CN107141336B - 具有dpp-iv抑制活性的牦牛骨蛋白肽及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种具有DPP‑IV抑制活性的牦牛骨蛋白肽及制备方法。本发明的牦牛骨蛋白肽优选可以由以牦牛骨制备得到的牦牛骨蛋白经过多级复合蛋白酶分步酶解的酶解物制得，所述复合蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶。本发明所述的牦牛骨蛋白肽具有优异的DPP‑IV抑制和抗氧化功能，可以作为DPP‑IV抑制剂和抗氧化原料应用于特需食品和营养食品中。
Description
技术领域
本发明涉及动物食品加工领域，更具体地，涉及具有DPP-IV抑制和抗氧化功能的牦牛骨蛋白肽及制备方法。
背景技术
降血糖功能因子是指能降低糖尿病患者血糖浓度以及改善其症状的生物活性成分。目前研究较多的天然产物类降糖因子、矿物质类降糖因子、维生素类降糖因子，其作用机理各不相同。天然产物类降糖因子按化学结构可分为黄酮类、
活性多糖类、生物碱类、皂甙类、萜类、多肽类等。自人工合成胰岛素以来，磺脲类药物、双胍类、胰岛素增敏剂、糖抑制剂等各种口服或注射的药物相继问世，然而化学药物常产生一定的毒副作用，天然降血糖成分具有作用温和而持久，性质稳定，几乎无毒性反应，还可多种降糖成分并存，综合起作用等优点，备受患者以及和医学界的青睐，也成为了降血糖功能因子的主要研究方向。
关于降血糖功能蛋白肽的开发有:专利CN201410129977.3公开了一种利用蚕蛹制备降血糖肽的方法，即在pH值为3.8-4.2下，向脱脂干蚕蛹粉的水溶液中加入酸性蛋白酶酶解，经脱色、超滤、浓缩以及真空冷冻干燥后即得具有降血糖功能的肽粉；又如，专利CN201610134873.0公开了一种牡丹籽降血糖肽，该发明利用超声波辅助生物酶法降解牡丹籽蛋白，将其切成多种不同分子量多肽，然后使用超滤、离子交换、葡聚糖凝胶和高效液相色谱进行分离纯化，获得大量的牡丹籽降血糖肽。
目前，基于肠促胰素的治疗包括胰升血糖素样肽l类似物及二肽基肽酶(DPP-IV)抑制剂成为糖尿病新药研究的热点，而相当于GLP-l类似物，DPP-IV抑制剂具有可口服使用，已成为糖尿病新药研究的一个热点。国内外越来越多的人致力于化学合成的DPP-IV抑制剂，如已进入市场的西他列汀，如专利CN201480012769.3公开了一种新型DPP-IV抑制剂，该发明包括具有β受体阻断剂活性的二肽基肽酶IV(DPP-IV)的新型抑制剂，该抑制剂由特定化合物及其药用盐构成，等。由于存在化学药品长期服用是否会产生副作用的争议，因此，如果能从天然药物或天然食物中获取具有DPP-IV抑制活性的功能物质，将对人类健康产生重大的影响。
近几年来，从食物来源中寻找具有DPP-IV抑制活性的小分子活性肽已成为研究热点。如，专利CN201410498361.3公开了一种源于鹿蛋白的DPP-IV抑制肽GPGSPGGPL，其氨基酸序列为Gly-Pro-Gly-Ser-Pro-Gly-Gly-Pro-Leu。多肽GPGSPGGPL具有DPP-IV抑制活性及降血糖活性；又如，专利CN201410455009.1公开一种豆渣蛋白质的提取方法及其用于制备DPP-IV抑制肽的方法，该方法中不需要添加任何酸液或碱液，避免了对环境的污染；又如，专利CN201510622792.2公开了一种具有ACE和DPP-IV抑制活性的多肽及其应用，该发明中的多肽从酸奶中提取，氨基酸序列为Phe-Val-Ala-Pro-Glu-Val-Phe，该多肽不仅具有血管紧张素转换酶ACE抑制活性还具有DPP-IV抑制活性，可用于降血压、降血糖等疾病的保健品和药物先导化合物。
目前，以牦牛骨为原料制备具有DPP-IV抑制活性的肽未见相关研究。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种具有DPP-IV抑制活性和抗氧化功能的牦牛骨蛋白肽及其制备方法和应用。
为了实现本发明的目的，本发明一方面提供了一种具有DPP-IV抑制活性和抗氧化功能的牦牛骨蛋白肽，该牦牛骨蛋白肽使用牦牛骨蛋白经过复合蛋白酶分步酶解的酶解物制得；其中，复合蛋白酶为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶。
