KR102252955B1 - 돈태반 유래 펩타이드를 포함하는 돈태반 가수분해물 및 간 보호용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 돈태반 유래 펩타이드를 포함하는 돈태반 가수분해물 및 간 보호용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 돈태반 유래 펩타이드를 포함하는 돈태반 가수분해물과 상기 펩타이드를 포함하는 알코올로 인한 간 손상, 약물중독 또는 숙취 예방 또는 개선용 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

돈태반 유래 펩타이드를 포함하는 돈태반 가수분해물 및 간 보호용 조성물 {PIG PLACENTA HYDROLYSATE AND COMPOSITION FOR LIVER PROTECTION COMPRISING PIG PLACENTA-DERIVED PEPTIDE}
본 발명은 돈태반 유래 펩타이드를 포함하는 돈태반 가수분해물 및 간 보호용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 돈태반 유래 펩타이드를 포함하는 돈태반 가수분해물과 상기 펩타이드를 포함하는 알코올로 인한 간 손상, 약물중독 또는 숙취 예방 또는 개선용 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
간은 인간의 신체 장기 중 생체 내 대사가 가장 활발하게 일어나는 장기로서, 지방 성분이 포함된 음식 또는 알코올의 과다 섭취, 바이러스의 감염, 각종 약품과 같은 유해물질, 영양부족 등 다양한 원인에 의해 급성 또는 만성의 장애가 일어나며, 지방간, 간염, 황달, 간경화, 간암 등이 야기될 수 있다. 특히 음식을 통한 과다한 지방 섭취 또는 과도한 알코올 섭취는 간 조직에 지질이 쌓이는 지방간을 유발하며, 이때 혈청 속의 AST(aspartate transaminase), ALT(alanine transaminase), LDH(lactate dehydrogenase) 등이 증가하게 된다.
한편, 태반은 혈액 융모막으로 구성되어 있으며 태아와 모체조직 사이에 접촉을 유지하면서 태아에게 필요한 산소 및 영양소를 공급한다. 또한 태아가 생성하는 노폐물을 제거하는데 중요한 역할을 한다. 태반에는 태아의 성장에 필요한 다양한 영양 물질과 호르몬 등을 함유하고 있고 돈 태반은 성인 특히 갱년기 증상 완화 및 미용 목적 등을 위해 광범위하게 사용되고 있다. 태반에는 필수 아미노산, 멜라토닌, RNA, DNA 등의 핵산 성분, 항산화 효소인 SOD(Super [0003] Oxide Dismutase), 히알루론산, 항산화제, 사이토카인, 태반펩타이드, 인슐린유사 성장촉진인자, 표피성장촉진인자(EGF) 및 노화세포 활성인자(SCAF) 등의 성장인자와 사이토카인 류가 포함되어 있어 피로회복 및 면역증강 등에 유용한 것으로 알려져 있다. 또한 돈태반은 포유류의 태반 중에서도 사람 태반의 단백질 구조와 높은 상동성을 지니고 있으며 돈태반은 단백질과 각종 영양소 및 DNA와 RNA의 중요성분으로서 세포의 차별화와 태아의 발달을 관장하는 바이오-액티브 사이토카인의 근원으로 보고된 바 있다. 돈태반은 이러한 특성으로 인해 식품, 의약품 등에 응용되고 있다. 다만 알코올로 인한 간손상, 약물중독, 숙취 등을 효과적으로 예방 또는 개선할 수 있는 돈태반 조성물에 대한 연구는 아직 부족한 실정이다. 더구나, 돈태반에서 유래한 유효 펩타이드 설정에 관한 연구는 전무한 상태이다.
대한민국 공개특허 제10-2009-0002444호
본 발명은 돈태반 유래된 펩타이드를 포함하는 돈태반 가수분해물을 제공한다.
또한 본 발명은 돈태반 유래된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 간 보호용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 돈태반 유래된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 알코올로 인한 간 손상, 약물중독 또는 숙취 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 돈태반 유래된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 간 보호용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 돈태반 유래된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 알코올로 인한 간 손상, 약물중독 또는 숙취 예방 또는 개선용 약학적 조성물을 제공한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은, 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택되는 서열로 구성되는 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 돈태반 가수분해물을 제공한다.
또한, 본 발명은, 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택되는 서열로 구성되는 하나 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 간 보호용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택되는 서열로 구성되는 하나 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 알코올로 인한 간 손상, 약물중독 또는 숙취 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 펩타이드는 돈태반 가수분해물로부터 유래될 수 있다.
상기 펩타이드는 돈태반 가수분해물 내에 0.1 ppm ~ 100 ppm의 농도로 포함될 수 있다. 더욱 바람직하게 1 ~ 25 ppm의 농도로 포함될 수 있다.
상기 돈태반 가수분해물은 파파인, 프로나아제, 브로멜라인 및 알칼라아제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 가수분해제에 의해 가수분해된 것일 수 있다.
상기 조성물은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 또는 환으로 이루어진 군에서 선택되는 제형으로 제제화될 수 있다.
또한, 본 발명은, 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택되는 서열로 구성되는 하나 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 간 보호용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 펩타이드를 함유하는 돈태반 가수분해물은 건강기능식품 조성물의 총 중량에 대하여 1% ~ 20 중량%로 포함될 수 있다. 또한 상기 펩타이드는 상기 조성물 전체 중 0.001 ppm ~ 20 ppm의 농도로 포함 될 수 있다.
또한 본 발명은, 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택되는 서열로 구성되는 하나 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 알코올로 인한 간 손상, 약물중독 또는 숙취 예방 또는 개선용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택되는 서열로 구성되는 펩타이드를 제공한다.
상기 펩타이드는 돈태반 가수분해물로부터 유래될 수 있다.
상기 펩타이드는 돈태반 가수분해물 내에 0.1 ppm ~ 100 ppm 의 농도로 포함될 수 있다.
상기 펩타이드를 함유하는 돈태반 가수분해물은 약학적 조성물의 총 중량에 대하여 5% ~ 30% 중량%로 포함될 수 있다. 또한 상기 펩타이드는 상기 조성물 전체 중 0.005 ppm ~ 30ppm의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 돈태반 유래 펩타이드를 포함하는 조성물은 간 보호 효과가 있으며 더욱 구체적으로 알코올로 인한 간 손상, 약물중독 또는 숙취 예방 또는 개선 또는 치료 효과가 있다.
