WO2023277222A1 - 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물을 포함하는 간 보호용 조성물 - Google Patents

돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물을 포함하는 간 보호용 조성물 Download PDF

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WO2023277222A1
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hydrolyzate
enzyme
placenta
pig
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PCT/KR2021/008308
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김건남
배근원
황지선
윤선명
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유바이오주식회사
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    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
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    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics

Definitions

  • the present invention relates to a composition for protecting the liver comprising a mixture of a pig placenta enzyme hydrolyzate and an acid hydrolyzate.
  • the liver is one of the organs in the human body in which metabolism is most active. It can be caused by various causes, such as excessive consumption of food or alcohol containing fat, viral infection, harmful substances such as various medicines, and lack of nutrition. Chronic disorders occur, and fatty liver, hepatitis, jaundice, cirrhosis of the liver, and liver cancer may be caused. In particular, excessive fat intake through food or excessive alcohol intake causes fatty liver in which lipids are accumulated in liver tissue, and at this time, AST (aspartate transaminase), ALT (alanine transaminase), and LDH (lactate dehydrogenase) in serum increase.
  • AST aspartate transaminase
  • ALT alanine transaminase
  • LDH lactate dehydrogenase
  • the placenta is composed of blood chorion and supplies necessary oxygen and nutrients to the fetus while maintaining contact between the fetus and maternal tissue. It also plays an important role in eliminating waste products produced by the fetus.
  • the placenta contains various nutrients and hormones necessary for the growth of the fetus, and pig placenta is widely used in adults, especially for menopausal symptom relief and cosmetic purposes.
  • the placenta contains essential amino acids, melatonin, nucleic acid components such as RNA and DNA, antioxidant enzymes such as SOD (Super Oxide Dismutase), hyaluronic acid, antioxidants, cytokines, placenta peptides, insulin-like growth promoters, and epidermal growth promoters. It is known to be useful for fatigue recovery and immunity enhancement because it contains growth factors and cytokines such as (EGF) and senescent cell activator (SCAF).
  • EGF epidermal growth promoters
  • porcine placenta has high homology with the protein structure of human placenta among mammalian placentas, and porcine placenta is an important component of protein, various nutrients, DNA and RNA, and is a bio-active cytokine that governs cell differentiation and fetal development. has been reported as a source of Due to these characteristics, pig placenta is applied to food and medicine. However, research on a porcine placenta composition that can effectively prevent or improve alcohol-induced liver damage, drug addiction, hangover, etc. is still lacking.
  • An object of the present invention is to provide a health functional food composition for liver protection comprising a mixture of a pig placenta enzyme hydrolyzate and an acid hydrolyzate as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a health functional food composition for preventing or improving alcohol-induced liver damage, drug addiction or hangover, comprising a mixture of a pig placenta enzyme hydrolyzate and an acid hydrolyzate as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for liver protection comprising a mixture of a pig placenta enzyme hydrolyzate and an acid hydrolyzate as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating alcohol-induced liver damage, drug addiction or hangover, comprising a mixture of a pig placenta enzyme hydrolyzate and an acid hydrolyzate as an active ingredient.
  • the present invention provides a health functional food composition for liver protection comprising a mixture of a pig placenta enzyme hydrolyzate and an acid hydrolyzate as an active ingredient.
  • the present invention provides a health functional food composition for preventing or improving alcohol-induced liver damage, drug addiction, or hangover, comprising a mixture of a pig placenta enzyme hydrolyzate and an acid hydrolyzate as an active ingredient.
  • the pig placental enzyme hydrolyzate may include one or more peptides consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3.
  • the pig placenta enzyme hydrolyzate and acid hydrolyzate may be mixed in a weight ratio of 1:0.1 to 10, preferably 1:0.5 to 5, 1:0.6 to 5, 1: 0.7 ⁇ 5, 1:0.8 ⁇ 5, 1:0.9 ⁇ 5, 1:1 ⁇ 5, 1:1 ⁇ 4, 1:1 ⁇ 3, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 or It may be mixed in a weight ratio of 1:5, but is not limited thereto.
  • the pig placental enzyme hydrolyzate may be prepared by treating a proteolytic enzyme, and the proteolytic enzyme is composed of papain, pronase, bromelain and alcalase. It may be selected from the group, but is not limited thereto.
  • the pork placenta acid decomposition product may be prepared by treating an acid, and the acid may be hydrochloric acid, sulfuric acid, acetic acid or citric acid, but is not limited thereto no.
  • the peptide may be included in a concentration of 0.1 ppm to 100 ppm, preferably in a concentration of 1 to 25 ppm in the pig placenta enzyme hydrolyzate.
  • the mixture of the pig placenta enzyme hydrolyzate and the acid hydrolyzate may be included in an amount of 1% to 20% by weight based on the total weight of the health functional food composition.
  • the peptide may be included in a concentration of 0.001 ppm to 20 ppm in the entire composition.
  • the composition may reduce the levels of alkaline phosphatase (ALP), aspartate transaminase (AST) or alanine transaminase (ALT) in serum.
  • ALP alkaline phosphatase
  • AST aspartate transaminase
  • ALT alanine transaminase
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for liver protection comprising a mixture of a pig placenta enzyme hydrolyzate and an acid hydrolyzate as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating alcohol-induced liver damage, drug addiction, or hangover, comprising a mixture of a pig placenta enzyme hydrolyzate and an acid hydrolyzate as an active ingredient.
  • the mixture of the pig placenta enzyme hydrolyzate and the acid hydrolyzate may be included in an amount of 5% to 30% by weight based on the total weight of the pharmaceutical composition.
  • the peptide may be included in a concentration of 0.005 ppm to 30 ppm in the entire composition.
  • composition according to the present invention has a remarkable effect on liver protection and, in particular, has a remarkable effect on preventing, improving or treating alcohol-induced liver damage, so it can be usefully used in the fields of medicine and pharmacy and food.
  • VVVE porcine placenta enzyme hydrolysates and peptides
  • VVVE pig placental enzyme hydrolysates and peptides
  • DGLHLR porcine placental enzyme hydrolysates and peptides
  • DDFNPSVH porcine placenta enzyme hydrolysates and peptides
  • ADH alcohol dehydrogenase
  • A-form pig placenta Acid degradant administration group
  • the present invention proposes a health functional food composition for liver protection comprising a mixture of a pig placenta enzyme hydrolyzate and an acid hydrolyzate as an active ingredient.
  • the present invention in its best form, proposes a health functional food composition for preventing or improving liver damage caused by alcohol, drug addiction or hangover, comprising a mixture of a pig placenta enzyme hydrolyzate and an acid hydrolyzate as an active ingredient.
  • the present invention is a health functional food composition for liver protection comprising a mixture of a pig placenta enzyme hydrolyzate and an acid hydrolyzate as an active ingredient; And it provides a health functional food composition for preventing or improving liver damage caused by alcohol, drug addiction or hangover.
  • the pig placental enzyme hydrolyzate may include one or more peptides consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 3.
  • the peptide may be included in a concentration of 0.1 ppm to 100 ppm, preferably in a concentration of 1 to 25 ppm in the pig placental enzyme hydrolyzate.
  • proteolytic enzyme hydrolysate refers to a product prepared by treating porcine placenta with a proteolytic enzyme.
  • the proteolytic enzyme may be selected from the group consisting of papain, pronase, bromelain, and alcalase, but is not limited thereto.
  • porcine placenta acid hydrolyzate refers to a product prepared by acid-treating porcine placenta.
  • the acid may be hydrochloric acid, sulfuric acid, acetic acid or citric acid, but is not limited thereto.
  • the pig placenta enzyme hydrolyzate and acid hydrolyzate may be mixed in a weight ratio of 1:0.1 to 10, preferably 1:0.5 to 5, 1:0.6 to 5, 1:0.7 to 5, 1:0.8 to 5 , 1:0.9-5, 1:1-5, 1:1-4, 1:1-3, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 or 1:5 mixed in a weight ratio It may, but is not limited thereto.
  • the health functional food composition of the present invention may include all foods in a conventional sense, and may be used interchangeably with terms known in the art, such as functional food and health functional food.
  • health functional food refers to food manufactured and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids and pills using raw materials or ingredients having useful functionalities for the human body.
  • 'functionality' means obtaining useful effects for health purposes, such as adjusting nutrients for the structure and function of the human body or physiological functions.
  • the health functional food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and can be prepared by adding raw materials and components commonly added in the art during the preparation.
  • the formulation of the health functional food may also be manufactured without limitation as long as the formulation is recognized as a health functional food.
