CN107828842B - 一种具有抗氧化和dpp-iv抑制功能的核桃蛋白肽 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种具有抗氧化和DPP‑IV抑制功能的核桃蛋白肽，其制备方法包括：(1)核桃粕粉加水，在高温下处理、去脂得到核桃蛋白液；(2)超声处理核桃蛋白液；(3)加入复合蛋白酶酶解，同步进行超声处理；高温下保温，冷却后，过滤分离，收集分离液；(4)分离液通过二步超滤法处理；(5)滤液过柱分离，收集洗脱峰，即得。本发明方法操作简单，酶用量少，制备过程无需添加酸或碱调节pH值，且不添加任何添加剂，较好地保持产品的功能特性，得率高，风味好，所得的核桃蛋白肽具有优异的抗氧化和DPP‑IV抑制功能，DPP‑IV抑制活性IC50值低于202μg/ml，广泛应用于特需食品和营养食品的制造。

Description

一种具有抗氧化和DPP-IV抑制功能的核桃蛋白肽
技术领域
本发明涉及食品加工技术领域，具体地涉及一种具有抗氧化和DPP-IV抑制功能的核桃蛋白肽及其制备方法。
背景技术
蛋白质经过水解得到多肽，使得蛋白质的结构被改变，疏水区的活性官能基团暴露，随着肽键的裂解，游离氨基酸增加，从而可以提供质子或电子源，保持较高的氧化还原电位，使其具有清除活性自由基的能力，还原力，具有抑制脂质过氧化作用的发生，从而抗氧化肽的抗氧化活性得以提高。氧化对需氧生物特别是脊椎动物和人类是一个重要的代谢过程，但是它却导致了自由基的形成。自由基是高度不稳定的、易于和其他分子发生化学反应，活性氧自由基(ROS)被认为能引起氧化应激。氧化应激涉及多种人类疾病如动脉粥样硬化，糖尿病，神经系统疾病，如阿尔茨海默病，帕金森氏病等等，以及老龄化。在食品体系中，脂类或蛋白质可能会受到ROS的攻击经历氧化过程，从而导致食品产生不愉快味道，颜色发暗，同时也可能产生潜在的毒性产物。抗氧化多肽的应用能使人体免受氧化应激的破坏，并防止食品成分由于捐献电子给ROS以及中和ROS的负面作用而变质。因此抗氧化肽在医学、化妆品、生物、食品领域有广泛的应用价值。
降血糖功能因子是指能降低糖尿病患者血糖浓度以及改善其症状的生物活性成分。目前研究较多的天然产物类降糖因子、矿物质类降糖因子、维生素类降糖因子，其作用机理各不相同。天然产物类降糖因子按化学结构可分为黄酮类、活性多糖类、生物碱类、皂甙类、萜类、多肽类等。自人工合成胰岛素以来，磺脲类药物、双胍类、胰岛素增敏剂、糖抑制剂等各种口服或注射的药物相继问世，然而化学药物常产生一定的毒副作用，天然降血糖成分具有作用温和而持久，性质稳定，几乎无毒性反应，还可多种降糖成分并存，综合起作用等优点，备受患者以及和医学界的青睐，也成为了降血糖功能因子的主要研究方向。
DPP IV二肽基肽酶(一种负责降解GLP1的酶)：其作用是使GLP-1分裂，降解，DPPIV是一种能使促胰岛素激素GLP-1迅速失活的酶。抑制DPP-IV能提高GLP-1及其他生物活性肽的激素活性，从而刺激胰岛素的释放，减少胰高血糖素的分泌，有利于2型糖尿病患者血糖高水平的调节。
本发明针对目前核桃蛋白产品开发的现状，利用核桃粕粉为原料，在不添加任何酸和碱条件下，利用多种蛋白酶复合酶解，通过膜分离和凝胶分离技术，开发了同时具有特定降血糖和抗氧化功能的核桃蛋白肽，建立一套简单高效的多功能的核桃蛋白肽的制备方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是在于提供一种具有抗氧化和DPP-IV抑制功能的核桃蛋白肽。
本发明的另一目的在于提供上述核桃蛋白肽的制备方法。
本发明的再一个目的在于提供上述核桃蛋白肽的应用。
为了实现上述技术目的，本发明提供了一种具有抗氧化和DPP-IV抑制功能的核桃蛋白肽，包括以下步骤:
(1)核桃粕粉加水，在高温下处理、去脂得到核桃蛋白液；
(2)超声处理核桃蛋白液；
(3)加入复合蛋白酶酶解，酶解过程同步进行超声处理；高温下保温，冷却后，过滤分离，收集分离液；
(4)分离液通过二步超滤法处理；
(5)滤液过柱分离，收集洗脱峰，即得。
上述制备方法中，步骤(1)水与核桃粕粉的质量比为8-10:1，所述高温下处理为90-100℃搅拌2-4小时；之后离心去脂得到核桃蛋白液。
步骤(2)超声处理方法为将步骤(1)得到的核桃蛋白液调至65-75℃，60-80kH的超声频率处理25-35min。
本发明通过大量实验发现，核桃蛋白液温度调至65-75℃进行60-80kH超声处理，效果最好，能够较好地改变核桃蛋白的组织结构，使下面酶解步骤缩短酶解时间和使用较少的酶量，就能够获得优质的蛋白肽。