도 1은 돈태반 효소가수분해물의 가수분해 시간별 샘플의 HPLC 패턴을 비교한 결과를 나타내는 것이다.
도 2는 돈태반 효소가수분해물의 LC/MS 크로마토그램을 나태는 것이다.
도 3은 돈태반 효소가수분해물과 펩타이드(VVVE) 크로마토그램이다.
도 4는 돈태반 효소가수분해물과 펩타이드(VVVE) MS/MS 패턴을 나타내는 그래프이다.
도 5는 돈태반 효소가수분해물과 펩타이드 (DGLHLR) 크로마토그램이다.
도 6은 돈태반 효소가수분해물과 펩타이드(DGLHLR) MS/MS 패턴을 나타내는 그래프이다.
도 7은 돈태반 효소가수분해물과 펩타이드(DDFNPSVH) 크로마토그램이다.
도 8은 돈태반 효소가수분해물과 펩타이드(DDFNPSVH) MS/MS 패턴을 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택되는 서열로 구성되는 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 돈태반 가수분해물을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택되는 서열로 구성되는 하나 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 간 보호용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택되는 서열로 구성되는 하나 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 알코올로 인한 간 손상, 약물중독 또는 숙취 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택되는 서열로 구성되는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 간 보호용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택되는 서열로 구성되는 하나 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 알코올로 인한 간 손상, 약물중독 또는 숙취 예방 또는 개선용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 펩타이드는 돈태반 가수분해물로부터 유래될 수 있다.
상기 펩타이드는 돈태반 가수분해물 내에 0.1 ppm ~ 100 ppm의 농도로 포함될 수 있다.
상기 돈태반 가수분해물은 파파인, 프로나아제, 브로멜라인 및 알칼라아제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 가수분해효소에 의해 가수분해된 것일 수 있다. 더욱 바람직하게는 파파인으로 가수분해된 것일 수 있다.
또한 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택되는 서열로 구성되는 펩타이드를 제공한다. 상기 펩타이드는 돈태반 가수분해물로부터 유래될 수 있다.
본 발명에서 용어 "건강기능식품"은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 알코올로 인한 간손상, 약물중독 또는 숙취 예방 또는 개선 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 펩타이드를 함유하는 돈태반 가수분해물은 상기 조성물 총 중량에 대하여 1% ~ 20% (중량%)로 포함될 수 있으나, 이에 반드시 한정되는 것은 아니고, 유효성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료 등의 각 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.
건강기능식품의 제형은 산제, 과립제, 환, 정제, 캡슐제의 형태뿐만 아니라 일반 식품 또는 음료의 형태 어느 것이나 가능하다.
상기 식품의 종류에는 특별히 제한은 없고, 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.
일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 상기 유효성분은 원료 100 중량부에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 또한 본 발명은 천연물로부터의 분획물을 이용하는 점에서 안전성 면에서 문제가 없으므로 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 기능성식품 중 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 음료 100 mL당 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g일 수 있다.
상기 외에 본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나 본 발명의 기능성식품 조성물 100 중량부 대비 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 유효성분을 포함하는 것이라면 그 함량을 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게 상기 펩타이드를 함유하는 돈태반 가수분해물은 상기 조성물 총 중량에 대하여 5 ~ 30 중량%로 포함될 수 있다. 다만, 이에 한정되지 않는다. 또한 상기 펩타이드는 상기 조성물 전체 중 0.005 ppm ~ 30ppm의 농도로 포함될 수 있다. 이때, 유효성분(펩타이드)이 상기 농도 범위 미만인 경우, 바람직한 예방 또는 치료 효과를 발휘하기 어려운 문제점이 있고, 상기 농도 범위를 초과하는 경우, 기대하는 효과의 변화가 미미할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기 담체 또는, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리게이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제는 상기 자스몬에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용하는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예를 통하여 쉽게 이해될 것이다. 본 발명은 여기서 설명하는 실시 예에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 여기서 소개되는 실시 예는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 따라서 이하의 실시예에 의해 본 발명이 제한되어서는 안 된다.
실시예 1. 돈태반 가수분해물의 제조
돼지 태반을 해빙기에서 해동한 후 상수로 이물을 제거한 돼지 태반을 연육기 넣어 탈혈이 용이하도록 연육한다. 그 후 0.9% NaCl로 수차례 세척하여, 돼지 태반 내에 있는 혈액을 제거시킨 돼지태반을 믹서기를 이용하여 가수분해가 용이하도록 파쇄한다. 상기와 같이 준비된 돼지태반에 단백분해효소(파파인) 3%를 넣고 1, 3, 6, 20시간 동안 가수분해 한다. 가수분해가 끝난 후 가열하여 단백질 분해효소를 불활성화시키고, 상기 돈태반 가수분해물을 여과보조제에 접촉시킨 뒤 여과하여 흡착 정제한다. 이후 돈태반 가수분해물 여과액에 1.2 배 (w/w) 에탄올을 넣어 15 ~ 20시간 방치 후 필터를 사용하여 가수분해가 충분하지 않은 당, 단백질 및 불순물 등을 제거한다. 여과한 액을 농축한 후 활성탄 0.1 ~ 2%를 사용하여 흡착 정제한 후, 사용된 활성탄은 필터를 사용하여 여과의 방법으로 제거한다. 활성탄이 제거된 정제된 돈태반 가수분해물을 0.2㎛ 필터로 제균 여과한 액을 멸균하였다. 최종적으로 고순도의 태반 추출물을 얻었다.
실험예 1. 돈태반 가수분해물의 가수분해 시간별 특성
돈태반 효소가수분해물의 가수분해시간에 따른 특성을 확인하고자 돈태반 효소가수분해물의 가수분해 시간별 샘플을 실시 예 1에 따라서 제조하였다. 수득한 돈태반 효소가수분해물의 HPLC 패턴, 질소함량 및 아미노산 함량을 분석하여 도 1 및 표 1에 나타냈다.
