CN113151388B - 一种具有抗氧化和dpp-iv抑制功能的海参肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及动物食品加工技术领域，具体涉及一种具有抗氧化和DPP‑IV抑制功能的海参肽及其制备方法。本发明提供一种海参肽的制备方法，包括如下步骤：以海参为原料，将经前处理的原料经两步酶解制得酶解物；所述两步酶解中，第一步酶解使用的酶为复合蛋白酶，所述复合蛋白酶为碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶，第二步酶解使用的酶为风味蛋白酶。本发明制备的海参肽中小分子肽含量高，且具有优异的抗氧化和DPP‑IV抑制功能，可广泛应用于特需食品和营养食品。

Description

一种具有抗氧化和DPP-IV抑制功能的海参肽及其制备方法
技术领域
本发明涉及动物食品加工技术领域，具体涉及一种具有抗氧化和DPP-IV抑制功能的海参肽及其制备方法。
背景技术
海参是对人体有益的天然海洋功能食品，海参肽是由海参中蛋白水解后制备的重要活性物质，近年来受到越来越多的关注。海参资源丰富，种类繁多，使海参肽具备充足的原料来源。海参肽具有良好的溶解性和稳定性，还具有抗氧化性、降血糖、促进胶原蛋白分泌、抗肿瘤、抑制炎症、抗疲劳、抗菌、保护血管内皮细胞及促进伤口愈合等多种生物活性，具有应用于食品、医药、化妆品等行业的潜力。
根据以往报道，人体衰老、疾病的发生均与自由基氧化有关。活性氧主要包括超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH自由基等。在机体新陈代谢过程中，若抗氧化体系出现故障，会引起DNA、蛋白质、脂质等大分子物质、细胞或组织的氧化损伤，具有很强的破坏性。外源抗氧化剂的补充对维持机体代谢平衡有重要意义。近年来，人们越来越关注从天然产物中提取无毒副作用的外源抗氧化剂。
胰高血糖素样肽-1是一种肠促胰岛素，它通过刺激和保护胰岛β细胞，促进胰岛素的合成和分泌，降低餐后血糖。二肽基肽酶-IV(DPP-IV)能够裂解包括胰高血糖素样肽-1和抑胃肽在内的多种肽类激素，DPP-IV抑制剂能够抑制DPP-IV对肠促胰岛素的降解。因此，可以通过DPP-IV抑制剂来抵抗DPP-IV对肠促胰岛素的降解，间接调节胰岛素的分泌，从而达到调节血糖的目的。
海参中的蛋白经酶解后的多肽产物组成十分复杂，其中包含大量未知序列、未知功能的多肽，而具有特定功能的活性肽可能包含具有不同氨基酸组成、不同分子量大小的多种肽，较难通过某些共性特征将其区分。这些都对具有特定功能的海参肽的开发造成较大困难。现有技术中的海参肽很多并不具有特定的功能，同时具有较好的抗氧化和DPP-IV抑制功能的海参肽更是甚少。此外，现有技术在酶解过程中，多需要添加酸碱调节pH，这不仅增加了工艺的复杂性和成本，而且，也可能会影响产品的功能特性，增加产品灰分含量。
发明内容
本发明的目的是提供一种海参肽，该海参肽同时具有抗氧化和DPP-IV抑制功能。本发明的另一目的是提供该海参肽的制备方法和应用。
本发明以开发同时具有抗氧化和DPP-IV抑制功能的海参肽为研究目标，针对海参的原料特性和成分组成特点，开发以海参为原料生产具有抗氧化和DPP-IV抑制功能的海参肽的制备工艺。本发明在研发过程中尝试多种单一酶解和复合酶解，很多方法虽然能够获得分子量较小的肽，但获得的肽根本不具有抗氧化和DPP-IV抑制功能，或者功能较差。在众多方法中，本发明确定了适于海参的、在不依赖酸或碱进行pH的调节的情况下，能够获得具有较好的抗氧化和DPP-IV抑制功能的海参肽的制备工艺。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种海参肽的制备方法，该方法包括如下步骤：以海参为原料，将经前处理的原料经两步酶解制得酶解物；
所述两步酶解中，第一步酶解使用的酶为复合蛋白酶，所述复合蛋白酶为碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶，第二步酶解使用的酶为风味蛋白酶。
本发明发现，采用上述两步酶解的方法不仅能够充分酶解海参蛋白，获得高含量的小分子多肽，还能够显著提高酶解产物中具有抗氧化和DPP-IV抑制功能的多肽含量。