使用上述方法得到的牦牛骨蛋白肽具有较好的DPP-IV抑制活性和抗氧化功能，DPP-IV抑制活性(IC50值)小于0.55g/mL。
为了提高得到的牦牛蛋白肽的抑制活性，在本发明一个优选实施方式中，牦牛骨蛋白肽的制备方法包括如下步骤：
1)牦牛骨蛋白液的制备；
2)将步骤1)制得的牦牛骨蛋白液经过复合蛋白酶分步酶解；
3)将步骤2)酶解后的产物除杂、膜分离、凝胶分离以及反相HPLC分离，浓缩，冷冻干燥后即得。
该制备方法中不添加任何酸和碱。
为了得到100％牦牛骨蛋白肽，使用上述3种复合蛋白酶的分步酶解优选可以包括以下步骤：
调节牦牛骨蛋白液中蛋白含量为6-9wt％，按照牦牛骨蛋白液中蛋白重量0.4～1.0％的重量百分比加入复合蛋白酶进行分步酶解。
分步酶解进一步优选为：
第一步酶解反应：向蛋白重量6-9wt％的牦牛骨蛋白液中加入0.2～0.5wt％第一复合蛋白酶，在45～60℃条件下进行酶解反应0.5～1.5h，其中，第一复合蛋白酶为碱性蛋白酶和中性蛋白酶；
第二步酶解反应：向第一步酶解反应产物中加入0.2～0.5wt％第二复合蛋白酶，在45～55℃条件下进行酶解反应1.0～2.0h，其中，第二复合蛋白酶为胰蛋白酶和风味蛋白酶。
在本发明一个优选实施方式中，第一复合蛋白酶中碱性蛋白酶和中性蛋白酶的质量比为1～2:1。
在本发明一个优选实施方式中，第二复合蛋白酶中胰蛋白酶和风味蛋白酶的质量比为1:1～2。
在本发明一个优选实施方式中，步骤1)中还包括制得的牦牛骨蛋白液经频率为50-80kH的超声波超声处理15-25分钟。在本发明的实施方式中，利用特定频率超声波技术处理的牦牛骨蛋白液，可以明显改善牦牛骨蛋白对酶的敏感性，降低酶的使用量。
在本发明一个优选实施方式中，步骤2)中除杂具体为：
在90～95℃下保温10～20分钟，冷却至室温，加入酶解液重量0.2-0.6％的活性炭于酶解液中，通过硅藻土进行分离，收集分离液。
在该优选实施方式中，通过使用活性炭除杂，使得蛋白肽具有良好的风味和色泽，能广泛应用于特需食品、药物以及营养食品中。
为了使得到的牦牛骨蛋白液的抑制效果更好，步骤3)中膜分离可以具体为：
将除杂后的产物通过两步超滤方法进行处理，先后利用孔径为10000道尔顿的膜和孔径为5000道尔顿的膜进行超滤。
进一步地，可以利用孔径为10000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于10000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为5000道尔顿的膜将分子量小于5000道尔顿的蛋白肽分离出来。
在本发明一个优选实施方式中，步骤3)中凝胶分离和反相HPLC可以为：
将膜分离后的产物经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到牦牛骨蛋白肽粗品；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，收集经过RP-HPLC反相高效液相色谱分离中9-13分中的肽洗脱液。
将得到的肽洗脱液浓缩，冷冻干燥，即可得到本发明最优选的牦牛骨蛋白肽。
在本发明一个优选实施方式中，使用上述方法制备得到的具有DPP-IV抑制和抗氧化功能的牦牛骨蛋白肽包括具有如下氨基酸序列的多肽：
Val-Leu-Gly-Leu-Val-Arg(VLGLVA，如SEQ ID NO.1所示)。
在本发明一个优选实施方式中，使用上述方法制备得到的具有DPP-IV抑制和抗氧化功能的牦牛骨蛋白肽包括具有如下氨基酸序列的多肽：
Leu-Ala-Leu-Leu-Glu-Ala-Arg(LALLGAA，如SEQ ID NO.2所示)
在本发明一个优选实施方式中，使用上述方法制备得到的具有DPP-IV抑制和抗氧化功能的牦牛骨蛋白肽包括具有如下氨基酸序列的多肽：
Leu-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys(LGTLGGL，如SEQ ID NO.3所示)
含有上述3种多肽中任一种的牦牛骨蛋白肽具有较好的DPP-IV抑制活性和抗氧化功能，DPP-IV抑制活性(IC50值)小于0.55g/mL。
在本发明一个优选实施方式中，牦牛骨蛋白肽中活性成分包括上述3种多肽，进一步优选地，活性成分为上述3种多肽的组合，进一步优选地，上述3种肽的组合的含量在45％以上。