이를 분석한 결과 가수분해 시간에 따라서 총질소 함량 및 아미노산 함량은 증가하는 경향을 나타내었으며, 전기영동 시험결과, 가수분해 시간이 경과함에 따라 펩타이드 분자량이 감소하는 경향을 나타내었으며, 저분자화된 펩타이드가 증가하였다 (표 1). 대신에 가수분해가 충분하지 않은 , 분자량이 큰 당 단백질 및 불순물 등이 제거됨을 확인하였다. 또한 HPLC(C18) 크로마토그램에서 효소가수분해 시간이 늘어남에 따라 증가하는 피크(붉은 박스표시)를 확인하였다(도 1).
돈태반 효소가수분해 시간별 총 질소 함량 및 아미노산 함량 분석
구분 총 질소
(mg/mL)		 아미노산
(mg/mL)		 전기영동
1 hr 6.32 2.13
Figure 112019129169495-pat00001
3 hr 6.45 2.56
6 hr 6.57 2.81
20hr 6.63 3.31
실험예 2. 돈태반 가수분해물의 펩타이드 확인 및 펩타이드 효능 분석
2-1. 돈태반 가수분해물의 mass chromatography
실시예 1에서 얻어진 돈태반 효소가수분해물을 시료 100 ㎕ 에 MeOH 를 500 ㎕ 첨가하여 볼텍싱한 후, 원심분리하여 상등액 (600 ㎕) 을 새로운 시험관에 옮겨서 진공건조 한다. 그 후 건조된 샘플을 100 ㎕ 가 되도록 물을 첨가한 후 필터한 액을 MicroQ-TOF III mass spectrometer (Bruker Daltonics, 255748 Germany) 시스템과 ms/ms 이온화 분석을 통하여 서열분석 하였다.
<분석조건>
- 이동상:
A이동상:H2O/FA=100/0.2(v/v), B이동상:Acetonitrile/FA=100/0.2 (v/v)
Mass chromatography 분석 조건
Step (%) Total Time(min) Flow Rate(㎕/min) A(%) B(%)
0 0.00 200 95 5
1 5.00 200 95 5
2 28.00 200 70 30
3 33.00 200 5 95
4 40.00 200 5 95
5 41.00 200 95 5
6 46.00 200 95 5
상기 분석으로 얻어진 결과는 다음과 같다.
상기의 분석 결과 총 17개의 펩타이드를 분석하였고, uniprot data base에서 돼지 유래 펩타이드 (peptide)로 5개의 펩타이드를 확인하였다 (표 3).
돈태반 효소가수분해물의 펩타이드 서열
No. m/z RT(min) Charge Sequence Organism
1 445.27 10.0 1 VVVE Sus scrofa (Pig)
2 571.27 11.5 1 QMHR -
3 355.70 14.5 2 DGLHLR Sus scrofa (Pig)
4 394.73 14.7 2 LDKWNL Sus scrofa (Pig)
5 438.24 15.3 2 SLDKRAK -
6 465.71 15.4 2 DDFNPSVH Sus scrofa (Pig)
7 490.23 15.9 1 GPLCT Sus scrofa (Pig)
이에 본 발명은 확인된 5개의 돼지 유래 펩타이드 중에서 피크 크기 및 배치 간 재현성을 확인하여 3개의 돼지 유래 펩타이드를 지표 물질로 선정하였다 (도 2, 표 4).
돈태반 효소가수분해물 지표성분의 펩타이드 서열
No. m/z RT (min) Charge Sequence 가수분해물 내 함량 (ppm)
PEP-1 445.27 9.4 1 VVVE
(서열번호 1)		 10-19 ppm
PEP-2 355.70 14.3 2 DGLHLR
(서열번호 2)		 4-10 ppm
PEP-3 465.71 15.3 2 DDFNPSVH
(서열번호 3)		 10-21 ppm
상기 돈태반 가수분해물로부터 확인된 펩타이드와 동일한 mass 및 ms/ms 이온화 형태를 갖는 펩타이드를 애니젠 (www.anygen.com)으로부터 합성하여 이후 실험을 진행하였다.
상기 PEP-1, PEP-2, PEP-3 펩타이드의 가수분해물 내 함량은 각각 1 - 25 ppm 을 함유하는 것으로 확인되었다.
2-2. 펩타이드의 검증
상기 PEP-1, PEP-2, PEP-3 펩타이드의 검증을 통하여 애니젠에서 합성한 펩타이드가 돈태반 가수분해물 내 존재하는 펩타이드와 일치함을 확인하고자 펩타이드 검증 시험을 진행하였다.
PEP-1의 경우 두 가지 방법으로 펩타이드의 검증을 진행하였다. 첫 번째 방법으로서, 돈태반 효소가수분해물과 펩타이드(VVVE)의 크로마토그램을 분석하였다. 돈태반 가수분해물(A), 펩타이드(VVVE)(B) 및 돈태반 가수분해물에 합성펩타이드를 spiking (C)하여 크로마트그램을 확인하였고, 그 결과 돈태반 가수분해물과 합성펩타이드가 동일 피크로 판정되었다. 이로써 펩타이드가 돈태반 가수분해물 내에 존재하는 성분과 일치함을 확인하였다 (도 3). 두 번째 방법으로서, 돈태반 효소가수분해물과 펩타이드(VVVE) MS/MS 패턴을 확인하였다. 그 결과 돈태반 가수분해물의 MS/MS 패턴과 펩타이드(VVVE) MS/MS 패턴이 일치하여 펩타이드가 돈태반 가수분해물 내에 존재하는 성분과 일치함을 확인하였다 (도 4).
PEP-2의 경우 첫 번째 방법으로서,돈태반 효소가수분해물과 펩타이드 (DGLHLR) 크로마토그램을 분석하였다. 돈태반 가수분해물(A), 펩타이드(DGLHLR)(B) 및 돈태반 가수분해물에 합성펩타이드를 spiking (C)하여 크로마트그램을 확인하였고, 그 결과 돈태반 가수분해물과 합성펩타이드가 동일 피크로 확인되었다. 이로써 펩타이드가 돈태반 가수분해물 내에 존재하는 성분과 일치함을 확인하였다 (도 5). 또한, 펩타이드 검증의 두 번째 방법으로서, 돈태반 효소가수분해물과 펩타이드(DGLHLR) MS/MS 패턴을 확인하였다. 그 결과 돈태반 가수분해물의 MS/MS 패턴과 펩타이드(DGLHLR) MS/MS 패턴이 일치하여 펩타이드가 돈태반 가수분해물 내에 존재하는 성분과 일치함을 확인하였다 (도 6).
