WO2022265281A1 - 증숙생강 추출물 또는 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염 예방, 개선, 또는 치료용 조성물 - Google Patents

증숙생강 추출물 또는 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염 예방, 개선, 또는 치료용 조성물 Download PDF

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ginger extract
gingerdione
degenerative arthritis
steamed
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강세찬
정용준
김태우
박재현
전혜린
박대원
양윤정
김은정
김인혜
강동호
이영근
권정은
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing, improving, or treating degenerative arthritis, comprising a steamed ginger extract or 1-dehydro-6-gingerdione isolated therefrom as an active ingredient.
  • Degenerative arthritis is also called osteoarthritis, and the cartilage in the joint is continuously degraded and damaged by cytokines and cartilage degrading enzymes expressed in chondroocytes and synovial fluid through physical stimulation of the joint, resulting in damage to the joint surface. It refers to a condition in which motor function is lost and instability is induced. Osteoarthritis is the most common form of arthritis with a prevalence of about 60% in men and about 70% in women over the age of 65 years. Current treatment options for degenerative arthritis are limited and include symptomatic treatment with simple analgesics, non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) or intra-articular (IA) injectable glucocorticoid and hyaluronic acid (HA) formulations. Non-pharmacological measures range from physical exercise and weight loss to joint lavages and ultimately surgical joint replacement.
  • NSAIDs non-steroidal anti-inflammatory drugs
  • IA intra-articular injectable glucocorticoid and hyaluronic acid
  • Nonsteroidal anti-inflammatory drugs such as ibuprofen, aspirin, and indomethacin, which are widely used for the treatment of arthritis, have the advantage of quick-acting, but cause damage to the gastrointestinal tract, which limits their long-term use.
  • NSAIDs Nonsteroidal anti-inflammatory drugs
  • ginger Zingiber officinale Roscoe
  • Zingiber officinale Roscoe is a perennial tropical plant belonging to the Zingiberaceae family. There are about 47 genera and 1,400 species worldwide. is mainly cultivated in the high-temperature regions of tropical and temperate regions. In Korea, Yangha of the genus Ginger, Flower Ginger of the genus Ginger, and Yangha of the genus Flower ginger grow wild in the southern region.
  • Ginger is registered as an edible food in Korea and has been edible for a long time in the US and Europe. -paradol, 1-dehydro-6-gingerdione, and 1-dehydro-8-gingerdione.
  • rhizomes healthy
  • roots, stems, and leaves are listed in the Food Code as edible, and single toxicity (rodents and non-rodents), three types of genotoxicity (reverse mutation, chromosomal abnormality, micronucleus) test) and 13-week repeated toxicity (rodent) test were performed to confirm safety.
  • Dried rhizomes were used as medicines in oriental medicine such as Donguibogam, which was used to treat chills, fever, headache, vomiting, seawater, and phlegm caused by colds, and to treat symptoms such as stomach pain and diarrhea caused by food poisoning.
  • ginger extract is known to be active in antioxidant, brain nerve protection, and improvement of gastrointestinal discomfort
  • gingerol and shogaol the main components of ginger, are effective in metabolic syndrome such as diabetes, blood pressure and cholesterol lowering, in addition to antioxidant, anticancer, antibacterial, and neuroprotective effects. It is known that there is
  • the present inventors attempted to develop a natural product-derived functional material for the prevention, improvement, or treatment of degenerative arthritis by analyzing various physiological activities using a steamed ginger extract obtained by steaming ginger.
  • the inventors of the present invention are generally included in the process of making ginseng into red ginseng, which produces ingredients beneficial to the human body and has an absorption rate
  • the steamed ginger extract was prepared by applying a steaming process that improves and enables long-term storage to ginger, and the effect of improving the degenerative arthritis was confirmed. Based on this, the present invention was completed.
  • an object of the present invention is to provide a food composition for preventing or alleviating degenerative arthritis comprising a steamed ginger extract as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of degenerative arthritis comprising a steamed ginger extract as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a composition for preventing, improving, or treating degenerative arthritis using a steamed ginger extract.
  • the present invention is a steamed ginger extract; 1-dehydro-6-gingerdione isolated therefrom; Or it provides a food composition for preventing or improving degenerative arthritis, including a food acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention steamed ginger extract; 1-dehydro-6-gingerdione isolated therefrom; Or it provides a pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative arthritis, comprising a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the food composition may be a health functional food composition, but is not limited thereto.
  • the steamed ginger extract is water, C 1 to C 4 lower alcohol, n-hexane, ethyl acetate, acetone, acetonitrile, n-butyl acetate, 1,3-butylene glycol, methylene It may be extracted with one solvent selected from the group consisting of chloride and mixed solvents thereof, but is not limited thereto.
  • the steamed ginger extract is 1-dehydro-6-gingerdione, 6-gingerol, 8-gingerol ), 10-gingerol, 6-shogaol, 6-paradol, 8-paradol, 1-dehydro-8-ginger It may include one or more selected from the group consisting of dione (1-dehydro-8-gingerdione), food acceptable salts thereof, and pharmaceutically acceptable salts thereof, but is not limited thereto.
  • the 1-dehydro-6-gingerdione may be included in an amount of 0.001% to 10% by weight based on the dry weight of the steamed ginger extract, but is not limited thereto.
  • the composition may reduce the expression of one or more selected from the group consisting of IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , and prostaglandin E 2 (PGE 2 ), but is not limited thereto.
  • PGE 2 prostaglandin E 2
  • the composition may have cartilage tissue recovery, cartilage production, or cartilage degradation inhibitory activity, but is not limited thereto.
  • the composition may reduce the expression of I- ⁇ B or nuclear factor (NF)- ⁇ B protein, but is not limited thereto.
  • NF nuclear factor
  • the present invention steamed ginger extract; 1-dehydro-6-gingerdione isolated therefrom; Or it provides a method for treating or improving degenerative arthritis, comprising the step of administering a composition containing a pharmaceutically or food-wise acceptable salt thereof to a subject in need thereof.
  • the present invention steamed ginger extract; 1-dehydro-6-gingerdione isolated therefrom; Or it provides a use for preventing, improving, or treating degenerative arthritis of a composition containing a pharmaceutically or food-wise acceptable salt thereof.
  • the present invention steamed ginger extract; 1-dehydro-6-gingerdione isolated therefrom; Or it provides a use for the manufacture of a pharmaceutical or pharmaceutically acceptable salt thereof used for the prevention, improvement, or treatment of degenerative arthritis.
  • the present invention provides a method for preparing a composition for preventing, improving, or treating degenerative arthritis, including the steamed ginger extract, comprising the following steps:
  • the steamed ginger extract according to the present invention or 1-dehydro-6-gingerdione isolated therefrom exhibits effects of inhibiting inflammatory cytokine expression, cartilage tissue recovery, cartilage production, or cartilage degradation, and produces inflammatory cytokines and MMP It inhibits the expression of I- ⁇ B or NF- ⁇ B proteins involved in , and is expected to be usefully used in functional food compositions, pharmaceutical compositions, etc.
  • 1 is a view showing changes in 1-dehydro-6-gingerdione in a ginger extract and a steamed ginger extract according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2a is a view confirming the cytotoxicity (left figure) and NO production inhibitory effect (right figure) by the treatment of the steamed ginger extract according to one embodiment of the present invention.
  • Figure 2b is a view confirming the cytotoxicity by treatment of the active ingredients of the steamed ginger extract according to one embodiment of the present invention.
  • Figure 2c is a view confirming the change in NO production by treatment of the active ingredients of the steamed ginger extract according to one embodiment of the present invention.
  • Figure 3a is a view confirming the change in mRNA expression of IL-1 ⁇ by treatment with a steamed ginger extract and 1-dehydro-6-ginger dione according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3b is a view confirming changes in protein expression of IL-1 ⁇ by treatment with steamed ginger extract and 1-dehydro-6-ginger dione according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 schematically shows the process of inducing a degenerative arthritis animal model and administering a steamed ginger extract according to an embodiment of the present invention.
  • 5a is a micro-CT image confirming changes in cartilage tissue structure by administration of a steamed ginger extract in an animal model with degenerative arthritis according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5b is a diagram showing quantification of morphological indicators of cartilage tissue by administration of a steamed ginger extract in an animal model with degenerative arthritis according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a view confirming changes in the expression of IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , and PGE 2 in the blood of an animal model for degenerative arthritis according to an embodiment of the present invention by administration of a steamed ginger extract.
  • FIG. 7 is a diagram confirming changes in the expression of IL-1 ⁇ , IFN- ⁇ , and TNF- ⁇ in the cartilage of an animal model for degenerative arthritis according to an embodiment of the present invention by administration of a steamed ginger extract.
  • FIG. 8 is a view confirming the expression changes of TIMP1, TIMP2, MMP-9, and COL-2 in cartilage of an animal model with degenerative arthritis according to an embodiment of the present invention by administration of a steamed ginger extract.
  • FIG. 9 is a diagram confirming changes in the expression of I- ⁇ B and NF- ⁇ B proteins by administration of a steamed ginger extract in cartilage of an animal model with degenerative arthritis according to an embodiment of the present invention.
  • ginger was steamed to prepare a steamed ginger extract (see Example 1).
  • 6-shogaol, 6-gingerol, and 1-dehydro-6-gingerdione (1-dehydro-6 -gingerdione)
  • 1-dehydro-6-gingerdione 1-dehydro-6 -gingerdione
  • the steamed ginger extract reduced the expression of inflammatory cytokines in the blood or cartilage tissue of an animal model of degenerative arthritis induced by MIA (mono-iodoacetate), and inhibited cartilage tissue recovery, cartilage production, and cartilage degradation. activity, it was confirmed that the cartilage exhibits an effect of reducing the expression of I- ⁇ B and NF- ⁇ B proteins involved in the production of inflammatory cytokines and MMPs according to the progression of degenerative arthritis (see Experimental Example 2).
  • the present invention steamed ginger extract; 1-dehydro-6-gingerdione isolated therefrom; Or it provides a food composition for preventing or improving degenerative arthritis, including a food acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • steaming generally refers to a process of steaming and cooking through heat treatment, and is a method of ripening by providing moist air at a constant temperature, and is widely used to manufacture ginseng into red ginseng. Steaming is one of the heat treatment methods for the purpose of long-term storage and distribution. It has been used as one of the methods.
