WO2023182757A1 - 뇌졸중의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

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WO2023182757A1
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sanyak
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정재언
유대원
김경순
유성진
왕윤
우구젠
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주식회사 메디포럼
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for the prevention and treatment of stroke, and specifically, to a pharmaceutical composition and food composition for the prevention or treatment of stroke containing extracts of goji berry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdan bark extracts or fractions thereof as active ingredients. and a feed composition, a method for preventing or treating stroke comprising administering the pharmaceutical composition, and a method for producing the pharmaceutical composition.
  • Stroke is a cerebrovascular disease, one of the three leading causes of death along with heart disease and cancer, and is one of the most common diseases affecting life expectancy prospects and increasing the age of the population as the number of strokes gradually increases.
  • Hypertension, hyperlipidemia, atherosclerosis, and hypercholesterolemia are known to be various important risk factors for cerebrovascular stroke.
  • Stroke is largely divided into two types: ischemic stroke, which occurs in an ischemic state of brain tissue due to a decrease or blockage of blood supply to brain tissue, and hemorrhagic stroke, which occurs when a blood vessel bursts and bleeds into brain tissue.
  • Ischemic stroke accounts for more than 80% of all stroke patients.
  • the mortality rate due to stroke is increasing every year not only domestically but also globally, and today, much attention is being paid to the development of drugs to treat stroke.
  • approaches using natural products such as the development of compositions for preventing or treating stroke containing natural product extracts or compounds extracted from natural products as active ingredients, are attracting attention (KR 10-1182199 B2).
  • Intractable neurological diseases such as stroke or neurodegenerative disease commonly result in the death of brain cells or nerve cells, resulting in irreversible high-order neurological dysfunction.
  • treatments using various types of compounds, stem cells, etc. are being attempted in animal models around the world, but many problems are involved in applying them to clinical trials. Therefore, there is a need to consider ways to effectively protect brain cells or nerve cells before they die.
  • a composition containing goji berry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdan bark extracts or fractions thereof as active ingredients at the optimal composition ratio of the present invention has a neuronal protective effect and reduces the risk of stroke-related disorders.
  • the present invention was completed by confirming that it has the effect of improving disability and reducing damage to brain tissue caused by stroke, and that it can be usefully used in the prevention and treatment of stroke.
  • the present inventors were the first to identify the excellent stroke prevention or treatment effect of goji berry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdan bark extracts or fractions thereof, and to A pharmaceutical composition for preventing or treating stroke containing it as an active ingredient; A method for preventing or treating stroke using the pharmaceutical composition; And the present invention was completed by developing a method for producing the pharmaceutical composition.
  • One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating stroke containing extracts of goji berry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdan bark extracts or fractions thereof as active ingredients.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving stroke containing extracts of goji berry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdan bark extracts or fractions thereof as active ingredients.
  • Another object of the present invention is to provide a feed composition for preventing or improving stroke containing extracts of wolfberry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdanbark extracts or fractions thereof as active ingredients.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating stroke comprising administering the pharmaceutical composition.
  • Another object of the present invention is to provide a method for producing the pharmaceutical composition.
  • Another object of the present invention is to provide the use of a composition containing extracts of Goji berry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdan bark extracts or fractions thereof for preparing the pharmaceutical composition for preventing or treating stroke.
  • Another object of the present invention is to provide a use for the prevention or treatment of stroke of a composition containing extracts of wolfberry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdan bark extracts or fractions thereof.
  • the wolfberry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdan bark extracts or fractions thereof of the present invention exhibit excellent stroke prevention or treatment effects, and are therefore included as active ingredients in pharmaceutical compositions or foods to be used as preventive, therapeutic or ameliorating agents for stroke. Can be used for development.
  • Figure 1 is a diagram briefly showing the in vitro experiment schedule of the present invention.
  • Figure 2 is a diagram showing the results of confirming the neuronal protection effect and MAP2-immunoreactivity by treatment with the herbal extract of the present invention.
  • Figure 3 is a diagram showing the results confirming the effect of reducing apoptosis by treatment with the herbal extract of the present invention.
  • Figure 4 is a diagram showing the results confirming the effect of reducing apoptosis by treatment with the herbal extract of the present invention.
  • Figure 5 is a diagram showing the results of confirming the effect of controlling calcium metabolism by treatment with the herbal extract of the present invention.
  • Figure 6 is a diagram showing the results of confirming the effect of controlling calcium metabolism by treatment with the herbal extract of the present invention.
  • Figure 7 is a diagram showing the results of confirming the specific protective effect of the herbal extract of the present invention against nerve cell damage.
  • Figure 8 is a diagram briefly showing the in vivo experiment schedule of the present invention.
  • Figure 9 is a diagram showing the results confirming the effect of reducing brain tissue damage by administering the herbal extract of the present invention in an animal model of Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAo).
  • MCAo Middle Cerebral Artery Occlusion
  • Figure 10 is a diagram showing the results of confirming the effect of improving behavioral disorders by administering the herbal extract of the present invention in an animal model of Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAo).
  • MCAo Middle Cerebral Artery Occlusion
  • Figure 11 is a diagram showing the results of confirming inflammation-related gene changes caused by administration of the herbal extract of the present invention in an animal model of Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAo).
  • MCAo Middle Cerebral Artery Occlusion
  • Figure 12 is a diagram showing the results of confirming changes in genes related to endoplasmic reticulum stress and apoptosis caused by administration of the herbal extract of the present invention in an animal model of Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAo).
  • MCAo Middle Cerebral Artery Occlusion
  • Figure 13 is a diagram showing the results of confirming changes in genes related to neurotrophic factors caused by administration of the herbal extract of the present invention in an animal model of Middle Cerebral Artery Occlusion (MCAo).
  • MCAo Middle Cerebral Artery Occlusion
  • One aspect of the present invention for achieving the above object is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating stroke containing extracts of goji berry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mok Danbar extract or fractions thereof as active ingredients.
  • Lycium chinense refers to the fruit of the Lycium chinense tree. Goji berries usually have an egg-shaped or long oval shape. The wolfberry is used as a tonic and antipyretic, and is known to have excellent liver function protection properties.
  • Rehmannia glutinosa is an herbal medicine made by steaming and drying the roots of Rehmannia glutinosa.
  • Rehmannia glutinosa is a perennial medicinal plant belonging to the ginseng family, and its roots are used as medicine in oriental medicine.