PEP-3의 경우 첫 번째 방법으로서, 돈태반 효소가수분해물과 펩타이드(DDFNPSVH) 크로마토그램을 분석하였다. 돈태반 가수분해물(A), 펩타이드(DDFNPSVH)(B) 및 돈태반 가수분해물에 합성펩타이드를 spiking (C)하여 크로마트그램을 확인하였고 그 결과 돈태반 가수분해물과 합성펩타이드가 동일 피크로 확인되었다. 이로써 펩타이드가 돈태반 가수분해물 내에 존재하는 성분과 일치함을 확인하였다 (도 7). 또한, 펩타이드 검증의 두 번째 방법으로서, 돈태반 효소가수분해물과 펩타이드(DDFNPSVH) MS/MS 패턴을 확인하였다. 그 결과, 돈태반 가수분해물의 MS/MS 패턴과 펩타이드(DDFNPSVH) MS/MS 패턴이 일치하여 펩타이드가 돈태반 가수분해물 내에 존재하는 성분과 일치함을 확인하였다 (도 8).
2-3. 펩타이드의 HepG2 세포독성평가
HepG2 간암세포주를 배양 후 농도별로 3 가지의 합성 펩타이드를 첨가한 후 세포생존율을 확인하기 위해 MTT (methylthiazol tetrazolium bromide, Sigma Aldrich)를 시행하였다. 24 웰 플레이트 (BD, Falcon)에 각 웰에 세포들을 적당량 (1 x 105/well) 시딩 (seeding)하여, 각각 농도 별로 시료들을 처리하고 37℃ 인큐베이터에서 24시간 배양 후에 세포생존율을 확인하였다. MTT 용액 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrasodium bromide)을 이용하여 4시간 동안 반응시킨 후, DMSO을 400 ㎕씩 넣어 불용성인 formazan 결정체를 용해시켜 570 nm 파장에서 ELISA 판독기(TECAN, Infinite M200 pro)로 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 표 5에서 나타낸 것과 같이 3가지의 펩타이드 세포독성을 확인한 결과, PEP-1, PEP-2, PEP-3 모두 10 ug/ml까지 무독성을 보였다.
2-4. 펩타이드의 간세포 보호능
간암세포주인 HepG2 세포를 24 웰 플레이트에 1 x 105/well이 되도록 분주하고 배양 하였다. 이 후 3 가지의 합성 펩타이드의 간세포 보호능을 확인하고자 하는 농도별로 처리하여 23시간 동안 배양 후, 간 세포에 손상을 위해 t-BHP를 10 mM 농도로 처리하여 90분 동안 배양 하였다. MTT 용액 (3-(4,5 -dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrasodium bromide)을 이용하여 4시간 동안 반응시킨 후, DMSO을 400 ㎕씩 넣어 불용성인 formazan 결정체를 용해시켜 570nm 파장에서 ELISA 판독기(TECAN, Infinite M200 pro)로 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 표 5에서 나타낸 것과 같이 PEP-2, PEP-3은 10 ug/ml에서 각각 26%, 20% 높은 보호능을 보였다.
2-5. 펩타이드의 간기능검사지표 AST 측정
AST를 확인하기 위해 각 웰 (1 x 105/well)에 3 가지 합성 펩타이드를 농도별로 처리하여 23시간 동안 배양 후, t-BHP를 20 mM 농도로 처리하여 3시간 동안 배양 하였다. 이 후 상층액을 취하여 Aspartate Aminotransferase (AST or SGOT) Activity Colorimetric Assay Kit (BIOVISION; K753-100)을 이용하여 측정하였다. 또한, 세포 정량을 위하여 상층액을 제거하고 MTT 용액 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrasodium bromide)을 이용하여 4시간 동안 반응시킨 후, DMSO을 400 ㎕씩 넣어 불용성인 포르마잔(formazan) 결정체를 용해시켜 570 nm 파장에서 ELISA 판독기(TECAN, Infinite M200 pro)로 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 표 6에서 나타낸 것과 같이 PEP-2, PEP-3 각각은 10 ug/ml에서 가장 우수한 억제능을 보였으며, 그 수치는 34%, 14% 였다. 간세포보호능 결과와 같이 PEP-2이 가장 우수한 효능을 보임을 확인하였다.
2-6. 펩타이드의 간기능검사지표 ALT 측정
ALT를 확인하기 위해 각 웰 (1 x 105/well)에 3 가지 합성 펩타이드를 농도별로 처리하여 23시간 동안 배양 후, t-BHP를 20 mM 농도로 처리하여 3시간 동안 배양 하였다. 이 후 상층액을 취하여 Alanine Aminotransferase (ALT or SGPT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit(BIOVISION; K752-100)을 이용하여 측정하였다. 또한, 세포 정량을 위하여 상층액을 제거하고 MTT 용액 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrasodium bromide)을 이용하여 4시간 동안 반응시킨 후, DMSO을 400 ㎕씩 넣어 불용성인 포르마잔(formazan) 결정체를 용해시켜 570nm 파장에서 ELISA 판독기(TECAN, Infinite M200 pro)로 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 표 5에서 나타낸 것과 같이 PEP-2에서 우수한 억제능이 확인되었다. 최대 효능을 보인 수치는 1 ug/ml이였고 그 수치는 34%로, 우수한 억제능을 보임을 확인하였다.
돈태반 유래 펩타이드의 간 건강 개선 효력 시험
시료농도 PEP-1 PEP-2 PEP-3
합성샘플 sequence - VVVE DGLHLR DDFNPSVH
시험농도설정 세포독성 (HepG2) 0.01~1000 ug/ml ~10ug/ml ~10ug/ml ~10ug/ml
간지표 간세포보호능 0.1 ug/ml ND 15% 9%
1 ug/ml ND 20% 20%
10 ug/ml 7% 26% 20%
AST 억제능 0.1 ug/ml ND 4% ND
1 ug/ml ND 15% 5%
10 ug/ml 2% 34% 14%
ALT 억제능 0.01 ug/ml ND 21% ND
0.1 ug/ml ND 30% ND
1 ug/ml ND 34% ND
실험예 3. 돈태반 유래 펩타이드를 포함하는 가수분해물의 효능 분석
실시예 1에서 제조한 돈태반 가수분해물을 이용하여 간 건강에 관한 효능을 분석하였다. 돈태반 가수분해물은 상기 펩타이드를 포함하고 있다.