  • extract refers to an extract obtained by extracting the steamed ginger, a diluted or concentrated solution of the extract, a dried product obtained by drying the extract, a crude or purified product of the extract, or a mixture thereof, It includes the extract itself and extracts of all formulations that can be formed using the extract.
  • the steamed ginger extract may be in the form of dry powder, but is not limited thereto.
  • the method for extracting the steamed ginger is not particularly limited, and may be extracted according to a method commonly used in the art.
  • Non-limiting examples of the extraction method include a hot water extraction method, an ultrasonic extraction method, a filtration method, a reflux extraction method, and the like, which may be performed alone or in combination of two or more methods.
  • the type of extraction solvent used to extract the steamed ginger is not particularly limited, and according to a conventional method known in the art for extracting an extract from natural products, that is, under normal temperature and pressure conditions. It can be extracted using a common solvent.
  • the steamed ginger extract is water, C 1 to C 4 lower alcohol, n -hexane, ethyl acetate, acetone, acetonitrile, n-butyl acetate, 1,3-butylene glycol, methylene chloride, And it may be extracted with one solvent selected from the group consisting of a mixed solvent thereof, and according to an embodiment of the present invention, extraction may be performed using ethanol as a solvent, but is not limited thereto.
  • steamed ginger when steamed ginger is extracted using ethanol as a solvent, for example, 10% to 100% ethanol, 10% to 90% ethanol, 10% to 80% ethanol, 10% to 70% ethanol, 20% to 90% ethanol, 20% to 80% ethanol, 20% to 70% ethanol, 30% to 90% ethanol, 30% to 80% ethanol, 30% to 70% ethanol, 40% to 90% ethanol, 40% to 80% ethanol, 40% to 70% ethanol, 50% to 90% ethanol, 50% to 80% ethanol, 50% to 70% ethanol, 60% to 90% ethanol, 60% to 80% ethanol, 60% to 70% % ethanol, 65% to 75% ethanol, or 70% ethanol may be used, but is not limited thereto.
  • the prepared extract may then be filtered or concentrated or dried to remove the solvent, and both filtration, concentration and drying may be performed.
  • filtration may be performed using filter paper or a vacuum filter
  • concentration may be performed using a vacuum concentrator
  • drying may be performed by spray drying, freeze drying, etc., but is not limited thereto.
  • osteoarthritis Also called osteoarthritis, it is the most common joint disease.
  • the steamed ginger extract is 1-dehydro-6-gingerdione, 6-gingerol, 8-gingerol, 10- 10-gingerol, 6-shogaol, 6-paradol, 8-paradol, 1-dehydro-8-gingerdione (1 -dehydro-8-gingerdione), food acceptable salts thereof, and one or more selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable salts thereof, but is not limited thereto.
  • 1-dehydro-6-gingerdione is a compound of molecular formula C 17 H 22 O 4 , which is a kind of phenolic compound having a structure represented by Formula 1 below. , with a molecular weight of 290.4 (CAS No. 76060-35-0).
  • the 1-dehydro-6-gingerdione may be isolated from steamed ginger, but is not limited thereto, and chemically synthesized or commercially available materials may be used by methods known in the art.
  • the 1-dehydro-6-gingerdione is an indicator component of the steamed ginger extract, and its content may be 0.001% by weight or more relative to the dry weight of the steamed ginger extract, for example, 0.001% to 10% by weight.
  • marker component refers to a component determined for the purpose of quality control among chemically identified components contained in raw materials, and is a standard substance for identifying herbal medicines.
  • the term "acceptable salt in food science” includes salts derived from organic acids, inorganic acids, or bases acceptable in food science.
  • "food” means a natural product or processed product containing one or more nutrients, preferably means a state that can be eaten directly through a certain degree of processing process, and usually means As, it means to include all health functional foods, beverages, food additives and beverage additives.
  • the food composition may be a health functional food composition, but is not limited thereto.
  • the "functional food” is the same term as food for special health use (FoSHU), medicine processed to efficiently display bioregulatory functions in addition to nutritional supply, It means a food with high medical effect, and can be manufactured into tablets, capsules, pills, granules, powders, liquids, flakes, pastes, syrups, gels, jellies, bars, or film formulations.
  • “functionality” means obtaining useful effects for health purposes such as regulating nutrients for the structure and function of the human body or physiological functions.
  • the steamed ginger extract; 1-dehydro-6-ginger dione isolated therefrom; Or a food chemically acceptable salt thereof may be included as an active ingredient in a food composition for preventing or improving degenerative arthritis.
  • active ingredient is a substance or substance group whose pharmacological action, directly or indirectly, is expected to be the efficacy and effect of the preparation, and the component is 1% by weight based on the dry weight of the total composition. More than may be included, for example, 10% to 100% by weight, 20% to 100% by weight, 30% to 100% by weight, 40% to 100% by weight, 50% to 100% by weight, 60% to 60% by weight 100 wt%, 70 wt% to 100 wt%, 80 wt% to 100 wt%, 90 wt% to 100 wt%, 10 wt% to 80 wt%, 20 wt% to 80 wt%, 30 wt% to 80 wt% %, 40% to 80% by weight, 50% to 80% by weight, 60% to 80% by weight, or 70% to 80% by weight may be included, but is not limited thereto.
  • a food chemically acceptable salt thereof when used as a food additive, it may be added as it is or used together with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to conventional methods.
  • the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • a food chemically acceptable salt thereof may be added in an amount of 15% by weight or less, or 10% by weight or less based on the raw material.
  • the amount in the case of long-term intake for the purpose of health and hygiene or health control, the amount may be less than the above range, and since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in an amount greater than the above range.
  • Examples of foods to which the above substances can be added include meat, sausages, bread, chocolates, candies, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice creams, various soups, beverages, tea, drinks, There are alcoholic beverages and vitamin complexes, and includes all health functional foods in a conventional sense.
  • the health beverage composition according to the present invention may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional components, like conventional beverages.
  • the aforementioned natural carbohydrates are monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrins and cyclodextrins, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.
  • natural sweeteners such as thaumatin and stevia extract, or synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame may be used.
  • the proportion of the natural carbohydrate is generally about 0.01-0.20 g, or about 0.04-0.10 g per 100 mL of the composition of the present invention.
  • the composition of the present invention contains various nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, A carbonation agent used in carbonated beverages and the like may be contained.
  • the composition of the present invention may contain fruit flesh for preparing natural fruit juice, fruit juice beverages and vegetable beverages. These components may be used independently or in combination. The ratio of these additives is not critical, but is generally selected in the range of 0.01-0.20 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the present invention is a steamed ginger extract; 1-dehydro-6-gingerdione isolated therefrom; Or it provides a pharmaceutical composition for preventing or treating degenerative arthritis, comprising a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • salts include salts derived from inorganic acids, organic acids, or bases that are pharmaceutically acceptable.
  • the present invention provides a steamed ginger extract; 1-dehydro-6-gingerdione isolated therefrom; Or it provides a method for treating or improving degenerative arthritis, comprising the step of administering a composition containing a pharmaceutically or food-wise acceptable salt thereof to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a steamed ginger extract; 1-dehydro-6-gingerdione isolated therefrom; Or it provides a use for preventing, improving, or treating degenerative arthritis of a composition containing a pharmaceutically or food-wise acceptable salt thereof.
  • the present invention provides a steamed ginger extract; 1-dehydro-6-gingerdione isolated therefrom; Or it provides a use for the manufacture of a pharmaceutical or pharmaceutically acceptable salt thereof used for the prevention, improvement, or treatment of degenerative arthritis.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the onset of degenerative arthritis
  • treatment means that degenerative arthritis and metabolic abnormalities are improved or beneficially changed by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • Immulement means any activity that reduces the parameters related to degenerative arthritis, for example, the severity of symptoms, by administration of the composition according to the present invention.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the manufacture of pharmaceutical compositions.
  • the excipient may be, for example, one or more selected from the group consisting of a diluent, a binder, a disintegrant, a lubricant, an adsorbent, a moisturizer, a film-coating material, and a controlled release additive.
  • compositions according to the present invention are powders, granules, sustained-release granules, enteric granules, solutions, eye drops, elsilic agents, emulsions, suspensions, spirits, troches, perfumes, and limonadese, respectively, according to conventional methods.
  • tablets, sustained-release tablets, enteric tablets, sublingual tablets, hard capsules, soft capsules, sustained-release capsules, enteric capsules, pills, tinctures, soft extracts, dry extracts, fluid extracts, injections, capsules, perfusate It can be formulated and used in the form of an external agent such as a warning agent, lotion, pasta agent, spray, inhalant, patch, sterile injection solution, or aerosol, and the external agent is a cream, gel, patch, spray, ointment, warning agent , lotion, liniment, pasta, or cataplasma may have formulations such as the like.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition according to the present invention include lactose, dextrose, sucrose, oligosaccharide, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • Additives for the liquid formulation according to the present invention include water, dilute hydrochloric acid, dilute sulfuric acid, sodium citrate, sucrose monostearate, polyoxyethylene sorbitol fatty acid esters (tween esters), polyoxyethylene monoalkyl ethers, lanolin ethers, Lanolin esters, acetic acid, hydrochloric acid, aqueous ammonia, ammonium carbonate, potassium hydroxide, sodium hydroxide, prolamine, polyvinylpyrrolidone, ethyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose, and the like may be used.
  • a solution of white sugar, other sugars, or a sweetener may be used, and aromatics, coloring agents, preservatives, stabilizers, suspending agents, emulsifiers, thickeners, etc. may be used as necessary.
  • Purified water may be used in the emulsion according to the present invention, and emulsifiers, preservatives, stabilizers, fragrances, etc. may be used as needed.
  • Suspension agents according to the present invention include acacia, tragacantha, methylcellulose, carboxymethylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, microcrystalline cellulose, sodium alginate, hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910, etc. Agents may be used, and surfactants, preservatives, stabilizers, colorants, and fragrances may be used as needed.