步骤(3)按照核桃蛋白液总重量的0.8-1.2％的重量百分比加入复合蛋白酶，所述复合蛋白酶由中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶组成，三者质量比为1：(1-2):1。
步骤(3)的酶解条件为50-65℃酶解3-4小时；步骤(3)所述超声处理是20-30kH处理；步骤(3)酶解之后于90-95℃下保温10-20min，冷却至65-75℃，过滤分离，收集分离液。在本发明的实施例中是通过硅藻土进行过滤分离，然后收集分离液。本领域技术人员可以采用任何具有等同效果的分离方式进行过滤分离。
步骤(4)的两步超滤法为先用孔径为3000D的膜超滤，再用孔径为1500D的膜超滤，得到分子量小于1500D的蛋白肽。
具体地，是利用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于3000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为1500道尔顿的膜将分子量小于1500道尔顿的蛋白肽分离出来。
步骤(5)滤液过柱分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰，浓缩、冷冻干燥得到核桃蛋白肽。
具体地，取分子量为小于1500的蛋白肽液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到核桃蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行分离，收集经过RP-HPLC反相高效液相色谱分离中第8-9分钟洗脱出来的肽液；将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到核桃蛋白肽粉。
通过LC-MS/MS对核桃蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为其氨基酸序列为SAPLRVY(丝氨酸-丙氨酸-脯氨酸-亮氨酸-精氨酸-缬氨酸-酪氨酸)、FSTELPST(苯丙氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸)、DTDYKKY(天冬氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-赖氨酸-赖氨酸-酪氨酸)的肽的含量为85％～95％，其中SAPLRVY(29％-36％)、FSTELPST(23％-28％)、DTDYKKY(26％-35％)。所述％均为质量百分比。
上述制备方法制备得到的核桃蛋白肽属于本发明的保护范围。本发明通过实验发现，本发明上述方法制备得到的核桃蛋白肽具有优异的DPP-IV抑制和抗氧化功能。
进而，本发明提供了该核桃蛋白肽在制备降血糖或抗氧化药物中的应用。含有本发明方法制得的核桃蛋白肽的食品、保健品或药物也属于本发明的保护范围。
本发明发现氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示的肽均具有抗氧化和DPP-IV抑制功能。
进一步地，本发明提供了氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示的肽在制备食品、保健品或药物中的应用。
本发明的优点在于：
(1)本发明提出核桃蛋白肽制备全过程同步利用不同频率的超声波处理，制备方法简单，整个加工过程中没有添加酸或碱进行pH的调整，产品保持较好的功能特性，较易实现产业化生产。
(2)开发的蛋白肽具有很好的DPP-Ⅳ抑制和抗氧化功能，发明的核桃蛋白肽DPP-IV抑制活性(IC50值)低于202μg/mL，其中核桃蛋白肽中含量占29％-36％的SAPLRVY肽DPP-IV抑制活性(IC50值)为110μg/mL。
(3)本发明利用特定频率超声波技术处理的核桃蛋白液，可以明显改善核桃蛋白对酶的敏感性，降低酶的使用量。
(4)开发的产品安全，本发明采用多种食品级复合蛋白酶(木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶)，经在温和条件下，经过适度酶解获得特定分子量和肽组成的核桃蛋白肽，酶用量少，不加任何添加剂，为100％核桃蛋白肽。
(5)本发明开发的蛋白肽，具有良好的风味和色泽，能广泛应用于特需食品和营养食品。
(6)本发明开发蛋白肽中分子量小于1500的肽的比例为95％以上，具有非常明确的肽的组成。
具体实施方式
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公知的方法制得的产品。以下实施例的％均指质量百分比。核桃粕购自石家庄康福寿乐核桃油加工有限公司，，中性蛋白酶、风味蛋白酶均购自诺维信(中国)投资有限公司、木瓜蛋白酶购自南宁庞博生物工程有限公司。