本发明的牦牛骨蛋白肽可以为粉末状。
为了使整个加工过程更加简单且不用添加酸或碱进行pH的调整，步骤1)中的牦牛骨蛋白液是以牦牛骨为原料，经高温蒸煮和去脂得到的。
即本发明还提供了上述牦牛骨蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
1)以牦牛骨为原料，经高温蒸煮和去脂得到牦牛骨蛋白液；
2)将步骤1)制得的牦牛骨蛋白液经过复合蛋白酶分步酶解；
3)将步骤2)酶解后的产物除杂、膜分离、凝胶分离以及反相HPLC分离，浓缩，冷冻干燥后即得。
其中，步骤2)和步骤3)的进一步优选方案参照上述内容。
在本发明一个优选实施方式中，步骤1)中牦牛骨蛋白液的制备具体可以为：
选用冷冻鲜牦牛骨，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,牦牛骨清洗后用牛骨粉碎将牦牛骨打成骨粒，加入牦牛骨颗粒总量1.0～3.0倍的水在121-131℃条件下处理2-5小时，然后通过离心过滤得到去骨渣的牦牛骨高温蒸煮液，冷却到15-30℃，通过分液罐去脂，得到牦牛骨蛋白液。
为了保持较好的功能特性，较易实现产业化生产，在本发明一个优选实施方式中，牦牛骨蛋白肽的制备方法具体可以为：
1)选用冷冻鲜牦牛骨，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,牦牛骨清洗后用牛骨粉碎将牦牛骨打成骨粒，加入牦牛骨颗粒总量1.0～3.0倍的水在121-131℃条件下处理2-5小时，然后通过离心过滤得到去骨渣的牦牛骨高温蒸煮液，冷却到15-30℃，通过分液罐去脂，得到牦牛骨蛋白液；
将得到的牦牛骨蛋白液，温度调整到65-75℃，利用超声波发生器经超声波(频率为50-80kH)处理15-25分钟，改变牦牛骨胶原蛋白的组织结构；
2)调节牦牛骨蛋白液中蛋白含量为6-9％，按照牦牛骨蛋白液中蛋白重量0.4～1.0％的重量百分比加入复合蛋白酶进行分步酶解，
第一步利用0.2～0.5％第一复合蛋白酶(碱性蛋白酶和中性蛋白酶组成，它们之间的质量比为1～2：1)，在45～60℃条件下进行酶解反应0.5～1.5h；
然后进行第二步利用0.2～0.5％第二复合蛋白酶(胰蛋白酶和风味蛋白酶组成，它们之间的质量比为1：1～2)，在45～55℃条件下进行酶解反应1.0～2.0h；
3)在90～95℃下保温10～20分钟，冷却至室温，加入酶解液重量0.2-0.6％的活性炭于酶解液中，通过硅藻土进行分离，收集分离液；
膜分离：将上述步骤所得的分离液通过两步超滤方法进行处理，利用孔径为10000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于10000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为5000道尔顿的膜将分子量小于5000道尔顿的蛋白肽分离出来；
凝胶分离以及反相HPLC分离：取分子量为小于5000的蛋白肽液，再经过SephadexG-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到牦牛骨蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，收集经过RP-HPLC反相高效液相色谱分离中9-13分中的肽洗脱液；
将上述步骤得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到牦牛骨蛋白肽粉。
由上述制备方法得到牦牛骨蛋白肽分子量低于1000的肽的比例为85％以上，在具有抑制DPP-IV活性的同时，也还具有较好的抗氧化能力，在20μg/mL的条件下，其清除DPPH自由基能力达到88％以上，还原力达到0.88以上。
本发明还提供了上述牦牛骨蛋白肽以及上述制备牛骨蛋白肽的方法在制备预防或治疗受益于DPP-IV抑制和/或抗氧化的疾病的药物或食品中的应用。
本发明的牦牛蛋白肽可以作为药物，或是膳食补充剂，或作为食品基料加入到普通食品如饮料、乳制品等中，本发明的药物或食品可用于治疗糖尿病、神经疾病、炎症性疾病如关节炎、高血压、心脑血管等能够用DPP-IV抑制剂和抗氧化剂治疗的其他疾病。
