KR20140000364A

KR20140000364A - 돈태반 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 간 보호용 조성물

Info

Publication number: KR20140000364A
Application number: KR1020120067089A
Authority: KR
Inventors: 박선민; 박선영
Original assignee: 호서대학교 산학협력단; 주식회사 코드바이오
Priority date: 2012-06-22
Filing date: 2012-06-22
Publication date: 2014-01-03
Also published as: KR101505861B1

Abstract

본 발명은 간 보호, 및 간 손상 예방 및 개선을 위하여, 돈태반 가수분해물을 유효성분으로 함유하는, 간 보호용 조성물을 제공한다.

Description

돈태반 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 간 보호용 조성물{Hepatoprotective composition comprising pig placenta hydrolysate}

본 발명은 간 보호용 조성물에 관한 것으로서, 더 상세하게는 돈태반 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 간 보호용 조성물에 관한 것이다.

인간의 신체 장기 중 간은 생체 내 다양한 대사가 활발하게 일어나는 장기로서, 지방 성분이 포함된 음식이나 알코올의 과다 섭취, 바이러스의 감염, 각종 약품과 같은 유해물질, 영양부족 등 다양한 원인에 의해 급성 또는 만성의 장애가 일어날 수 있다. 또한, 간은 우리 몸에 독성 물질에 노출될 때 제거하는 중추적인 역할을 하는 기관으로 독성물질에 의해 손상될 가능성이 높다. 간세포의 손상은 독성 물질을 제거하는 해독기능에 장애를 나타내고, 면역체계에 이상을 가져와 지방간, 간염, 황달, 간경화, 간암 등을 야기할 수 있다(Jo et al.,Food Sci. Biotech., 40, 1-5, 2008; Mansour et al., Biochem. Mol. Biol. Rep., 39, 656-661, 2006).

식생활과 생활습관의 서구화로 인해 비만인에서 비알코올성 지방간의 발생이 증가하고 있으며(Chiang et al., Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 300, G697-G702, 2011), 알코올 섭취의 지속적인 증가, 비만, 및 스트레스 등을 감안하면 지방간을 비롯한 간질환의 발병이 더욱 증가할 것으로 예상된다.

간질환의 치료 방법은 식이 요법과 약물 요법이 있으며 약물 요법으로 사용하는 것으로 우루소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid), 실리마린(실리마린(silymarin)), DDB(biphenyl dimethyl dicarboxylate), 글루타치온(glutathione), 글리시리진(glycyrrhizin) 등과 같은 간세포 재생촉진제 및 간 기능 보조제, 아시클로바(acyclovir)와 같은 항바이러스제 등의 약물이 사용되고 있다(Raskovic et al., Molecules, 16, 8601-8613, 2011; Abdel-Hameid, Toxicol. In Vitro., 21, 618-625, 2007; Korenaga et al., Biol. Pharm. Bull., 21, 44-49, 2011; Chen et al., Chem. Res. Toxicol., 25, 94-100, 2012).

혈액 융모막으로 구성되어 있는 태반은 태아와 모체조직 사이에 접촉을 유지하면서 태아에게 필요한 산소 및 영양소 공급과 태아가 생성하는 노폐물을 제거하는데 중요한 역할을 한다. 태반에는 태아의 성장에 필요한 다양한 영양 물질과 호르몬 등을 함유하고 있어서 태반(인태반, 돈태반, 양태반 등)은 태아뿐 아니라 성인 특히 갱년기 증상 완화 및 미용 목적 등을 위해 광범위하게 사용되고 있으나 태반 추출물의 효과에 대한 의학적인 근거가 부족하다(Pal et al., Int. J. Dermatol., 34, 61-66, 1995; Jung et al., Int. Immuno. pharmacol., 11, 976-984, 2011; Lui et al., Biol. Pharm. Bull., 21, 44-49, 1998). 병원에서는 태반 추출물을 주사제로 사용하고 있어서 많은 연구가 필요하며 돈태반 같은 경우 주사제보다는 경구 투여제로 사용하는 것이 오남용이나 부작용을 방지할 수 있다. 아직까지 돈태반의 경구 투여가 간 기능 개선에 효과적인 지에 대한 과학적 연구는 적다.