  • Cornus officinalis refers to the fruit of the Cornus officinalis tree.
  • Poria cocos refers to a symbiosis of ectomycorrhizal fungi on pine roots.
  • the Bokryeong is specifically the sclerotia of Poria cocos Wolf, a member of the Jannabigeosangidae family that parasitizes on the roots of pine trees, and can be used by almost removing the outer layer.
  • Alisma rhizome refers to the tuberous rhizome of Alisma orientale Juzepczuk or other related plants (Alismataceae).
  • Paeonia suffruticosa refers to a medicinal material made from the root bark of the peony of the peony family.
  • the bark is known to have pharmacological effects such as analgesic, sedative, antipyretic, anticonvulsant, anti-inflammatory, and inhibition of blood clot formation.
  • extract in the present invention refers to a substance obtained by extracting a substance, and specifically refers to an extract obtained by the extraction process of the present invention, a dilution or concentrate of the extract, and a dried product obtained by drying the extract. , includes extracts of the extract itself and all formulations that can be formed using the extract, such as crude or purified products of the extract, or mixtures thereof.
  • the extract may be a complex extract of two or more selected from the group consisting of Goji berry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdan bark, but is not limited thereto. More specifically, it may be Goji berry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdan bark extract.
  • the method for extracting the extract is not particularly limited, and may be extracted according to a method commonly used in the art.
  • Non-limiting examples of the extract extraction method include solvent extraction, ultrasonic extraction, filtration, and reflux extraction, which may be performed alone or by combining two or more methods.
  • the type of extraction solvent used for the extract is not particularly limited, and any solvent known in the art can be used.
  • Non-limiting examples of the extraction solvent include water, alcohols having 1 to 4 carbon atoms, or mixed solvents thereof, and these may be used alone or in combination of one or more types.
  • the extraction solvent may be hot water.
  • fraction refers to the result obtained by performing fractionation to separate a specific component or specific group of components from a mixture containing various components.
  • the fractionation method for obtaining the fraction in the present invention is not particularly limited as long as it can exhibit a stroke-inhibiting effect, but may be performed according to a method commonly used in the art.
  • solvent fractionation by treatment with various solvents for example, solvent fractionation by treatment with various solvents, ultrafiltration fractionation by passage through an ultrafiltration membrane with a certain molecular weight cut-off value, and various chromatographic methods (separation based on size, charge, hydrophobicity, or affinity). It can be a chromatographic fractionation method that performs (manufactured for) and a combination thereof.
  • the type of fractionation solvent used to obtain the fraction in the present invention is not particularly limited, and any solvent known in the art can be used.
  • Non-limiting examples of the fractionating solvent include polar solvents such as water, distilled water, and alcohol; Nonpolar solvents such as hexane, ethyl acetate, chloroform, and dichloromethane may be included. These may be used individually or in combination of two or more types.
  • alcohol is used among the fractionating solvents, specifically, C1 to C4 alcohols can be used.
  • stroke refers to symptoms of local neurological deficit suddenly caused by abnormal cerebral blood flow. These strokes may include cerebral infarction, which occurs when a cerebral blood vessel is blocked by a blood clot, leading to the death of brain cells, or cerebral hemorrhage, which occurs when a cerebral blood vessel ruptures. Specific symptoms of stroke include sudden headache and vomiting, paralysis of the entire body or part of the body, paralysis and loss of sensation in part of the body, speech disorders (aphasia or speech disorders), facial nerve disorders, and ataxia. It may appear. In the present invention, stroke may mean paralysis.
  • the stroke may specifically be an ischemic stroke, but is not limited thereto.
  • ischemic stroke is a condition in which cerebral blood flow is reduced due to occlusion of cerebral blood vessels and brain tissue cannot function, and is a term that refers to both cerebral infarction and transient ischemic attack.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may promote recovery of motor function damaged due to stroke or reduce infarct size.
  • composition of the present invention has excellent effects for preventing or treating stroke.
  • prevention in the present invention refers to all actions that inhibit or delay the growth of stroke by administering the pharmaceutical composition according to the present invention.
  • treatment refers to any action in which the symptoms of a subject suspected of having a stroke or affected by stroke are improved or beneficially changed by administration of the pharmaceutical composition.
  • the extracts of goji berry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdan bark included in the pharmaceutical composition of the present invention are 0.7 to 1.3 of Goji Rehmannia glutinosa, 0.2 to 0.8 of Cornus officinalis, 0.2 to 0.8 of Sanyak, 0.01 to 0.55 of Bokryeong, based on 1 weight of Goji berry.
  • It may be mixed at a weight ratio of 0.01 to 0.55 of the cocoa root and 0.01 to 0.55 of the coriander bark, and specifically, based on the weight of 1 wolfberry, 0.9 to 1.1 of the rehmannia glutinosa, 0.4 to 0.6 of the Cornus officinalis, 0.4 to 0.6 of the Sanyak, 0.15 to 0.35 of the bokryeong, and 0.15 to 0.35 of the columbine.
  • It may be mixed at a weight ratio of 0.15 to 0.35, and more specifically, relative to 1 weight of wolfberry, 0.95 to 1.05 of Rehmannia glutinosa, 0.45 to 0.55 of Cornus officinalis, 0.45 to 0.55 of Sanyak, 0.2 to 0.3 of Bokryeong, 0.2 to 0.3 of Taeksa, and 0.2 of Mok Danpi. It may be mixed at a weight ratio of 0.3 to 0.3.
  • the extracts of Goji berry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mok Danpi included in the pharmaceutical composition of the present invention are 1 Sok Rehmannia glutinosa, 0.5 Cornus officinalis, 0.5 Sanyak, 0.25 Bokryeong, 0.25 Taxa and Mok Danpi, relative to 1 weight of Goji berry. It may be mixed at a weight ratio of 0.25, but is not limited thereto.
  • the content of Goji berry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mok Danbar extract contained in the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited, but is 0.0001 to 80% by weight, 0.0001 to 50% by weight, based on the total weight of the final composition. More specifically, it may be included in an amount of 0.01 to 20% by weight.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient, or diluent, and the carrier may include a non-naturally occurring carrier.
  • carriers, excipients, and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, Calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, polycaprolactone, polylactic acid ( Poly Lactic Acid, poly-L-lactic acid, mineral oil, etc.
  • composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier, diluent or excipient, and may be formulated into powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, etc. according to conventional methods to suit each purpose of use. It can be formulated and used in a variety of forms, such as oral formulations such as aerosols and injections of sterile injectable solutions, and can be administered orally or through various routes including intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, rectal, and topical administration.
  • compositions examples include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginates, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Examples include cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, and mineral oil.
  • the composition of the present invention may further include fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives, etc.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations contain at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, etc. Formulated by mixing. Additionally, in addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may be used.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, oral solutions, emulsions, and syrups.
  • simple diluents such as water and liquid paraffin, they may contain various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives. You can.
  • Preparations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate.
  • injectables may contain conventional additives such as solubilizers, isotonic agents, suspending agents, emulsifiers, stabilizers, preservatives, etc.
  • Another embodiment of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving stroke containing extracts of goji berry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdan bark extracts or fractions thereof as active ingredients.
  • the term “improvement” means any action that results in at least a reduction in the severity of a parameter, such as a symptom, associated with the condition being treated by administration of the composition.
  • the extracts of Goji berry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdan bark extracts according to the present invention exhibit excellent stroke-inhibiting effects and can be included in food compositions for the purpose of preventing or improving stroke, and the food compositions can be used for daily consumption. Because this is possible, high effectiveness in preventing or improving stroke can be expected.
  • the term "food” refers to meat, sausages, bread, chocolate, candies, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, and alcoholic beverages.
  • vitamin complexes, health functional foods, etc. include all foods in the conventional sense, and are not limited thereto, as long as they can include the wolfberry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdan bark extracts or fractions thereof of the present invention. No.
  • health functional food in the present invention refers to food manufactured and processed using raw materials or ingredients with functionality useful to the human body in accordance with Act No. 6727 on Health Functional Food, and “functionality” refers to the structure of the human body. It means controlling nutrients for functions or obtaining useful effects for health purposes such as physiological effects. Meanwhile, health food refers to food that has a more active health maintenance or promotion effect compared to general food, and health supplement refers to food for health supplement purposes. In some cases, the terms health functional food, health food, and health supplement food are used. can be used interchangeably.
  • the wolfberry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdan bark extracts or fractions thereof of the present invention can be added as is or used together with other foods or food ingredients, and can be used appropriately according to conventional methods.
  • the food of the present invention can be manufactured by methods commonly used in the industry, and can be manufactured by adding raw materials and ingredients commonly added in the industry.
  • the food composition may further include a physiologically acceptable carrier.
  • the type of carrier is not particularly limited, and any carrier commonly used in the art can be used.
  • the food composition contains food additives such as preservatives, disinfectants, antioxidants, colorants, coloring agents, bleaches, seasonings, sweeteners, flavorings, leavening agents, strengthening agents, emulsifiers, thickening agents, coating agents, gum base agents, foam suppressants, solvents, and improvers. It can be included.
  • the additives can be selected depending on the type of food and used in an appropriate amount.
  • the food formulation can be manufactured without limitation as long as it is a formulation recognized as a food.
  • the food composition of the present invention can be manufactured in various types of formulations, and unlike general drugs, it is made from food as a raw material and has the advantage of not having side effects that may occur when taking the drug for a long period of time and is highly portable, so the present invention Foods can be consumed as supplements to enhance the effect of preventing or improving stroke.
  • Wolfberry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdanpi of the present invention may be included in various weight percentages in food compositions if they can show the effect of preventing or improving stroke. Specifically, it may be included in an amount of 0.00001 to 100% by weight or 0.01 to 80% by weight based on the total weight of the food composition, but is not limited thereto. When consumed for a long period of time for health and hygiene purposes, the content may be below the above range. Since there is no problem in terms of safety, the active ingredient may be used in amounts above the above range.
  • Another embodiment of the present invention is to provide a feed composition for preventing or improving stroke containing extracts of goji berry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdan bark extracts or fractions thereof as active ingredients.
  • the extracts or fractions thereof of goji berry, Rehmannia glutinosa, cornelian cherry, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdan bark extract or fractions thereof according to the present invention exhibit excellent stroke treatment effects and can be included in feed compositions for the purpose of preventing or improving stroke, and the feed compositions are used in animals. Because it is possible to consume this on a daily basis, it can be expected to be highly effective in preventing or improving stroke.
  • feed means any natural or artificial diet, meal, etc., or a component of the meal, for or suitable for eating, ingestion, and digestion by animals.
  • the type of feed is not particularly limited, and feed commonly used in the art can be used.
  • Non-limiting examples of the feed include plant feeds such as grains, roots and fruits, food processing by-products, algae, fiber, pharmaceutical by-products, oils and fats, starches, cucurbits or grain by-products;
  • Examples include animal feeds such as proteins, inorganic substances, fats and oils, minerals, oils and fats, single-cell proteins, zooplanktons or foods. These may be used alone or in combination of two or more types.
  • Another embodiment of the present invention provides a method for preventing or treating stroke comprising administering the pharmaceutical composition.
  • the method of the present invention including the step of administering it to a subject can be usefully used for the prevention or treatment of stroke.
  • the term “administration” means introducing the composition into a subject by an appropriate method.
  • the term "individual" of the present invention may be a mammal including rats, mice, livestock, etc., including humans who have or may develop a stroke, but may include wolfberry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and the like of the present invention.
  • Subjects in which stroke can be prevented or treated with a pharmaceutical composition containing a woody plant extract or a fraction thereof as an active ingredient are included without limitation. It is not limited to this. Additionally, humans may be excluded from the subjects of the present invention, but are not limited thereto.
  • the method of the present invention may include administering the pharmaceutical composition in a pharmaceutically effective amount.
  • the appropriate total daily usage amount can be determined by the treating physician within the scope of sound medical judgment, and can be administered once or in several divided doses.
  • the term "pharmaceutically effective amount" of the present invention refers to an amount that is sufficient to treat a disease with a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment and does not cause side effects, and the effective dose level is determined by the patient's Factors including health status, type and severity of disease, activity of drug, sensitivity to drug, method of administration, time of administration, route of administration and excretion rate, duration of treatment, drugs combined or used simultaneously, and other factors well known in the field of medicine. It can be decided depending on The composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiple times. Considering all of the above factors, it is important to administer an amount that can achieve maximum effect with the minimum amount without side effects, and this can be easily determined by a person skilled in the art.