优选地，所述复合蛋白酶中，碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶的质量之比为(1-2)：1：(1-2)，所述碱性蛋白酶的酶活为50,000-500,000U/g，所述胰蛋白酶的酶活为100,000-1,000,000U/g，所述中性蛋白酶的酶活为100,000-650,000U/g。碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶在该配比范围内使用能够更好地适用于海参蛋白，提高蛋白的酶解效率，同时提高酶解产物中具有抗氧化和DPP-IV抑制功能的多肽含量。
优选地，所述第一步酶解中，复合蛋白酶与原料蛋白的用量质量比为0.4-0.9％，酶解条件为45-60℃酶解3-7h；
所述第二步酶解中，风味蛋白酶与原料蛋白的用量质量比为0.1-0.2％，所述风味蛋白酶的酶活为80,000-250,000U/g，酶解条件为50-60℃酶解0.5-1h。
上述两步酶解法能够使得第一步酶解和第二步酶解之间很好地配合作用，将海参蛋白充分降解为小分子肽，同时保证小分子肽中具有抗氧化和DPP-IV抑制功能的多肽含量。经鉴定，经上述酶解可获得高含量的序列为LSFWLIPP的多肽，这些多肽具有优异的抗氧化和DPP-IV抑制功能。
本发明的海参肽的制备方法还包括在酶解前对海参进行前处理的步骤。具体地，所述前处理包括：将海参经高温高压蒸煮后，经均质得到原料蛋白液；
优选地，高温高压蒸煮为在100-120℃、0.1-0.3Mpa条件下蒸煮30-120min。
上述高温高压蒸煮处理提高了蛋白原料与酶的接触，能够更好地提高酶解效率，降低酶的使用量，同时减少对功能性多肽的不利影响。
本发明使用的海参原料可为任意的海参种类。优选为刺参或光参中的一种或多种的组合。海参原料可以为新鲜海参、冷冻海参或干海参。对于干海参，在高温高压蒸煮前先将干海参于常温下清水浸泡20-24小时。
本发明的海参肽的制备方法还包括将所述酶解物进行灭酶处理后，再进行过滤和目标肽的分离的步骤。
优选地，过滤步骤包括：先利用孔径为纳米级别的陶瓷膜过滤，滤液再经过纳滤膜过滤处理，收集截留液；该步过滤中，纳米级别的陶瓷膜过滤可去除大分子的杂质，纳滤膜过滤可脱除分离液中的小分子无机盐。
将所述截留液先用孔径为5000道尔顿的超滤膜超滤，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离。该步骤先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来。
采用陶瓷膜-纳滤膜-超滤膜三膜联用过滤，获得的海参肽产品的活性高、溶解性好，解决了海产品原料中含盐量过高的问题。
优选地，目标肽的分离步骤包括：
将所述分子量为小于2000的蛋白肽先经过SephadexG-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰，再用RP-HPLC反相高效液相色谱分离；分离条件如下：采用C18色谱柱，以含0.1％TFA的水溶液为流动相A，含0.1％TFA的乙腈溶液为流动相B，采用梯度洗脱进行分离：0-5min，5％的流动相B；5-45min，5-45％的流动相B；45-55min，45-5％的流动相B，流速为1mL/min，收集8-11分钟分离的蛋白肽溶液。
作为本发明的优选方案，所述海参肽的制备方法包括：
(1)原料前处理：将海参清洗干净后与1-2倍的水混合，100-120℃、0.1-0.3Mpa条件下蒸煮30-120min，冷却到65-75℃，用高速均质机处理2-3分钟，得到海参蛋白液；
(2)酶解：调节海参蛋白液中蛋白含量为7-10％，按照海参蛋白液中蛋白重量0.6-1.0％的重量百分比加入蛋白酶进行分步酶解，第一步酶解添加原料蛋白重量0.4-0.9％的复合蛋白酶，该复合蛋白酶由酶活单位之比为(1-20)：(2-20)：(2-26)的碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶组成，在45-60℃条件下进行酶解反应3-7h；第二步酶解再添加蛋白重量0.1-0.2％的风味蛋白酶，在50-60℃条件下酶解0.5-1h；酶解结束后在95-100℃下保温10-20分钟，冷却至室温；
(3)过滤：将步骤(2)所得的分离液进行分级过滤处理，先利用孔径为纳米级别的陶瓷膜过滤，去除大分子的杂质，滤液再经过纳滤膜过滤处理，脱除分离液中的小分子无机盐，收集截留液；