본 발명은 돈태반 가수분해물의 간 보호 효과를 시험관(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 실험을 통하여 확인함으로써, 돈태반 가수분해물을 유효성분으로 하는 간 보호용 조성물, 및 이를 이용한 간 손상 예방 및 치료 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 돈태반 가수분해물을 유효성분으로 함유하는, 간 보호용 조성물이 제공된다.

상기 간 보호용 조성물은 지방간, 간암, 간염, 황달, 또는 간경화를 예방 또는 개선할 수 있다.

상기 돈태반 가수분해물은 단백질 가수분해효소를 이용하여 가수분해된 산물일 수 있으며, 상기 단백질 가수분해효소는 파파인, 브로멜라인, 프로나아제 및/또는 알칼라아제일 수 있다. 상기 단백질 가수분해효소 처리에 의하여 돈태반에 함유되어 있는 성장 호르몬 등의 다양한 호르몬의 기능을 소실하거나 제거될 수 있다. 또한, 제품의 purity를 높이기 위해 지방을 제거하는 과정에서 여성호르몬들도 제거되었을 가능성이 높다.

이때, 본 발명의 일실시예 따른 조성물은 바람직하게는 조성물 총 중량에 대하여 상기 돈태반 가수분해물을 0.1 내지 50 중량% 로 포함할 수 있다. 또한, 추가로 돈태반 가수분해물과 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있으나, 상기 유효성분의 함량을 초과하지 않는 것이 바람직하다.

상기 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여 시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 제약상 허용되는 담체를 비롯한 불활성 성분을 추가로 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "제약상 허용된 담체"란 조성물, 구체적으로 의약 조성물의 활성 물질을 제외한 성분을 지칭하는 용어이다. 제약상 허용되는 담체의 예로는 결합제, 붕해제, 희석제, 충진제, 활택제, 가용화제 또는 유화제 및 염이 포함된다.

실제 사용에 있어서, 본 발명의 일실시예에 따른 조성물은 통상적인 제약 조제 기술에 따른 제약 담체와 조합될 수 있다. 담체는, 예를 들어 경구 또는 (정맥내 투여를 비롯한) 비경구 투여에 바람직한 제조에 따라 광범위하게 다양한 형태를 지닐 수 있다.

아울러, 본 발명의 일실시예에 따른 조성물은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여된다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.

본 발명의 다른 관점에 따르면, 돈태반 가수분해물을 유효성분으로 함유하는, 간 손상 예방 및 개선용 건강식품이 제공된다.

상기 건강기능 식품은 건강기능식품법 제3조에서 정의하고 있는 바와 같이, 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 가능한 식품을 말하며, 본 발명의 일실시예에 따르면 돈태반 가수분해물이 포함될 수 있는 식품의 예로는 각종 캅셀, 정제, 과립제, 드링크제, 차, 음료수, 비타민 복합제 등이 있고, 유효 성분의 양은 그의 사용 목적(예방, 증상 완화, 또는 치료보조적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명의 건강기능 식품은 간 손상 예방 및 개선용 목적으로 식품 총 중량에 대하여 돈태반 가수분해물을 0.01 내지 95 중량%, 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함할 수 있다. 본 발명의 기능성 식품의 제조에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 식품제조방법 등 어느 것이라도 그대로 또는 적절히 변형하여 적용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 약제학적으로 유효한 양의 돈태반 가수분해물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 간 손상 예방 및 치료 방법이 제공된다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 돈태반 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 간 보호용 조성물을 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 돈태반 가수분해물의 BSP 제거 효율을 확인한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 돈태반 가수분해물의 간 보호효과를 혈청 AST(도 2a) 및 ALT(도 2b)의 농도 변화를 통하여 확인한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 돈태반 가수분해물의 간 보호효과를 간 조직 염색방법을 통하여 확인한 그림이다.