  • the dosage may increase or decrease depending on the route of administration, severity of disease, gender, weight, age, etc., so the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is, for example, 0.1 to 200 mg/kg of body weight (kg), specifically 1 to 200 mg/kg of body weight (kg) per day to animals, including humans. kg), 10 to 150 mg/kg of body weight (kg) or 40 to 110 mg/kg of body weight (kg), more specifically 45 to 55 mg/kg of body weight (kg), and more specifically about 50 mg/kg of body weight (kg). It can be administered, but is not limited to this.
  • the frequency of administration of the composition of the present invention is not particularly limited, but may be administered once a day or divided into multiple doses. However, since it may increase or decrease depending on the route of administration, severity of disease, gender, weight, age, etc., the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • Another embodiment of the present invention provides a method for producing the pharmaceutical composition.
  • the method is (a) by adding water, alcohol with 1 to 6 carbon atoms, or a mixed solvent thereof to goji berry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa, and Mokdan bark, respectively, to produce extracts of Goji berry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa, and Mokdan bark. Extracting each;
  • step (b) preparing a concentrate by concentrating under reduced pressure the extracts of goji berry, rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdanbark extracts extracted in step (a);
  • step (c) preparing dried extract by drying each of the goji berry, rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdan bark concentrates prepared in step (b);
  • step (d) mixing corn starch with the dried extracts of goji berry, rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Taxa, and Mokdan bark prepared in step (c);
  • step (f) adding water, alcohol with 1 to 6 carbon atoms, or a mixed solvent thereof to the dried extract of the herbal medicine complex extract prepared in step (e); but is not limited thereto.
  • the Goji berry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdan bark extracts are mixed by drying, pulverizing or extracting each of the above materials, or mixing two or more of the above materials and drying, pulverizing or It can be manufactured by extraction, or by extracting some of the above materials and drying and pulverizing others.
  • Step (a) water, alcohol with 1 to 6 carbon atoms, or a mixed solvent thereof are added to goji berry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa, and Mokdan bark, respectively, to extract extracts of Goji berry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa, and Mokdan bark, respectively. (Step (a)).
  • step (a) it can be prepared by additionally including the step of drying and crushing goji berry, rehmannia glutinosa, cornelian cherry, sanyak, bokryeong, taxa, and mokdan bark, respectively.
  • extraction can be performed by adding water, alcohol having 1 to 4 carbon atoms, or a mixed solvent thereof to the dried or pulverized material of the material. Specifically, extraction can be performed by adding water as a solvent. You can.
  • the amount of solvent added may be 5 to 15 times the weight or volume of the material to be extracted, specifically 10 to 12 times the amount, but is not limited thereto.
  • the extraction may be performed by shaking extraction, Soxhlet extraction, or reflux extraction, but is not limited thereto. Additionally, the extraction temperature may be 40 to 100°C, the extraction time may be 0.5 to 24 hours, and the number of extractions may be 1 to 5, but are not limited thereto.
  • the extraction may be performed for 2 to 3 hours at a temperature range of 90 to 110° C., but is not limited thereto.
  • step (b) the extracts of Goji berry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdan bark extracts extracted in step (a) are concentrated under reduced pressure to prepare a concentrate (step (b)).
  • dried extracts are prepared by drying each of the goji berry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdan bark concentrates prepared in step (b) (step (c)).
  • the extract may be concentrated and dried, and the concentration may be reduced pressure concentration or vacuum concentration, specifically, reduced pressure concentration, but is not limited thereto.
  • the drying may be freeze-drying, reduced-pressure drying, vacuum drying, boiling drying, or spray drying, and may specifically be freeze-drying, but is not limited thereto.
  • the reduced pressure concentration may be performed at a temperature range of 40 to 45° C., but is not limited thereto.
  • each of the goji berry, rehmannia glutinosa, cornelian cherry, Sanyak, Bokryeong, Taeksa and Mokdan bark dried extracts prepared in step (c) were mixed at a weight ratio (w/w) of 1: 1: 0.5: 0.5: 0.25: 0.25: 0.25 to obtain herbal medicine.
  • the extracts of the wolfberry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdan bark extract are 0.7 to 1.3 for wolfberry, 0.2 to 0.8 for Cornus officinalis, 0.2 to 0.8 for Sanyak, 0.01 to 0.55 for Bokryeong, based on 1 weight of wolfberry.
  • It can be prepared by mixing at a weight ratio of 0.01 to 0.55 of Taxa and 0.01 to 0.55 of Mok Danpi, and specifically, based on the weight of 1 wolfberry, 0.9 to 1.1 of Rehmannia glutinosa, 0.4 to 0.6 of Cornus officinalis, 0.4 to 0.6 of Sanyak, 0.15 to 0.35 of Bokryeong, and 0.15 to 0.15 of Taxa.
  • It can be prepared by mixing at a weight ratio of 0.35 and 0.15 to 0.35, and more specifically, relative to the weight of 1 wolfberry, 0.95 to 1.05 of Rehmannia glutinosa, 0.45 to 0.55 of Cornus officinalis, 0.45 to 0.55 of Sanyak, 0.2 to 0.3 of Bokryeong, 0.2 to 0.3 of Taeksa, and It can be prepared by mixing wood skin at a weight ratio of 0.2 to 0.3.
  • step (e) water, alcohol with 1 to 6 carbon atoms, or a mixed solvent thereof are added to the dried extract of the herbal complex extract prepared in step (d) (step (e)).
  • water can be added as a solvent.
  • Another object of the present invention is to provide the use of a composition containing extracts of Goji berry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdan bark extracts or fractions thereof for preparing the pharmaceutical composition for preventing or treating stroke.
  • Another object of the present invention is to provide a use for the prevention or treatment of stroke of a composition containing extracts of wolfberry, Rehmannia glutinosa, Cornus officinalis, Sanyak, Bokryeong, Taxa and Mokdan bark extracts or fractions thereof.
  • Example 1-1 Preparation of dried goji berry extract
  • Herbal medicine was selected and adjusted according to the Korean Pharmacopoeia General Rules [moderation and fineness]. 5 to 10 times the volume of purified water was added to 1 kg of goji berries, extracted at 90 to 110°C for 2 to 3 hours, and the filtered liquid was stirred at low temperature ( After concentrating and drying under reduced pressure (40 to 45°C), about 367.6 g of dried extract was obtained and then mixed with about 211.8 g of corn starch (USP).