将收集的截留液通过二步超滤方法进行处理：利用孔径为5000道尔顿的超滤膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来；
(4)目标肽收集：取分子量为小于2000的蛋白肽液，先经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到海参蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行分离，分离条件如下：采用C18色谱柱，以含0.1％TFA的水溶液为流动相A，含0.1％TFA的乙腈溶液为流动相B，采用梯度洗脱进行分离：0-5min，5％的流动相B；5-45min，5-45％的流动相B；45-55min，45-5％的流动相B，流速为1mL/min，取8-11分钟收集的分离蛋白肽溶液；
(5)将步骤(4)得到的蛋白肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到具有特定功能的海参蛋白肽粉。
上述制备的海参肽通过LC-MS/MS对蛋白肽的主要成分进行测定，其中，氨基酸序列为LSFWLIPP的多肽的肽的含量≥90％。
上述制备方法中，以海参为原料，通过对海参原料的高温高压、均质等预处理，在不添加任何酸和碱条件下，利用多种蛋白酶进行分步酶解，进一步通过三膜联用过滤、SephadexG-15凝胶分离、RP-HPLC分离技术，获得具有高含量特定氨基酸序列多肽(LSFWLIPP)、具有较高的抗氧化和DPP-IV抑制功能的海参肽。该方法在整个加工过程中没有添加酸或碱进行pH的调整，产品保持较好的功能特性，产品灰分含量低(小于0.5％)。
进一步地，本发明提供一种海参肽，其由所述海参肽的制备方法制备得到。
优选地，所述海参肽含有质量百分含量为≥80％的功能肽，所述功能肽的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种功能性多肽，其具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
本发明通过实验验证，如SEQ ID NO.1所示的功能性多肽具有较高的抗氧化和DPP-IV抑制功能。
本发明还提供所述海参肽或所述功能性多肽在制备药品、食品或食品添加剂中的应用。
优选地，所述药品或所述食品具有抗氧化和/或预防、治疗受益于DPP-IV抑制的疾病的功能。
本发明还提供含有所述海参肽或所述功能性多肽的药品、食品或食品添加剂。
所述药品、食品或食品添加剂除含有所述海参肽或所述功能性多肽外，还可含有药品或食品领域允许的辅料。
本发明的有益效果在于：本发明以海参为原料制备海参肽，采用多种食品级复合蛋白酶(碱性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶)进行分步酶解，在温和条件下，经过适度酶解获得特定分子量和肽组成的海参蛋白肽。利用本发明的方法制备得到的海参肽具有较高的小分子肽的含量，分子量小于2000的肽的含量比例可达80％以上，具有较明确的肽的组成和较高的纯度，其中序列为LSFWLIPP的肽的含量可达85％以上。本发明制备的海参肽具有优异的抗氧化(清除DPPH自由基的IC50低于3.4mg/ml，还原力的IC50低于5.6mg/ml)和DPP-IV抑制功能(IC50值小于1.35mg/mL)，能广泛应用于特需食品和营养食品。
附图说明
图1为本发明实施例1中海参肽的检测结果图。
图2为本发明实施例1中海参肽的LC-MS图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中使用的碱性蛋白酶的酶活为300，000U/g，胰蛋白酶的酶活为100,000U/g，中性蛋白酶的酶活为350,000U/g，风味蛋白酶的酶活为180,000U/g。
以下实施例中，反相HPLC的分离条件具体如下：
液相系统：岛津LC-16；
检测器：紫外检测器220nm；
流动相：A-含0.1％TFA的水溶液B-含0.1％TFA的乙腈溶液；
柱子：Cosmosil 5C18-PAQ column(4.6×250mm，Nacalai Tesque，Kyoto，Japan)；
流速：1mL/min；
洗脱程序：0-5min，5％的流动相B；5-45min，5-45％的流动相B；45-55min，45-5％的流动相B。
实施例1具有抗氧化和DPP-IV抑制功能的海参肽制备方法(1)
本实施例提供一种具有抗氧化和DPP-IV抑制功能的海参肽制备方法，具体如下：