  • the health functional food composition of the present invention uses food as a raw material and has the advantage of not having side effects that can occur when taking medicine for a long time, and has excellent portability, preventing liver damage caused by alcohol, drug addiction or hangover Or it can be taken as an adjuvant to enhance the improvement effect.
  • the active ingredient may be included in an amount of 1% to 20% (% by weight) based on the total weight of the composition, but is necessarily limited thereto. It is not, and the mixing amount of active ingredients can be appropriately determined according to each purpose of use such as prevention, health or treatment.
  • the formulation of the health functional food may be in the form of a powder, granule, pill, tablet, or capsule, as well as a general food or beverage form.
  • the type of food is not particularly limited, and examples of food to which the substance can be added include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, and dairy products including ice cream. , various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages and vitamin complexes, etc., and may include all foods in a conventional sense.
  • the active ingredient when preparing food or beverage, may be added in an amount of 15 parts by weight or less, preferably 10 parts by weight or less, based on 100 parts by weight of the raw material.
  • the amount in the case of long-term intake for the purpose of health and hygiene or health control, the amount may be less than the above range, and since the present invention uses fractions from natural products, there is no problem in terms of safety, so the above range The above amount can also be used.
  • beverages may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional components, like conventional beverages.
  • the aforementioned natural carbohydrates may be monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • sweetener natural sweeteners such as thaumatin and stevia extract, or synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame may be used.
  • the ratio of the natural carbohydrate may be about 0.01 to 0.04 g, preferably about 0.02 to 0.03 g per 100 mL of the beverage according to the present invention.
  • the health functional food composition according to the present invention contains various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, It may contain glycerin, alcohol, and carbonation agents used in carbonated beverages.
  • the health functional food composition of the present invention may contain fruit flesh for preparing natural fruit juice, fruit juice beverages and vegetable beverages. These components may be used independently or in combination. The ratio of these additives is not limited, but the functional food composition of the present invention is generally selected from the range of 0.01 to 0.1 parts by weight based on 100 parts by weight.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for liver protection comprising a mixture of a pig placenta enzyme hydrolyzate and an acid hydrolyzate as an active ingredient; And it provides a pharmaceutical composition for preventing or improving liver damage caused by alcohol, drug addiction or hangover.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited in content as long as it contains the active ingredient, but preferably the active ingredient may be included in 5 to 30% by weight based on the total weight of the composition. However, it is not limited thereto.
  • the peptide may be included in a concentration of 0.005 ppm to 30 ppm in the entire composition. At this time, when the peptide is less than the above concentration range, there is a problem that it is difficult to exert a desirable preventive or therapeutic effect, and when the peptide exceeds the above concentration range, the change in the expected effect may be insignificant.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is formulated according to conventional methods into oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories and sterile injection solutions.
  • oral formulations such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external preparations, suppositories and sterile injection solutions.
  • suitable carriers, excipients or diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions may be included.
  • carrier or excipient or diluent examples include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, undecided various compounds or mixtures including vaginal cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like.
  • diluents or excipients such as commonly used fillers, weighting agents, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • a solid preparation for oral administration may be prepared by mixing the jasmon with at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, and the like.
  • excipients for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin, and the like.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions for oral use, emulsions, syrups, etc., and various excipients such as wetting agents, sweeteners, aromatics, preservatives, etc. may be included in addition to water and liquid paraffin, which are commonly used simple diluents. .
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, water-insoluble agents, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspensions.
  • injectable esters such as ethyl oleate
  • a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin paper, glycerol gelatin, and the like can be used.
  • a preferred dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention varies depending on the patient's condition, body weight, disease severity, drug type, administration route and period, but can be appropriately selected by those skilled in the art. However, for desirable effects, it may be administered at 0.0001 to 2,000 mg/kg per day, preferably 0.001 to 2,000 mg/kg. Administration may be administered once a day or divided into several times. However, the scope of the present invention is not limited by the dosage.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be administered to mammals such as rats, mice, livestock, and humans through various routes. All modes of administration can be administered, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebroventricular injection.
  • the pig placenta After the pig placenta is thawed in a thawing machine, the pig placenta, which has been removed with water, is put in a meat tenderizer to be tenderized to facilitate blood removal. Thereafter, the placenta was washed several times with 0.9% NaCl to remove blood from the placenta, and the placenta was crushed to facilitate hydrolysis using a blender. 3% of a proteolytic enzyme (papain) was added to the porcine placenta prepared as described above, and hydrolysis was performed for 20 hours.
  • papain proteolytic enzyme
  • the proteolytic enzyme was inactivated by heating, and the porcine placenta hydrolyzate was brought into contact with a filter aid, followed by filtration and adsorption purification. Thereafter, 1.2-fold (w/w) ethanol was added to the filtrate of the hydrolyzate of the pig placenta, and after being allowed to stand for 15 to 20 hours, a filter was used to remove sugars, proteins, and impurities that were not sufficiently hydrolyzed. After concentrating the filtrate, adsorption and purification using 0.1 to 2% of activated carbon, the used activated carbon was removed by filtration using a filter. The purified porcine placental enzyme hydrolyzate from which activated carbon was removed was sterilized by sterilization and filtration through a 0.2 ⁇ m filter. Finally, a high-purity placenta extract was obtained.
  • the present inventors performed an experiment to analyze the nitrogen content, amino acid content and HPLC pattern of the prepared pig placenta enzyme hydrolysate and acid hydrolyzate in order to confirm the characteristics of the pig placenta enzyme hydrolyzate and the acid hydrolyzate.
  • the amino acid content was about 40%, and in the case of the acid hydrolyzate, the amino acid content was about 80% (Table 1). That is, it was confirmed that the amino acid content was higher in the acid hydrolyzate than in the enzyme hydrolyzate.
  • the HPLC patterns of the pig placenta enzyme hydrolyzate and the acid hydrolyzate were also different (FIG. 1).
  • H 2 O/FA 100/0.2 (v/v)
  • a peptide having the same mass and ms/ms ionization form as the peptide identified from the porcine placenta enzyme hydrolysate was synthesized from Anygen (www.anygen.com), and subsequent experiments were conducted.
  • the peptide was verified in two ways.
  • chromatograms of pig placental enzyme hydrolysates and peptides were analyzed.
  • Pig placenta hydrolysate (A), peptide (VVVE) (B) and pig placenta hydrolysate were spiked with synthetic peptides (C) to confirm the chromatogram.
  • the pig placenta hydrolyzate and the synthetic peptide were determined to have the same peak.
  • the peptides were consistent with components present in the porcine placenta hydrolysate (FIG. 3).
  • porcine placental enzyme hydrolysates and peptides were analyzed.
  • Pig placenta hydrolysate (A), peptide (DGLHLR) (B) and pig placenta hydrolysate were spiked with synthetic peptides (C) to confirm the chromatogram.
  • the pig placenta hydrolyzate and the synthetic peptide were identified as the same peak.
  • the peptides were identical to the components present in the porcine placenta hydrolysate (FIG. 5).
  • HepG2 cells a hepatic cancer cell line
  • a hepatic cancer cell line were dispensed in a 24-well plate at 1 ⁇ 10 5 /well and cultured. Thereafter, in order to confirm the hepatocellular protective ability of the three synthetic peptides, the peptides were treated at each concentration and cultured for 23 hours, and then treated with 10 mM t-BHP to damage liver cells and cultured for 90 minutes.
  • PEP-2 and PEP-3 showed high hepatocellular protective ability of 26% and 20%, respectively, at 10 ⁇ ug/ml (Table 5).
  • each well (1 x 10 5 /well) was treated with three synthetic peptides at each concentration and cultured for 23 hours, then treated with 20 mM t-BHP and cultured for 3 hours. Then, the supernatant was taken and measured using Aspartate transaminase (AST or SGOT) Activity Colorimetric Assay Kit (BIOVISION; K753-100).
  • PEP-2 and PEP-3 each showed the most significant AST inhibitory ability at 10 ⁇ g/ml, and the values were 34% and 14% (Table 6). As shown in the results of hepatocellular protective ability, it was confirmed that PEP-2 showed the most excellent efficacy.
  • each well (1 x 10 5 /well) was treated with three synthetic peptides at each concentration and cultured for 23 hours, then treated with 20 mM t-BHP and cultured for 3 hours. Then, the supernatant was taken and measured using Alanine transaminase (ALT or SGPT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit (BIOVISION; K752-100).