  • Injections according to the present invention include distilled water for injection, 0.9% sodium chloride injection, IV injection, dextrose injection, dextrose + sodium chloride injection, PEG, lactated IV injection, ethanol, propylene glycol, non-volatile oil-sesame oil , solvents such as cottonseed oil, peanut oil, soybean oil, corn oil, ethyl oleate, isopropyl myristate, and benzene benzoate; solubilizing agents such as sodium benzoate, sodium salicylate, sodium acetate, urea, urethane, monoethylacetamide, butazolidine, propylene glycol, twins, nijuntinamide, hexamine, and dimethylacetamide; buffers such as weak acids and their salts (acetic acid and sodium acetate), weak bases and their salts (ammonia and ammonium acetate), organic compounds, proteins, albumin, peptone, and gums; tonicity agents such as sodium chlor
  • the suppository according to the present invention includes cacao butter, lanolin, witapsol, polyethylene glycol, glycerogelatin, methylcellulose, carboxymethylcellulose, a mixture of stearic acid and oleic acid, subanal, cottonseed oil, peanut oil, palm oil, cacao butter + Cholesterol, Lecithin, Lannet Wax, Glycerol Monostearate, Tween or Span, Imhausen, Monolen (Propylene Glycol Monostearate), Glycerin, Adeps Solidus, Buytyrum Tego-G -G), Cebes Pharma 16, Hexalide Base 95, Cotomar, Hydroxycote SP, S-70-XXA, S-70-XX75 (S-70-XX95), Hyde Hydrokote 25, Hydrokote 711, Idropostal, Massa estrarium (A, AS, B, C, D, E, I, T), Massa-MF, Masupol, Masupol-15, Neos
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations contain at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, etc. ) or by mixing lactose and gelatin.
  • excipients for example, starch, calcium carbonate, sucrose, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions for oral administration, emulsions, syrups, etc.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, aromatics, and preservatives may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, freeze-dried formulations, and suppositories.
  • Propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used as non-aqueous solvents and suspending agents.
  • composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease with a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is the type of patient's disease, severity, activity of the drug, It may be determined according to factors including sensitivity to the drug, administration time, route of administration and excretion rate, duration of treatment, drugs used concurrently, and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with the minimum amount without side effects, which can be easily determined by a person skilled in the art to which the present invention belongs.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a subject by various routes. All modes of administration can be envisaged, eg oral administration, subcutaneous injection, intraperitoneal administration, intravenous injection, intramuscular injection, paraspinal space (intrathecal) injection, sublingual administration, buccal administration, intrarectal insertion, vaginal It can be administered by intraoral insertion, ocular administration, otic administration, nasal administration, inhalation, spraying through the mouth or nose, dermal administration, transdermal administration, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the type of drug as an active ingredient together with various related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the age, sex, weight and severity of the disease of the patient.
  • steamed ginger extract; 1-dehydro-6-gingerdione isolated therefrom; food-acceptable salts thereof; or a pharmaceutically acceptable salt thereof is 200 to 600 mg, 250 to 600 mg, 300 to 600 mg, 350 to 600 mg, 400 to 600 mg, 450 to 600 mg, 200 to 550 mg, 200 to 500 mg per day , 250 to 550 mg, 250 to 500 mg, 300 to 550 mg, 300 to 500 mg, 350 to 550 mg, 350 to 500 mg, 400 to 550 mg, 400 to 500 mg, 450 to 550 mg, 450 to 500 mg , or at a dose of 480 mg, 6 to 18 weeks, 6 to 16 weeks, 6 to 14 weeks, 8 to 18 weeks, 8 to 16 weeks, 8 to 14 weeks, 10 to 18 weeks, 10 to 16 weeks, 10 to 10 weeks It may be administered to a subject for 14 weeks or 12 weeks, but is not limited thereto.
  • “individual” means a subject in need of treatment of a disease, and more specifically, a human or non-human primate, mouse, rat, dog, cat, horse, and cow mammals such as
  • administration means providing a given composition of the present invention to a subject by any suitable method.
  • the present invention provides a method for preparing a composition for preventing, improving, or treating degenerative arthritis, including the steamed ginger extract, comprising the following steps:
  • the steaming in step (a) is performed at 85 to 105 ° C, 90 to 105 ° C, 95 to 100 ° C, or 97 ° C for 1 to 3 hours, 1 to 2.5 hours, 1.5 to 3 hours, 1.5 to 1.5 hours. It may be performed for 2.5 hours or 2 hours, but is not limited thereto.
  • the drying in step (b) may be carried out for 30 hours or more, for example, 30 to 50 hours at 40 to 60 °C, 45 to 60 °C, 45 to 55 °C, or 50 °C, 30 to 45 °C hour, 30 to 40 hours, or 30 to 35 hours, but is not limited thereto.
  • the extraction in step (c) is 75 to 95 °C, 75 to 90 °C, 80 to 95 °C, 80 to 90 °C, or 85 °C 10 to 20 hours, 10 to 17 hours, 12 to It may be performed for 20 hours, 12 to 17 hours, or 15 hours, but is not limited thereto.
  • the concentration under reduced pressure in step (d) may be performed at a temperature of 65 ° C or less, for example, 10 to 65 ° C, 20 to 65 ° C, 30 to 65 ° C, 40 to 65 ° C, 50 to 65 ° C °C, or 60 to 65 °C, and may be concentrated under reduced pressure to 20 brix or more, such as 20 to 100 brix, 20 to 80 brix, 20 to 60 brix, or 20 to 40 brix, but is not limited thereto. .
  • the steamed ginger extract and carbohydrates are mixed in a ratio of 1:0.5 to 2, 1:0.5 to 1.5, 1:0.5 to 1, 1:1 to 2 , 1: 1 to 1.5, or may further include mixing at a dry weight ratio of 1: 1, and according to one embodiment of the present invention, the carbohydrate may be dextrin, but is not limited thereto.
  • the step (e) is to heat the mixture of the steamed ginger extract and carbohydrates at 80 to 100 ° C, 85 to 100 ° C, 80 to 95 ° C, 85 to 95 ° C, or 90 ° C for 10 to 20 minutes, 10 to 100 ° C.
  • a step of sterilizing for 17 minutes, 12 to 17 minutes, or 15 minutes may be further included, but is not limited thereto.
  • the spray drying in step (e) has an inlet temperature of 180 to 200 ° C, 180 to 195 ° C, 185 to 200 ° C, 185 to 195 ° C, or 190 ° C, an outlet temperature It may be carried out in a dryer at 80 to 100 °C, 80 to 95 °C, 85 to 100 °C, 85 to 95 °C, or 90 °C, but is not limited thereto.
  • Fresh ginger was purchased and its rhizome was used, and after washing with purified water for 5 to 7 minutes, the washed ginger was put into a steamer and steamed at 97 ° C. for 2 hours. Then, the steamed ginger was put in a dryer and dried at 50 ° C. for 30 hours or more to prepare steamed ginger.
  • Example 1-1 70% alcohol (ethanol) was added 15 times to the raw material of steamed ginger prepared in Example 1-1, and extracted at 85 ° C. for 15 hours. Then, after filtering, the mixture was concentrated under reduced pressure to a concentration of 20 brix or higher at a low temperature of 65 °C or less, and filtered again. Then, the steamed ginger concentrate was mixed with dextrin, sterilized at 90 ° C for 15 minutes, and then spray-dried in a dryer with an inlet temperature of 190 ° C and an outlet temperature of 90 ° C to prepare a steamed ginger extract powder.
  • ethanol 70% alcohol
  • Samples were prepared by dissolving the steamed ginger extract and ginger extract in 80% methanol to prepare a 10,000 ppm solution, and then purifying with a 0.22 ⁇ m membrane filter (Woongki Science Co., Ltd., Seoul, Korea).
  • HPLC used for analysis was Agilent Technologies 1260 series, and Cadenza CD-C18 (3 ⁇ m, 250 ⁇ 4.6 mm) was used as an analytical column.
  • the measurement wavelength was 370 nm
  • the sample injection amount was 10 ⁇ L
  • the solvent elution rate was 0.4 mL/min
  • water containing 0.1% formic acid (A) and acetonitrile were used as analysis solvents.
  • (B) was used, and observation was performed for 60 minutes by changing the composition of the solvent as follows.
  • 1-dehydro-6-gingerdione was set as the indicator component.
  • 1-dehydro-6-gingerdione which is an indicator component in steamed ginger
  • a calibration curve was prepared using a standard product, and based on the prepared calibration curve, 1-dehydro-6- It was confirmed that 1.18 mg/g of ginger dione was contained.
  • the 1-dehydro-6-gingerdione content of the ginger extract was 0.54 mg/g.
  • GE ginger extract
  • GGE steamed ginger extract
  • active ingredients of steamed ginger were used to confirm cell viability and NO production inhibitory effect.
  • MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Viable cells are measured for absorbance by converting MTT to formazan, and RAW 264.7 cells are inoculated in a 96-well plate at a concentration of 1 ⁇ 10 4 cells/well, then 37 °C, 5% CO It was cultured for 24 hours in an incubator under 2 conditions, and treated with ginger extract (GE) and steamed ginger extract (GGE) at concentrations of 25, 50, 100, and 200 ⁇ g/mL, and the active ingredients of steamed ginger were 1.3, 2.5, and 5 , 10, and 20 ⁇ g/mL concentrations, and incubated for 24 hours, then 10 ⁇ L of 5 mg/mL MTT solution was added and cultured for 2 hours. Then, the medium supernatant was removed, dissolved in 100 ⁇ L of DMSO, and absorbance was measured at 540 nm.
  • RAW 264.7 cells were inoculated into a 96-well plate at a concentration of 1 ⁇ 10 4 cells/well, then cultured in an incubator at 37° C. and 5% CO 2 for 24 hours, and inflammation was induced.
  • LPS lipopolysaccharide
  • steamed ginger extract was treated at concentrations of 25, 50, 100, and 200 ⁇ g/mL
  • active ingredients of steamed ginger were treated at 1.3, 2.5, and 5 , 10, 20 ⁇ g / mL concentration, incubated for 24 hours, transferred 50 ⁇ L of the supernatant to a new 96-well plate, added 50 ⁇ L of Griess reagent, and reacted at room temperature for 20 minutes
  • Absorbance was measured at 450 nm.