  • Herbal medicines were selected and adjusted according to the general rules of the Korean Pharmacopoeia [moderation and fineness]. 5 to 10 times the volume of purified water was added to 1 kg of the extract, extracted at 90 to 110°C for 2 to 3 hours, and then the filtered liquid was stored at low temperature (40° C.). to 45°C), concentrated under reduced pressure, dried, and then obtained about 247.5 g of dried extract, which was then prepared by mixing about 165 g of corn starch (USP).
  • USP corn starch
  • Herbal medicines were selected and adjusted according to the general rules [fineness and fineness] of the Korean Pharmacopoeia. 5 to 10 times the volume of purified water was added to 1 kg of wood dandelion bark, extracted at 90 to 110°C for 2 to 3 hours, and the filtered liquid was dissolved at low temperature (40 degrees Celsius). to 45°C), concentrated under reduced pressure, dried, and then obtained about 373.1 g of dried extract, which was then prepared by mixing about 183.7 g of corn starch (USP).
  • Primary cultured neurons were obtained from pregnant rat embryos (E14-15), and cortical tissue was isolated by removing the occipital muscle, striatum, and hippocampus. Placed in trypsin solution for 20 minutes at room temperature. After washing off the trypsin with pre-warmed DMEM medium, cells were separated and cultured in a 96-well cell culture plate pre-coated with polyethyleneamine. The medium containing antioxidant substances (antioxidant, B27;+AO) was changed every 2 to 3 days, and from the 7th day of culture, the medium was replaced with medium without antioxidant substances (-AO) to exclude the antioxidant effect.
  • antioxidant substances antioxidant, B27;+AO
  • MAP2 microtubulin-associated protein 2
  • the herbal extract of the present invention has a stroke prevention effect due to its neuroprotective effect.
  • TUNEL is a method for detecting apoptotic DNA fragmentation and is used to identify and quantify apoptotic cells or detect excessive DNA breakage in individual cells. Specifically, using TdT (terminal deoxynucleotidyl transferase) enzyme, UTP (uridine triphosphate) was attached to the ends of DNA to determine whether DNA fragmentation occurred (In situ Cell Death Detection Kit; Roche, Indianapolis, IN).
  • TdT terminal deoxynucleotidyl transferase
  • UTP uridine triphosphate
  • the herbal extract of the present invention has a stroke prevention effect due to its neuroprotective effect.
  • NMDAR N-methyl-D-aspartate receptor
  • a in Figure 6 is the control 3 seconds before treatment with the NMDA substance during nerve cell culture
  • A1 in Figure 6 is the control 5 seconds after treatment with the NMDA substance during nerve cell culture.
  • B is the group (PM012) administered the herbal extract of the present invention 3 seconds before treatment with the NMDA substance during nerve cell culture
  • B1 in Figure 6 is the group (PM012) administered the herbal extract of the invention 5 seconds after treatment with the NMDA substance. (NMDA experiment).
  • the upper part of C in Figure 6 is the control group, and the lower part of Figure 6C is the group administered the herbal extract of the present invention (PM012).
  • the herbal extract of the present invention has a stroke prevention effect due to the neuronal protection effect by regulating calcium metabolism.
  • Neurotoxic substances glutamate, Glu, G, 100uM
  • herbal extract prepared in Example 2 PM, 0.1mg/ml or 1mg/ml
  • control group Vehicle, Veh
  • the herbal extract of the present invention has a stroke prevention effect by showing a specific protective effect against nerve cell damage.
  • MCAo Middle cerebral artery occlusion
  • the rat was first anesthetized with chloral hydrate (400 mg/kg, i.p.), and then a craniotomy of about 2 to 4 mm was performed on the right skull.
  • the right MCA was sutured with 10-0, and blood flow to the carotid artery was blocked with clips. After 60 minutes, reperfusion of blood flow was performed by removing the MCA suture and the carotid artery clip.
  • body temperature was monitored and maintained at 37°C, and the animals recovered from anesthesia were maintained at 37°C in a temperature-controlled incubator.
  • necrosis (death of part of the tissue or cell) of brain tissue begins.
  • brain tissue becomes necrotic and reaches an unrecoverable state, it is called cerebral infarction.
  • TTC 2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride staining using mitochondrial dehydrogenase reaction is performed, dead tissue is removed. It can stain white, and living tissue can stain red.
  • the herbal extract was intraperitoneally administered to experimental animals at different doses of 50 mg/kg and 100 mg/kg for 2 days, and then brain damage was induced by the method of Experiment 2-1 above. . Then, 2 days after the stroke was induced, the brains of the experimental animals (experimental group and control group) were extracted.
  • the extracted brain was sectioned using a brain matrix at 2 mm intervals, incubated in 2% TTC (2,3,5-triphenyltetrazolium chloride) solution for 5 minutes, and then fixed with 4% PFA solution.
  • the area of brain damage was measured on the stained brain tissue sections using a digital scanner and imaging tool program (University of Texas Health Science Center). The results are shown in Figure 9 (A in Figure 9: a photograph of a stained brain section, B in Figure 9: a graph quantifying the damaged portion in A).
  • the TTC stain used in the experiment appears red as it reacts with dehydrogenase in the mitochondria in normal cells, but in the case of cerebral infarction, the dehydrogenase is lost and is not stained, so it appears white, indicating the presence or absence of irreversible damage to the cells. It is widely used as an indicator.
  • the efficacy of the herbal extract of the present invention in preventing stroke due to reduction of cerebral infarction was confirmed.
  • the present invention clearly confirmed the stroke prevention effect of the herbal extract through the brain damage induced model by middle cerebral artery occlusion (MCAo) of the present invention used above, which is a different aspect from confirming the treatment efficacy. clearly confirmed the stroke prevention efficacy of herbal extracts.
  • Models in which nerve damage is induced show a tendency for muscle and nerve functions to decline and the amount of voluntary action to decrease.
  • 13 animals in the experimental group (PM012) were administered the herbal extract of the present invention at a dose of 50 mg/kg, and 9 animals in the vehicle group ( veh), each vehicle was intraperitoneally administered for 2 days, and then brain damage was induced using MCAo of Experimental Example 2-1.
  • Five control animals (naive) did not receive MCAo and were used as pure controls.