  • ALT or SGPT Alanine transaminase
  • BIOVISION BIOVISION; K752-100
  • the supernatant was removed and reacted for 4 hours using an MTT solution (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrasodium bromide), followed by 400 ⁇ l of DMSO. The insoluble formazan crystals were dissolved by putting in each, and the absorbance was measured with an ELISA reader (TECAN, Infinite M200 pro) at a wavelength of 570 nm.
  • the present inventors performed a cytotoxicity test of the pig placenta enzyme hydrolysate and acid lysate by measuring the cell viability after treating the human liver cancer cell line with the pig placenta enzyme hydrolysate and acid lysate. Briefly, HepG2 human liver cancer cell line was cultured in a cell culture flask and dispensed at a cell number of 1.5x10 5 in a 24 well plate when it reached 80% confluence. After culturing for 48 hours, each test substance was treated for each concentration and further cultured for 24 hours.
  • HepG2 human liver cancer cell line was cultured in a cell culture flask and then dispensed into a 24 well plate at a cell number of 1.5x10 5 when reaching 80% confluence. After culturing for 48 hours, each test substance was treated by concentration and cultured for 23 hours. Then, t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide, 10 mM) was simultaneously treated with the sample for 1 hour and 30 minutes on the cells. After 1 hour and 30 minutes of concurrent treatment, MTT was compared to the liver injury treatment group damaged by t-BHP to confirm the protective ability of hepatocytes.
  • t-BHP tert-Butyl hydroperoxide, 10 mM
  • the present inventors conducted an experiment to confirm the effect of the pig placental enzyme hydrolysate and the acid hydrolyzate on inhibiting hepatotoxicity. After culturing the HepG2 human liver cancer cell line in a cell culture flask, when it reached 80% confluence, it was dispensed into a 24 well plate at a cell number of 1.5x10 5 . After culturing for 48 hours, each test substance was treated by concentration and cultured for 23 hours.
  • liver function improvement efficacy of porcine placenta enzyme hydrolysates and acid hydrolysates division cytotoxicity
  • Hepatocellular protective ability AST inhibition ALT inhibition enzyme hydrolysate non-toxic (0.5 mg/ml) About 40% protection (0.05mg/ml) 91% (0.1mg/ml) 23% (0.1mg/ml) acid hydrolyzate non-toxic (0.5 mg/ml) About 21% protection (0.05mg/ml) 93% (0.1mg/ml) no change (0.1mg/ml)
  • the present inventors in order to confirm the characteristics of a mixture of a pig placenta enzyme hydrolyzate and an acid hydrolyzate by ratio, used a weight ratio of 1:1, 1:2, 1:3, and 1:4 After mixing, an experiment was performed to analyze the nitrogen content and amino acid content.
  • Example 7 Alcoholic liver damage of porcine placenta enzymatic hydrolysates, acid lysates and mixtures of porcine placenta enzymatic hydrolysates and acid lysates. in vivo Efficacy evaluation
  • Powder samples were prepared by spray drying porcine placenta enzyme hydrolysates, acid hydrolysates, and mixtures of enzyme hydrolysates and acid hydrolysates. Therefore, in order to confirm the characteristics of the powder sample, the nitrogen content and amino acid content of the powder sample were analyzed (Table 8).
  • Porcine placenta enzymatic hydrolysates, acid lysates, and mixtures of enzymatic hydrolysates and acid lysates are divided Total Nitrogen (mg/mL) Amino Acids (mg/mL) amino acid % Peptide % enzyme hydrolysate 46.79 125.25 42.5 57.5 acid hydrolyzate 35.70 197.38 81.2 18.8 A mixture of enzyme and acid digest (1:3) 39.27 176.27 64.0 36.0
  • the recipe for the alcoholic diet is as follows: 1) Place the required weight of powdered feed (132.28 g) in a beaker with 67 ml of alcohol (spirit) plus 821 ml of water; 2) After adding enough water, stir enough to avoid clumps; 3) Add water up to the marked 1L portion; 4) After thoroughly stirring the feed, put it in a blender and mix for 30 seconds; and 5) using a Feeding Tube (120 ml).
  • liquid diet is used in a regular feeding trough, it may overflow or easily stick to the animal's body, resulting in a large loss.
  • highly volatile alcohol is easily blown away or its diet is easily oxidized, which can have a great effect on the experiment. Therefore, in this experiment, a food container for liquid food was used.
  • test group is as follows.
  • Negative control group Alcohol diet (free feeding for 4 weeks) + 30% alcohol (1.4 g/kg, PO) 2 additional administrations at 4 weeks
  • Porcine placenta enzyme hydrolyzate high-dose group 2511 mg/kg/day, PO+alcohol diet (free feeding for 4 weeks) + 30% alcohol (1.4 g/kg, PO) 2 additional administrations at 4 weeks
  • Pig placenta acid hydrolyzate high-dose group 3282 mg/kg/day, PO+alcohol diet (free feeding for 4 weeks) + 30% alcohol (1.4 g/kg, PO) 2 additional administrations at 4 weeks
  • the present inventors performed the experiment for 4 weeks according to the protocol after pre-breeding the test animals for about 1 week.
  • the test sample was prepared at a dose of a predetermined concentration every day and administered orally once. At the 4th week, two additional doses were orally administered at the prescribed dose.
  • the blood was collected by cardiac blood collection, and the blood was centrifuged at 3000 rpm, and the serum was quantified with an alcohol kit and an acetaldehyde kit, and the blood concentration was compared and analyzed.
  • blood collection for liver toxicity evaluation was put into a heparin tube as cardiac blood collection, and after centrifugation at 10,000 rpm for 10 minutes, liver enzyme levels were measured to evaluate liver toxicity. A portion of the tissue was taken to evaluate liver tissue changes and intrahepatic ADH and ALDH enzymatic activities. All results were mean and standard error, and the significance between test groups was verified by Student's t-test and ANOVA test.
  • serum indicators ALP, ALT, and AST, which represent liver disease, as well as albumin and total protein, which represent liver synthesis capacity, are measured to determine the efficacy of pig placenta for liver inflammation as well as comprehensive liver status of liver synthesis capacity attempted to verify.
  • the measured values for each serum index are shown in Table 5.
  • serum albumin is an indicator of hepatosynthetic ability along with total protein, and no significant difference was found in the indicators for each group.
  • ALP alkaline phosphatase
  • silymarin, pig placenta extract a test substance
  • pig placental enzyme hydrolysates were confirmed to be significantly reduced.
  • ALT and AST are representative aminotransferases that show liver function.
  • the ALT level increased by about 3.5 times compared to the normal control group, and when the test substance (silymarin, porcine placenta extract) was administered, it was confirmed that it decreased compared to the negative control group.
  • the test substance saliva, porcine placenta extract
  • the ALT level was decreased in a dose-dependent manner, and the ALT level decreased most remarkably at the high dose of the mixture of pig placenta enzyme hydrolyzate and acid hydrolyzate.
  • the AST level was significantly increased due to hepatotoxicity compared to the normal control group, and the AST level was significantly decreased in all test groups except for the high dose of the enzyme hydrolyzate in the test substance.
  • the AST level decreased in a dose-dependent manner, as in ALT, when the mixture of the hydrolyzate and the acid hydrolyzate of the pig placenta was administered.
  • a mixture of porcine placenta enzyme hydrolysate and acid hydrolyzate (mixed at a weight ratio of 1:3) was dissolved in distilled water at a concentration of 100 mg/100 ml (0.1% by weight) or 15,000 mg/100 mL (15% by weight), respectively.
  • distilled water was dissolved in distilled water at a concentration of 100 mg/100 ml (0.1% by weight) or 15,000 mg/100 mL (15% by weight), respectively.
  • oligosaccharide 2% by weight
  • sugar 2% by weight
  • salt (0.5% by weight
  • An injection was prepared by dissolving 1 mg of a mixture of pig placenta enzyme hydrolyzate and acid hydrolyzate (mixed at a weight ratio of 1:3) in 5 ml of distilled water or physiological saline and sterilized. Alternatively, it was prepared as a powder formulation after lyophilization in a vial.
  • Capsules were prepared by filling 100 mg of porcine placenta hydrolyzate, 100 mg of corn starch, 100 mg of lactose, and 2 mg of magnesium stearate into gelatin capsules.

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Abstract

본 발명은 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물을 포함하는 간 보호용 조성물; 및 알코올로 인한 간 손상, 약물중독 또는 숙취의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 조성물은 간 보호에 현저한 효과가 있고, 특히, 알코올로 인한 간 손상의 예방, 개선 또는 치료에 현저한 효과가 있어, 의약학 분야 및 식품 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물을 포함하는 간 보호용 조성물
본 발명은 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물을 포함하는 간 보호용 조성물에 관한 것이다.