본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.

본 문서에서 사용되는 “사염화탄소”는 간세포 사멸, 섬유증 및 암을 유발시키는 물질로 간 손상을 유발시키는데 많이 사용해왔다. 간 독성을 일으키는 작용기전이 규명되어 있지 않으나 사염화탄소가 과산화작용기전을 활성화시켜 간세포를 손상시킨다는 것이 알려져 있다(Jung et al., Int. Immuno. pharmacol., 11, 976-984, 2011; Huo et al., Int. J. Mol. Sci., 12, 6529-6543, 2011; Makni et al., Eur. J. Pharmacol., 668, 133-139, 2011). 또한, 사염화탄소로 간 손상을 유발시키면 단백질 합성, 글리코겐의 저장량을 감소시키고 간세포 파괴로 인한 혈청 ALT와 AST 농도를 증가시킨다는 보고가 있다(Huo et al., Int. J. Mol. Sci., 12, 6529-6543, 2011; Makni et al., Eur. J. Pharmacol., 668, 133-139, 2011). 또한, 조직학적으로는 간세포의 응고괴사, 지방변성, 염증 증가, 수종 변성 등을 나타낸다고 알려졌다.

본 문서에서 사용되는 “태반”은 태아에게 영양 공급을 하기 위한 각종 영양소(각종 활성 펩타이드, 아미노산, 비타민, 미네랄, 수백 종의 효소 등)가 포함되어 있으며, 면역 강화 작용을 하는 많은 물질이 생산, 비축되어 있는 조직을 의미한다. 태반을 이용한 화장품과 주사 등의 제품이 판매되고 있으나 아직까지 실제로 갱년기나 간 보호 효과에 대한 연구는 적으며, 어떤 성분에 의한 효과인지에 대한 연구도 거의 없었다(Pal et al., Int. J. Dermatol., 34, 61-66, 1995; Jung et al., Int. Immuno. pharmacol., 11, 976-984, 2011).

본 문서에서 사용되는 “실리마린(silymarin)”은 플라보노이드의 일종으로 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)에서 간 손상 억제 효과가 알려져 있다. 사염화탄소가 주입된 동물모델에 실리마린의 투여할 경우, 간에서 과산화물의 생성과 지방의 축적을 억제하고 간세포의 파괴를 억제하여 혈청 내 AST와 ALT의 농도의 상승을 억제시키는 효과가 보고된 바 있다(Mansour et al., Biochem. Mol. Biol. Rep., 39, 656-661, 2006; Al-Anati et al., Mol. Nutr. Food. Res., 53, 460-466, 2009; Raskovic et al., Molecules, 16, 8601-8613, 2011). 또한, 대식세포나 내피세포에 50 μM의 실리마린을 처리하였을 때, 혈청의 LDL 산화를 억제하는 효과가 있다는 것도 보고되었다(Skottova et al., Phytother. Res., 13, 535-537, 1999; Wallace et al., J. Agric. Food. Chem., 56, 3966-3972, 2008).