  • IL-1 ⁇ interleukin-1beta
  • GGE steamed ginger extract
  • 6-GD 1-dehydro-6-gingerdione
  • RAW 264.7 cells were inoculated in a 6-well-plate at 1 ⁇ 10 4 cells/well, pretreated with LPS at a concentration of 1 ⁇ g/mL for 2 hours, and steamed ginger extract was prepared by concentration (50, 100, 200 ⁇ g/mL). mL) for 24 hours.
  • Total RNA was extracted using TRIzol solution, RNA was quantified through Nanodrop, and the same amount of RNA was synthesized into cDNA using a cDNA synthesis kit (Takara, Japan), followed by qRT-PCR (quantitative real time-PCR). proceeded.
  • interleukin-1 beta the protein was extracted using RIPA buffer, and the same amount of protein was electrophoresed with 12% SDS-PAGE and then transferred to a nitrocellulose membrane. transferred. After that, blocking was performed with 5% skim milk at room temperature for 1 hour, and then the primary antibody against IL-1 ⁇ (Invirogen, USA) was reacted at 4 ° C for one day, and enzymes and radioactive materials , or a secondary antibody (HPR-conjugated rabbit, Cell Signaling, USA) attached with a fluorescent substance or the like was reacted at room temperature for 1 hour. After 1 hour, proteins were detected with Lumi-Pico reagent.
  • FIGS. 3a and 3b mRNA (FIG. 3a) and protein (FIG. 3b) expression of IL-1 ⁇ , an inflammatory cytokine, was increased by treatment with steamed ginger extract or 1-dehydro-6-gingerdione. confirmed to decrease.
  • MIA mono-iodoacetate
  • ginger extract 200 mg/kg
  • steamed ginger extract 50, 100, 200 mg/kg
  • celecoxib 10 mg/kg, celecoxib
  • PC positive control group
  • FIG. 4 The process of inducing the degenerative arthritis animal model and administering the steamed ginger extract as described above is shown schematically in FIG. 4 .
  • ginger extract and steamed ginger extract were administered to animals with MIA-induced degenerative arthritis for 6 weeks, and blood was collected from the abdominal vein after fasting before autopsy, and serum was separated by centrifugation at 4 ° C. and 12,000 rpm for 15 minutes.
  • serum was separated by centrifugation at 4 ° C. and 12,000 rpm for 15 minutes.
  • the contents of IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ , and PGE 2 were measured after reacting according to the manufacturer's experimental method with the items configured in the kit (R&D system, USA).
  • MMPs Mestrix metalloproteinases
  • TIMP tissue inhibitor of metalloproteinases
  • COL COL involved in the generation of cartilage tissue Expression of -2 (collagen type II was confirmed.
  • RNA was extracted from cartilage tissues of experimental animals using TRIzol reagent in the same manner as in Experimental Examples 2-4, and Nanodrop was used. After RNA was quantified through the quantification, the same amount of RNA was synthesized into cDNA using a cDNA synthesis kit (Takara, Japan), and then gene expression was confirmed using qRT-PCR.
  • the steamed ginger extract according to the present invention exhibits cartilage degradation inhibitory and cartilage production effects in degenerative arthritis.
  • I- ⁇ B and NF- ⁇ B proteins involved in the production of inflammatory cytokines and MMPs was confirmed in the cartilage of the MIA-induced osteoarthritis animal model according to the progression of degenerative arthritis.
  • proteins were extracted from the cartilage tissue of experimental animals using RIPA buffer, and the same amount of protein was electrophoresed with 12% SDS-PAGE and then transferred to a nitrocellulose membrane. transferred to. After that, blocking was performed with 5% skim milk at room temperature for 1 hour, and then phospho-I ⁇ B (Santa Cruz, USA), I ⁇ B (Santa Cruz, USA), phospho-NF- ⁇ B (Cell Signaling, USA), and primary antibodies against NF- ⁇ B (Cell Signaling, USA) were reacted at 4 ° C for one day, and secondary antibodies (HPR-conjugated rabbit or mouse, Cell Signaling, USA) was reacted at room temperature for 1 hour. After 1 hour, proteins were detected and quantified with Lumi-Pico reagent.
  • the steamed ginger extract according to the present invention or 1-dehydro-6-gingerdione isolated therefrom is expected to be usefully used in functional food compositions, pharmaceutical compositions, etc. for preventing, improving, or treating degenerative arthritis , has industrial applicability.

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Abstract

본 발명은 증숙생강 추출물 또는 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염 예방, 개선, 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 증숙생강 추출물 또는 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온은 염증성 사이토카인 발현 억제, 연골 조직 회복, 연골 생성, 또는 연골 분해 억제 효과를 나타내며, 염증성 사이토카인 및 MMP 생성에 관여하는 I-κB 또는 NF-κB 단백질의 발현을 억제하는 바, 퇴행성 관절염을 예방, 개선, 또는 치료하기 위한 기능성 식품 조성물, 약학적 조성물 등에 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

Description

증숙생강 추출물 또는 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염 예방, 개선, 또는 치료용 조성물
본 발명은 증숙생강 추출물 또는 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염 예방, 개선, 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 출원은 2021년 06월 15일에 출원된 한국특허출원 제10-2021-0077699호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
퇴행성 관절염은 골관절염이라고도 하며, 관절 부위의 물리적 자극을 통하여 콘드로사이트(chondrocyte)와 관절막(synovial fluid)에서 발현되는 사이토카인과 연골 분해 효소에 의해 관절 내 연골이 지속적으로 분해, 손상되어 관절면의 운동기능이 소실되고 불안정성이 유발되는 상태를 칭한다. 퇴행성 관절염은 65세 이상의 연령에서의 유병률이 남성에서 약 60%이고 여성에서 약 70%인 가장 일반적인 형태의 관절염이다. 퇴행성 관절염을 위한 현재의 치료 선택지는 제한적이며, 이들은 단순 진통제, 비스테로이드성 항염증 약물(NSAID) 또는 관절내(IA) 주사 글루코코르티코이드 및 하이알루론산(HA) 제제에 의한 대증적 치료를 포함한다. 비약리학적 척도는 신체 운동 및 체중 손실부터 관절 세척액, 및 궁극적으로는 외과적 관절 대체에 이르기까지의 범위이다.
관절염 치료에 많이 사용하는 이부프로펜, 아스피린, 인도메타신 등의 비스테로이드성 소염진통제(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)는 속효성의 장점은 있으나 위장관 손상을 유발하여 장기간 사용에 제약이 있다. 또한, 관절 건강과 관련한 개별인정형 및 고시형 소재는 22개이고 대부분 중국, 인도 등 해외에서 원재료를 수입하거나 해외에서 개발된 소재를 수입해서 판매하고 있으며 국내산 원재료를 활용한 관절 건강 기능성 소재 개발이 필요한 실정이다.
한편, 생강(Zingiber officinale Roscoe)은 생강과에 속하는 여러해살이 열대식물로, 전 세계에 약 47속 1,400여 종이 있고, 주로 인도와 말레이군도 등 열대에 분포하고 고대부터 아시아의 따뜻한 지역에서 재배되었으나 현재는 주로 열대와 온대 지역의 고온지대에서 재배되고 국내는 생강속의 양하, 꽃생강속의 꽃생강, 꽃양하속의 꽃양하가 남부지방에 자생하고 있다.
생강은 국내에 식용 가능한 식품으로 등재되어 있고 미국, 유럽 등의 해외에서도 오래전부터 식용해온 소재로서, 주요성분으로는 6-gingerol, 8-gingerol, 10-gingerol, 6-shogaol, 6-paradol, 8-paradol, 1-dehydro-6-gingerdione, 및 1-dehydro-8-gingerdione 등이 있다. 식품원료로는 뿌리줄기(건강), 뿌리, 줄기, 잎을 식용 가능함이 식품공전에 등재되어 있으며, GLP 기관에서 단회독성(설치류 및 비설치류), 유전독성 3종(복귀돌연변이, 염색체이상, 소핵시험) 및 13주 반복독성(설치류) 시험을 수행하여 안전성을 확인한 바 있다.
동의보감 등 한방에서 뿌리줄기 말린 것을 약재로 사용하였으며, 이는 감기로 인한 오한, 발열, 두통, 구토, 해수, 가래를 치료하고, 식중독으로 인한 복통, 설사 등의 증상에 음용되었다. 또한, 생강 추출물은 항산화, 뇌신경 보호, 위장관 불편함 개선 등에 대한 활성이 알려져 있으며, 생강의 주성분인 gingerol 및 shogaol은 항산화, 항암, 항균, 신경보호 효능 외에 당뇨, 혈압 및 콜레스테롤 저하 등 대사증후군에 효과가 있음이 알려져 있다.
본 발명자들은 생강을 증숙시켜 얻은 증숙생강 추출물을 이용하여 여러 가지 생리활성을 분석함으로써, 퇴행성 관절염 예방, 개선, 또는 치료에 대한 천연물 유래 기능성 소재로서의 개발을 시도하였다.