本发明的牦牛骨蛋白肽具有优异的DPP-IV抑制和抗氧化功能，DPP-IV抑制活性(IC50值)小于0.55mg/mL；本发明开发的牦牛骨蛋白肽制备方法简单，整个加工过程中没有添加酸或碱进行pH的调整，产品保持较好的功能特性，较易实现产业化生产；本发明开发的产品安全，本发明采用多种食品级复合蛋白酶(碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶)，经在温和条件下，经过适度酶解获得特定分子量的肽组成的牦牛骨蛋白肽，不加任何添加剂，为100％牦牛骨蛋白肽。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规技术手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售。
实施例1：具有DPP-Ⅳ抑制和抗氧化功能的牦牛骨蛋白肽的制备
(1)选用冷冻鲜牦牛骨100克，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,牦牛骨清洗后用牛骨粉碎机将牦牛骨打成骨粒，加入牦牛骨颗粒总量2倍的水在121℃条件下处理5小时，通过离心过滤得到去骨渣的牦牛骨蒸煮液，冷却到20℃，通过分液罐去脂，得到牦牛骨蛋白液。
(2)将(1)得到的牦牛骨蛋白液，温度调整到65℃，利用超声波发生器经超声波(频率为80kH)处理15分钟。
(3)调节牦牛骨蛋白液中蛋白含量为8％，按照牦牛骨蛋白液中蛋白重量0.8％的重量百分比加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步利用0.4％第一复合蛋白酶(碱性蛋白酶和中性蛋白酶的质量比为1：1)，在50℃条件下进行酶解反应1.5h；然后进行第二步利用0.4％第二复合蛋白酶(胰蛋白酶和风味蛋白酶的质量比为1：2)，在55℃条件下进行酶解反应1.0h；在95℃下保温10分钟，冷却至室温，加入酶解液重量0.2％的活性炭于酶解液中，通过硅藻土进行分离，收集分离液；
(4)将步骤(3)所得的分离液利用孔径为10000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于10000的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为5000道尔顿的膜将分子量小于5000道尔顿的蛋白肽分离出来。
(5)取分子量为小于5000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到经过凝胶分离的牦牛骨蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，取9-11分收集的肽溶液；
(6)将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到具有DPP-Ⅳ抑制和抗氧化功能的骨胶原蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对骨胶原蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Val-Leu-Gly-Leu-Val-Arg，Leu-Ala-Leu-Leu-Glu-Ala-Arg，Leu-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys。上述肽的含量共为45.3％。经检测，该蛋白肽中生物活性最高的三种肽分别为上述三种肽。
实施例2：具有DPP-Ⅳ抑制和抗氧化功能的牦牛骨蛋白肽的制备
(1)选用冷冻鲜牦牛骨500克，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,牦牛骨清洗后用牛骨粉碎机将牦牛骨打成骨粒，加入牦牛骨颗粒总量1.5倍的水在130℃条件下处理3小时，通过离心过滤得到去骨渣的牦牛骨蒸煮液，冷却到30℃，通过分液罐去脂，得到牦牛骨蛋白液。
(2)将(1)得到的牦牛骨蛋白液，温度调整到70℃，利用超声波发生器经超声波(频率为70kH)处理20分钟。