이하, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하면 다음과 같다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 도면에 도시된 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 도면에 도시된 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. 또한 설명의 편의를 위하여 도면에서는 구성 요소들이 그 크기가 과장 또는 축소될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 돈태반 가수분해물의 BSP 제거 효율을 확인한 그래프이다. 본 발명의 일 실시예에서 사염화탄소 투여에 의하여 간 손상이 유발된 동물 모델을 제조하였으며, 이를 이용하여 돈태반 가수분해물의 간 보호효과를 확인하였다. 실험 군으로는 용매만을 투여한 음성대조군(CCl₄+vehicle), 돈태반 가수분해물을 저용량(300 mg/kg 체중) 또는 고용량(1000 mg/kg 체중)로 투여한 저용량 돈태반군(CCl₄+LPLA) 또는 고용량 돈태반군(CCl₄+HPLS)군, 및 간 보호효과가 알려진 실라마린을 투여한 양성대조군(CCl₄+silymarine)(80 mg/kg 체중)을 이용하였다. 또한, 사염화탄소를 투여하지 않은 동물을 정상대조군으로 이용하였다. 3주 동안 각 군에 맞도록 돈태반 또는 실리마린을 투여한 후, 케타민(100 mg/kg 체중)과 자일라진(10 mg/kg 체중)으로 백서를 마취한 후, 복강 정맥으로 1% BSP(1 ml/kg 체중)을 주입한 후 1, 21, 46분에 하행대동맥(descending aorta)으로부터 혈액을 채취하여 BSP 제거율을 확인하였다. 그 결과, 사염화탄소로 간 손상을 유발시킨 음성대조군에서는 BSP의 제거율이 현저하게 감소하였으며 양성대조군, 고용량 및 저용량 돈태반군에서는 BSP의 제거율이 현저하게 증가되었다. 이러한 결과는 돈태반 가수분해물의 간 보호효과를 입증하는 것이다.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 돈태반 가수분해물의 간 보호효과를 혈청 AST(도 2a) 및 ALT(도 2b)의 농도 변화를 통하여 확인한 그래프이다. 3주간 돈태반 가수분해물을 투여한 후, 간 손상정도를 확인할 수 있는 혈청 AST 및 ALT 농도 변화를 확인하였다. 그 결과, 사염화탄소에 의하여 증가한 혈청 AST 및 ALT 농도가 돈태반 가수분해물 투여에 의해서 감소하는 것을 관찰할 수 있었으며, 이러한 감소효과는 돈태반 가수분해물의 농도에 의존적이었다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 돈태반 가수분해물의 간 보호효과를 간 조직 염색방법을 통하여 확인한 그림이다. 간 조직 염색을 통하여 돈태반 가수분해물의 간 보호효과를 직접적으로 확인하였다. 3주간 돈태반 가수분해물을 투여한 후, 백서로부터 간 조직을 채취한 후, 이를 헤마톡시린&에오신 염색방법을 통하여 조직을 관찰하였다. 그 결과, 음성대조군에서는 간 조직이 손상되고, 지방량이 증가하였으나, 저용량 또는 고용량 돈태반군에서는 간 조직의 손상 정도가 낮았으며, 고용량 돈태반군의 조직은 정상대조군과 유사한 형태를 나타냈다. 이러한 결과는 본 발명의 일 실시예에 따른 돈태반 가수분해물이 간 보호 효과가 있음을 증명하는 것이다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 동물사육

본 연구에 사용된 동물은 7주령 수컷 Sprague Dawley rat(중앙동물, Korea)을 구입한 후 2주 동안 새로운 사육 환경에 적응시키고, 실험 전 기간 동안 실험동물들은 고형사료(대한바이오링크, 음성) 및 물을 자유롭게 섭취시켰다. 사육실 온도는 20±2℃,상대습도는 65±5%를 유지하고, 광주기와 암주기를 12시간이 되도록 빛을 조절하였다. 모든 실험은 호서대학교 동물 윤리위원회에서 사전 승인을 받고 진행하였다. 실험동물을 체중에 따라 난괴법(Randomized complete block design)에 의해서 한 군에 8 마리씩 5 군으로 나누어 사육하였으며 그 중에서 4군은 하기 실시예 2에 기재된 바와 같이 사염화탄소를 주입하여 간 손상을 유발시켰다.

실시예 2: 간손상 동물 모델의 제조

간 손상을 유발시키기 위해서 사염화탄소(Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO)를 옥수수유(CJ 제일제당, 서울)에 1:1로 희석하여, 희석액을 2ml/kg 체중씩 주3회 1 주 동안 피하주사하였다.