간은 인간의 신체 장기 중 생체 내 대사가 가장 활발하게 일어나는 장기로서, 지방 성분이 포함된 음식 또는 알코올의 과다 섭취, 바이러스의 감염, 각종 약품과 같은 유해물질, 영양부족 등 다양한 원인에 의해 급성 또는 만성의 장애가 일어나며, 지방간, 간염, 황달, 간경화, 간암 등이 야기될 수 있다. 특히 음식을 통한 과다한 지방 섭취 또는 과도한 알코올 섭취는 간 조직에 지질이 쌓이는 지방간을 유발하며, 이때 혈청 속의 AST(aspartate transaminase), ALT(alanine transaminase), LDH(lactate dehydrogenase) 등이 증가하게 된다.
한편, 태반은 혈액 융모막으로 구성되어 있으며 태아와 모체조직 사이에 접촉을 유지하면서 태아에게 필요한 산소 및 영양소를 공급한다. 또한 태아가 생성하는 노폐물을 제거하는데 중요한 역할을 한다. 태반에는 태아의 성장에 필요한 다양한 영양 물질과 호르몬 등을 함유하고 있고 돈 태반은 성인 특히 갱년기 증상 완화 및 미용 목적 등을 위해 광범위하게 사용되고 있다. 태반에는 필수 아미노산, 멜라토닌, RNA, DNA 등의 핵산 성분, 항산화 효소인 SOD(Super [0003] Oxide Dismutase), 히알루론산, 항산화제, 사이토카인, 태반펩타이드, 인슐린유사 성장촉진인자, 표피성장촉진인자(EGF) 및 노화세포 활성인자(SCAF) 등의 성장인자와 사이토카인 류가 포함되어 있어 피로회복 및 면역증강 등에 유용한 것으로 알려져 있다. 또한 돈태반은 포유류의 태반 중에서도 사람 태반의 단백질 구조와 높은 상동성을 지니고 있으며 돈태반은 단백질과 각종 영양소 및 DNA와 RNA의 중요성분으로서 세포의 차별화와 태아의 발달을 관장하는 바이오-액티브 사이토카인의 근원으로 보고된 바 있다. 돈태반은 이러한 특성으로 인해 식품, 의약품 등에 응용되고 있다. 다만 알코올로 인한 간손상, 약물중독, 숙취 등을 효과적으로 예방 또는 개선할 수 있는 돈태반 조성물에 대한 연구는 아직 부족한 실정이다.
본 발명의 목적은 본 발명은 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 간 보호용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 알코올로 인한 간 손상, 약물중독 또는 숙취의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 간 보호용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 알코올로 인한 간 손상, 약물중독 또는 숙취의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 간 보호용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 알코올로 인한 간 손상, 약물중독 또는 숙취의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 돈태반 효소 가수분해물은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 하나 이상의 펩타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 돈태반 효소 가수분해물 및 산 분해물은 1:0.1~10의 중량비로 혼합된 것일 수 있고, 바람직하게는 1:0.5~5, 1:0.6~5, 1:0.7~5, 1:0.8~5, 1:0.9~5, 1:1~5, 1:1~4, 1:1~3, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 또는 1:5의 중량비로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 돈태반 효소 가수분해물은 단백질 가수분해효소를 처리하여 제조된 것일 수 있고, 상기 단백질 가수분해효소는 파파인, 프로나아제, 브로멜라인 및 알칼라아제로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 돈태반 산 분해물은 산(acid)을 처리한 제조된 것일 수 있고, 상기 산(acid)는 염산, 황산, 아세트산 또는 구연산인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 돈태반 효소 가수분해물 내에 0.1 ppm ~ 100 ppm의 농도로 포함될 수 있고, 바람직하게 1 ~ 25 ppm의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물은 건강기능식품 조성물의 총 중량에 대하여 1% ~ 20 중량%로 포함될 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 상기 조성물 전체 중 0.001 ppm ~ 20 ppm의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 혈청 내의 ALP(alkaline phosphatase), AST(aspartate transaminase) 또는 ALT(alanine transaminase) 수치를 감소시키는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 간 보호용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 알코올로 인한 간 손상, 약물중독 또는 숙취의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물은 약학적 조성물의 총 중량에 대하여 5% ~ 30% 중량%로 포함될 수 있다. 또한, 상기 펩타이드는 상기 조성물 전체 중 0.005 ppm ~ 30ppm의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 간 보호에 현저한 효과가 있고, 특히, 알코올로 인한 간 손상의 예방, 개선 또는 치료에 현저한 효과가 있어, 의약학 분야 및 식품 분야에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 돈태반 효소 가수분해물 및 산 분해물의 HPLC 패턴을 나타낸 결과이다.
도 2는 돈태반 효소 가수분해물의 LC/MS 크로마토그램 결과이다.
도 3은 돈태반 효소 가수분해물 및 펩타이드(VVVE)의 크로마토그램 결과이다.
도 4는 돈태반 효소 가수분해물 및 펩타이드(VVVE)의 MS/MS 패턴을 나타낸 결과이다.
도 5는 돈태반 효소 가수분해물 및 펩타이드(DGLHLR)의 크로마토그램 결과이다.
도 6은 돈태반 효소 가수분해물 및 펩타이드(DGLHLR)의 MS/MS 패턴을 나타낸 결과이다.
도 7은 돈태반 효소 가수분해물 및 펩타이드(DDFNPSVH)의 크로마토그램 결과이다.
도 8은 돈태반 효소 가수분해물 및 펩타이드(DDFNPSVH)의 MS/MS 패턴을 나타낸 결과이다.
도 9는 돈태반 효소 가수분해물, 산 분해물 또는 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물을 투여한 후, 간 조직 내 알코올 탈수소효소(ADH) 활성도를 측정한 결과이다 (Normal: 정상대조군; Alcohol: 음성대조군; Silymarin: 양성대조군; L: 돈태반 혼합물 저용량군; M: 돈태반 혼합물 중용량군; H: 돈태반 혼합물 고용량군; E-form: 돈태반 효소 가수분해물 투여군; 및 A-form: 돈태반 산 분해물 투여군).
도 10은 돈태반 효소 가수분해물, 산 분해물 또는 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물을 투여한 후, 간 조직 내 알데하이드 분해효소(ALDH) 활성도를 측정한 결과이다 (Normal: 정상대조군; Alcohol: 음성대조군; Silymarin: 양성대조군; L: 돈태반 혼합물 저용량군; M: 돈태반 혼합물 중용량군; H: 돈태반 혼합물 고용량군; E-form: 돈태반 효소 가수분해물 투여군; 및 A-form: 돈태반 산 분해물 투여군).
본 발명은 최선의 형태로, 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 간 보호용 건강기능식품 조성물을 제시한다.
또한, 본 발명은 최선의 형태로, 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 알코올로 인한 간 손상, 약물중독 또는 숙취의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제시한다.
본 발명은 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 간보호용 건강기능식품 조성물; 및 알코올로 인한 간 손상, 약물중독 또는 숙취의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 돈태반 효소 가수분해물은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 하나 이상의 펩타이드를 포함할 수 있다.
상기 펩타이드는 돈태반 효소 가수분해물 내에 0.1 ppm ~ 100 ppm의 농도로 포함될 수 있고, 바람직하게는 1 ~ 25 ppm의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 용어, "돈태반 효소 가수분해물"은 돼지 태반에 단백질 가수분해효소를 처리하여 제조된 것을 말한다.
상기 단백질 가수분해효소는 파파인, 프로나아제, 브로멜라인 및 알칼라아제로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 용어, "돈태반 산 분해물"은 돼지 태반에 산을 처리하여 제조된 것을 말한다.
상기 산은 염산, 황산, 아세트산 또는 구연산인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 돈태반 효소 가수분해물 및 산 분해물은 1:0.1~10의 중량비로 혼합된 것일 수 있고, 바람직하게는 1:0.5~5, 1:0.6~5, 1:0.7~5, 1:0.8~5, 1:0.9~5, 1:1~5, 1:1~4, 1:1~3, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 또는 1:5의 중량비로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있으며, 기능성 식품, 건강기능식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용 가능하다.
본 발명의 용어, "건강기능식품"은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 알코올로 인한 간손상, 약물중독 또는 숙취 예방 또는 개선 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에 있어서, 상기 유효성분(돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물)은 상기 조성물 총 중량에 대하여 1% ~ 20% (중량%)로 포함될 수 있으나, 이에 반드시 한정되는 것은 아니고, 유효성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료 등의 각 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.