实施例1具有DPP-IV抑制和抗氧化功能的核桃蛋白肽的制备
(1)选用核桃粕100克，用粉碎机将核桃粕蛋白打成粉，加入核桃粕总量8倍的水在100℃条件下处理3小时，离心去脂肪，得到核桃蛋白液。
(2)将(1)得到的核桃蛋白液，温度调整到75℃，利用超声波发生器经超声波(频率为60kH)处理35分钟，改变核桃蛋白的组织结构。
(3)按照核桃蛋白液中核桃重量1.2％的重量百分比加入复合蛋白酶进行酶解(复合蛋白酶组成：中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶组成，它们之间的质量比为1：1：1)，在55℃条件下进行酶解反应4h，酶解过程同步利用超声波发生器(频率为20kH)处理；在95℃下保温10分钟，冷却至65℃，通过硅藻土进行过滤分离，收集分离液；
(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于3000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为1500道尔顿的膜将分子量小于1500道尔顿的蛋白肽分离出来。
(5)取分子量为小于1500的蛋白肽液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到核桃蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行分离，收集经过RP-HPLC反相高效液相色谱分离中第8-9分钟洗脱出来的肽液；
(6)将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到核桃蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对核桃蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为SAPLRVY(丝氨酸-丙氨酸-脯氨酸-亮氨酸-精氨酸-缬氨酸-酪氨酸)、FSTELPST(苯丙氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸)、DTDYKKY(天冬氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-赖氨酸-赖氨酸-酪氨酸)的肽的含量为88％，其中SAPLRVY(33％)、FSTELPST(25％)、DTDYKKY(30％)。
实施例2具有DPP-Ⅳ抑制和抗氧化功能的核桃蛋白肽的制备
(1)选用核桃粕500克，用粉碎机将核桃粕打成粉，加入核桃重量9.0倍的水在95℃条件下处理3小时，去脂肪，得到核桃蛋白液。
(2)将步骤(1)得到的核桃蛋白液，温度调整到70℃，利用超声波发生器经超声波(频率为80kH)处理25分钟，改变核桃蛋白的组织结构。
(3)按照核桃液中核桃重量1.0％的重量百分比加入复合蛋白酶进行酶解(复合蛋白酶组成：中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶组成，它们之间的质量比为1：2：1)，在60℃条件下进行酶解反应3h，酶解过程同步利用超声波发生器(频率为25kH)处理；在95℃下保温10分钟，冷却至70℃，通过硅藻土进行过滤分离，收集分离液；
(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于3000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为1500道尔顿的膜将分子量小于1500道尔顿的蛋白肽分离出来。
(5)取分子量为小于1500的蛋白肽液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到核桃蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行分离，收集经过RP-HPLC反相高效液相色谱分离中第8-9分钟洗脱出来的肽液；
(6)将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到核桃蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对核桃蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为SAPLRVY(丝氨酸-丙氨酸-脯氨酸-亮氨酸-精氨酸-缬氨酸-酪氨酸)、FSTELPST(苯丙氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸)、DTDYKKY(天冬氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-赖氨酸-赖氨酸-酪氨酸)的肽的含量为92％，其中SAPLRVY(31％)、FSTELPST(27％)、DTDYKKY(34％)。