본 발명자들은 기존 관절염 치료제의 부작용을 개선하고, 뛰어난 퇴행성 관절염 개선 효과를 나타내는 소재의 개발을 위해 연구한 결과, 일반적으로 인삼을 홍삼으로 만드는 과정에 포함되는 방법으로서, 인체에 유익한 성분을 생성하고 흡수율을 개선하며 장기간 보존이 가능하도록 하는 증숙 과정을 생강에 적용하여, 증숙생강 추출물을 제조하고 이의 퇴행성 관절염 개선 효과를 확인하였는 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 증숙생강 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 증숙생강 추출물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 증숙생강 추출물을 이용한 퇴행성 관절염 예방, 개선, 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 증숙생강 추출물; 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온(1-dehydro-6-gingerdione); 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 증숙생강 추출물; 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온(1-dehydro-6-gingerdione); 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 식품 조성물은 건강기능성 식품 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 증숙생강 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급알코올, n-헥산, 에틸아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴, n-부틸아세테이트, 1,3-부틸렌 글리콜, 메틸렌클로라이드, 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 용매로 추출되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 증숙생강 추출물은 1-데하이드로-6-진저다이온(1-dehydro-6-gingerdione), 6-진저롤(6-gingerol), 8-진저롤(8-gingerol), 10-진저롤(10-gingerol), 6-쇼가올(6-shogaol), 6-파라돌(6-paradol), 8-파라돌(8-paradol), 1-데하이드로-8-진저다이온(1-dehydro-8-gingerdione), 이들의 식품학적으로 허용 가능한 염, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 1-데하이드로-6-진저다이온은 증숙생강 추출물의 건조중량 대비 0.001 중량% 내지 10 중량%의 용량으로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 IL-1β, TNF-α, IFN-γ, 및 프로스타글란딘 E2(PGE2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 발현을 감소시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 연골 조직 회복, 연골 생성, 또는 연골 분해 억제 활성을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조성물은 I-κB 또는 핵 인자(NF)-κB 단백질의 발현을 감소시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 증숙생강 추출물; 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온(1-dehydro-6-gingerdione); 또는 이의 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 퇴행성 관절염 치료 또는 개선 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 증숙생강 추출물; 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온(1-dehydro-6-gingerdione); 또는 이의 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물의 퇴행성 관절염 예방, 개선, 또는 치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 증숙생강 추출물; 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온(1-dehydro-6-gingerdione); 또는 이의 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 염의 퇴행성 관절염 예방, 개선, 또는 치료에 이용되는 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 증숙생강 추출물을 포함하는 퇴행성 관절염 예방, 개선, 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다:
(a) 생강을 세척하고 85 내지 105 ℃에서 1 내지 3시간 동안 증숙시키는 단계;
(b) 증숙된 생강을 40 내지 60 ℃에서 30 내지 50시간 건조하는 단계;
(c) 상기 건조시킨 증숙생강을 용매에 넣고 75 내지 95 ℃에서 10 내지 20시간 동안 추출하는 단계;
(d) 상기 추출한 증숙생강을 여과하고 10 내지 65 ℃의 온도에서 감압농축하는 단계; 및
(e) 상기 감압농축한 증숙생강 추출물을 여과하고 분무건조 하여 증숙생강 추출 분말을 제조하는 단계.
본 발명에 따른 증숙생강 추출물 또는 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온은 염증성 사이토카인 발현 억제, 연골 조직 회복, 연골 생성, 또는 연골 분해 억제 효과를 나타내며, 염증성 사이토카인 및 MMP 생성에 관여하는 I-κB 또는 NF-κB 단백질의 발현을 억제하는 바, 퇴행성 관절염을 예방, 개선, 또는 치료하기 위한 기능성 식품 조성물, 약학적 조성물 등에 유용하게 이용될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 생강 추출물과 증숙생강 추출물의 1-데하이드로-6-진저다이온의 변화를 나타낸 도면이다.
도 2a는 본 발명의 일 구현예에 따른 증숙생강 추출물의 처리에 의한 세포독성(좌측 도면) 및 NO 생성 억제 효과(우측 도면)를 확인한 도면이다.
도 2b는 본 발명의 일 구현예에 따른 증숙생강 추출물의 유효성분들의 처리에 의한 세포독성을 확인한 도면이다.
도 2c는 본 발명의 일 구현예에 따른 증숙생강 추출물의 유효성분들의 처리에 의한 NO 생성 변화를 확인한 도면이다.
도 3a는 본 발명의 일 구현예에 따른 증숙생강 추출물 및 1-데하이드로-6-진저다이온 처리에 의한 IL-1β의 mRNA 발현 변화를 확인한 도면이다.
도 3b는 본 발명의 일 구현예에 따른 증숙생강 추출물 및 1-데하이드로-6-진저다이온 처리에 의한 IL-1β의 단백질 발현 변화를 확인한 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 퇴행성 관절염 동물 모델 유도 및 증숙생강 추출물 투여 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 5a는 본 발명의 일 구현예에 따른 퇴행성 관절염 동물 모델에서 증숙생강 추출물의 투여에 의한 연골 조직 구조 변화를 Micro-CT 이미지로 확인한 도면이다.
도 5b는 본 발명의 일 구현예에 따른 퇴행성 관절염 동물 모델에서 증숙생강 추출물의 투여에 의한 연골 조직의 형태학적 지표를 정량화하여 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 퇴행성 관절염 동물 모델의 혈액에서 증숙생강 추출물의 투여에 의한 IL-1β, TNF-α, 및 PGE2의 발현 변화를 확인한 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 퇴행성 관절염 동물 모델의 연골에서 증숙생강 추출물의 투여에 의한 IL-1β, IFN-γ, 및 TNF-α의 발현 변화를 확인한 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 구현예에 따른 퇴행성 관절염 동물 모델의 연골에서 증숙생강 추출물의 투여에 의한 TIMP1, TIMP2, MMP-9, 및 COL-2의 발현 변화를 확인한 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 구현예에 따른 퇴행성 관절염 동물 모델의 연골에서 증숙생강 추출물의 투여에 의한 I-κB 및 NF-κB 단백질의 발현 변화를 확인한 도면이다.
본 발명의 일 실시예에서는 생강을 증숙 처리하여 증숙생강 추출물을 제조하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는 증숙생강 추출물로부터 분리된 6-쇼가올(6-shogaol), 6-진저롤(6-gingerol), 및 1-데하이드로-6-진저다이온(1-dehydro-6-gingerdione) 중 특히 1-데하이드로-6-진저다이온의 함량이 생강 추출물에 비해 크게 증가함을 확인하여, 1-데하이드로-6-진저다이온을 지표성분으로 설정하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 일 실험예에서는 in vitro 상에서 증숙생강 추출물 및 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온이 낮은 세포독성을 나타내고, 높은 NO 생성 및 IL-1β발현 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다(실험예 1 참조).
본 발명의 다른 실험예에서는 MIA(Mono-iodoacetate)로 유도한 퇴행성 관절염 동물 모델의 혈액 또는 연골 조직에서 증숙생강 추출물이 염증성 사이토카인의 발현을 감소시키고, 연골 조직 회복, 연골 생성, 및 연골 분해 억제 활성을 나타내며, 연골에서 퇴행성 관절염 진행에 따라 염증성 사이토카인 및 MMP 생성에 관여하는 I-κB 및 NF-κB 단백질의 발현을 감소시키는 효과를 나타내는 것을 확인하였다(실험예 2 참조).
이에, 본 발명은 증숙생강 추출물; 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온(1-dehydro-6-gingerdione); 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, “증숙”이란 일반적으로 열 처리를 통하여 쪄서 익히는 과정을 말하는 것으로서, 일정한 온도에서 습열한 공기를 제공하여 숙성하는 방법으로, 인삼을 홍삼으로 제조하는 데에 많이 사용되고 있다. 증숙은 장기보관 및 유통을 목적으로 하는 가열처리 방법 중 하나로, 한방에서는 수치(修治)라 하여 한약재의 가열처리를 통해 독성을 낮추고 부작용을 최소화하여 치료효과를 높이며, 가공이나 절편에 편리하게 사용하고자 하는 방법의 하나로 사용하여 왔다.
본 발명에 있어서, “추출물”은 상기 증숙생강의 추출처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 증숙생강 추출물은 건조 분말 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 증숙생강의 추출물에 있어서, 상기 증숙생강을 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2 종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 증숙생강을 추출하는 데에 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 천연물로부터 추출물을 추출하는 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도, 압력의 조건 하에서 통상적인 용매를 사용하여 추출할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 있어서 상기 증숙생강 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급알코올, n-헥산, 에틸아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴, n-부틸아세테이트, 1,3-부틸렌 글리콜, 메틸렌클로라이드, 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 용매로 추출될 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면 에탄올을 용매로 사용하여 추출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 에탄올을 용매로 사용하여 증숙생강을 추출할 경우, 예컨대 10 % 내지 100 % 에탄올, 10 % 내지 90 % 에탄올, 10 % 내지 80 % 에탄올, 10 % 내지 70 % 에탄올, 20 % 내지 90 % 에탄올, 20 % 내지 80 % 에탄올, 20 % 내지 70 % 에탄올, 30 % 내지 90 % 에탄올, 30 % 내지 80 % 에탄올, 30 % 내지 70 % 에탄올, 40 % 내지 90 % 에탄올, 40 % 내지 80 % 에탄올, 40 % 내지 70 % 에탄올, 50 % 내지 90 % 에탄올, 50 % 내지 80 % 에탄올, 50 % 내지 70 % 에탄올, 60 % 내지 90 % 에탄올, 60 % 내지 80 % 에탄올, 60 % 내지 70 % 에탄올, 65 % 내지 75 % 에탄올, 또는 70 % 에탄올을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 제조된 추출물은 이후 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 예컨대, 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 농축은 감압 농축기, 건조는 분무건조, 동결건조법 등을 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, “퇴행성 관절염”이란 뼈의 관절면을 감싸고 있는 관절 연골이 마모되어 연골 밑의 뼈가 노출되고, 관절 주변의 활액막에 염증이 생겨서 통증과 변형이 발생하는 질환이며, 흔히 골관절염(osteoarthritis)이라고도 불리우며 관절 질환 중에서 가장 많이 발생하는 질환이다.
본 발명에 있어서, 상기 증숙생강 추출물은 1-데하이드로-6-진저다이온(1-dehydro-6-gingerdione), 6-진저롤(6-gingerol), 8-진저롤(8-gingerol), 10-진저롤(10-gingerol), 6-쇼가올(6-shogaol), 6-파라돌(6-paradol), 8-파라돌(8-paradol), 1-데하이드로-8-진저다이온(1-dehydro-8-gingerdione), 이들의 식품학적으로 허용 가능한 염, 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, “1-데하이드로-6-진저다이온(1-dehydro-6-gingerdione)”은 분자식 C17H22O4의 화합물로서, 하기 화학식 1의 구조를 갖는 페놀화합물의 일종이며, 분자량은 290.4이다(CAS No. 76060-35-0). 본 발명에 있어서, 상기 1-데하이드로-6-진저다이온은 증숙생강으로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 당업계에 공지된 방법으로 화학적으로 합성하거나 시판되는 물질을 사용할 수 있다.