실시예 3: 돈태반 가수분해물

본 발명에서 사용된 돈태반 가수분해물은(주)코드바이오(천안, 한국)에서 제조한 것을 사용하였다. 돈태반 가수분해물은 단백질 가수분해효소인 파파인, 브로멜라인, 프로나아제 및 알칼라아제로 가수분해한 후 여과단계를 거쳐 지질을 제거하고 멸균한 후 pH를 6.0-7.5로 조절한 제품으로 본 발명에서는 액상의 제품을 동결건조하여 사용하였다(대한민국 공개특허 10-2010-0011850).

실험예 1: 체중 및 장기 무게 변화 측정

상기 실시예 2에서 사염화탄소를 3회 피하주사로 투입하여 간손상을 유발한 간 손상 동물을 무작위로 음성대조군(사염화탄소+용매), 양성대조군(사염화탄소+실리마린(silymarin)), 저용량 돈태반군(사염화탄소+저용량 돈태반)과 고용량 돈태반군(사염화탄소+고용량 돈태반)의 4군으로 분류하였다. 이에 대한 정상대조군은 사염화탄소를 투여하지 않은 정상 상태의 동물을 이용하였으며, 용매(vehicle)를 투여하였다. 상기 실시예 3에서 동결건조한 돈태반 가수분해물을 용매(vehicle)에 녹인 후, 저용량 돈태반군은 300 mg/kg 체중/일의 비율로, 고용량 돈태반군은 돈태반 가수분해물 1,000 mg/kg 체중/일의 비율로 돈태반 가수분해물을 투여하였다. 음성대조군은 용매(vehicle)인 DMSO를 첨가한 생리식염수를 투여하였고, 양성대조군은 실리마린(silymarin)(80 mg/kg 체중/일; Sigma-Aldrich Chemical Co.)을 DMSO에 녹인 후 생리식염수에 희석시켜 투여하였다. 모든 실험군은 3주 동안 각 군에 맞추어 존대를 사용하여 매일 투여하였다.

투여 종료 후, 각 군의 백서의 무게를 측정하고, 12시간 동안 절식 후에 혈액을 채취하고, 케타민(ketamin)(100 mg/kg 체중)과 자일라진(xylazine)(10 mg/kg 체중)으로 마취시킨 후, 간 및 자라를 채취하여 무게를 측정하였다. 결과는 평균±표준 편차 (SD)로 표시하였다. 간 손상을 유발한 군들에서 각각의 처리군 사이의 변수들의 통계적 유의성은 ANOVA(one-way analysis of variance)로 검증하였다. 각 군의 평균값 사이의 차이는 Tukey 방법으로 다중비교(multiple comparison)를 수행하여 결정하였다. 정상대조군인 사염화탄소를 주입하지 않은 군과 사염화탄소를 주입한 군사이의 통계적 유의성은 two-sample t-test로 검증하였다. 모든 통계 처리의 유의성 검증은 P<0.05로 정하였다.

그 결과, 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 정상대조군에 비해 음성대조군의 백서에서 체중과 정소상체 지방조직(epididymal fat pads)의 양은 감소하였고, 양성대조군(사염화탄소+실리마린), 저용량 또는 고용량 돈태반군에서는 체중과 정소상체 지방조직의 양에 변화가 없었다(표 1 참조).

장기 중 사염화탄소에 의해서 영향을 받을 가능성이 있는 간과 비장의 무게를 비교해보면 절대 질량과 체중 대비 간의 질량은 정상대조군과 음성대조군 사이에 차이가 없었다. 그러나 체중 대비 지라의 질량 비율은 정상대조군에 비해 음성대조군에서 더 높았다. 사염화탄소를 투여한 백서 가운데, 체중대비 간과 지라의 비율은 음성대조군에 비해 양성대조군(실리마린 투여), 저용량 또는 돈태반 고용량군에서 높았다.