  • each experimental animal was placed outside in a transparent acrylic box measuring 42 was measured.
  • the outside of the transparent box contains eight infrared sensors positioned 10 cm from the floor to record the animals' movements (Accuscan, Columbus, OH). Specifically, vertical activity (total number of beam breaks from vertical sensors, VACTV), total distance traveled (distance traveled in centimeters, TOTDIST), and horizontal activity (total number of beam breaks from horizontal sensors, HACTV) were measured using the Versamax program (Accus , Columbus, O). The results are shown in Figure 10.
  • the herbal extract of the present invention has a stroke prevention effect.
  • the present invention confirmed that when the herbal extract was pre-administered through the brain damage induction model by middle cerebral artery occlusion (MCAo) of the present invention used above, behavioral disorders accompanying stroke were improved.
  • MCAo middle cerebral artery occlusion
  • the herbal extract of the present invention was intraperitoneally administered to experimental animals at a dose of 50 mg/kg for 2 days, and then brain damage was induced by the method of Experiment 2-1 above.
  • the rat's cerebral cortex tissue was collected for analysis of inflammation-related specific gene expression on the second day after MCAo surgery. This was used for PCR experiments, including microglial marker (IBA1; Anti-ionized Ca 2+ binding adapter molecule 1), pro-inflammatory cytokine (IL-6; Interleukin-6), and M1 marker (CD86; pro-inflammatory).
  • microglial marker IBA1; Anti-ionized Ca 2+ binding adapter molecule 1
  • pro-inflammatory cytokine IL-6
  • M1 marker CD86; pro-inflammatory
  • genetic analysis was performed using the M2 marker (CD206; anti-inflammatory) ( Figure 11A to Figure 11D, respectively).
  • lesioned refers to the brain hemisphere in which a stroke was induced
  • non-lesioned refers to the brain
  • the microglial marker (IBA1) and pro-inflammatory cytokine (IL-6) expressed in the herbal extract group of the present invention were compared to the control group. It was confirmed that there was a significant decrease compared to . Through this, it was confirmed that the herbal extract of the present invention suppresses inflammation such as microglial activity and suppresses neuronal apoptosis.
  • the expression of the M1 marker (proinflammatory marker; CD86), which was increased due to MCAo surgery, was suppressed in the group treated with Goji Rehmannia glutinosa extract, and the activated M2 marker (anti-inflammatory marker; CD206) was increased in the control group. It was confirmed that there was a significant increase compared to This means that the herbal extract treatment of the present invention induces a change from the M1 type, which secretes inflammation-promoting factors and causes nerve damage, to the M2 type, which promotes neuroprotection and removal of cell debris damaged by phagocytosis, and the increase in the M2 type It is suggested that it contributes to brain tissue repair during recovery from ischemic stroke.
  • the herbal extract of the present invention has a stroke prevention effect due to the neuronal protection effect due to the anti-inflammatory effect.
  • the signal transduction process of genes such as ATF6, BIP, CHOP, IRE1, PERK, and SIGMAR1 present in the endoplasmic reticulum (ER) is not only related to cell survival, but is also involved in apoptosis, and the stress situation for cells is very high. If it occurs strongly or continuously, the function of the endoplasmic reticulum acts abnormally and induces apoptosis due to endoplasmic reticulum stress.
  • the herbal extract of the present invention was intraperitoneally administered to experimental animals at a dose of 50 mg/kg for 2 days, and then brain damage was performed using the method of Experiment 2-1 above. induced.
  • the rat's cerebral cortex tissue was collected on the second day after MCAo surgery for analysis of specific gene expression for endoplasmic reticulum stress and apoptosis.
  • the herbal extract of the present invention has a stroke prevention effect due to its protective effect on nerve cells against suicide caused by endoplasmic reticulum stress.
  • the herbal extract of the present invention was intraperitoneally administered to experimental animals at a dose of 50 mg/kg for 2 days, and then brain damage was induced by the method of Experiment 2-1 above.
  • the rat's cerebral cortex tissue was collected for analysis of neurotrophic factor expression on the second day after MCAo surgery. This used a PCR experiment, and the expression of neurotrophic factors, brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), was measured (Figure 13A and Figure 13B, respectively).
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
  • the herbal extract of the present invention has a stroke prevention effect due to the protective effect on nerve cells through nerve factors.

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Abstract

본 발명은 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 식품 조성물 및 사료 조성물, 상기 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 뇌졸중의 예방 또는 치료방법 및 상기 약학 조성물의 제조방법에 관한 것이다.

Description

뇌졸중의 예방 및 치료용 조성물
본 발명은 뇌졸중의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 식품 조성물 및 사료 조성물, 상기 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 뇌졸중의 예방 또는 치료방법 및 상기 약학 조성물의 제조방법에 관한 것이다.
뇌졸중은 뇌혈관 질환으로서, 심장 질환 및 암과 함께 3가지 주요한 사망 원인이며, 빈발수가 점진적으로 증가됨에 따라 평균 수명 전망 및 인구의 나이를 연장에 영향을 주는 가장 일반적인 질환 중 하나이다. 고혈압, 고지방혈증, 죽상동맥경화증, 고콜레스테롤혈증은 뇌혈성 뇌졸중에 대한 다양한 중요한 위험인자들로 알려져있다.
뇌졸중은 크게 2가지로 나누는데, 뇌조직으로 가는 혈액 공급의 감소 혹은 차단으로 뇌조직의 허혈상태로 발생하는 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)과 혈관이 터져 뇌조직으로 출혈을 일으키는 출혈성 뇌졸중(hemorrhagic stroke)으로 구분하고 있으며, 허혈성 뇌졸중이 전체 뇌졸중 환자의 약 80% 이상을 차지하고 있다. 이러한 뇌졸중으로 인한 사망률은 국내뿐만 아니라 세계적으로 매년 증가하고 있는 추세이며, 오늘날 뇌졸중 치료 약물 개발에 많은 관심이 모이고 있다. 예를 들어, 천연물 추출물 또는 천연물에서 추출한 화합물을 유효성분으로 함유하는 뇌졸중의 예방 또는 치료용 조성물 개발과 같은 천연물을 활용하는 접근 방법이 주목받고 있다(KR 10-1182199 B2).