건강기능식품의 제형은 산제, 과립제, 환, 정제, 캡슐제의 형태뿐만 아니라 일반 식품 또는 음료의 형태 어느 것이나 가능하다.
상기 식품의 종류에는 특별히 제한은 없고, 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.
일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 상기 유효성분은 원료 100 중량부에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 또한 본 발명은 천연물로부터의 분획물을 이용하는 점에서 안전성 면에서 문제가 없으므로 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 기능성식품 중 음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 음료 100 mL당 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g일 수 있다.
상기 외에 본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나, 본 발명의 기능성식품 조성물은 100 중량부를 기준으로 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 간보호용 약학적 조성물; 및 알코올로 인한 간 손상, 약물중독 또는 숙취의 예방 또는 개선용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 유효성분을 포함하는 것이라면 그 함량을 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게 상기 유효성분은 상기 조성물 총 중량에 대하여 5 ~ 30 중량%로 포함될 수 있다. 다만, 이에 한정되지 않는다. 또한 ,상기 펩타이드는 상기 조성물 전체 중 0.005 ppm ~ 30ppm의 농도로 포함될 수 있다. 이때, 펩타이드가 상기 농도 범위 미만인 경우, 바람직한 예방 또는 치료 효과를 발휘하기 어려운 문제점이 있고, 상기 농도 범위를 초과하는 경우, 기대하는 효과의 변화가 미미할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기 담체 또는, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리게이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제는 상기 자스몬에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용하는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 돈태반 효소 가수분해물의 제조
돼지 태반을 해빙기에서 해동한 후 상수로 이물을 제거한 돼지 태반을 연육기에 넣어 탈혈이 용이하도록 연육한다. 그 후 0.9% NaCl로 수차례 세척하여, 돼지 태반 내에 있는 혈액을 제거시킨 돼지태반을 믹서기를 이용하여 가수분해가 용이하도록 파쇄하였다. 상기와 같이 준비된 돼지 태반에 단백질 분해효소(파파인) 3%를 넣고, 20시간 동안 가수분해하였다. 가수분해가 끝난 후 가열하여 단백질 분해효소를 불활성화시키고, 상기 돈태반 가수분해물을 여과보조제에 접촉시킨 뒤 여과하여 흡착 정제하였다. 이후, 돈태반 가수분해물 여과액에 1.2 배 (w/w) 에탄올을 넣어 15 ~ 20 시간 방치 후 필터를 사용하여 가수분해가 충분하지 않은 당, 단백질 및 불순물 등을 제거하였다. 여과한 액을 농축한 후, 활성탄 0.1 ~ 2%를 사용하여 흡착 정제한 후, 사용된 활성탄은 필터를 사용하여 여과의 방법으로 제거하였다. 활성탄이 제거된 정제된 돈태반 효소 가수분해물을 0.2㎛ 필터로 제균 여과한 액을 멸균하였다. 최종적으로 고순도의 태반 추출물을 얻었다.
실시예 2. 돈태반 산 분해물의 제조
돼지 태반을 해빙기에서 해동한 후, 상수로 이물을 제거한 돼지 태반 100 kg에 35% (v/w) 염산 70 kg을 투입하여 110 ℃에서 22 시간 동안 분해한 후 여과하였다. 이후, 여과한 분해물을 농축한 후, 수산화나트륨을 넣어 pH 6 ~ 7로 중화시킨 후, 활성탄을 사용하여 흡착 정제 하였다. 사용된 활성탄은 필터를 사용하여 여과의 방법으로 제거하였다. 활성탄이 제거된 정제된 돈태반 산 분해물을 0.2 ㎛ 필터로 제균 여과한 액을 멸균하였다.
실시예 3. 돈태반 효소 가수분해물 및 산 분해물의 분석
본 발명자들은 돈태반 효소 가수분해물과 돈태반 산 분해물의 특성을 확인하기위하여, 제조된 돈태반 효소 가수분해물 및 산 분해물의 질소 함량, 아미노산 함량 및 HPLC 패턴을 분석하는 실험을 수행하였다.
그 결과, 효소 가수분해물의 경우 아미노산의 함량이 약 40% 로 나타났고, 산 분해물의 경우 아미노산의 함량이 약 80% 로 나타났다 (표 1). 즉, 산 분해물에서는 효소 가수분해물에 비해 아미노산 함량이 더 많았음을 확인하였다. 또한, 도 1에 나타낸 바와 같이, 돈태반 효소 가수분해물 및 산 분해물의 HPLC 패턴도 상이하게 나타났다 (도 1).
돈태반 효소 가수분해물 및 산 분해물의 분석
구분 총 질소(mg/mL) 아미노산(mg/mL) 아미노산 % 펩타이드 %
효소가수분해물 5.30 13.68 41.1 58.9
산 분해물 5.67 31.72 81.2 18.8
[계산식]
Figure PCTKR2021008308-appb-I000001
실시예 4. 돈태반 효소 가수분해물의 펩타이드 확인 및 펩타이드 효능 분석
4.1. 돈태반 효소 가수분해물의 mass chromatography
실시예 1에서 얻어진 돈태반 효소 가수분해물을 시료 100 ㎕ 에 메탄올(MeOH) 500 ㎕ 첨가하여 볼텍싱한 후, 원심분리하여 상등액 600 ㎕ 을 새로운 시험관에 옮겨서 진공건조하였다. 이후, 건조된 샘플에 100 ㎕ 가 되도록 물을 첨가한 후 필터한 액을 MicroQ-TOF III mass spectrometer (Bruker Daltonics, 255748 Germany) 시스템과 ms/ms 이온화 분석을 통하여 서열분석하였다.
<분석조건>
- 이동상:
A 이동상: H2O/FA = 100/0.2 (v/v)
B 이동상: Acetonitrile/FA = 100/0.2 (v/v)
Mass chromatography 분석 조건
Step (%) Total Time(min) Flow Rate(μl/min) A(%) B(%)
0 0.00 200 95 5
1 5.00 200 95 5
2 28.00 200 70 30
3 33.00 200 5 95
4 40.00 200 5 95
5 41.00 200 95 5
6 46.00 200 95 5
상기의 분석 결과, 총 17개의 펩타이드를 분석하였고, uniprot data base에서 돼지 유래 펩타이드 (peptide)로 5개의 펩타이드를 확인하였다 (표 3).
돈태반 효소가수분해물의 펩타이드 서열
No. m/z RT(min) Charge Sequence Organism
1 445.27 10.0 1 VVVE Sus scrofa (Pig)
2 571.27 11.5 1 QMHR -
3 355.70 14.5 2 DGLHLR Sus scrofa (Pig)
4 394.73 14.7 2 LDKWNL Sus scrofa (Pig)
5 438.24 15.3 2 SLDKRAK -
6 465.71 15.4 2 DDFNPSVH Sus scrofa (Pig)
7 490.23 15.9 1 GPLCT Sus scrofa (Pig)
이후, 본 발명에서는 확인된 5개의 돼지 유래 펩타이드 중에서 피크 크기 및 배치 간 재현성을 확인하여 3개의 돼지 유래 펩타이드를 지표 물질로 선정하였다 (도 2 및 표 4).
돈태반 효소가수분해물 지표성분의 펩타이드 서열
No. m/z RT (min) Charge Sequence 가수분해물 내 함량 (ppm)
PEP-1 445.27 9.4 1 VVVE (서열번호 1) 10-19 ppm
PEP-2 355.70 14.3 2 DGLHLR (서열번호 2) 4-10 ppm
PEP-3 465.71 15.3 2 DDFNPSVH (서열번호 3) 10-21 ppm
상기 돈태반 효소 가수분해물로부터 확인된 펩타이드와 동일한 mass 및 ms/ms 이온화 형태를 갖는 펩타이드를 애니젠 (www.anygen.com)으로부터 합성하여 이후 실험을 진행하였다.
상기 PEP-1, PEP-2 및 PEP-3 펩타이드의 가수분해물 내 함량은 1 내지 25 ppm 로 함유하고 있음을 확인하였다.
4.2. 펩타이드의 검증
상기 PEP-1, PEP-2, PEP-3 펩타이드의 검증을 통해, 애니젠에서 합성한 펩타이드가 돈태반 효소 가수분해물 내 존재하는 펩타이드와 일치함을 확인하고자 펩타이드 검증 시험을 진행하였다.