[화학식 1]
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본 발명에 있어서, 상기 1-데하이드로-6-진저다이온은 증숙생강 추출물의 지표성분으로서, 이의 함량은 증숙생강 추출물의 건조중량 대비 0.001 중량% 이상일 수 있고, 예컨대 0.001 중량% 내지 10 중량%, 0.001 중량% 내지 5 중량%, 0.001 중량% 내지 3 중량%, 0.001 중량% 내지 1 중량%, 0.001 중량% 내지 0.5 중량%, 0.001 중량% 내지 0.3 중량%, 0.005 중량% 내지 10 중량%, 0.005 중량% 내지 5 중량%, 0.005 중량% 내지 3 중량%, 0.005 중량% 내지 1 중량%, 0.005 중량% 내지 0.5 중량%, 0.005 중량% 내지 0.3 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.01 중량% 내지 3 중량%, 0.01 중량% 내지 1 중량%, 0.01 중량% 내지 0.5 중량%, 0.01 중량% 내지 0.3 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 0.1 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 3 중량%, 0.1 중량% 내지 1 중량%, 0.1 중량% 내지 0.5 중량%, 0.1 중량% 내지 0.2 중량%, 0.1 중량% 내지 0.15중량%, 또는 0.118 중량%의 용량으로 증숙생강 추출물에 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, "지표성분"이란 원료 중에 함유되어 있는 화학적으로 규명된 성분 중에서 품질관리의 목적으로 정한 성분을 말하며, 생약을 확인하는데 기준이 되는 물질이다.
본 발명에 있어서, “식품학적으로 허용 가능한 염”이란 식품학적으로 허용되는 유기산, 무기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다.
본 발명에 있어서, “식품”이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 건강기능성 식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제 등을 모두 포함하는 의미이다.
본 발명에 있어서, 상기 식품 조성물은 건강기능성 식품 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 “건강기능성 식품(functional food)”이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미하며, 정제, 캡슐제, 환제, 과립제, 분말, 액제, 편상(flake), 페이스트, 시럽제, 겔, 젤리, 바(bar), 또는 필름 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 증숙생강 추출물; 이로부터 분리한 1-데하이드로-6-진저다이온; 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염은 퇴행성 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물에 유효성분으로 포함될 수 있다.
본 발명에 있어서, “유효성분”은 직접 또는 간접으로 그 성분 자체가 가지고 있는 약리작용이 제제의 효능·효과로 기대되는 물질 또는 물질군으로서, 그 성분이 전체 조성물의 건조중량에 대하여 1 중량% 이상 포함될 수 있으며, 예컨대 10 중량% 내지 100 중량%, 20 중량% 내지 100 중량%, 30 중량% 내지 100 중량%, 40 중량% 내지 100 중량%, 50 중량% 내지 100 중량%, 60 중량% 내지 100 중량%, 70 중량% 내지 100 중량%, 80 중량% 내지 100 중량%, 90 중량% 내지 100 중량%, 10 중량% 내지 80 중량%, 20 중량% 내지 80 중량%, 30 중량% 내지 80 중량%, 40 중량% 내지 80 중량%, 50 중량% 내지 80 중량%, 60 중량% 내지 80 중량%, 또는 70 중량% 내지 80 중량% 포함되어 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 증숙생강 추출물; 이로부터 분리한 1-데하이드로-6-진저다이온; 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 식품 첨가물로 사용할 경우, 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 증숙생강 추출물; 이로부터 분리한 1-데하이드로-6-진저다이온; 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 mL당 일반적으로 약 0.01-0.20g, 또는 약 0.04-0.10g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 증숙생강 추출물; 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온(1-dehydro-6-gingerdione); 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, “약학적으로 허용 가능한 염”이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 증숙생강 추출물; 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온(1-dehydro-6-gingerdione); 또는 이의 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 퇴행성 관절염 치료 또는 개선 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 증숙생강 추출물; 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온(1-dehydro-6-gingerdione); 또는 이의 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물의 퇴행성 관절염 예방, 개선, 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 증숙생강 추출물; 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온(1-dehydro-6-gingerdione); 또는 이의 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 염의 퇴행성 관절염 예방, 개선, 또는 치료에 이용되는 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.
본 발명에서 “예방”이란 퇴행성 관절염의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 퇴행성 관절염과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 퇴행성 관절염과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는 에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO3) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na2S2O5), 아황산나트륨(Na2SO3), 질소가스(N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16(Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈(Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입(AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈(N, Es), 웨코비(W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제(TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명에 있어서, 증숙생강 추출물; 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온(1-dehydro-6-gingerdione); 이의 식품학적으로 허용 가능한 염; 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 하루에 200 내지 600 mg, 250 내지 600 mg, 300 내지 600 mg, 350 내지 600 mg, 400 내지 600 mg, 450 내지 600 mg, 200 내지 550 mg, 200 내지 500 mg, 250 내지 550 mg, 250 내지 500 mg, 300 내지 550 mg, 300 내지 500 mg, 350 내지 550 mg, 350 내지 500 mg, 400 내지 550 mg, 400 내지 500 mg, 450 내지 550 mg, 450 내지 500 mg, 또는 480 mg의 용량으로, 6 내지 18주, 6 내지 16주, 6 내지 14주, 8 내지 18주, 8 내지 16주, 8 내지 14주, 10 내지 18주, 10 내지 16주, 10 내지 14주, 또는 12주 동안 개체에 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에 있어서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 증숙생강 추출물을 포함하는 퇴행성 관절염 예방, 개선, 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다:
(a) 생강을 세척하고 85 내지 105 ℃에서 1 내지 3시간 동안 증숙시키는 단계;
(b) 증숙된 생강을 40 내지 60 ℃에서 30 내지 50시간 건조하는 단계;
(c) 상기 건조시킨 증숙생강을 용매에 넣고 75 내지 95 ℃에서 10 내지 20시간 동안 추출하는 단계;
(d) 상기 추출한 증숙생강을 여과하고 10 내지 65 ℃의 온도에서 감압농축하는 단계; 및
(e) 상기 감압농축한 증숙생강 추출물을 여과하고 분무건조 하여 증숙생강 추출 분말을 제조하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계에서의 증숙은 85 내지 105 ℃, 90 내지 105 ℃, 95 내지 100 ℃, 또는 97 ℃에서 1 내지 3시간, 1 내지 2.5시간, 1.5 내지 3시간, 1.5 내지 2.5시간, 또는 2시간 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계에서의 건조는 30시간 이상 수행할 수 있으며, 예컨대 40 내지 60 ℃, 45 내지 60 ℃, 45 내지 55 ℃, 또는 50 ℃에서 30 내지 50시간, 30 내지 45시간, 30 내지 40시간, 또는 30 내지 35시간 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서의 추출은 75 내지 95 ℃, 75 내지 90 ℃, 80 내지 95 ℃, 80 내지 90 ℃, 또는 85 ℃에서 10 내지 20시간, 10 내지 17시간, 12 내지 20시간, 12 내지 17시간, 또는 15시간 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계에서의 감압농축은 65 ℃ 이하의 온도에서 수행될 수 있으며, 예컨대 10 내지 65 ℃, 20 내지 65 ℃, 30 내지 65 ℃, 40 내지 65 ℃, 50 내지 65 ℃, 또는 60 내지 65 ℃에서 수행될 수 있고, 20 brix 이상, 예컨대 20 내지 100 brix, 20 내지 80 brix, 20 내지 60 brix, 또는 20 내지 40 brix가 되도록 감압농축할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계는 감압농축한 증숙생강 추출물을 여과한 후에 증숙생강 추출물 및 탄수화물을 1:0.5 내지 2, 1:0.5 내지 1.5, 1:0.5 내지 1, 1:1 내지 2, 1:1 내지 1.5, 또는 1:1의 건조중량비로 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 탄수화물은 덱스트린일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계는 증숙생강 추출물 및 탄수화물의 혼합물을 80 내지 100 ℃, 85 내지 100 ℃, 80 내지 95 ℃, 85 내지 95 ℃, 또는 90 ℃에서 10 내지 20분, 10 내지 17분, 12 내지 17분, 또는 15분 동안 살균하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 (e) 단계에서 분무건조는 입구(inlet) 온도가 180 내지 200 ℃, 180 내지 195 ℃, 185 내지 200 ℃, 185 내지 195 ℃, 또는 190 ℃, 출구(outlet) 온도가 80 내지 100 ℃, 80 내지 95 ℃, 85 내지 100 ℃, 85 내지 95 ℃, 또는 90 ℃인 건조기에서 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 증숙생강 추출물 제조
1-1. 증숙생강 제조
생생강을 구입하여 이의 뿌리줄기 부위를 사용하였으며, 정제수로 5~7분 동안 세척한 후, 세척된 생강을 증숙기에 넣고 97 ℃에서 2시간 동안 증숙시켰다. 그런 다음, 증숙된 생강을 건조기에 넣고 50 ℃에서 30시간 이상 건조하여 증숙생강을 제조하였다.
1-2. 증숙생강 추출물 제조
상기 실시예 1-1에서 제조한 증숙생강 원재료에 70 % 주정(에탄올)을 15배 가하여 85 ℃에서 15시간 추출하였다. 그런 다음, 이를 여과한 후 65 ℃ 이하의 저온에서 20 brix 이상이 되도록 감압농축하고 이를 다시 여과하였다. 그리고 나서, 증숙생강농축액을 덱스트린과 혼합하고 90 ℃에서 15분 동안 살균한 후, 입구(inlet) 온도 190 ℃, 출구(outlet) 온도 90 ℃의 건조기에서 분무건조하여 증숙생강 추출분말을 제조하였다.
상기와 같은 증숙생강 추출 분말의 제조 과정 및 조건을 하기 표 1에 나타내었다.
