜蛋白酶酶活为550,000U/g。将牛骨胶原蛋白汤液在62℃条件下匀速通过固定化蛋白酶柱进行酶解，用有机聚丙烯微孔滤膜(孔径0.8μm)过滤反应液，未透过液返回再次进入复合固定化蛋白酶柱，透过液进入下一步酶解，此步酶解反应6h；透过液进入第二次酶解柱，柱温60℃，酶解柱中装填固定化风味蛋白酶，所述固定化风味蛋白酶中的风味蛋白酶的质量为原料牛骨重量的0.07wt％，酶活为180,000U/g。用混合纤维素酯膜(0.45μm)过滤反应液，未透过液返回再次进入固定化风味蛋白酶柱，收集透过液，此步酶解反应1.5h，酶解完成后将酶解液高温灭酶(95℃，12分钟)，离心(12000rpm，5分钟)取上清液，得到牛骨胶原蛋白酶解液；

(6)分离：取分子量为小于2000的蛋白肽冻干粉5g，用去离子水溶解成20mg/mL溶液，再经过SephadexG-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第2个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到牛骨胶原蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，取13-15分钟收集的分离蛋白肽溶液；本实施例中牛骨胶原蛋白肽的HPLC图见图6。

(7)浓缩干燥：将上述得到的蛋白肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到具有特定功能的牛骨胶原蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为GQPGAK的肽的含量为62.9％。本实施例中牛骨胶原蛋白肽的质谱图见图7。

实验例1

本实验涉及本发明牛骨胶原蛋白肽抗氧化活性的测定，具体如下：

试验样品：BBC样品组分别为实施例1-3步骤(3)所制备牛骨胶原蛋白汤液冻干粉(Bovine bone collagen，BBC)，BBCH样品组分别为实施例1-3步骤(4)制备的牛骨胶原蛋白酶解液冻干粉(Bovine bone collagen hydrolysate，BBCH)，BBCPs样品组分别为实施例1-3步骤(7)制备的具有特定功能的牛骨胶原蛋白肽粉(Bovine bone collagen peptides，BBCPs)。

试剂盒：增强型CCK-8试剂盒(购自碧云天生物技术，Beyotime Biotechnology)。

抗氧化测定按照如下方法进行：

(1)牛骨胶原蛋白肽对HepG2细胞氧化损伤的保护作用

HepG2细胞培养24h后，以1×10⁴个细胞/孔的密度接种于96孔板中，细胞分成空白组、对照组、H₂O₂模型组和牛骨胶原蛋白肽样品组(BBC组、BBCH组和BBCPs组)。加入100.0μL细胞培养液和增强型CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白组，孵育24h，对照组在HepG2细胞中添加100.0μL的培养基，孵育24h，模型组在HepG2细胞中加入1.3mmol/L的H₂O₂ 100.0μL，孵育24h。样品组在HepG2细胞中加入100.0μg/mL的BBC、BBCH和BBCPs，孵育24h，然后加入1.3mmol/L的H₂O₂ 100.0μL，孵育24h。酶标仪检测450nm各孔OD值，取三次实验平均值，检测并计算细胞活力。

HepG2细胞活力计算公式如下:

式中：A_模型/_样品为H₂O₂模型组/牛骨胶原蛋白肽样品组在波长450nm的吸光度值；A_空白为空白组在波长450nm的吸光度值；A_对照为对照组在波长450nm的吸光度值。

(2)牛骨胶原蛋白肽对HepG2细胞内ROS生成的影响

HepG2细胞培养24h后，以1×10⁵个细胞/孔的密度接种于6孔板中，细胞分为空白组、对照组、H₂O₂模型组和BBC组、BBCH组、BBCPs组。加入100.0μL细胞培养液和增强型CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白组，孵育24h。对照组在HepG2细胞中加入100.0μL培养基，孵育24h。H₂O₂模型组在HepG2细胞中加入1.3mmol/L的H₂O₂ 100.0μL，孵育24h。BBC组、BBCH组、BBCPs组分别在HepG2细胞中加入100.0μg/mL的对应样品孵育24h，然后加入1.3mmol/L的H₂O₂ 100.0μL，孵育24h。避光在每孔中添加100.0μL的ROS荧光探针孵育30min，用PBS洗涤三次，添加100.0μL的培养基后，在荧光显微镜下观察、拍照，并使用Image proplus定量各组平均荧光强度。

(3)牛骨胶原蛋白肽对HepG2细胞内抗氧化指标的影响

按上述步骤(2)的方法设置各组别，处理细胞，收集细胞，除去培养基，PBS洗一次，向每个孔细胞加入200.0μl裂解液混合。裂解结束后，10000g离心5min，取上清用BCA法测定蛋白浓度，同时根据ELISA试剂盒说明书检测SOD、GSH-Px、CAT水平和MDA含量。