实施例3具有DPP-Ⅳ抑制和抗氧化功能的核桃蛋白肽的制备
(1)选用核桃粕1000克，用粉碎机将核桃粕打成粉，加入核桃粕总量10.0倍的水在95℃条件下处理2小时，得到核桃蛋白液。
(2)将步骤(1)得到的核桃蛋白液，温度调整到65℃，利用超声波发生器经超声波(频率为80kH)处理35分钟，改变核桃蛋白的组织结构。
(3)按照核桃液中核桃重量0.8％的重量百分比加入复合蛋白酶进行酶解(复合蛋白酶组成：中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶组成，它们之间的质量比为1：2：1)，在60℃条件下进行酶解反应3h，酶解过程同步利用超声波发生器(频率为20kH)处理；在90℃下保温20分钟，冷却至65℃，通过硅藻土进行过滤分离，收集分离液；
(4)将步骤(3)所得的分离液通过二步超滤方法进行处理，利用孔径为3000道尔顿的陶瓷膜超滤，先将分子量小于3000道尔顿的蛋白和多肽分离出来，再用孔径为1500道尔顿的膜将分子量小于1500道尔顿的蛋白肽分离出来。
(5)取分子量为小于1500的蛋白肽液，再经过Sephadex G-25凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥，得到核桃蛋白肽；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行分离，收集经过RP-HPLC反相高效液相色谱分离中第8-9分钟洗脱出来的肽液；
(6)将步骤(5)得到的肽溶液通过浓缩、冷冻干燥，得到核桃蛋白肽粉。通过LC-MS/MS对核桃蛋白肽的主要成分进行测定，其氨基酸序列为SAPLRVY(丝氨酸-丙氨酸-脯氨酸-亮氨酸-精氨酸-缬氨酸-酪氨酸)、FSTELPST(苯丙氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸)、DTDYKKY(天冬氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-赖氨酸-赖氨酸-酪氨酸)的肽的含量为93％，其中SAPLRVY(33％)、FSTELPST(26％)、DTDYKKY(34％)。
实验例4核桃蛋白肽DPP-Ⅳ抑制能力的测定试验
1、试验样品：样品1、2、3分别为实施例1、实施例2、实施例3制备的核桃蛋白肽，样品4为实施例1粉碎得到的核桃粕粉。
2、按照如下方法进行：
将样品用100mmol/L的Tris-HCL(pH8.0)缓冲液稀释至合适的浓度，吸取25μL样品稀释液与25μL底物(浓度为1.6mmol/L)混合，加入到96孔酶标板中。在37℃下孵育10min后，加入50μL DPP-IV酶液(酶活力为8U/L)，混匀后在37℃下精确孵育60min，立即加入100μL1mol/L的醋酸-醋酸钠(pH 4.0)缓冲液终止反应，于405nm下测吸光值A，并根据下列公式计算样品的DPP-IV抑制率。
DPP-IV抑制率％＝{1-(样品吸光值A-样品空白对照吸光值B)/(阴性对照吸光值C-阴性空白对照吸光值D)}×100
样品吸光值A：为样品反应液在405nm处的吸光值；
样品空白对照吸光值B：以Tris-HCL缓冲液代替DPP-IV酶液作为样品空白对照在405nm处的吸光值；
阴性对照吸光值C：以Tris-HCL缓冲液代替样品作为阴性对照在405nm处的吸光值；
阴性空白对照吸光值D：以Tris-HCL缓冲液代替DPP-IV酶液和样品作为阴性空白对照在405nm处的吸光值
DPP-IV抑制的IC50值测定：
测定样品在不同浓度下的DPP-IV抑制率，以多肽浓度的对数值与抑制率做回归曲线，得到回归方程，由此计算IC50，即50％的DPP-IV酶活性抑制时肽的浓度。
实验例5核桃蛋白肽抗氧化能力的测定试验
试验样品：样品1、2、3分别为实施例1、实施例2、实施例3制备的核桃蛋白肽，样品4为实施例1粉碎的核桃蛋白粉。抗氧化能力按照如下方法进行：
(1)清除DPPH自由基能力：取500μg/mL的抗氧化活性肽1.5mL，加入99.5％乙醇1.5mL和0.02％DPPH乙醇溶液0.675mL混合，振荡混匀，室温下避光水浴30min，然后在517nm下检测体系吸光值。吸光值越低，体系的清除DPPH自由基能力越强。空白对照即是将样品溶液1.5mL换成去离子水1.5mL。