PEP-1의 경우, 두 가지 방법으로 펩타이드의 검증을 진행하였다. 첫 번째 방법으로서, 돈태반 효소가수분해물과 펩타이드(VVVE)의 크로마토그램을 분석하였다. 돈태반 가수분해물(A), 펩타이드(VVVE)(B) 및 돈태반 가수분해물에 합성 펩타이드를 spiking (C)하여 크로마트그램을 확인하였다. 그 결과, 돈태반 가수분해물과 합성 펩타이드가 동일 피크로 판정되었다. 이로써, 펩타이드가 돈태반 가수분해물 내에 존재하는 성분과 일치함을 확인하였다 (도 3). 두 번째 방법으로서, 돈태반 효소가수분해물과 펩타이드(VVVE) MS/MS 패턴을 확인하였다. 그 결과, 돈태반 가수분해물의 MS/MS 패턴과 펩타이드(VVVE) MS/MS 패턴이 일치하여 펩타이드가 돈태반 가수분해물 내에 존재하는 성분과 일치함을 확인하였다 (도 4).
PEP-2의 경우, 첫 번째 방법으로서,돈태반 효소가수분해물과 펩타이드 (DGLHLR) 크로마토그램을 분석하였다. 돈태반 가수분해물(A), 펩타이드(DGLHLR)(B) 및 돈태반 가수분해물에 합성 펩타이드를 spiking (C)하여 크로마트그램을 확인하였다. 그 결과, 돈태반 가수분해물과 합성 펩타이드가 동일 피크로 확인되었다. 이로써, 펩타이드가 돈태반 가수분해물 내에 존재하는 성분과 일치함을 확인하였다 (도 5). 또한, 펩타이드 검증의 두 번째 방법으로서, 돈태반 효소가수분해물과 펩타이드(DGLHLR) MS/MS 패턴을 확인하였다. 그 결과, 돈태반 가수분해물의 MS/MS 패턴과 펩타이드(DGLHLR) MS/MS 패턴이 일치하여 펩타이드가 돈태반 가수분해물 내에 존재하는 성분과 일치함을 확인하였다 (도 6).
PEP-3 의 경우 첫 번째 방법으로서, 돈태반 효소가수분해물과 펩타이드(DDFNPSVH) 크로마토그램을 분석하였다. 돈태반 가수분해물(A), 펩타이드(DDFNPSVH)(B) 및 돈태반 가수분해물에 합성 펩타이드를 spiking (C)하여 크로마트그램을 확인하였다. 그 결과, 돈태반 가수분해물과 합성 펩타이드가 동일 피크로 확인되었다. 이로써, 펩타이드가 돈태반 효소 가수분해물 내에 존재하는 성분과 일치함을 확인하였다 (도 7). 또한, 펩타이드 검증의 두 번째 방법으로서, 돈태반 효소 가수분해물과 펩타이드(DDFNPSVH) MS/MS 패턴을 확인하였다. 그 결과, 돈태반 효소 가수분해물의 MS/MS 패턴과 펩타이드(DDFNPSVH) MS/MS 패턴이 일치하여 펩타이드가 돈태반 가수분해물 내에 존재하는 성분과 일치함을 확인하였다 (도 8).
4.3. 펩타이드의 HepG2 세포독성평가
HepG2 간암세포주를 배양 후 농도별로 3 가지의 합성 펩타이드를 첨가한 후 세포생존율을 확인하기 위해 MTT (methylthiazol tetrazolium bromide, Sigma Aldrich)를 시행하였다. 24 웰 플레이트 (BD, Falcon)에 각 웰에 세포들을 적당량 (1X105/well) 시딩 (seeding)하여, 각각 농도 별로 시료들을 처리하고, 37℃ 인큐베이터에서 24시간 배양 후에 세포생존율을 확인하였다. MTT 용액 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrasodium bromide)을 이용하여 4시간 동안 반응시킨 후, DMSO을 400 ㎕씩 넣어 불용성인 formazan 결정체를 용해시켜 570 nm 파장에서 ELISA 판독기(TECAN, Infinite M200 pro)로 흡광도를 측정하였다.
3가지의 펩타이드에 대한 세포독성을 확인한 결과, PEP-1, PEP-2 및 PEP-3 모두 10 μg/ml까지 무독성을 보였다 (표 5).
4.4. 펩타이드의 간세포 보호능
간암세포주인 HepG2 세포를 24 웰 플레이트에 1 x 105/well이 되도록 분주하고 배양하였다. 이후, 3 가지 합성 펩타이드의 간세포 보호능을 확인하기 위하여, 펩타이드를 농도별로 처리하여 23시간 동안 배양한 후, 간 세포의 손상을 위해 10 mM 의 t-BHP를 처리하여 90분 동안 배양하였다. MTT 용액 (3-(4,5 -dimethylthiazol-2-yl)-2,5 -diphenyl tetrasodium bromide)을 넣고 4시간 동안 반응시킨 후, DMSO을 400 ㎕씩 넣어 불용성인 formazan 결정체를 용해시켜 570nm 파장에서 ELISA 판독기(TECAN, Infinite M200 pro)로 흡광도를 측정하였다.
그 결과, PEP-2 및 PEP-3은 10 μug/ml에서 각각 26% 및 20% 의 높은 간세포 보호능을 나타내었다 (표 5).
4.5. 펩타이드의 간 기능 검사지표 AST 측정
AST를 확인하기 위해 각 웰 (1 x 105/well)에 3 가지 합성 펩타이드를 농도별로 처리하여 23시간 동안 배양 후, 20 mM 의 t-BHP를 처리하여 3시간 동안 배양하였다. 이후 상층액을 취하여 Aspartate transaminase (AST or SGOT) Activity Colorimetric Assay Kit (BIOVISION; K753-100)을 이용하여 측정하였다. 또한, 세포 정량을 위하여 상층액을 제거하고, MTT 용액 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrasodium bromide)을 이용하여 4시간 동안 반응시킨 후, DMSO을 400 ㎕씩 넣어 불용성인 포르마잔(formazan) 결정체를 용해시켜 570 nm 파장에서 ELISA 판독기(TECAN, Infinite M200 pro)로 흡광도를 측정하였다.
그 결과, PEP-2, PEP-3 각각은 10 μg/ml에서 가장 현저한 AST 억제능을 보였으며, 그 수치는 34% 및 14% 으로 나타났다 (표 6). 간세포 보호능의 결과에서와 같이, PEP-2이 가장 우수한 효능을 보임을 확인하였다.
4.6. 펩타이드의 간 기능 검사지표 ALT 측정
ALT를 확인하기 위해 각 웰 (1 x 105/well)에 3 가지 합성 펩타이드를 농도별로 처리하여 23시간 동안 배양 후, 20 mM의 t-BHP를 처리하여 3시간 동안 배양하였다. 이후, 상층액을 취하여 Alanine transaminase (ALT or SGPT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit(BIOVISION; K752-100)을 이용하여 측정하였다. 또한, 세포 정량을 위하여 상층액을 제거하고 MTT 용액 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrasodium bromide)을 이용하여 4시간 동안 반응시킨 후, DMSO을 400 ㎕씩 넣어 불용성인 포르마잔(formazan) 결정체를 용해시켜 570nm 파장에서 ELISA 판독기(TECAN, Infinite M200 pro)로 흡광도를 측정하였다.
그 결과, PEP-2에서 우수한 ALT 억제능이 확인되었다. 최대 효능을 보인 농도는 1 μg/ml 로서, 그 수치는 34% 로 나타났다 (표 5).
돈태반 유래 펩타이드의 간 건강 개선 효력 시험
시료농도 PEP-1 PEP-2 PEP-3
합성샘플 sequence - VVVE DGLHLR DDFNPSVH
시험농도설정 세포독성 (HepG2) 0.01~1000 ug/ml ~10ug/ml ~10ug/ml ~10ug/ml
간지표 간세포
보호능		 0.1 ug/ml ND 15% 9%
1 ug/ml ND 20% 20%
10 ug/ml 7% 26% 20%
AST 억제능 0.1 ug/ml ND 4% ND
1 ug/ml ND 15% 5%
10 ug/ml 2% 34% 14%
ALT 억제능 0.01 ug/ml ND 21% ND
0.1 ug/ml ND 30% ND
1 ug/ml ND 34% ND
실시예 5. 돈태반 효소 가수분해물 및 산 분해물의 간(liver) 개선 in-vitro 효능 평가
본 발명자들은 돈태반 효소 가수분해물 및 산 분해물을 인간간암세포주에 처리한 후 세포생존율을 측정하여, 돈태반 효소 가수분해물 및 산 분해물의 세포 독성 실험을 수행하였다. 간단히, HepG2 인간간암세포주를 세포배양 flask에 배양하여 80% confluence가 되었을 때 24 well plate에 1.5x105의 세포 수로 분주하였다. 48시간 배양 후, 농도별 각 시험물질을 처리하여 24시간 동안 추가 배양하였다. 이후, MTT 용액 (3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrasodium bromide)을 이용하여 4시간 동안 반응시킨 후, DMSO을 400 ㎕씩 넣어 불용성인 formazan 결정체를 용해시켜 570 nm 파장에서 ELISA 판독기(TECAN, Infinite M200 pro)로 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 돈태반 효소 가수분해물 및 산 분해물은 총 질소 0.5 mg/ml의 농도까지 무독성인 것을 확인하였다 (표 6).