实验结果分析：

(1)牛骨胶原蛋白肽对HepG2细胞氧化损伤的保护作用

H₂O₂可以穿透细胞膜，诱导氧化应激，导致细胞损伤。在细胞暴露于H₂O₂(1.3mmol/L)前，用不同阶段的牛骨胶原蛋白(肽)预处理细胞。结果如表1所示，H₂O₂模型组细胞存活率为55.86±5.88％，与对照组相比模型组细胞存活率显著降低，牛骨胶原蛋白肽预处理可显著提高细胞活力，随着牛骨胶原蛋白肽纯度增加，细胞活力逐渐升高，与H₂O₂模型组比较具有显著性差异，表明BBC组、BBCH组对细胞有一定的保护作用、BBCPs组均对细胞有显著的保护作用。

表1牛骨胶原蛋白肽对HepG2细胞氧化损伤的保护作用(n＝3)

(2)牛骨胶原蛋白肽对HepG2细胞内ROS生成的影响

代表性结果如图1所示，H₂O₂模型组细胞内的ROS水平显著增加，定量结果表明平均荧光强度与对照组比较具有显著性差异。而经牛骨胶原蛋白肽预处理后，细胞内ROS水平显著降低，且牛骨胶原肽纯度越高，其效果越显著，说明牛骨胶原蛋白和牛骨胶原蛋白肽能够降低细胞内ROS的水平，其中BBCPs组的细胞内ROS荧光强度最弱，说明其保护作用最强，具体数据见表2。

表2HepG2细胞ROS荧光染色定量结果(n＝3)

(3)牛骨胶原蛋白肽对HepG2细胞内抗氧化指标的影响

超氧化物歧化酶(SOD)可以清除体内积累的自由基，防止自由基对细胞结构造成的损害，将有害的超氧自由基转化为H₂O₂，经CAT分解，从而保护细胞免受其损伤。过氧化氢酶(CAT)是关键抗氧化酶之一，它能够催化H₂O₂分解成氧和H₂O，从而使机体内H₂O₂水平降低。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)能清除细胞外的H₂O₂，使ROS毒性降低，同时还可以保护细胞的结构完整及正常功能，减缓脂质过氧化的进程。丙二醛(MDA)是脂质过氧化损伤的副产物，间接反映细胞氧化损伤程度，MDA水平的升高是氧化损伤和衰老的一个常见标志。检测结果如表3所示，与对照组相比，H₂O₂模型组细胞内SOD、GSH-Px和CAT活性分别降低63.69％、51.97％和67.89％。与H₂O₂模型组相比，经牛骨胶原蛋白和牛骨胶原蛋白肽预处理后，SOD、GSH-Px和CAT活性显著提高。与对照组相比，H₂O₂处理使MDA水平增加，而牛骨胶原蛋白肽预处理能够显著降低细胞中MDA的含量。

表3牛骨胶原蛋白肽对HepG2细胞内抗氧化指标的影响(n＝3)

表中，###P<0.001，####P<0.0001与对照组相比；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与模型组相比。

因此，以上结果表明牛骨胶原蛋白肽可提高抗氧化酶活性，抑制脂质过氧化，从而保护细胞免受H₂O₂诱导的氧化损伤。

实验例2

本实验涉及本发明牛骨胶原蛋白肽抗衰老作用实验，具体如下：

动物饲养与分组

55只雄性KM小鼠适应性饲养1周后，随机分为11组(每组5只)：对照组、衰老模型组、BBC组(实施例1-3)、BBCH组(实施例1-3)、BBCPs组(实施例1-3)。

衰老小鼠模型建立及给药

建立衰老动物模型：每个实验组的小鼠皮下注射5％D-半乳糖(1000mg/kg)，对照组皮下注射生理盐水，每日0.2mL。BBC组，BBCH组和BBCPs组每日灌胃400mg/kg，同时，衰老模型组和对照组的小鼠每天同样剂量灌胃蒸馏水，连续进行60d。饲养期间，所有受试小鼠自由摄取饲料和饮用水。试验期最后一晚小鼠禁食不禁水。

(1)小鼠皮肤蛋白质含量测定

称取小鼠皮肤，用生理盐水作溶剂，4000r/min离心1min，取上清液，制得皮肤组织匀浆。然后按蛋白浓度测定试剂盒说明书操作，计算待测样品的蛋白质含量。

(2)小鼠皮肤羟脯氨酸、透明质酸含量测定

冲洗小鼠背部皮肤，用镊子将小鼠背部皮肤毛发处理干净，取小鼠皮肤，根据羟脯氨酸试剂盒、透明质酸试剂盒说明书操作，分别测定小鼠皮肤羟脯氨酸、透明质酸含量。

实验结果分析：

(1)牛骨胶原蛋白肽对小鼠皮肤蛋白质含量的影响

结果见表4，由表4可知，与对照组相比，衰老模型组皮肤的蛋白质含量极显著降低，表面衰老可降低皮肤中蛋白质含量。与衰老模型组相比，各实验组小鼠皮肤蛋白质含量均有所提高，其中，BBCPs组皮肤蛋白质含量增加较多，与衰老模型组相比差异显著(P<0.001)。以上结果表明，本发明制备的牛骨胶原蛋白肽有助于提高皮肤蛋白质的含量。