3-1. HepG2 세포독성평가
간암세포주인 HepG2 세포는 한국 세포주 은행 (Cat No. 88065)에서 분양 받아 사용하였으며, 10% FBS (Fetal bovine serum, Hyclone)와 100 IU/ml 페니실린과 100 μg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 MEM (Minimum Essential medium, Hyclone) 배지를 이용하여 5% CO2, 37℃ 인큐베이터에서 배양하여 실험을 진행하였다. HepG2인 간암세포주를 배양 후 각각의 가수분해 시간별 가수분해물의 농도별로 첨가한 후 세포생존율을 확인하기 위해 MTT (methylthiazol tetrazolium bromide, Sigma Aldrich)를 시행하였다. 24 웰 플레이트 (BD, Falcon)에 각 웰에 세포들을 적당량 (1 X 105/well) 시딩(seeding)하여, 각각 농도 별로 시료들을 처리하고 37℃ 인큐베이터에서 24시간 배양 후에 세포생존율을 확인하였다. MTT 용액 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrasodium bromide)을 이용하여 4시간 동안 반응시킨 후, DMSO을 400 ㎕씩 넣어 불용성인 포르마잔(formazan) 결정체를 용해시켜 570nm 파장에서 ELISA 판독기(TECAN, Infinite M200 pro)로 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 표 5에서 나타낸 것과 같이 3시간, 6시간 가수분해물은 총질소 0.125 mg/ml까지 무독성을 보였으며, 20시간 가수분해물은 총질소 0.5 mg/ml까지 무독성을 보였다.
3-2. 간세포보호능 측정
간세포보호능을 측정하기 위해, 간암세포주인 HepG2 세포를 24 웰 플레이트에 1 X 105/well이 되도록 분주하고 배양 하였다. 이 후 시간별 돈태반 효소가수분해물 간세포 보호능을 확인하고자 하는 농도별로 처리하여 23시간 동안 배양 후, 간 세포에 손상을 위해 t-BHP를 10mM 농도로 처리하여 90분 동안 배양 하였다. MTT 용액 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrasodium bromide)을 이용하여 4시간 동안 반응시킨 후, DMSO을 400 ㎕씩 넣어 불용성인 포르마잔(formazan) 결정체를 용해시켜 570 nm 파장에서 ELISA 판독기(TECAN, Infinite M200 pro)로 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 표 6에서 나타낸 것과 같이 시간별 돈태반 효소가수분해물 간세포보호능은 각 시간별 총질소 0.05 mg/ml에서 가장 높은 보호능을 보였으며, 3시간 6시간 20시간 가수분해물은 각각 총질소 0.05 mg/ml에서 약 29%, 30%, 40%의 보호능을 보였고. 가수분해 시간에 따라 유의적으로 간세포보호능이 증가하는 경향을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
3-3. 간기능검사지표 AST 측정
AST를 측정하기 위해, 간암세포주인 HepG2 세포를 24 웰 플레이트에 1 X 105/well이 되도록 분주하고 배양 하였다. 이 후 시간별 돈태반 효소가수분해물 AST를 확인하고자 하는 농도별로 처리하여 23시간 동안 배양 후, 각 웰에 t-BHP를 20 mM 농도로 처리하여 3시간 동안 배양 하였다. 이 후 상층액을 취하여 Aspartate Aminotransferase (AST or SGOT) Activity Colorimetric Assay Kit (BIOVISION; K753-100)을 이용하여 측정하였다. 또한, 세포 정량을 위하여 상층액을 제거하고 MTT 용액 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrasodium bromide)을 이용하여 4시간 동안 반응시킨 후, DMSO을 400 ㎕씩 넣어 불용성인 포르마잔(formazan) 결정체를 용해시켜 570 nm 파장에서 ELISA 판독기(TECAN, Infinite M200 pro)로 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 표 6에서 나타낸 것과 같이 시간별 돈태반 효소가수분해물의 AST 억제능은 각 시간별 총질소 0.1 mg/ml에서 가장 높은 억제능을 보였으며, 3시간 6시간 20시간 가수분해 시료는 각각 총질소 0.1 mg/ml에서 약 32%, 38%, 91%의 억제능을 보였고, 보호능과 유사하게 가수분해 시간 유의적으로 AST 분비가 억제하는 경향을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
3-4. 간기능검사지표 ALT 측정
ALT를 측정하기 위해, 간암세포주인 HepG2 세포를 24 웰 플레이트에 1 X 105/well이 되도록 분주하고 배양 하였다. 이 후 시간별 돈태반 효소가수분해물 ALT를 확인하고자 하는 농도별로 처리하여 23시간 동안 배양 후, 각 웰에 t-BHP를 20 mM 농도로 처리하여 3시간 동안 배양 하였다. 이후 상층액을 취하여 Alanine Aminotransferase (ALT or SGPT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit (BIOVISION; K752-100)을 이용하여 측정하였다. 또한, 세포 정량을 위하여 상층액을 제거하고 MTT 용액 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrasodium bromide)을 이용하여 4시간 동안 반응시킨 후, DMSO을 400 ㎕씩 넣어 불용성인 포르마잔(formazan) 결정체를 용해시켜 570 nm 파장에서 ELISA 판독기(TECAN, Infinite M200 pro)로 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 표 6에서 나타낸 것과 같이 시간별 돈태반 효소가수분해물의 ALT 억제능은 각 시간별 총질소 0.1 mg/ml에서 가장 높은 억제능을 보였으며, 3시간 6시간 20시간 가수분해 시료는 각각 총질소 0.1 mg/ml에서 약 14%, 19%, 23%의 억제능을 보였고, 보호능과 유사하게 가수분해 시간에 따라 유의적으로 ALT 분비가 억제하는 경향을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