	음성대조군	저용량 돈태반군	고용량 돈태반군	양성대조군	정상대조군
체중(g)	214.8±8.8	214.7±13.9	207.2±10.6	218.6±18.4	237.3±20.2^†
정소상체 지방조직(g)	3.8±0.5	3.7±0.4	3.7±0.5	3.6±0.6	4.4±0.6^†
간(g)	9.61±0.16	10.19±0.81	9.65±0.80	10.30±0.92	10.30±1.25
간 (% 체중대비)	4.28±0.1^b	4.74±0.14^a	4.68±0.47^a	4.71±0.32^a	4.30±0.19
지라(g)	0.63±0.02	0.68±0.04	0.64±0.06	0.68±0.08	0.64±0.08
지라 (% 체중대비)	0.29±0.01^b	0.32±0.01^a	0.31±0.03^a	0.31±0.03^a	0.27±0.01^†

a, b: CCl₄ 처리군 사이의 p<0.05인 것을 의미함.

†: 음성대조군에 대하여, p<0.05

실험예 2: 간 보호효과 확인

본 발명의 일 실시예에 따른 돈태반 가수분해물의 간 보호효과를 확인하기 위하여, 하기와 같이 BSP 제거 테스트, 혈청 AST 및 ALT 측정, 혈청 및 간의 중성지방 함량 변화 및 간 조직염색을 수행하였다.

2-1: BSP 제거(clearance) 테스트

BSP(Bromosulfalein) 제거(clearance) 실험은 BSP를 주입한 후에 제거율을 측정하는 실험으로 간 기능을 나타내는 지표로 사용될 수 있다. 이에, BSP 제거 정도를 통하여 본 발명의 일 실시예에 따른 돈태반 가수분해물의 간 보호효과를 확인하고자 하였다.

약물 투여 종료 후에 12시간 동안 절식 후에 혈액을 채취하고, 케타민(ketamin)과 자일라진(xylazine)으로 마취시키고 BSP(Bromosulfalein) 제거(clearance) 실험을 수행하였다(West, Res Vet Sci, 46, 258-263, 1989). 구체적으로, 12시간 금식 후에 백서를 케타민(100 mg/kg 체중)과 자일라진(10 mg/kg 체중)으로 마취한 후, 복강을 개복하고, 복강 정맥으로 1% BSP(1 ml/kg 체중)을 주입한 후 1, 21, 46분에 하행대동맥(descending aorta)으로부터 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액에서 혈청을 분리한 후 혈청에 생리식염수와 10%(w/w) HCl 용액을 넣어 혼합하고, 산을 중화시키기 위해서 10%(w/w) NaOH를 혼합하였다. 혼합 후 원심분리하고 상등액을 취하여 분광 광도계(spectrophotometer) 575 nm에서 흡광도를 측정하였다. BSP 표준 용약을 농도 단계별로 희석한 후, 희석된 BSP를 채취한 혈액과 동일하게 HCl 및 NaOH를 처리한 후, 흡광도를 측정하였다. BSP 표준적정선으로부터 혈액 샘플의 BSP 농도를 측정하여 혈액으로부터 BSP 제거 정도를 측정하였다. BSP 제거율은 시간별로 BSP가 혈액에서 없어지는 비율로 계산하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, BSP는 투여 1분 째에 혈중 농도가 가장 높게 나타났으며 그 후 21분과 46분에 지속적으로 감소하였다(도 1 참조). 정상대조군에서는 46분에는 주입한 BSP의 98.8%가 제거된 것으로 보아 간의 기능이 정상적일 경우에 BSP는 50분 이내에 모두 제거한다는 것을 알 수 있었다. 사염화탄소로 간 손상을 유발시킨 음성대조군에서는 BSP의 제거율이 현저하게 감소하였으며 양성대조군, 고용량 및 저용량 돈태반군에서는 BSP의 제거율이 현저하게 증가되었다. 그러나 정상대조군의 BSP 제거율 만큼 높지는 않았다(표 2 참조).