Figure PCTKR2022007917-appb-img-000002
실시예 2. 증숙생강 추출물로부터 화합물 분리
상기 실시예 1에서 제조한 증숙생강 추출물로부터 n-헥산과 증류수를 활용하여 용매 계통분획을 수행하였다. 수득한 n-헥산 분획물로부터 SiO2, ODS, Sephadex LH-20 등 다양한 레진을 활용하여 오픈컬럼 크로마토그래피를 반복 수행함으로써 주요성분인 1-데하이드로-6-진저다이온(1-dehydro-6-gingerdione), 6-진저롤(6-gingerol), 8-진저롤(8-gingerol), 10-진저롤(10-gingerol), 6-쇼가올(6-shogaol), 6-파라돌(6-paradol), 8-파라돌(8-paradol), 및 1-데하이드로-8-진저다이온(1-dehydro-8-gingerdione)을 수득하였다.
또한, 하기 조건과 같이 증숙생강 추출물에 대하여 액체 크로마토그래피(High Pressure Liquid Chromatography, HPLC) 분석을 수행하였다.
증숙생강 추출물과 생강 추출물을 80 % 메탄올로 녹여 10,000 ppm의 용액으로 제조한 후, 0.22 μm 멤브레인 필터(Woongki Science Co., Ltd., 서울, 한국)로 정제하여 샘플을 제조하였다. 분석에 사용된 HPLC는 Agilent Technologies 1260 series를 사용하였으며, 분석용 컬럼으로 Cadenza CD-C18(3 μm, 250 × 4.6 mm)를 사용하였다. 이 때 측정 파장은 370 nm로 하였으며, 시료주입량은 10 μL, 용매 용출 속도는 0.4 mL/min로, 분석 용매로는 포름산(formic acid)이 0.1 % 함유된 물 (A) 및 아세토니트릴(acetonitrile) (B)을 사용하였으며, 용매의 조성을 다음과 같이 변화시켜 60분간 관측을 진행하였다.
(B) 기준, 30 % (0 min) → 30 % (5 min) → 55 % (10 min) → 55 % (13 min) → 80 % (20 min) → 80 % (23 min) → 100 % (30 min) → 100 % (60 min).
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 증숙생강 추출물과 생강 추출물을 비교했을 때, 특징적으로 1-데하이드로-6-진저다이온(1-dehydro-6-gingerdione)의 함량이 크게 증가함을 확인하여, 1-데하이드로-6-진저다이온을 지표성분으로 설정하였다. 증숙생강 속 지표성분인 1-데하이드로-6-진저다이온의 함량을 확인하기 위하여, 표준품을 활용해 검량곡선을 작성하였으며, 작성된 검량곡선을 토대로 증숙생강 추출물에 대하여 1-데하이드로-6-진저다이온이 1.18 mg/g 함유되어 있음을 확인하였다. 생강 추출물에 대한 1-데하이드로-6-진저다이온 함량은 0.54 mg/g이었다.
[실험예]
실험예 1. In vitro 상에서 항염증 효과 확인
1-1. 세포생존율 및 NO 생성 억제 효과 확인
마우스 대식세포인 RAW 264.7 세포에서 생강 추출물(GE), 증숙생강 추출물(GGE), 및 증숙생강의 유효성분들을 이용하여 세포생존율 및 NO 생성 억제 효과를 확인하였다.
세포생존율은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 이용하여 확인하였다. 생존세포는 MTT를 포르마잔(formazan)으로 전화하는 것을 이용하여 흡광도를 측정하는 것으로, RAW 264.7 세포를 96 웰-플레이트에 1×104 세포/웰의 농도로 접종한 후 37 ℃, 5 % CO2 조건의 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하고, 생강 추출물(GE) 및 증숙생강 추출물(GGE)을 25, 50, 100, 200 μg/mL 농도로 처리하였고, 증숙생강의 유효성분들은 1.3, 2.5, 5, 10, 20 μg/mL 농도로 처리하고, 24시간 동안 배양한 후 5 mg/mL MTT 용액을 10 μL씩 첨가하고 이를 2시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 배지 상층액을 제거하고 DMSO 100 μL를 넣어 용해시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
NO 생성 억제 효과의 확인을 위해, RAW 264.7 세포를 96 웰-플레이트에 1×104 세포/웰의 농도로 접종한 후 37 ℃, 5 % CO2 조건의 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하고, 염증 유도를 위하여 LPS(lipopolysaccharide)를 1 μg/mL의 농도로 2시간 전처리한 다음, 증숙생강 추출물을 25, 50, 100, 200 μg/mL 농도로 처리하였고, 증숙생강의 유효성분들은 1.3, 2.5, 5, 10, 20 μg/mL 농도로 처리하여, 24시간 동안 배양한 후 상층액을 새로운 96 웰-플레이트에 50 μL 옮기고, 그리에스 시약(Griess reagent)을 50 μL 첨가하여 상온에서 20분간 반응시킨 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 증숙생강 추출물의 경우 생강 추출물에 비해 세포독성이 낮고(좌측 도면), LPS에 의해 유도된 NO 생성을 억제하는 효과를 나타내는 것을 확인하였다(우측 도면).
또한, 도 2b 및 2c에 나타낸 바와 같이, 증숙생강의 유효성분들 중에서도 특히 지표성분인 1-데하이드로-6-진저다이온은 낮은 세포독성을 나타내면서(도 2b) 농도의존적으로 높은 NO 생성 억제 효과(도 2c)를 나타내는 것을 확인하였다.
1-2. IL-1β 발현 억제 효과 확인
RAW 264.7 세포에서 증숙생강 추출물(GGE) 및 증숙생강의 유효성분인 1-데하이드로-6-진저다이온(6-GD) 처리에 의한 인터루킨-1베타(IL-1β)의 mRNA 및 단백질 발현을 확인하였다.
구체적으로, RAW 264.7 세포를 6 웰-플레이트에 1×104 세포/웰로 접종한 후 LPS를 1 μg/mL의 농도로 2시간 전처리하고, 증숙생강 추출물을 농도별(50, 100, 200 μg/mL)로 24시간 동안 처리하였다. 총 RNA는 TRIzol 용액을 이용하여 추출하였으며, Nanodrop을 통해 RNA를 정량한 후 동량의 RNA 를 cDNA 합성 키트(Takara, Japan)를 이용하여 cDNA로 합성한 후 qRT-PCR(quantitative real time-PCR)을 진행하였다.
실험에 사용한 프라이머 서열은 하기 표 2에 나타내었다.
Gene Primer sequences 서열번호
IL-1β 5'-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3' (sense) 1
5'-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3' (antisense) 2
β-actin 5'-CGTGAAAAGATGACCAGAT-3' (sense) 3
5'-ACCCTCATAGATGGCACA-3' (antisense) 4
또한, 인터루킨-1 베타(IL-1β)의 단백질 발현 확인을 위해, RIPA 버퍼를 이용하여 단백질을 추출하였으며, 동량의 단백질을 12 % SDS-PAGE로 전기영동한 후 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 이동(transfer)시켰다. 그 후 5 % 스킴 밀크(skim milk)로 상온에서 1시간동안 블로킹(blocking)을 진행한 후 IL-1β에 대한 1차 항체(Invirogen, USA)를 4 ℃에서 하룻동안 반응시키고, 효소, 방사선 물질, 또는 형광물질 등이 부착된 2차 항체(HPR-conjugated rabbit, Cell Signaling, USA)를 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 후 Lumi-Pico 시약으로 단백질을 검출하였다.
그 결과, 도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이, 증숙생강 추출물 또는 1-데하이드로-6-진저다이온 처리에 의해 염증성 사이토카인인 IL-1β의 mRNA(도 3a) 및 단백질(도 3b) 발현이 감소되는 것을 확인하였다.
실험예 2. 퇴행성 관절염 동물 모델에서의 효과 확인
2-1. 퇴행성 관절염 동물 모델 유도 및 증숙생강 추출물 투여
5주령의 Wistar 래트의 관절강에 MIA(Mono-iodoacetate) 50 μL(3 mg/kg)를 2주간 투여하여 퇴행성 관절염을 유도하였다.
그런 다음, 6주간 생강 추출물(200 mg/kg), 증숙생강 추출물(50, 100, 200 mg/kg) 및 양성대조군(PC)으로 셀레콕시브(10 mg/kg, celecoxib)를 경구투여하고, Micro-CT 분석, 혈액 및 관절연골에서 관절 구조 및 염증마커 분석을 실시하였다.
상기와 같은 퇴행성 관절염 동물 모델 유도 및 증숙생강 추출물 투여 과정은 도 4에 도식화하여 나타내었다.
2-2. Micro-CT 분석
상기 실험예 2-1의 MIA 유도 퇴행성 관절염 동물 모델을 이용하여 관절 조직의 구조 변화 확인을 위해 Micro-CT 촬영 및 분석을 실시하였다.
그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, 정상군(NC)에 비하여 MIA 유도군은 연골 조직이 파괴되어 퇴행성 관절염이 유도된 것을 확인하였으며, 생강 추출물(GE), 증숙생강 추출물(GGE) 및 PC(celecoxib) 투여군은 정상군 수준으로 연골 조직이 회복되는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 5b에 나타낸 바와 같이, 골 표면적(bone surface, BS), 골 표면 밀도(bone surface density, BS/TV), 및 골소주 수(trabecular number, Tb.N)는 MIA에 의해 증가하였으나, 생강 추출물 및 증숙생강 추출물 투여에 의해 감소하는 것을 확인하였으며, 골소주 두께(trabecular thickness, Tb.Th)는 MIA에 의해 감소하였으나, 생강 추출물 및 증숙생강 추출물 투여에 의해 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 생강 추출물에 비해 증숙생강 추출물 투여군에서 더 뛰어난 연골 조직 회복 효과가 나타나는 것을 확인하였다.
2-3. 퇴행성 관절염 동물 모델의 혈액에서 염증성 사이토카인 발현 확인
상기 실험예 2-1의 MIA 유도 퇴행성 관절염 동물 모델의 혈액에서 염증성 사이토카인의 발현을 확인하였다.