3-5. SOD 유사활성능 측정
시간별 돈태반 효소가수분해물의 항산화 활성 정도를 알아보기 위해, 산화방지 및 노화억제 작용과 관계가 있는 SOD 유사활성 측정방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다. 이 측정법은 과산화수소 (Hydrogen peroxide, H2O2)로 전환반응을 촉매하는 산화효소인 피로가롤 (pyrogallol)의 생성량을 측정하여 SOD 유사활성능을 측정하였다. 돈태반 효소가수분해물의 10 ㎕에 pH 8.5로 보정한 트리스염산 버퍼 (tris-HCl buffer, 50 mM tris[hydroxymethyl] amino-methane + 10 mM EDTA) 130 ㎕와 7.4 mM 피로갈롤(pyrogallol) 10 ㎕을 첨가하여 25℃에서 10분간 반응 후, 1 N 염산 (HCl) 10 ㎕을 가하여 반응을 정지시켰다. 반응액 중 산화된 피로갈롤(pyrogallol)의 양은 420 nm에서 흡광도를 측정하여 돈태반 효소가수분해물의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 차이를 백분율(%)로 나타내었다. 그 결과, 표 6에서 나타낸 것과 같이 총질소 5 mg/ml 농도에서 3시간, 6시간, 20시간 가수분해 시에 50%, 51%, 56% 의 SOD 유사활성능을 나타내어, 가수분해 시간에 따라 유의적으로 항산화능이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
3-6. ABTS 자유라디칼 소거능 측정
시간별 돈태반 효소가수분해물 항산화 활성 정도를 알아보기 위해, ABTS 자유라디칼 소거능 측정을 통하여 평가 하였다. 항산화 물질의 가장 특징적인 기작은 유리기와 반응하는 것으로 자유라디칼 소거 작용은 활성라디칼에 전자를 공여하여 항산화 효과나 인체 노화를 억제하는 척도로 이용된다. 이 방법은 2.5 mM ABTS (2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt)와 1 mM AAPH (2,2′-Azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride)를 100 ml PBS에 용해시킨다. 이후 암소에서 70℃, 30분을 가하여 활성화(activation)시켜 용액을 만든다. ABTS 용액 980 ㎕와 돈태반 효소가수분해물 20 ㎕을 혼합하여 96 웰 플레이트에 200 ㎕를 넣어 37℃에서 30분 반응시킨 후 732 nm 파장에서 ELISA 판독기(TECAN, Infinite M200 pro)로 흡광도를 측정하였다. 돈태반 효소가수분해물의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 차이를 백분율(%)로 나타내었고, 그 결과, 총 질소 5 mg/ml 농도에서 3시간, 6시간, 20시간 가수분해 시에 78%, 83%, 85% 의 SOD 유사 활성능을 나타내어, ABTS 자유라디칼 소거능도 가수분해 시간 유의적으로 증가하였는 바, 가수분해 시간 유의적으로 항산화능이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
돈태반 유래 펩타이드를 함유하는 가수분해물의 간 건강 개선 효능 평가
총질소 농도 3h 가수분해 6h 가수분해 20h 가수분해
시험농도
설정		 세포독성 (HepG2) ~0.5 mg/ml ≤ 0.125 mg/ml
무독성		 ≤ 0.125 mg/ml
무독성		 ≤ 0.125 mg/ml
무독성
항산화 SOD 유사활성능 확인 5 mg/ml 50% 51% 56.0%
ABTS radical
소거능 확인		 5 mg/ml 78% 83% 85%
간지표 간세포보호능 0.05 mg/ml 약 29% 보호 약 30% 보호 약 40% 보호
AST 억제능 0.025 mg/ml 13% 11% 55%
0.05 mg/ml 28% 30% 73%
0.1 mg/ml 32% 38% 91%
ALT 억제능 0.025 mg/ml 6% 9% 13%
0.05 mg/ml 12% 14% 20%
0.1 mg/ml 14% 19% 23%
실험예 4. 돈태반 유래 펩타이드를 포함하는 가수분해물의 숙취 예방/개선 효능 분석
동물사육
본 연구에 사용된 동물은 7~8주령 SD종 흰쥐(250 gm 내외)를 구입한 후 10일 동안의 검역 및 순화기간을 거쳐 체중변화 및 일반 건강상태를 관찰한 후 건강한 개체를 연구에 사용하였다. 실험 기간 동안 사료는 방사선 멸균된 실험동물 rat용 사료를, 음수(멸균수)는 자유 섭취 시켰다. 사육실 온도는 23±2℃, 상대습도는 40~60%를 유지하고, 환기횟수는 시간당 10~12회를 시켰다. 또한, 광주기 암주기를 12시간이 되도록 빛을 조절하였다. 실험동물은 각 군당 10마리 배정하였고, 실험과정에 이상이 없는 개체 5마리의 데이터를 사용하였다.
숙취 예방/개선 효능 분석
시험동물을 약 2주간 예비사육 후 18시간을 절식시켰다. 실시의 예 1에서 생산한 돈태반 가수분해물을 동결건조시켜 얻은 추출물을 증류수 (D.W)에 용해시킨 후, 저용량, 고용량 시험군에 각각 500 mg/kg, 1500 mg/kg을 조제하여 경구투여 하였다. 양성 대조군에는 실리마린(silymarin) 0.1 g/kg을 증류수에 녹여 경구투여 하였다. 30분 후에 알코올 3 g/㎏을 경구 투여하였다. 알코올 투여한 후, 1시간, 3시간 5시간째에 꼬리정맥으로 0.6 ml정도의 혈액을 채취하여, 3000 rpm에서 원심분리한 후, 혈청으로 알코올 키트와 아세트알데하이드 키트로 정량하여 혈중 농도를 비교 분석하였다. 또한, 간독성 평가를 위한 채혈은 심장채혈로 헤파린 튜브에 넣고 10,000 rpm에서 10분간 원심분리 후에 간효소 수치를 측정하여 간독성을 평가한다. 조직의 일부를 취하여 간조직 변화 및 간내 ADH 및 ALDH 효소 활성을 평가하였다. 데이터는 6 마리 쥐의 평균 ± SD를 나타낸다. 측정 수치는 던컨의 다중검정(Duncan's multiple range test)에 따라 계산하였으며, (a-c) 위첨자는 p <0.05에서 유의한 차이가 있다.
중성지방(TG, triglyceride)은 콜레스테롤과 함께 동맥경화와 관련이 있는 지방성분으로 본 연구에서는 대조군(알코올투여군)과 저용량군에서 유의하게 증가하였으나 고용량군 및 실리마린(Silymarin)군에서 모두 정상군 수치로 감소하였다 (표 7).