	음성대조군	저용량 돈태반군	고용량 돈태반군	양성대조군	정상대조군
전체 BSP의 제거율(%)	65.4±8.1^b	81.6±9.6^a	88.0±16.1^a	82.9±13.6^a	98.8±17.9^†
1-21분 사이의 BSP 제거율(%)	48.5±8.8^b	58.5±10.9^a	65.8±14.1^a	52.6±13.4^b	86.6±20.0^†
21-46분 사이의 BSP 제거율(%)	31.5±3.6^b	40.0±8.9^a	43.5±11.4^a	46.8±11.9^a	79.3±12.7^†

a, b: CCl₄ 처리군 사이의 p<0.05인 것을 의미함.

† : 음성대조군에 대하여, p<0.05

2-2: 혈청 ALT와 AST 농도 변화

본 발명의 일 실시예에 따른 돈태반 가수분해물의 간 보호 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 2의 사염화탄소에 투여에 의하여 간 손상이 유도된 동물모델에 돈태반을 투여하며, 주당 1회씩 꼬리 정맥으로부터 혈액을 체취하여 ALT(alanine aminotransferase)와 AST(aspartate aminotransferase)의 농도를 ALT와 AST kit(아산제약, 서울)를 사용하여 비색정량으로 계산하였다.

간세포의 손상 정도를 나타내는 지표인 혈청 ALT와 AST의 농도의 변화를 살펴보면, 사염화탄소를 투여한 모든 실험군은 정상대조군에 비해 1주차에 혈청 ALT와 AST의 농도가 가장 높았으며, 그 후 점차 낮아지는 경향을 나타냈다(도 2a 및 2b 참조). 또한, 양성대조군, 저용량 또는 고용량 돈태반 군에서는 혈청 ALT와 AST의 농도가 감소하였으며, 돈태반 가수분해물의 농도에 의존하여 ALT와 AST가 감소하였다(도 2a 및 2b 참조).

약물 투여 3주째에 고용량 돈태반군의 혈청 AST 농도가 거의 정상대조군과 유사한 값을 나타냈다(도 2B 참조).

2-3: 혈청과 간의 TBARS 측정

약물 투여 종료 후, 혈청 중성지방과 총콜레스테롤의 농도(아산제약, 서울)를 측정하였다. 약물 투여 종료 후에 간에 저장된 중성지방을 2:1(v/v) 클로로포름-메탄올(chloroform-methanol)로 추출한 후, 클로로포름에 녹이고 이것을 0.1% 트라이톤( triton) X-100을 녹인 PBS 용액에 용해시킨다. 이 용액의 중성지방 함량을 중성지방 키트(아산제약, 서울)로 비색정량하여 측정하였다(Sebokova et al., Ann NY Acad Sci 683, 218-227, 1993). 간의 총 콜레스테롤함량은 Richmond(1976)의 방법으로 측정하였다(Richmond et al., Clin Chem 2, 1579-1588, 1976). 또한, 간 조직의 과산물의 함량은 Buege와 Aust방법(1978)으로 TBARS(thiobarbituric acid reactive substance)를 측정하여 정하였다(Buege JA and Aust SD, Methods Enzymol 52, 302-310, 1978).

그 결과, 사염화탄소로 간 손상을 유발시킨 백서에서 체내 지방대사 장애가 나타났다. 정상대조군에 비해 음성대조군에서 혈청 중성지방과 콜레스테롤 농도가 상승하였으며, 돈태반군과 양성대조군은 콜레스테롤 농도가 음성대조군에 비해 감소하였다. 또한, 돈태반 가수분해물의 투여 농도 의존적으로 혈청 중성지방과 콜레스테롤 농도가 저하되는 것을 관찰할 수 있었다(표 3 참조).