(1)原料前处理：将海参清洗干净后添加2倍符合饮用水卫生标准的水中，100℃，0.1MPa下蒸煮60min，冷却到65℃，用高速均质机处理2分钟，得到海参蛋白液；
(2)酶解：调节海参蛋白液中蛋白含量为7％，按照海参蛋白液中蛋白重量0.6％的重量百分比加入蛋白酶进行分步酶解，第一步酶解添加蛋白重量0.5％的复合蛋白酶(质量比为2：1∶2的碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶)，在45℃条件下进行酶解反应6h；然后进行第二步酶解，再添加蛋白重量0.1％的风味蛋白酶，在50℃条件下进行酶解反应1h；在95℃下保温20分钟，冷却至室温；
(3)过滤：将步骤(2)所得的分离液进行分级过滤处理：先利用孔径为纳米级别的陶瓷膜过滤，去除大分子的杂质，滤液再经过纳滤膜过滤处理，脱除分离液中的小分子无机盐，收集截留液；
将收集的截留液通过二步超滤方法进行处理：利用孔径为5000道尔顿的超滤膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来；
(4)目标肽收集：取分子量为小于2000的蛋白肽液，先经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到海参蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，取8-11分钟收集的分离蛋白肽溶液；
(5)将步骤(4)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到具有特定功能的海参蛋白肽粉。
本实施例还提供采用上述制备方法制备得到的海参肽。
通过LC-MS/MS对步骤(5)得到的具有特定功能的海参蛋白肽粉的主要成分进行测定(图1和图2)，其氨基酸序列为LSFWLIPP的肽的含量为85.71％。
实施例2具有抗氧化和DPP-IV抑制功能的海参肽制备方法(2)
本实施例提供一种具有抗氧化和DPP-IV抑制功能的海参肽制备方法，具体如下：
(1)原料前处理：将海参清洗干净后添加3倍符合饮用水卫生标准的水中，110℃，0.14MPa下蒸煮90min，冷却到75℃，用高速均质机处理2分钟，得到海参蛋白液；
(2)酶解：调节海参蛋白液中蛋白含量为8％，按照海参蛋白液中蛋白重量0.8％的重量百分比加入蛋白酶进行分步酶解，第一步酶解添加蛋白重量0.6％的复合蛋白酶(质量比为2：1：1的碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶)，在55℃条件下进行酶解反应4.5h；然后进行第二步酶解，再添加蛋白重量0.2％的风味蛋白酶，在50℃条件下进行酶解反应45min；在95℃下保温20分钟，冷却至室温；
(3)过滤：将步骤(2)所得的分离液进行分级过滤处理：先利用孔径为纳米级别的陶瓷膜过滤，去除大分子的杂质，滤液再经过纳滤膜过滤处理，脱除分离液中的小分子无机盐，收集截留液；
将收集的截留液通过二步超滤方法进行处理：利用孔径为5000道尔顿的超滤膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来；
(4)目标肽收集：取分子量为小于2000的蛋白肽液，先经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到海参蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，取8-11分收集的分离蛋白肽溶液；
(5)将步骤(4)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到具有特定功能的海参蛋白肽粉。
本实施例还提供采用上述制备方法制备得到的海参肽。
通过LC-MS/MS对步骤(5)得到的具有特定功能的海参蛋白肽粉的主要成分进行测定，其氨基酸序列为LSFWLIPP的肽的含量为86.36％。
实施例3具有抗氧化和DPP-IV抑制功能的海参肽制备方法(3)
本实施例提供一种具有抗氧化和DPP-IV抑制功能的海参肽制备方法，具体如下：
(1)原料前处理：将海参清洗干净后添加5倍符合饮用水卫生标准的水中，120℃，0.2MPa下蒸煮120min，冷却到70℃，用高速均质机处理2.5分钟，得到海参蛋白液；