뇌졸중이나 신경변성 질환 등의 난치성 신경질환은 공통으로 뇌세포 또는 신경세포가 사멸하게 되는데, 그 결과 비가역적인 고차 신경기능장애를 가져온다. 현재 세계적으로 여러 종류의 화합물, 줄기세포 등을 이용한 치료를 동물 모델에서 시도하고 있으나, 임상시험에 적용되기엔 많은 문제가 수반되는 상황이다. 따라서, 뇌세포 또는 신경세포의 사멸 전에 이들 세포를 유효하게 보호할 수 있는 방안의 고려가 요구되고 있다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 본 발명의 최적의 조성비로 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물이 신경 세포 보호 효과를 가지고, 뇌졸중으로 인한 행동 장애를 개선하며, 뇌졸중으로 인한 뇌 조직의 손상을 감소시키는 효과를 나타냄을 확인하여, 뇌졸중의 예방 및 치료에 유용하게 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물 또는 이의 분획물의 우수한 뇌졸중 예방 또는 치료 효과를 최초로 규명하고, 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학 조성물; 상기 약학 조성물을 이용한 뇌졸중의 예방 또는 치료 방법; 및 상기 약학 조성물의 제조방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 뇌졸중 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 약학 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제조하기 위한, 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 조성물의 뇌졸중 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명의 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물 또는 이의 분획물은 우수한 뇌졸중 예방 또는 치료 효과를 나타내므로, 약학 조성물 또는 식품에 유효성분으로 포함되어 뇌졸중의 예방제, 치료제 또는 개선제 등의 개발에 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 in vitro 실험 일정을 간략히 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 생약 추출물 처리에 의한 신경세포 보호 효과 및 MAP2- 면역반응성 을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 생약 추출물 처리에 의한 세포 자멸 감소 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 생약 추출물 처리에 의한 세포 자멸 감소 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 생약 추출물 처리에 의한 칼슘대사 조절 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 생약 추출물 처리에 의한 칼슘대사 조절 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 생약 추출물의 신경세포 손상에 대한 특이적인 보호 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 in vivo 실험 일정을 간략히 나타낸 도이다.
도 9는 중뇌동맥협착(Middle Cerebral Artery Occlusion; MCAo) 동물모델에서 본 발명의 생약 추출물 투여에 의한 뇌 조직 손상 감소 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 중뇌동맥협착(Middle Cerebral Artery Occlusion; MCAo) 동물모델에서 본 발명의 생약 추출물 투여에 의한 행동장애 개선 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 중뇌동맥협착(Middle Cerebral Artery Occlusion; MCAo) 동물모델에서 본 발명의 생약 추출물 투여에 의한 염증 관련 유전자 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 중뇌동맥협착(Middle Cerebral Artery Occlusion; MCAo) 동물모델에서 본 발명의 생약 추출물 투여에 의한 소포체 스트레스 및 세포 자멸 관련 유전자 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 13은 중뇌동맥협착(Middle Cerebral Artery Occlusion; MCAo) 동물모델에서 본 발명의 생약 추출물 투여에 의한 신경영양인자 관련 유전자 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에서 용어, "구기자(Lycium chinense)"는 구기자나무의 열매를 의미한다. 구기자는 보통 달걀모양이나 긴 타원형의 형태를 가지고 있다. 상기 구기자는 강장제, 해열제로 쓰이며 간기능 보호 작용이 뛰어난 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어, "숙지황(Rehmannia glutinosa)"은 지황의 뿌리를 쪄서 말린 한약재이다. 지황은 현삼과에 딸린 여러해살이 약용식물로 그 뿌리가 한방에서 약재로 이용된다.
본 발명에서 용어, "산수유(Cornus officinalis)"는 산수유나무의 열매를 말한다.
본 발명에서 용어, "산약(Dioscorea rhizome)"은, 마과(科: Dioscoreaceae)에 속한 디오스코레아 바타타스(Dioscorea batatas(=Dioscorea opposita)), 디오스코레아 오포시타(Dioscorea opposite), 디오스코레아 자포니카(Dioscorea japonica), 디오스코레아 테누이페스(Dioscorea tenuipes)의 뿌리 줄기를 말한다.
본 발명에서 용어, "복령(Poria cocos)"은 소나무 뿌리에 외생균근이 공생하여 생긴 것을 말한다. 상기 복령은 구체적으로 소나무 뿌리에 기생하는 잔나비걸상과의 복령(Poria cocos Wolf)의 균핵으로, 바깥 층을 거의 제거하여 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "택사(Alisma rhizome)"는 질경이 택사(Alisma orientale Juzepczuk) 또는 기타 동속 근연식물(Alismataceae)의 덩이 뿌리줄기를 말한다.
본 발명에서 용어, "목단피(Paeonia suffruticosa)"는 작약과의 모란의 뿌리껍질로 만든 약재를 말한다. 상기 목단피는 진통, 진정, 해열, 항경련작용, 항염증작용, 혈전형성 억제 등의 약리작용을 가지는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 용어, “추출물”은 어떤 물질을 추출 처리하여 얻어지는 물질을 의미하는 것으로, 구체적으로 상기 본 발명의 추출처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나, 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
상기 추출물은 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 복합 추출물 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적으로는, 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물일 수 있다.
상기 추출물을 추출하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출물 추출 방법의 비제한적인 예로는, 용매 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 추출물에 사용되는 추출용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출용매의 비제한적인 예로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 추출용매는 열수일 수 있다.
본 발명의 용어, “분획물”은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 뇌졸중을 억제하는 효과를 나타낼 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 다양한 용매를 처리하여 수행하는 용매 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법 및 이의 조합 등이 될 수 있다.
본 발명에서 상기 분획물을 얻는 데에 사용되는 분획 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 증류수, 알코올 등의 극성 용매; 헥산(Hexan), 에틸 아세테이트(Ethyl acetate), 클로로포름(Chloroform), 디클로로메탄(Dichloromethane) 등의 비극성 용매 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 분획 용매 중 알코올을 사용하는 경우에는 구체적으로는 C1 내지 C4의 알코올을 사용할 수 있다.