또한, 간 중성지방 및 콜레스테롤 수치에 있어서도 정상대조군에 비해 음성대조군의 백서의 간에서 증가되었으며, 돈태반군과 양성대조군에서는 감소하였다(표 3 참조).

또한, 간에 존재하는 과산화물을 나타내는 지표인 TBARS의 함량은 정상대조군에 비해 음성대조군에서 현저히 증가하였고, 돈태반군과 양성대조군에서 소폭 감소하였다(표 3 참조).

	음성대조군	저용량 돈태반군	고용량 돈태반군	양성대조군	정상대조군
혈청 중성지방(mg/dL)	113.2±17.6^a	92.5±11.0^b	79.5±10.3^c	72.6±9.2^c	61.5±8.2
혈청 콜레스테롤(mg/dL)	85.5±10.3^a	78.4±10.4^ab	71.3±9.1^b	63.8±8.9^b	70.8±9.1
간 중성지방 (mg/g wet weight)	3.31±0.72^a	2.56±0.66^ab	1.95±0.64^b	1.63±0.29^b	1.45±0.44
간 전체 콜레스테롤 (mg/g wet weight)	2.30±0.57^a	1.85±0.48^ab	1.61±0.38^b	1.45±0.37^b	1.35±0.31
TBARS (nmol/mg 단백질)	4.34±0.78^a	3.72±0.65^ab	3.15±0.53^b	3.07±0.58^b	2.12±0.53

a, b, c: CCl₄ 처리군 사이의 p<0.05인 것을 의미함.

†: 음성대조군에 대하여, p<0.05

2-4: 면역염색을 이용한 간 조직 관찰

본 발명의 일 실시예에 따른 돈태반 가수분해물의 간 보호효과를 간 조직염색을 통하여 확인하기 위하여, 약물 투여 종료 후, 각 실험군의 간을 채취하였다. 간 조직의 일부는 10% 포르말린(formalin)에 고정한 후 일반적으로 사용하는 조직처리과정을 거쳐 파라핀 포매를 하였다. 포매한 간 조직은 마이크로톰으로 4 μm의 두께로 조직 절편을 만들고, 헤마톡시린&에오신(hematoxylin&eosin) 염색 방법을 이용하여 염색한 후 조직의 형상(morphology)을 관찰하였다.

그 결과, 정상대조군에 비해 음성대조군에서 간세포의 변성이 증가하였고, 특히 지방양이 증가한 것을 볼 수 있었다(도 3 참조). 그러나 사염화탄소 투여에 의한 간 변성과 지방양의 증가는 양성대조군 및 돈태반군에서 감소하였다. 또한, 이러한 간 보호 효과는 돈태반 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

종합하면, 본 발명은 돈태반 가수분해물이 간 손상을 회복시킬 수 있음을 간 손상을 나타내는 다양한 지표를 이용하여 최초로 입증한 것이다. 따라서, 본 발명의 일 실시예에 따른 가수분해물은 간 손상 보호용 조성물로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

본 발명은 도면에 도시된 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

Claims

돈태반 가수분해물을 유효성분으로 함유하는, 간 보호용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 돈태반 가수분해물은 돈태반을 단백질 가수분해효소로 가수분해한 후 여과단계를 거쳐 지질을 제거하고 멸균한 것인, 간 보호용 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 단백질 가수분해효소는 파파인, 브로멜라인, 프로나아제 및/또는 알칼라아제인, 간 보호용 조성물.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 간 보호용 조성물은 지방간, 간암, 간염, 황달, 또는 간경화를 예방 또는 개선하는, 간 보호용 조성물.
돈태반 가수분해물을 유효성분으로 함유하는, 간 손상 예방 및 개선용 건강식품.
약제학적으로 유효한 양의 돈태반 가수분해물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 간 손상 예방 및 치료 방법.