또한, 본 발명자들은 돈태반 효소 가수분해물 및 산 분해물이 간보호 효과가 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 간단히, HepG2 인간간암세포주를 세포배양 flask에 배양한 후 80% confluence가 되었을 때 24 well plate에 1.5x105의 세포수로 분주하였다. 48시간 배양 후, 농도별 각 시험물질 처리하여 23시간 동안 배양하였다. 이후, t-BHP (tert-Butyl hydroperoxide, 10 mM)를 세포에 1시간 30분 동안 샘플과 동시 처리하였다. 동시 처리 1시간 30분 후 MTT로 t-BHP에 의해 손상된 간손상처리 군에 비교하여 간세포의 보호능을 확인한다.
그 결과, t-BHP를 간세포에 처리한 경우, 다량의 ROS를 생성하여 간세포를 손상시키는 것을 확인하였다. 그러나, 돈태반 효소 가수분해물을 처리한 경우 총 질소 0.05 mg/ml의 농도에서 간세포를 약 40% 보호하였고, 돈태반 산 분해물은 총 질소 0.05 mg/ml의 농도에서 약 21% 보호하는 효과가 있었다 (표 6).
또한, 본 발명자들은 돈태반 효소 가수분해물 및 산 분해물이 간독성을 억제하는 효과가 확인하기 위한 실험을 수행하였다. HepG2 인간간암세포주를 세포배양 flask에 배양한 후 80% confluence가 되었을 때 24 well plate에 1.5x105의 세포수로 분주하였다. 48시간 배양 후, 농도별 각 시험물질 처리하여 23시간 동안 배양하였다. 23시간 후, t-BHP (20 mM)를 세포에 3시간을 동시 처리하였고, 3시간 후 상층액을 얻어 AST 및 ALT activity kit를 이용하여 간손상 지표인 AST(aspartate transminase) 및 ALT(alanine transminase)의 양을 확인하였다. 또한, MTT 용액을 처리하여 세포수를 확인하여 이를 보정하였다.
그 결과, 돈태반 효소 가수분해물을 총 질소 0.1 mg/ml의 농도로 처리한 경우 AST가 91%로 억제되었고, 돈태반 산 분해물을 총 질소 0.1 mg/ml의 농도로 처리한 경우 AST가 93% 억제되는 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 돈태반 효소 가수분해물을 총 질소 0.1 mg/ml의 농도로 처리한 경우 ALT가 23% 억제되는 효과가 있는 반면, 돈태반 산 분해물을 처리한 경우에는 아무런 변화가 없음을 확인하였다 (표 6).
돈태반 효소 가수분해물 및 산 분해물의 간 기능 개선 효능 평가
구분 세포독성 간세포보호능 AST 억제능 ALT 억제능
효소 가수분해물 무독성
(0.5mg/ml)		 약 40% 보호
(0.05mg/ml)		 91%
(0.1mg/ml)		 23%
(0.1mg/ml)
산 분해물 무독성
(0.5mg/ml)		 약 21% 보호
(0.05mg/ml)		 93%
(0.1mg/ml)		 변화없음
(0.1mg/ml)
실시예 6. 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물 특성 분석
본 발명자들은 돈태반 효소 가수분해물 및 산 분해물을 비율별로 혼합한 혼합물의 특성을 확인하기 위하여, 돈태반 효소 가수분해물 및 산 분해물을 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 의 중량비로 혼합한 후, 질소 함량 및 아미노산 함량을 분석하는 실험을 수행하였다.
그 결과, 돈태반 산 분해물의 혼합 비율이 높아질수록 아미노산의 함유량이 증가함을 확인하였다 (표 7). 이후 실험에서는 돈태반 효소 가수분해물 및 산 분해물의 혼합물 중 1:3의 중량비를 선정하였고, 이를 저, 중, 고 농도의 다양한 농도로 효능 평가를 수행하였다.
돈태반 효소 가수분해물 및 산 분해물의 혼합물 분석
구분 총 질소(mg/mL) 아미노산(mg/mL) 아미노산 % 펩타이드 %
효소 + 산 (1:1) 5.47 15.73 59.4 40.6
효소 + 산 (1:2) 5.52 17.54 65.8 34.2
효소 + 산 (1:3) 5.58 18.10 66.4 33.6
효소 + 산 (1:4) 5.61 18.62 68.2 31.8
[계산식]
Figure PCTKR2021008308-appb-I000002
실시예 7. 돈태반 효소 가수분해, 산 분해물 및 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물의 알코올성 간손상 in vivo 효능 평가
7.1. 시료 제조
돈태반 효소가수분해물, 산 분해물 및 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물을 분무 건조하여 분말 시료를 제조하였다. 이에 분말 시료의 특성을 확인하고자 분말시료의 질소 함량 및 아미노산 함량을 분석하였다 (표 8).
돈태반 효소가수분해물, 산 분해물, 및 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물
구분 총 질소(mg/mL) 아미노산 (mg/mL) 아미노산 % 펩타이드 %
효소 가수분해물 46.79 125.25 42.5 57.5
산 분해물 35.70 197.38 81.2 18.8
효소 및 산 분해물 (1:3)의 혼합물 39.27 176.27 64.0 36.0
[계산식]
Figure PCTKR2021008308-appb-I000003
7.2. 동물사육
본 발명에서는 7~8주령 SD종 흰쥐(250 gm 내외)를 구입한 후 1주일 동안의 검역 및 순화기간을 거쳐 체중변화 및 일반 건강상태를 관찰한 후 건강한 개체를 사용하였다. 실험 기간 동안 1군을 제외한 모든 군은 방사선 멸균된 rat용 알코올성 식이(Lieber Decarlie Liquid Ethanol Diet)를 4주 동안 자유섭취시켰고, 4주차에 추가로 알코올을 경구 투여로 주 2회(화/목요일) 시행하였으며, 음수는 따로 공급하지 않았다. 사육실 온도는 23±2℃, 상대습도는 40~60%를 유지하고, 환기횟수는 시간당 10~12회를 시켰다. 또한, 광주기 암주기를 12시간이 되도록 빛을 조절하였다.
7.3. 알코올성 식이(Lieber DeCalie Liquid Ethanol Diet)의 조제법
알코올성 식이의 조제법은 다음과 같다: 1) 필요한 중량의 분말 사료(132.28g)와 67 ml의 알코올(주정)에 821 ml의 물을 첨가한 비이커에 넣는다; 2) 충분한 물을 넣은 후 덩어리가 없도록 충분히 저어준다; 3) 표시된 1L 부분까지 물을 넣는다; 4) 사료를 충분히 저은 후 블렌더에 넣고 30초간 섞는다; 및 5) Feeding Tube(120 ml)을 이용한다.
액체식이를 일반 먹이통을 이용하게 되면, 넘쳐흐르거나 동물의 몸에 쉽게 붙어 손실량이 클 수 있다. 또한, 공기와 접촉되는 면적이 넓어지기 때문에 휘발성이 높은 알코올이 날아가거나, 그 식이가 산화되기 쉬워 실험에 큰 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 본 실험에서는 액체식이용 먹이통을 사용하였다.
7.4. 시험군
시험군은 다음과 같다.