(3)调节牦牛骨蛋白液中蛋白含量为9％，按照牦牛骨蛋白液中蛋白重量1.0％的重量百分比加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步利用0.4％第一复合蛋白酶(碱性蛋白酶和中性蛋白酶的质量比为1：1)，在50℃条件下进行酶解反应1.5h；然后进行第二步利用0.6％第二复合蛋白酶(胰蛋白酶和风味蛋白酶的质量比为1：1)，在50℃条件下进行酶解反应1.0h；在95℃下保温10分钟，冷却至室温，加入酶解液重量0.4％的活性炭于酶解液中，通过硅藻土进行分离，收集分离液；
(4)将步骤(3)所得的分离液利用孔径为10000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于10000的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为5000道尔顿的膜将分子量小于5000道尔顿的蛋白肽分离出来。
(5)取分子量为小于5000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到经过凝胶分离的牦牛骨蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，取10-13分收集的肽溶液；
(6)将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到具有DPP-Ⅳ抑制和抗氧化功能的骨胶原蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对骨胶原蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Val-Leu-Gly-Leu-Val-Arg，Leu-Ala-Leu-Leu-Glu-Ala-Arg，Leu-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys的肽的含量为48％。经检测，该蛋白肽中生物活性最高的三种肽分别为上述三种肽。
实施例3：具有DPP-Ⅳ抑制和抗氧化功能的牦牛骨蛋白肽的制备
(1)选用冷冻鲜牦牛骨1000克，用符合饮用水卫生标准的清洁水清洗,牦牛骨清洗后用牛骨粉碎机将牦牛骨打成骨粒，加入牦牛骨颗粒总量3.0倍的水在125℃条件下处理3小时，然后通过离心过滤得到去骨渣的牦牛骨高温蒸煮液，冷却到25℃，通过分液罐去脂，得到牦牛骨蛋白液。
(2)将(1)得到的牦牛骨蛋白液，温度调整到75℃，利用超声波发生器经超声波(频率为60kH)处理25分钟。
(3)调节牦牛骨蛋白液中蛋白含量为9％，按照牦牛骨蛋白液中蛋白重量0.6％的重量百分比加入复合蛋白酶进行分步酶解，第一步利用0.3％第一复合蛋白酶(碱性蛋白酶和中性蛋白酶组成，它们之间的质量比为2：1)，在60℃条件下进行酶解反应1.0h；然后进行第二步利用0.3％第二复合蛋白酶(胰蛋白酶和风味蛋白酶组成，它们之间的质量比为1：1)，在50℃条件下进行酶解反应2.0h；在90℃下保温20分钟，冷却至室温，加入酶解液重量0.6％的活性炭于酶解液中，通过硅藻土进行分离，收集分离液；
(4)将步骤(3)所得的分离液通过两步超滤方法进行处理，利用孔径为10000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于10000的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为5000道尔顿的膜将分子量小于5000道尔顿的蛋白肽分离出来。
(5)取分子量为小于5000的蛋白肽液，再经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到经过凝胶分离的牦牛骨蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，取9-12分收集的肽溶液；
(6)将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到具有DPP-Ⅳ抑制和抗氧化功能的骨胶原蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对骨胶原蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为Val-Leu-Gly-Leu-Val-Arg，Leu-Ala-Leu-Leu-Glu-Ala-Arg，Leu-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys的肽的含量为46％。经检测，该蛋白肽中生物活性最高的三种肽分别为上述三种肽。