(2)酶解：调节海参蛋白液中蛋白含量为10％，按照海参蛋白液中蛋白重量1.0％的重量百分比加入蛋白酶进行分步酶解，第一步添加蛋白重量0.9％的复合蛋白酶(质量比为2∶1∶2的碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶)，在50℃条件下进行酶解反应5h；然后进行第二步酶解，再添加蛋白重量0.1％的风味蛋白酶，在50℃条件下进行酶解反应1.0h；在100℃下保温10分钟，冷却至室温；
(3)过滤：将步骤(2)所得的分离液进行分级过滤处理：先利用孔径为纳米级别的陶瓷膜过滤，去除大分子的杂质，滤液再经过纳滤膜过滤处理，脱除分离液中的小分子无机盐，收集截留液；
将收集的截留液通过二步超滤方法进行处理：利用孔径为5000道尔顿的超滤膜超滤，先将分子量小于5000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离出来；
(4)目标肽收集：取分子量为小于2000的蛋白肽液，先经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到海参蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，取8-11分钟收集的分离蛋白肽溶液；
(5)将步骤(4)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到具有特定功能的海参蛋白肽粉。
本实施例还提供采用上述制备方法制备得到的海参肽。
通过LC-MS/MS对步骤(5)得到的具有特定功能的海参蛋白肽粉的主要成分进行测定，其氨基酸序列为LSFWLIPP的肽的含量为86.06％。
实验例1海参肽的抗氧化活性测定
试验样品：样品1-3分别为实施例1-3步骤(5)制备的具有特定功能海参蛋白肽粉，样品4为由实施例1步骤(1)所得的海参蛋白液直接经过冷冻干燥得到的海参蛋白粉，样品5为实施例1步骤(4)得到的海参蛋白肽粉，样品6为实施例2步骤(4)得到的海参蛋白肽粉，样品LSFWLIPP为根据氨基酸序列LSFWLIPP人工合成的多肽。
抗氧化活性按照如下方法测定：
(1)清除DPPH自由基能力：取20μg/mL的抗氧化活性肽1.5mL，加入99.5％乙醇1.5mL和0.02％DPPH乙醇溶液0.675mL混合，振荡混匀，室温下避光水浴30min，然后在517nm下检测体系吸光值。吸光值越低，体系的清除DPPH自由基能力越强。空白对照即是将样品溶液1.5mL换成去离子水1.5mL。
(2)还原力测定：取20μg/mL的抗氧化活性肽1mL，加入0.2M磷酸缓冲液(pH6.6)2.5mL和1％(质量分数)的铁氰化钾溶液2.5mL，混匀，然后在50℃水浴加热20min。取出迅速冷却，加入10％(质量分数)三氯乙酸(TCA)溶液2.5mL，混合均匀，然后在3000g下离心10min。取上清液2.5mL，加入去离子水2.5mL和1％(质量分数)三氯化铁溶液0.5mL，充分混匀，在室温下反应10min，用700nm波长测定吸光度。还原力即可用700nm波长处吸光值表示。
结果如表1所示，结果表明，实施例1-3的步骤(5)制备得到的海参蛋白肽粉具有较好的抗氧化能力，20μg/mL蛋白肽粉的DPPH自由基清除率达到91％以上，还原力达到0.85以上。
表1海参蛋白肽的抗氧化活性试验结果
Figure BDA0003026405120000111
Figure BDA0003026405120000121
实验例2海参肽的DPP-Ⅳ抑制能力测定
DPP-Ⅳ抑制能力测定方法如下：
将样品用100mmol/L的Tris-HCL(pH8.0)缓冲液稀释至合适的浓度，吸取25μL样品稀释液与25μL底物(浓度为1.6mmol/L)混合，加入到96孔酶标板中。在37℃下孵育10min后，加入50μL DPP-IV酶液(酶活力为8U/L)，混匀后在37℃下精确孵育60min，立即加入100μL1mol/L的醋酸-醋酸钠(pH 4.0)缓冲液终止反应，于405nm下测吸光值A，并根据下列公式计算样品的DPP-IV抑制率。
DPP-IV抑制率％＝{1-(A样品-A样品空白对照)/(A阴性对照-A阴性空白对照)}×100
A样品：为样品反应液在405nm处的吸光值A；
A样品空白对照：以Tris-HCL缓冲液代替DPP-IV酶液作为样品空白对照的吸光值A；
A阴性对照：以Tris-HCL缓冲液代替样品作为阴性对照的吸光值；