구체적으로, MIA 유도 퇴행성 관절염 동물에 6주간 생강 추출물 및 증숙생강 추출물을 투여하고 부검 전 절식 후 복대 정맥에서 혈액을 채취하였고, 4 ℃, 12,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈중 염증성 사이토카인의 함량을 측정하기 위해 IL-1β, TNF-α, PGE2의 함량을 키트(R&D system, 미국)에 구성된 물품으로 제조사의 실험방법에 맞춰 반응시킨 뒤 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, MIA 유도 퇴행성 관절염 동물 모델의 혈액에서 염증성 사이토카인인 IL-1β와 TNF-α, 및 프로스타글란딘 E2(PGE2)의 발현은 증숙생강 추출물의 처리에 의해 유의적으로 감소하는 것을 확인하였으며, 이때 증숙생강 추출물 처리 시 생강 추출물을 처리한 경우에 비해 염증성 사이토카인의 발현 감소 효과가 더 높은 것을 알 수 있었다.
2-4. 퇴행성 관절염 동물 모델의 연골에서 염증성 사이토카인 발현 확인
상기 실험예 2-1의 MIA 유도 퇴행성 관절염 동물 모델의 연골에서 염증성 사이토카인의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 실험동물의 무릎 관절 연골조직을 채취하고, TRIzol 시약을 이용하여 RNA를 추출한 후, Nanodrop을 통해 RNA를 정량하고 동량의 RNA 를 cDNA 합성 키트(Takara, Japan)를 이용하여 cDNA로 합성한 후, qRT-PCR을 진행하였다.
실험에 사용한 프라이머 서열은 하기 표 3에 나타내었다.
Gene Primer sequences 서열번호
IL-1β 5'-CACCTCTCAAGCAGAGCACAGCACCTC-3′(sense) 5
5'-GGGTTCCATGGTGAAGTCAAC-3′ (antisense) 6
TNF-α 5'-TCGTCTACTACTCCTCAGAGCCC-3′(sense) 7
5'-ACTTCAGCGTCTCGTGTGTT-3′(antisense) 8
IFN-γ 5'-GCAAAGGACGGTAACACGAA-3′(sense) 9
5'-ATGGCCTGGTTGTTGTCTTTCAAGA-3′(antisense) 10
β-actin 5'-CGTGAAAAGATGACCCAGAT-3′(sense) 11
5'-ACCCTCATAGATGGGCACA-3′(antisense) 12
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, MIA 유도 퇴행성 관절염 동물 모델의 연골에서 염증성 사이토카인인 IL-1β, IFN-γ, 및 TNF-α의 발현이 증숙생강 추출물의 처리에 의해 유의적으로 감소하는 것을 확인하였으며, 특히 IL-1β 및 TNF-α의 경우 생강 추출물을 처리한 경우에 비해 발현 감소 효과가 더 높은 것을 알 수 있었다.
2-5. 퇴행성 관절염 동물 모델의 연골에서 연골 분해 억제 및 생성 효과 확인
MIA 유도 퇴행성 관절염 동물 모델의 연골에서 연골 구성성분인 콜라겐과 젤라틴 등을 분해하는 MMPs(Matrix metalloproteinases), 상기 MMPs의 작용을 억제하는 TIMP(issue inhibitor of metalloproteinases), 및 연골 조직의 생성에 관여하는 COL-2(collagen type Ⅱ의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 퇴행성 관절염 동물 모델의 관절 연골에서 연골분해 억제 및 연골 생성 효과를 확인하기 위하여, 상기 실험예 2-4와 동일한 방법으로 실험동물의 연골조직에서 TRIzol 시약을 이용하여 RNA를 추출하고 Nanodrop을 통해 RNA를 정량한 후, 동량의 RNA 를 cDNA 합성 키트(Takara, Japan)를 이용하여 cDNA로 합성한 다음, qRT-PCR을 이용하여 유전자 발현을 확인하였다.
실험에 사용한 프라이머 서열은 하기 표 4에 나타내었다.
Gene Primer sequences 서열번호
MMP-9 5'-AGCCGGGAACGTATCTGGA-3′(sense) 13
5'-TGGAAACTCACACGCCAGAAG-3′(antisense) 14
TIMP-1 5'-CATCTCTGGCCTCTGGCATC-3′(sense) 15
5'-CATAACGCTGGTATAAGGTGGTCTC-3′(antisense) 16
TIMP-2 5'-CTGTGACCCAGTCCATCCAGAG-3′(sense) 17
5'-GACACGCTTAGCATCACCCAGA-3′(antisense) 18
COL2 5'-CTGAGGGCTCCCAGAACATC-3′(sense) 19
5'-TTCGTCCAGGTAGGCAATGC-3′(antisense) 20
β-actin 5'-CGTGAAAAGATGACCCAGAT-3′(sense) 11
5'-ACCCTCATAGATGGGCACA-3′(antisense) 12
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, MIA 유도 퇴행성 관절염 동물 모델의 연골에서 생강 추출물에 비해 증숙생강 추출물을 처리하였을 때 높은 TIMP1 및 TIMP2의 발현 증가, MMP-9의 발현 감소 효과를 확인하였을 뿐만 아니라, COL-2의 발현이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다.
이로부터, 본 발명에 따른 증숙생강 추출물은 퇴행성 관절염에서 연골의 분해 억제 및 연골 생성 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
2-6. 퇴행성 관절염 동물 모델의 연골에서 I-κB 및 NF-κB 발현 확인
MIA 유도 퇴행성 관절염 동물 모델의 연골에서 퇴행성 관절염 진행에 따라 염증성 사이토카인 및 MMP 생성에 관여하는 I-κB 및 NF-κB 단백질의 발현을 확인하였다.
구체적으로, IκB 및 NF-κB의 발현 확인을 위해 RIPA 버퍼를 이용하여 실험동물의 연골조직에서 단백질을 추출하였으며, 동량의 단백질을 12 % SDS-PAGE로 전기영동한 후 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)으로 이동(transfer)시켰다. 그 후 5 % 스킴 밀크(skim milk)로 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)을 진행한 후, phospho-IκB(Santa Cruz, USA), IκB(Santa Cruz, USA), phospho-NF-κB(Cell Signaling, USA), 및 NF-κB(Cell Signaling, USA)에 대한 1차 항체를 4 ℃에서 하룻동안 반응시키고, 효소, 방사선 물질, 또는 형광물질 등이 부착된 2차 항체(HPR-conjugated rabbit 또는 mouse, Cell Signaling, USA)를 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 1시간 후 Lumi-Pico 시약으로 단백질을 검출하고 정량화하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, MIA 유도 퇴행성 관절염 동물 모델의 연골에서 생강 추출물에 비해 증숙생강 추출물을 처리하였을 때 I-κB 및 NF-κB의 단백질 발현이 더 유의적으로 감소함을 확인하였으며, 이로부터 본 발명에 따른 증숙생강 추출물은 NF-κB 감소에 의한 항염증 작용으로 인해 퇴행성 관절염 개선 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
본 발명에 따른 증숙생강 추출물 또는 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온은 퇴행성 관절염을 예방, 개선, 또는 치료하기 위한 기능성 식품 조성물, 약학적 조성물 등에 유용하게 이용될 것으로 기대되는 바, 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (14)

  1. 증숙생강 추출물; 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온(1-dehydro-6-gingerdione); 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 식품 조성물은 건강기능성 식품 조성물인 것을 특징으로 하는, 퇴행성 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 증숙생강 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급알코올, n-헥산, 에틸아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴, n-부틸아세테이트, 1,3-부틸렌 글리콜, 메틸렌클로라이드, 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 용매로 추출되는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 증숙생강 추출물은 1-데하이드로-6-진저다이온(1-dehydro-6-gingerdione), 6-진저롤(6-gingerol), 8-진저롤(8-gingerol), 10-진저롤(10-gingerol), 6-쇼가올(6-shogaol), 6-파라돌(6-paradol), 8-파라돌(8-paradol), 1-데하이드로-8-진저다이온(1-dehydro-8-gingerdione), 및 이들의 식품학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 1-데하이드로-6-진저다이온은 증숙생강 추출물의 건조중량 대비 0.001 중량% 내지 10 중량%의 용량으로 포함되는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 인터루킨-1베타(IL-1β), 종양괴사인자 알파(TNF-α), 인터페론 감마(IFN-γ), 및 프로스타글란딘 E2(PGE2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 연골 조직 회복, 연골 생성, 또는 연골 분해 억제 활성을 가지는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 I-κB 또는 핵 인자(NF)-κB 단백질의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 관절염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  9. 증숙생강 추출물; 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온(1-dehydro-6-gingerdione); 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 증숙생강 추출물은 1-데하이드로-6-진저다이온(1-dehydro-6-gingerdione), 6-진저롤(6-gingerol), 8-진저롤(8-gingerol), 10-진저롤(10-gingerol), 6-쇼가올(6-shogaol), 6-파라돌(6-paradol), 8-파라돌(8-paradol), 1-데하이드로-8-진저다이온(1-dehydro-8-gingerdione), 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 하기 단계를 포함하는, 증숙생강 추출물을 포함하는 퇴행성 관절염 예방, 개선, 또는 치료용 조성물의 제조방법:
    (a) 생강을 세척하고 85 내지 105 ℃에서 1 내지 3시간 동안 증숙시키는 단계;
    (b) 증숙된 생강을 40 내지 60 ℃에서 30 내지 50시간 건조하는 단계;
    (c) 상기 건조시킨 증숙생강을 용매에 넣고 75 내지 95 ℃에서 10 내지 20시간 동안 추출하는 단계;
    (d) 상기 추출한 증숙생강을 여과하고 10 내지 65 ℃의 온도에서 감압농축하는 단계; 및
    (e) 상기 감압농축한 증숙생강 추출물을 여과하고 분무건조 하여 증숙생강 추출 분말을 제조하는 단계.
  12. 증숙생강 추출물; 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온(1-dehydro-6-gingerdione); 또는 이의 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 퇴행성 관절염 치료 또는 개선 방법.
  13. 증숙생강 추출물; 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온(1-dehydro-6-gingerdione); 또는 이의 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물의 퇴행성 관절염 예방, 개선, 또는 치료 용도.
  14. 증숙생강 추출물; 이로부터 분리된 1-데하이드로-6-진저다이온(1-dehydro-6-gingerdione); 또는 이의 약학적 또는 식품학적으로 허용 가능한 염의 퇴행성 관절염 예방, 개선, 또는 치료에 이용되는 약제의 제조를 위한 용도.
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