DPPH自由基清除能力％＝((空白吸光值-样品吸光值)/空白吸光值)×100
(2)还原力测定：取500μg/mL的抗氧化活性肽1mL，加入0.2M磷酸缓冲液(pH 6.6)2.5mL和1％(质量分数)的铁氰化钾溶液2.5mL，混匀，然后在50℃水浴加热20min。取出迅速冷却，加入10％(质量分数)三氯乙酸(TCA)溶液2.5mL，混合均匀，然后在3000g下离心10min。取上清液2.5mL，加入去离子水2.5mL和1％(质量分数)三氯化铁溶液0.5mL，充分混匀，在室温下反应10min，用700nm波长测定吸光度。还原力即用700nm波长处吸光值表示。
结果见表1，可见本发明核桃蛋白肽具有很好的DPP-IV抑制能力，DPP-IV抑制活性(IC50值)低于190μg/mL，显著低于同类复合蛋白肽的IC50值，其中SIIAEVK肽具有很好的DPP-IV抑制能力，DPP-IV抑制活性(IC50值)为98μg/mL。同时本发明的核桃蛋白肽具有较好的抗氧化能力，其中FSTELPST肽的DPPH自由基清除能力达到92％以上。
表1本发明核桃蛋白肽的DPP-IV抑制能力及抗氧化能力
Figure BDA0001459881430000101
Figure BDA0001459881430000111
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 安徽国肽生物科技有限公司
<120> 一种具有抗氧化和DPP-IV抑制功能的核桃蛋白肽
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Thr Asp Tyr Lys Lys Tyr
1 5

Claims (4)

1.一种具有抗氧化和DPP-IV抑制功能的核桃蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)核桃粕粉加水，在高温下处理、去脂得到核桃蛋白液；
(2)超声处理核桃蛋白液，将步骤(1)得到的核桃蛋白液调至65-75℃，60-80kH的超声频率处理25-35min以改变核桃蛋白的组织结构；
(3)加入复合蛋白酶酶解，酶解过程利用超声波发生器同步进行20-30kH的超声处理且不添加酸和碱；高温下保温，冷却后，过滤分离，收集分离液，所述复合蛋白酶由中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶组成；
(4)分离液通过二步超滤法处理，先用孔径为3000D的膜超滤，再用孔径为1500D的膜超滤，得到分子量小于1500D的蛋白肽液；
(5) 取分子量为小于1500D的蛋白肽液，再经过Sephadex G-25 凝胶分离，洗脱液为去离子水，洗脱峰在280nm下进行检测，收集第 1个洗脱峰；通过浓缩、冷冻干燥；再用RP-HPLC反相高效液相色谱进行分离，收集经过RP-HPLC反相高效液相色谱分离中第8-9分钟洗脱出来的蛋白肽液，通过浓缩、冷冻干燥，即得所述核桃蛋白肽，所述核桃蛋白肽包括质量百分比含量为85～95％的氨基酸序列为丝氨酸-丙氨酸-脯氨酸-亮氨酸-精氨酸-缬氨酸-酪氨酸 (SAPLRVY)、苯丙氨酸-丝氨酸-苏氨酸-谷氨酸-亮氨酸-脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸(FSTELPST)、天冬氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-赖氨酸-赖氨酸-酪氨酸 (DTDYKKY)的肽；
其中，所述核桃蛋白肽的整个加工过程中没有添加酸或碱进行pH 的调整；
步骤(1)水与核桃粕粉的质量比为8-10:1，所述高温下处理为90-100℃处理2-4小时；之后离心去脂得到核桃蛋白液；
步骤(3)按照核桃蛋白液总重量的0.8-1.2％的重量百分比加入复合蛋白酶，所述复合蛋白酶中的中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶三者质量比为1：(1-2):1；
步骤(3)的酶解条件为50-65℃酶解3-4小时；步骤 (3)酶解之后于90-95℃下保温10-20min，冷却至65-75℃，过滤分离，收集分离液。
2.根据权利要求1所述的制备方法制备得到的核桃蛋白肽。
3.权利要求2所述的核桃蛋白肽在制备降血糖或抗氧化药物中的应用。
4.含有权利要求2所述核桃蛋白肽的食品、保健品或药物。
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