A阴性空白对照：以Tris-HCL缓冲液代替DPP-IV酶液和样品作为阴性空白对照的吸光值；
DPP-IV抑制的IC50值测定：
测定样品在不同浓度下的DPP-IV抑制率，以多肽浓度的对数值与抑制率做回归曲线，得到回归方程，由此计算IC50，即50％的DPP-IV酶活性抑制时肽的浓度。
结果如表2所示，结果表明，实施例1-3的步骤(5)制备得到的具有特定功能的海参蛋白肽粉的DPP-IV抑制活性的IC50值均低于1.35mg/mL，具有非常好的DPP-IV抑制活性。
表2海参蛋白肽的DPP-IV抑制试验结果
海参蛋白肽 DPP-IV抑制活性(IC<sub>50</sub>值)mg/mL
样品1 1.34
样品2 1.29
样品3 1.32
样品4 2.13
样品5 1.51
样品6 1.54
样品LSFWLIPP 0.812
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 国肽生物工程（常德）有限公司
<120> 一种具有抗氧化和DPP-IV抑制功能的海参肽及其制备方法
<130> KHP211111006.3
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Leu Ser Phe Trp Leu Ile Pro Pro
1 5

Claims (9)

1.一种海参肽，其特征在于，所述海参肽采用包括如下步骤的方法制备得到：以海参为原料，将经前处理的原料经两步酶解制得酶解物；
所述两步酶解中，第一步酶解使用的酶为复合蛋白酶，所述复合蛋白酶为碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶，第二步酶解使用的酶为风味蛋白酶；
所述海参肽含有质量百分含量为≥80%的功能肽，所述功能肽的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的海参肽，其特征在于，所述复合蛋白酶中，碱性蛋白酶、胰蛋白酶和中性蛋白酶的质量之比为（1-2）：1：（1-2），所述碱性蛋白酶的酶活为50,000-500,000U/g，所述胰蛋白酶的酶活为100,000-1,000,000U/g，所述中性蛋白酶的酶活为100,000-650,000U/g。
3.根据权利要求2所述的海参肽，其特征在于，所述第一步酶解中，复合蛋白酶与原料蛋白的用量质量比为0.4-0.9%，酶解条件为45-60℃酶解3-7h；
所述第二步酶解中，风味蛋白酶与原料蛋白的用量质量比为0.1-0.2%，所述风味蛋白酶的酶活为80,000-250,000U/g，酶解条件为50-60℃酶解0.5-1h。
4.根据权利要求1~3任一项所述的海参肽，其特征在于，所述前处理包括：将海参经高温高压蒸煮后，经均质得到原料蛋白液；
所述高温高压蒸煮为在100-120℃、0.1-0.3Mpa条件下蒸煮30-120min。
5.根据权利要求1~3任一项所述的海参肽，其特征在于，所述制备方法还包括：将所述酶解物进行灭酶处理后，再进行过滤和目标肽的分离；
所述过滤包括：先利用孔径为纳米级别的陶瓷膜过滤，滤液再经过纳滤膜过滤处理，收集截留液；
将截留液先用孔径为5000道尔顿的超滤膜超滤，再用孔径为2000道尔顿的膜将分子量小于2000道尔顿的蛋白肽分离。
6.根据权利要求5所述的海参肽，其特征在于，所述目标肽的分离包括：
将所述分子量为小于2000的蛋白肽先经过SephadexG-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰，再用RP-HPLC反相高效液相色谱分离；分离条件如下：采用C18色谱柱，以含0.1%TFA的水溶液为流动相A，含0.1%TFA的乙腈溶液为流动相B，采用梯度洗脱进行分离：0-5min，5%的流动相B；5-45min，5-45%的流动相B；45-55min，45-5%的流动相B，流速为1 mL/min，收集8-11分钟分离的蛋白肽溶液。
7.功能性多肽，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
8.权利要求1~6任一项所述的海参肽或权利要求7所述的功能性多肽在制备药品中的应用；
所述药品具有抗氧化和/或DPP-IV抑制功能。
9.含有权利要求1~6任一项所述的海参肽或权利要求7所述的功能性多肽的药品。
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