돈태반 가수분해물 경구 투여 후 중성지방 감소 효과
Parameter
/Group (n=6) 		TG
(mg/dL)
정상군 23.12 ± 4.83a
대조군 (음성) 52.16 ± 8.66b
저용량 55.98 ± 22.55b
고용량 24.38 ± 19.39a
대조군(실리마린) 28.82 ± 17.02a
혈중 알코올 농도-변화추이는 고용량군에서는 1시간에 최고농도에 도달한 후에 지속적으로 감소하여 5시간째는 거의 10% 이하로 감소하였다. 하지만 대조군과 실리마린(Silymarin)군에서는 3시간에 최고농도에 도달한 후 5시간째는 각각 약 63%와 43%로 감소하였다 (표 8).
돈태반 가수분해물 경구 투여 후 혈중 알콜 농도
Group
Time (h)		 대조군(음성)
 저용량
(0.5 g/kg)		 고용량
(1.5 g/kg)		 대조군
(Silymarin
0.1 g/kg)
Alcohol 3 g/kg
0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00 0.00 ± 0.00
1.00 10.00 ± 1.51 6.27 ± 1.20 7.41 ± 3.14 7.66 ± 3.62
3.00 11.49 ± 3.11 5.92 ± 1.49 4.59 ± 4.21 9.04 ± 1.57
5.00 7.24 ± 4.05 5.82 ± 1.62 0.44 ± 0.90 3.92 ± 3.89
군간 알코올의 약동학적 지표의 변화를 보면 약물노출정도를 반영하는 AUC(5시간)에서는 대조군에서는 44.5 mM·h로 나타났으며 저용량군, 고용량군, 실리마린(Silymarin)군에서 유의하게 감소한 것으로 보아 돈태반과 Silymarin이 알코올 흡수를 억제하는 영향을 끼친 것으로 판단된다. 최고혈중농도(Cmax)의 경우에도 저용량군, 고용량군 및 실리마린(Silymarin)군에서 유의하게 감소하였다. 최고농도도달시간 (TMAX)에서는 통계적인 유의성은 없었으나 대조군에서는 평균 3시간이었지만, 모든 실험군에서는 2.67시간 이하로 단축되었다 (표 9).
돈태반 가수분해물 경구 투여 후 혈중 알콜 농도의 약동학적 지표
Group/Parameter 대조군
(음성)		 저용량
(0.5g/kg)		 고용량
(1.5g/kg)		 대조군
(Silymarin.1g/kg)
AUC0-5h (mM*h) 44.54 ± 10.17a 26.94 ± 4.70b 15.82 ± 12.38c 33.04 ± 4.41b
Cmax (mM) 12.26 ± 1.49a,b 7.07 ± 0.41d 7.55 ± 3.22d 10.14 ± 1.50c
Tmax (h) 3.00 ± 1.26 2.67 ± 1.97 1.33 ± 0.82 1.67 ± 1.03
주 대사 장기인 간조직의 ADH와 ALDH 활성도 변화를 분석한 결과, 알코올 투여군에서 간 ADH 활성도가 268.52 mU/mL로 가장 높게 나타났는 바, 이는 알코올에 의한 급성 효소유도작용으로 판단된다. 알코올 투여 후 돈태반 또는 Silymarin을 투여한 군에서는 전반적으로 ADH 활성이 감소되는 것으로 확인되었다 (표 10).
돈태반 가수분해물 경구 투여 후 간 조직의 효소 (ADH, ALDH) 활성
Tissue Liver
Parameter/Group ADH (mU/mL) ALDHNS(mU/mL)
정상군 17.92±0.16a 13.40±7.69
대조군 (음성)
(Alcohol 3g/kg)		 268.52±34.70b 7.93±1.25
저용량(0.5 g/kg) 72.88±10.79c,d 8.95±1.74
고용량(1.5 g/kg) 55.10±12.19c 8.63±4.32
대조군(Silymarin 0.1g/kg) 112.93±11.37e 11.46±1.45
실험예 5. 돈태반 유래 펩타이드를 포함하는 가수분해물의 간 건강 효능 분석
동물사육
본 연구에 사용된 동물은 7~8주령 SD종 흰쥐(250 gm 내외)를 구입한 후 7일 동안의 검역 및 순화기간을 거쳐 체중변화 및 일반 건강상태를 관찰한 후 건강한 개체를 연구에 사용하였다. 실험 기간 동안 사료는 방사선 멸균된 실험동물 rat용 알코올성 액체식이를 자유섭취 시키고, 액체식이 프로토콜대로 음수(멸균수)는 따로 공급하지 않았다. 사육실 온도는 23±2℃, 상대습도는 40~60%를 유지하고, 환기횟수는 시간당 10~12회를 시켰다. 또한, 광주기 암주기를 12시간이 되도록 빛을 조절하였다. 실험동물은 각 군당 10마리 배정하여 진행하였다.
알코올성 식이 (Lieber DeCalie Liquid Ethanol Diet)의 조제법
1) 필요한 중량의 분말 사료(132.28g)와 67 ml의 알콜(주정)에 821 ml의 물을 첨가한 비이커에 넣는다.
2) 충분한 물을 넣은 후 덩어리가 없도록 충분히 저어준다.
3) 표시된 1L 부분까지 물을 넣는다.
4) 사료를 충분히 저은 후 블렌더에 넣고 30초간 섞는다.
5) Feeding Tube(120 ml)을 이용한다 : 액체식이는 일반 먹이통을 이용하게 되면, 넘쳐흐르거나 동물의 몸에 쉽게 붙어 손실량이 클 수 있다. 또한 공기와 접촉되는 면적이 넓어지기 때문에 휘발성이 높은 알콜이 날아가거나, 그 식이가 산화되기 쉬워 실험에 큰 영향을 미칠 수 있다. 따라서 액체식이용 먹이통을 꼭 사용하도록 한다.