表4牛骨胶原蛋白肽对小鼠皮肤蛋白质含量的影响(n＝3)

(2)牛骨胶原蛋白肽对小鼠皮肤中羟脯氨酸及透明质酸含量含量的影响

羟脯氨酸主要存在于胶原蛋白中，极少存在于弹性蛋白中，也不存在于其他蛋白质中，所以羟脯氨酸的含量能间接反映胶原蛋白的数量。透明质酸主要在肌肤中起到保湿的作用，是目前为止发现的自然界中最好的肌肤保湿物质，被称为最理想的保湿因子。同时胶原蛋白含量和透明质酸含量有密切的关系，透明质酸的减少会直接导致皮肤胶原蛋白含量下降，从而导致皮肤老化。检测结果见表5，由表5可知，衰老模型组羟脯氨酸、透明质酸含量显著低于对照组(P<0.01)，说明衰老会降低皮肤中羟脯氨酸、透明质酸的含量。与衰老模型组相比，BBCPs组小鼠皮肤羟脯氨酸、透明质酸含量极显著增高(P<0.001)。以上结果表明，本发明制备的牛骨胶原蛋白肽能够有效增加皮肤中羟脯氨酸、透明质酸含量，可以有效提高衰老皮肤胶原蛋白结合能力。

表5牛骨胶原蛋白肽对小鼠皮肤中羟脯氨酸及透明质酸含量含量的影响(n＝3)

表中，##P<0.01，与对照组相比；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，与模型组相比。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种制备牛骨胶原蛋白酶解制品的方法，其特征在于，通过牛骨的两次酶解，获得牛骨胶原蛋白酶解制品；第一次酶解使用的为复合蛋白酶，所述复合蛋白酶由中性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成；第二次酶解使用的为风味蛋白酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述复合蛋白酶中，中性蛋白酶、木瓜蛋白酶的质量之比为(1-3)：1，所述中性蛋白酶的酶活为250,000-400,000U/g，所述木瓜蛋白酶的酶活为350,000-600,000U/g；所述风味蛋白酶的酶活为150,000-200,000U/g；

和/或，所述第一次酶解中，所述复合蛋白酶的质量为牛骨重量的0.08-0.3wt％，酶解的温度为40～65℃，酶解的时间为3～6h；所述第二次酶解中，所述风味蛋白酶的质量为牛骨重量的0.05-0.1wt％，酶解的温度为50～60℃，酶解的时间为1～2h。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在两次酶解前，还包括对牛骨预处理的步骤；所述预处理包括：清洗、破碎、蒸煮和分离；

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，在所述第一次酶解后，先将获得的第一次酶解反应液进行微孔过滤，获得透过液后，再对所述透过液进行第二次酶解，获得第二次酶解反应液；之后对所述第二次酶解反应液进行再次微孔过滤、灭酶、离心取上清，获得牛骨胶原蛋白酶解液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括对所述牛骨胶原蛋白酶解液进行过滤、目标肽分离的步骤；

所述牛骨胶原蛋白酶解液的过滤包括：将所述牛骨胶原蛋白酶解液经过陶瓷膜进行过滤处理，对收集到的滤液进行纳滤处理，收集未透过液；

6.一种牛骨胶原蛋白酶解液，其特征在于，由权利要求1-4任一项所述的方法制备获得。

7.一种牛骨胶原蛋白肽，其特征在于，由权利要求1-5任一项所述的方法制备得到；优选地，所述牛骨胶原蛋白肽含有质量百分含量为62.5-72％的功能肽，所述功能肽的序列如SEQ ID NO.1-3任一所示。

8.功能性多肽，其特征在于，具有如SEQ ID NO.1-3任一所示的氨基酸序列。

9.权利要求6所述的牛骨胶原蛋白酶解液或权利要求7所述的牛骨胶原蛋白肽或权利要求8所述的功能性多肽在制备药品、食品或食品添加剂中的应用；

优选地，所述药品或所述食品具有抗氧化和抗衰老的功能。

10.含有权利要求6所述的牛骨胶原蛋白酶解液或权利要求7所述的牛骨胶原蛋白肽或权利要求8所述的功能性多肽的药品、食品或食品添加剂。