实验例1：牦牛骨蛋白肽DPP-Ⅳ抑制能力的测定试验
试验样品：样品1、2、3分别为实施例1、实施例2、实施例3制备的牦牛骨蛋白肽，样品4为实施例1的牦牛骨蛋白液经过冷冻干燥达到的牦牛骨蛋白粉。
按照如下方法进行：
将样品用100mmol/L的Tris-HCL(pH8.0)缓冲液稀释至合适的浓度，吸取25μL样品稀释液与25μL底物(浓度为1.6mmol/L)混合，加入到96孔酶标板中。在37℃下孵育10min后，加入50μL DPP-IV酶液(酶活力为8U/L)，混匀后在37℃下精确孵育60min，立即加入100μL1mol/L的醋酸-醋酸钠(pH 4.0)缓冲液终止反应，于405nm下测吸光值A，并根据下列公式计算样品的DPP-IV抑制率。
DPP-IV抑制率％＝{1-(A样品-A样品空白对照)/(A阴性对照-A阴性空白对照)}×100
A样品：为样品反应液在405nm处的吸光值A；
A样品空白对照：以Tris-HCL缓冲液代替DPP-IV酶液作为样品空白对照的吸光值A；
A阴性对照：以Tris-HCL缓冲液代替样品作为阴性对照的吸光值；
A阴性空白对照：以Tris-HCL缓冲液代替DPP-IV酶液和样品作为阴性空白对照的吸光值
DPP-IV抑制的IC50值测定：
测定样品在不同浓度下的DPP-IV抑制率，以多肽浓度的对数值与抑制率做回归曲线，得到回归方程，由此计算IC50，即50％的DPP-IV酶活性抑制是肽的浓度。
结果：见表1。本发明牦牛骨蛋白肽具有很好的DPP-IV抑制能力，DPP-IV抑制活性(IC50值)低于0.55mg/mL，显著低于同类复合蛋白肽的IC50值，具有很好的DPP-IV抑制能力。
表1 本发明牦牛骨蛋白肽的DPP-IV抑制能力
实验例2：本发明牦牛骨蛋白肽抗氧化活性的测定试验
试验样品：样品1、2、3分别为实施例1、实施例2、实施例3制备的牦牛骨蛋白肽，样品4为实施例1的牦牛骨蛋白液经过冷冻干燥达到的牦牛骨蛋白粉。
按照如下方法进行：
(1)清除DPPH自由基能力：取20μg/mL的抗氧化活性肽1.5mL，加入99.5％乙醇1.5mL和0.02％DPPH乙醇溶液0.675mL混合，振荡混匀，室温下避光水浴30min，然后在517nm下检测体系吸光值。吸光值越低，体系的清除DPPH自由基能力越强。空白对照即是将样品溶液1.5mL换成去离子水1.5mL。
DPPH自由基清除能力％＝((空白吸光值-样品吸光值)/空白吸光值)×100
(2)还原力测定：取20μg/mL的抗氧化活性肽1mL，加入0.2M磷酸缓冲液(pH 6.6)2.5mL和1％(质量分数)的铁氰化钾溶液2.5mL，混匀，然后在50℃水浴加热20min。取出迅速冷却，加入10％(质量分数)三氯乙酸(TCA)溶液2.5mL，混合均匀，然后在3000g下离心10min。取上清液2.5mL，加入去离子水2.5mL和1％(质量分数)三氯化铁溶液0.5mL，充分混匀，在室温下反应10min，用700nm波长测定吸光度。还原力即可用700nm波长处吸光值表示。
从表2可以看出，本发明牦牛骨蛋白肽分子量低于1000的肽达到85％以上，具有较好的抗氧化能力，在20μg/mL的条件下，其清除DPPH自由基能力达到88％以上，还原力达到0.88以上，也是一种较好的抗氧化肽。
表2 本发明牦牛骨蛋白肽的抗氧化活性试验结果
最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 青海国肽生物科技有限公司
<120> 具有DPP-IV抑制活性的牦牛骨蛋白肽及制备方法
<130> KHP171112059.7
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> 牦牛骨
<400> 1
Val Leu Gly Leu Val Arg
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 牦牛骨
<400> 2
Leu Ala Leu Leu Glu Ala Arg
1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> 牦牛骨