(1) 정상대조군
(2) 음성대조군: 알코올식이(4주간 자유급식) + 30% 알코올(1.4 g/kg, PO) 4주차 2회 추가 투여
(3) 양성 대조군: 실리마린(silymarin, 100 mg/kg/day, PO)(Yang et al, 2015) + 30% 알코올(1.4g/kg, PO) 4주차 2회 추가 투여
(4) 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물 (1:3) 고용량군: 2952 mg/kg/day, PO+알코올식이(4주간 자유급식) + 30% 알코올(1.4 g/kg, PO) 4주차 2회 추가 투여
(5) 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물 (1:3) 중용량군: 1771 mg/kg/day, PO+알코올식이(4주간 자유급식) + 30% 알코올(1.4 g/kg, PO) 4주차 2회 추가 투여
(6) 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물 (1:3) 저용량군: 590 mg/kg/day, PO+알코올식이(4주간 자유급식) + 30% 알코올(1.4 g/kg, PO) 4주차 2회 추가 투여
(7) 돈태반 효소 가수분해물 고용량군: 2511 mg/kg/day, PO+알코올식이(4주간 자유급식) + 30% 알코올(1.4 g/kg, PO) 4주차 2회 추가 투여
(8) 돈태반 산 분해물 고용량군: 3282 mg/kg/day, PO+알코올식이(4주간 자유급식) + 30% 알코올(1.4 g/kg, PO) 4주차 2회 추가 투여
7.5. 알코올성 간 손상으로부터 간 기능 개선 효능
본 발명자들은 시험동물을 약 1주간 예비사육 후 프로토콜에 따라 4주간 실험을 수행하였다. 시험시료는 매일 정해진 농도의 용량으로 조제하여 1회 경구투여 하였으며, 알코올 식이는 정해진 조제방법에 따라 조제하여 매일 공급하여 자유 급식시켰다. 4주차에는 정해진 용량으로 2회 추가로 경구 투여시켰다. 시험 4주후 12시간 절식 후 심장 채혈로 사혈시키며, 혈액은 3000 rpm으로 원심분리한 후 혈청으로 알코올 키트와 아세트알데하이드 키트로 정량하여 혈중 농도를 비교 분석하였다. 또한, 간독성 평가를 위한 채혈은 심장채혈로 헤파린 튜브에 넣고 10,000 rpm에서 10분간 원심분리 후에 간효소 수치를 측정하여 간독성을 평가하였다. 조직의 일부를 취하여 간조직 변화 및 간내 ADH 및 ALDH 효소 활성을 평가하였다. 모든 결과는 평균과 표준오차로 시험군 간의 유의성을 Student's t-test와 ANOVA test로 검증하였다.
본 발명에서는 혈청 지표 중에 간질환을 대변하는 ALP, ALT, AST를 비롯하여 간의 합성능을 대변하는 알부민과 총 단백질양을 측정하여 간염증 뿐만 아니라 간의 합성능의 종합적인 간상태에 대한 돈태반의 효능을 검증하려고 시도하였다. 각 혈청 지표에 대한 측정치는 표 5에 나타내었다.
그 결과, 혈청 알부민(albumin)은 총 단백질양(total protein)과 함께 간합성능력을 나타내는 지표로서, 각 군마다 지표에 유의한 차이가 나타나지는 않았다.
ALP(alkaline phosphatase)는 주로 간, 골조직, 장관, 백혈구 등에 분포하며 수치의 증가는 주로 간과 골조직에서 기인한다. 본 발명에서는 시험물질(실리마린, 돈태반 추출물)을 투여할 경우 음성대조군에 비해 ALP가 감소하는 경향을 보였으나, 특히, 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물 중용량군; 및 돈태반 효소 가수분해물에서 유의하게 감소한 것을 확인하였다.
ALT와 AST는 간기능을 나타내는 대표적인 아미노산 전이효소(aminotransferase)이다. 알코올이 투여된 음성대조군에서는 정상대조군에 비해 ALT 수치가 3.5 배 정도로 증가하였고, 시험물질(실리마린, 돈태반 추출물)을 투여한 경우 음성대조군에 비해 감소한 것을 확인하였다. 특히, 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물을 투여한 경우에는 용량 의존적으로 감소하였고, 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물 고용량에서 가장 현저하게 ALT 수치가 감소하였다.
또한, 알코올 투여된 음성대조군에서는 정상대조군에 비해 간독성에 의해 AST 수치가 유의하게 증가하였고, 시험물질 중에 효소 가수분해물 고용량을 제외한 모든 시험군에서 AST 수치가 유의하게 감소하였다. 특히, 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물을 투여한 경우 ALT에서와 마찬가지로 용량 의존적으로 AST 수치가 감소하였음을 확인하였다.
알코올성 간 손상에 대한 돈태반 추출물의 혈청 생화학적 검사
Albumin ALP ALT(GPT) AST(GOT) Total protein
정상군 2.24±0.13 483.60±119.02 33.66±3.11 81.37±3.24 5.32±0.31
음성대조군 2.38±0.08 633.73±91.97 115.56±38.96 235.03±113.98 5.44±0.14
양성대조군 2.37±0.13 555.63±108.75 83.94±28.54 126.70±23.81 5.24±0.28
돈태반
효소 및 산(1:3)
혼합물		 고용량 2.33±0.22 552.89±94.56 73.64±10.15 139.17±17.64 5.19±0.46
중용량 2.34±0.18 490.23±82.20 68.76±21.50 123.97±25.76 5.22±0.34
저용량 2.39±0.12 568.11±85.03 56.91±13.99 122.83±17.23 5.32±0.27
효소 가수분해물 2.42±0.19 471.36±99.17 82.54±31.70 227.31±90.21 5.42±0.35
산 분해물 2.42±0.10 556.39±55.71 78.81±11.32 169.36±10.36 5.31±0.31
또한, 간 조직 내 알코올 대사효소인 ADH의 활성도를 측정한 결과, 알코올이 투여된 음성대조군(0.85)에서는 정상대조군(0.37)에 비해 ADH의 활성이 증가하였다 (도 9). 또한, 실리마린 > 돈태반 혼합물 저용량 > 돈태반 혼합물 중용량 > 돈태반 혼합물 고용량으로 ADH의 활성이 감소하는 경향을 보였다. 결과적으로 돈태반 효소 가수분해물 및 산 분해물 단독 처리군 보다 혼합물일 경우 ADH의 활성이 더 감소하였다. . 다만, 산 분해물을 투여한 군에서는 효소 활성이 유의하게 증가하였다 (도 9).
또한, 간 조직 내 알코올 대사효소인 ALDH의 활성도를 측정한 결과, 알코올이 투여된 음성대조군에서는 정상대조군에 비해 ALDH의 활성도가 증가하였고, 실리마린 또는 돈태반 추출물을 투여한 군에서는 효소유도작용에 의한 증가된 ALDH의 활성이 전반적으로 둔화되었다 (도 10). 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물에서는 용량 의존적으로 알코올의 효소유도작용을 억제시켰고, 돈태반 혼합물 고용량군에서 가장 뚜렷하게 ALDH의 활성이 억제되었다 (도 10). 돈태반 효소 가수분해물 및 산 분해물의 효과는 거의 유사하였다 (도 10). 이는 혼합물의 경우 단독처리군 보다 ALDH의 활성이 더 억제 되었다.
제조예 1. 건강기능식품 조성물의 제조
돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물 (1:3의 중량비로 혼합)을 증류수에 각각 100 mg/100 ml(0.1 중량%), 또는 15,000 mg/100 mL(15 중량%) 농도로 녹인 용액에, 각각 액상과당(0.5 중량%), 올리고당(2 중량%), 설탕(2 중량%), 및 식염(0.5 중량%)에 물을 추가하여 잔량을 맞춘 후, 균질하게 배합하여 순간 살균을 하여 건강기능음료를 제조하였다.
제조예 2. 약학적 조성물의 제조
돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물 (1:3의 중량비로 혼합) 1 mg을 증류수 또는 생리식염수 5 ml에 녹여 멸균하여 주사제로 제조하였다. 또는, 바이알에 동결건조 후 분말제제로 제조하였다. 돈태반 가수분해물 100mg, 옥수수 전분 100mg, 유당 100mg, 스테아린산 마그네슘 2mg을 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

Claims (7)

  1. 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 간 보호용 건강기능식품 조성물.
  2. 돈태반 효소 가수분해물과 산 분해물의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 알코올로 인한 간 손상, 약물중독 또는 숙취의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 돈태반 효소 가수분해물은 서열번호 1 내지 서열번호 3으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 서열로 이루어진 하나 이상의 펩타이드를 포함하는 것인 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 돈태반 효소 가수분해물은 단백질 가수분해효소를 처리하여 제조된 것인 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 돈태반 산 분해물은 산(acid)을 처리하여 제조된 것인 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 산(acid)는 염산, 황산, 아세트산 또는 구연산인 것인 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 돈태반 효소 가수분해물 및 산 분해물은 1:0.1~10의 중량비로 혼합된 것인 조성물.
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