실험군
다음과 같이 군을 정하였다
(1) 정상대조군
(2) 알코올 투여군 : 알코올식이 (4주간 자유급식) + 30% 알콜(1.4 g/kg, PO) 4주차 2회 추가투여
(3) 양성 대조군 : 실리마린(silymarin, 100 mg/kg/day, PO)(Yang et al, 2015) + 30% 알콜(1.4g/kg, PO) 4주차 2 회 추가 투여
(4) 효소분해추출물 고용량군: 2511 mg/kg/day, PO+알코올식이(4주간 자유급식)+30% 알콜(1.4 g/kg, PO) 4주 차 2회 추가투여
알콜로 인한 간 손상으로부터의 간 건강 예방/개선 효능
시험동물을 약 1주간 예비사육 후 정해진 프로토콜에 따라 4주간 실험하였다. 시험시료는 매일 정해진 용량으로 조제하여 1회 경구 투여하였다. 알코올 식이는 정해진 조제방법에 따라 조제하여 매일 공급하여 자유 급식시켰고 4주차에는 정해진 용량으로 2회 추가로 경구투여시켰다. 4주 후에 12시가 절식 후 심장 채혈로 사혈시킨다. 간독성 평가를 위한 채혈은 심장채혈로 헤파린 튜브에 넣고 10,000 rpm에서 10분간 원심분리 후에 간 효소 수치를 측정하여 간독성을 평가하였다. 측정 수치는 던컨의 다중검정(Duncan's multiple range test)에 따라 계산하였으며, (a-c)는 p <0.05에서 유의한 차이가 있다.
본 연구에서 ALP는 알코올 투여로 인하여 정상보다 시험물질(실리마린, 돈태반 효소분해추출물) 투여로 감소하는 경향이 보이고 있으나 그 중에서도 돈태반 효소분해추출에서 유의하게 감소하였다. ALT 수치는 알코올 투여로 정상수치의 3.5배정도로 유의하게 증가하였다. 실리마린, 돈태반 효소분해추출물을 투여로 유의하게 각각 27.3%, 28.5% 감소하였다 (표 11). 또한, LDH, TG, Albumin, T-bililubin, cholesterol, T. Protein 변화는 실험군 간 영향이 없었다.
알콜 간 손상으로부터 돈태반 가수분해물의 간 보호 효능
Parameters
/Groups (n=6)		 ALP ALT(GPT) AST(GOT)
(IU/L) (IU/L) (IU/L)
정상군 483.6±119.02 *(a) 33.66±3.11 *(a) 81.37±3.24 *(a)
대조군 633.73±91.97 *(b) 115.56±38.96 *(c) 235.03±113.98 *(c)
실리마린 555.63±108.75 *(ab) 83.94±28.54 *(b) 126.7±23.81 *(ab)
효소가수분해물 471.36±99.17 *(a) 82.54±31.70 *(b) 227.31±90.21 *(c)
<제조예 1> 건강기능식품 조성물의 제조
서열번호 1 펩타이드 내지 서열번호 3를 포함하는 돈태반 가수분해물를 증류수에 각각 100 mg/100 ml(0.1 중량%), 또는 15,000 mg/100 mL(15 중량%)농도로 녹인 용액에, 각각 액상과당(0.5중량%), 올리고당(2중량%), 설탕(2중량%), 및 식염(0.5중량%)에 물을 추가하여 잔량을 맞춘 후 균질하게 배합하여 순간 살균을 하여 건강기능음료를 제조하였다.
<제조예 2> 약학적 조성물의 제조
서열번호 1 펩타이드 내지 서열번호 3를 포함하는 돈태반 가수분해물1 mg을 증류수 또는 생리식염수 5 ml에 녹여 멸균하여 주사제로 제조하였다. 또는 바이알에 동결건조 후 분말제제로 제조하였다. 돈태반 가수분해물 100mg, 옥수수 전분 100mg, 유당 100mg, 스테아린산 마그네슘 2mg을 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<110> U Bio Inc. <120> PIG PLACENTA HYDROLYSATE AND COMPOSITION FOR LIVER PROTECTION COMPRISING PIG PLACENTA-DERIVED PEPTIDE <130> 1066396 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PIG PLACENTA <400> 1 Val Val Val Glu 1 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PIG PLACENTA <400> 2 Asp Gly Leu His Leu Arg 1 5 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PIG PLACENTA <400> 3 Asp Asp Phe Asn Pro Ser Val His 1 5

Claims (12)

  1. 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택되는 서열로 구성되는 하나 이상의 펩타이드가 포함된 돈태반 가수분해물의 제조 방법으로서,
    상기 돈태반 가수분해물은
    (a) 돼지 태반에 파파인 3%를 넣고 20 시간 동안 가수분해하는 단계;
    (b) 상기 가수분해물을 가열하여 파파인을 불활성화시킨 후, 여과보조제에 접촉시킨 뒤 여과하여 흡착 정제하는 단계;
    (c) 돈태반 가수분해물 여과액에 1.2 배 (w/w) 에탄올을 넣어 15 ~ 20 시간 방치 후 필터를 사용하여 가수분해가 충분하지 않은 당, 단백질 및 불순물을 제거하는 단계;
    (d) 여과한 액을 농축한 후 활성탄 0.1 ~ 2%를 사용하여 흡착 정제하는 단계; 및
    (e) 사용된 활성탄을 필터로 사용하여 제거하는 단계;에 의해 제조되고,
    서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드는 10-19 ppm으로 함유하고,
    서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드는 4-10 ppm으로 함유하며,
    서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드는 10-21 ppm으로 함유하는 것인, 돈태반 가수분해물의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 따른 방법에 의하여 제조된, 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택되는 서열로 구성되는 하나 이상의 펩타이드가 포함된 돈태반 가수분해물로서,
    서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드는 10-19 ppm으로 함유하고,
    서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드는 4-10 ppm으로 함유하며,
    서열번호 3의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드는 10-21 ppm으로 함유하는 것인, 돈태반 가수분해물.
  3. 제 2 항에 따른 돈태반 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 알코올로 인한 간 손상, 약물중독 또는 숙취 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  4. 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택되는 서열로 구성되는 하나 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 알코올로 인한 간 손상, 약물중독 또는 숙취 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 파파인에 의해 가수분해된 돈태반 가수분해물로부터 유래된 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
  6. 제 4 항에 있어서,
    상기 조성물은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환으로 이루어진 군에서 선택되는 제형으로 제제화되는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
  7. 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택되는 서열로 구성되는 하나 이상의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 알코올로 인한 간 손상, 약물중독 또는 숙취 예방 또는 개선용 약학적 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 파파인에 의해 가수분해된 돈태반 가수분해물로부터 유래된 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 파파인에 의해 가수분해된 돈태반 가수분해물로부터 유래된 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 합성 펩타이드인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
  12. 삭제
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