<400> 3
Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys
1 5
Claims (3)
1.一种具有DPP-IV抑制活性和抗氧化功能的牦牛骨蛋白肽，其特征在于，所述牦牛骨蛋白肽采用如下方法制备：
1)以牦牛骨为原料，经高温蒸煮和去脂得到牦牛骨蛋白液，将制得的牦牛骨蛋白液经频率为50-80kH的超声波超声处理15-25分钟以改变牦牛骨蛋白的组织结构；
2)将步骤1)制得的牦牛骨蛋白液经过复合蛋白酶分步酶解且不添加酸和碱，所述复合蛋白酶分步酶解包括以下步骤：第一步酶解反应：向蛋白重量6-9wt％的牦牛骨蛋白液中加入0.2～0.5wt％第一复合蛋白酶，在45～60℃条件下进行酶解反应0.5～1.5h，其中，第一复合蛋白酶为碱性蛋白酶和中性蛋白酶；第二步酶解反应：向第一步酶解反应产物中加入0.2～0.5％第二复合蛋白酶，在45～55℃条件下进行酶解反应1.0～2.0h，其中，第二复合蛋白酶为胰蛋白酶和风味蛋白酶；
3)将步骤2)酶解后的产物除杂、膜分离、凝胶分离以及反相HPLC分离，浓缩，冷冻干燥后即得；
其中，所述牦牛骨蛋白肽的整个加工过程中没有添加酸或碱进行pH的调整，所述步骤3)中除杂具体为：
在90～95℃下保温10～20分钟，冷却至室温，加入酶解液重量0.2-0.6％的活性炭于酶解液中，通过硅藻土进行分离，收集分离液；
所述步骤3)中膜分离具体为：将除杂后的产物通过两步超滤方法进行处理，先后利用孔径为10000道尔顿的膜和孔径为5000道尔顿的膜进行超滤；
所述步骤3)中凝胶分离和反相HPLC具体为：
将膜分离后的产物经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到牦牛骨蛋白肽粗品；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，收集经过RP-HPLC反相高效液相色谱分离中9-13分钟的肽洗脱液；
所述牦牛骨蛋白肽包括具有如下氨基酸序列的含量为45%的多肽：
Val-Leu-Gly-Leu-Val-Arg，
Leu-Ala-Leu-Leu-Glu-Ala-Arg，
和Leu-Glu-Tyr-Leu-Glu-Glu-Lys。
2.制备权利要求1所述的牦牛骨蛋白肽的方法，包括以下步骤：
1)以牦牛骨为原料，经高温蒸煮和去脂得到牦牛骨蛋白液，将制得的牦牛骨蛋白液经频率为50-80kH的超声波超声处理15-25分钟以改变牦牛骨蛋白的组织结构；
2)将步骤1)制得的牦牛骨蛋白液经过复合蛋白酶分步酶解且不添加酸和碱，所述复合蛋白酶分步酶解包括以下步骤：第一步酶解反应：向蛋白重量6-9wt％的牦牛骨蛋白液中加入0.2～0.5wt％第一复合蛋白酶，在45～60℃条件下进行酶解反应0.5～1.5h，其中，第一复合蛋白酶为碱性蛋白酶和中性蛋白酶；第二步酶解反应：向第一步酶解反应产物中加入0.2～0.5％第二复合蛋白酶，在45～55℃条件下进行酶解反应1.0～2.0h，其中，第二复合蛋白酶为胰蛋白酶和风味蛋白酶；
3)将步骤2)酶解后的产物除杂、膜分离、凝胶分离以及反相HPLC分离，浓缩，冷冻干燥后即得；
其中，所述牦牛骨蛋白肽的整个加工过程中没有添加酸或碱进行pH的调整，所述步骤3)中除杂具体为：
在90～95℃下保温10～20分钟，冷却至室温，加入酶解液重量0.2-0.6％的活性炭于酶解液中，通过硅藻土进行分离，收集分离液；
所述步骤3)中膜分离具体为：将除杂后的产物通过两步超滤方法进行处理，先后利用孔径为10000道尔顿的膜和孔径为5000道尔顿的膜进行超滤；
所述步骤3)中凝胶分离和反相HPLC具体为：
将膜分离后的产物经过Sephadex G-15凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到牦牛骨蛋白肽粗品；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行1次分离，收集经过RP-HPLC反相高效液相色谱分离中9-13分钟的肽洗脱液。
3.权利要求1所述的牦牛骨蛋白肽在制备预防或治疗受益于DPP-IV抑制和/或抗氧化的疾病的药物或食品中的应用。
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