본 발명에서 “뇌졸중(stroke)”이란, 뇌혈류 이상으로 인해 갑작스레 유발된 국소적인 신경학적 결손 증상을 의미한다. 이러한 뇌졸중에는 혈전 등으로 뇌혈관이 막혀 뇌세포의 사멸이 유도되는 뇌경색, 또는 뇌혈관이 터져서 발생하는 뇌출혈이 포함될 수 있다. 구체적인 뇌졸중의 증세로서는 갑작스러운 두통 및 구토가 있고, 반신 마비나 신체 일부의 마비, 신체 일부의 감각마비와 소실이 있을 수 있으며, 언어장애(실어증 혹은 발음장애), 안면신경장애, 운동실조 등이 나타날 수 있다. 본 발명에서 뇌졸중은 중풍을 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 뇌졸중은 구체적으로는 허혈성 뇌졸중인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 “허혈성 뇌졸중”이란 뇌혈관의 폐색으로 인해 뇌혈류가 감소되어 뇌조직이 기능을 하지 못하는 상태로, 뇌경색과 일과성 허혈성 발작 모두를 통틀어서 일컫는 용어이다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 뇌졸중으로 인해 손상된 운동 기능 회복을 촉진하거나, 또는 경색 크기를 감소시키는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 조성물을 처리한 신경세포배양에서 신경세포 독성 물질로 인한 신경세포 손상이 대조군에 비하여 감소됨을 확인함으로써, 뇌졸중 예방에 효과를 보임을 확인하였다(도 1 및 도 2).
또한, 본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 조성물을 처리한 신경세포배양에서 신경세포 독성 물질로 인한 신경세포의 세포자멸사 (apoptosis)가 대조군에 비하여 감소됨을 확인함으로써, 뇌졸중 예방에 효과를 보임을 확인하였다 (도 3 및 도 4).
상기 결과를 통해, 본 발명의 조성물이 뇌졸중의 예방 또는 치료 용도로 우수한 효과가 있음을 확인하였다.
본 발명의 용어, “예방”은 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 뇌졸중의 성장을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어, “치료”는 상기 약학 조성물의 투여에 의해 뇌졸중의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물에 포함되는 상기 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물은 구기자 1 중량 대비하여, 숙지황 0.7 내지 1.3, 산수유 0.2 내지 0.8, 산약 0.2 내지 0.8, 복령 0.01 내지 0.55, 택사 0.01 내지 0.55 및 목단피 0.01 내지 0.55의 중량비로 혼합된 것일 수 있고, 구체적으로 구기자 1 중량 대비하여, 숙지황 0.9 내지 1.1, 산수유 0.4 내지 0.6, 산약 0.4 내지 0.6, 복령 0.15 내지 0.35, 택사 0.15 내지 0.35 및 목단피 0.15 내지 0.35의 중량비로 혼합된 것일 수 있고, 보다 구체적으로 구기자 1 중량 대비하여, 숙지황 0.95 내지 1.05, 산수유 0.45 내지 0.55, 산약 0.45 내지 0.55, 복령 0.2 내지 0.3, 택사 0.2 내지 0.3 및 목단피 0.2 내지 0.3의 중량비로 혼합된 것일 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 상기 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물은 구기자 1 중량 대비하여, 숙지황 1, 산수유 0.5, 산약 0.5, 복령 0.25, 택사 0.25 및 목단피 0.25의 중량비로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물에 포함된 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 80 중량%, 0.0001 내지 50 중량%, 보다 구체적으로 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은, 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있는데, 상기 담체는 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 폴리락틱액시드(Poly Lactic Acid), 폴리-L-락틱액시드(poly-L-lactic acid), 광물유 등을 들 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사 용액의 주사제 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥내, 복강내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다. 이러한 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 또는 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토즈, 젤라틴 등을 혼합하여 제형화한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제가 사용될 수 있다.
경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 예시될 수 있으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액제, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61. 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 한편, 주사제에는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제, 방부제 등과 같은 종래의 첨가제가 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시 양태는 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
이때, 상기 용어 “구기자”, “숙지황”, “산수유”, “산약”, “복령”, “택사”, “목단피”, “추출물”, “분획물” 및 “예방”의 정의는 상기에서 서술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "개선"은 상기 조성물의 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 따른 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물은 우수한 뇌졸중 억제 효과를 나타내므로, 뇌졸중의 예방 또는 개선을 목적으로 식품 조성물에 포함될 수 있으며, 상기 식품 조성물은 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 뇌졸중의 예방 또는 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있다.
본 발명에서 용어, "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강기능식품 등의 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함하며, 본 발명의 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물 또는 이의 분획물을 포함할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, '기능성'은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 한편, 건강식품은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품은 건강 보조 목적의 식품을 의미하는데, 경우에 따라, 건강기능식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용될 수 있다.
본 발명의 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물 또는 이의 분획물은 그대로 첨가되거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조 가능하며, 상기 제조 시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 구체적으로, 상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 또한, 상기 식품 조성물은 방부제, 살균제, 산화방지제, 착색제, 발색제, 표백제, 조미료, 감미료, 향료, 팽창제, 강화제, 유화제, 증점제, 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
또한, 상기 식품의 제형은 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품은 뇌졸중의 예방 또는 개선의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
본 발명의 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피는 뇌졸중의 예방 또는 개선 효과를 나타낼 수 있다면 식품 조성물에 다양한 중량%로 포함될 수 있다. 구체적으로 식품 조성물의 총 중량 대비 0.00001 내지 100 중량% 또는 0.01 내지 80 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 건강 및 위생을 목적으로 장기간 섭취할 경우에는 상기 범위 이하의 함량을 포함할 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시 양태는 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 뇌졸중 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.
이때, 상기 용어 “구기자”, “숙지황”, “산수유”, “산약”, “복령”, “택사”, “목단피”, “추출물”, “분획물”, “예방” 및 “개선”의 정의는 상기에서 서술한 바와 같다.
본 발명에 따른 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물 또는 이의 분획물은 우수한 뇌졸중 치료 효과를 나타내므로, 뇌졸중의 예방 또는 개선을 목적으로 사료 조성물에 포함될 수 있으며, 상기 사료 조성물은 동물이 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 뇌졸중의 예방 또는 개선에 대하여 높은 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 용어, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미한다.
상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시 양태는 상기 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 뇌졸중 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
이때, 상기 “약학 조성물”, “예방” 및 “치료”에 대한 설명은 상기에서 서술한 바와 같다.
본 발명의 약학 조성물은 뇌졸중의 예방 또는 치료 효과를 나타내므로, 이를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 본 발명의 방법은 뇌졸중의 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 용어, "투여"는 적절한 방법으로 개체에게 상기 조성물을 도입하는 것을 의미한다.
본 발명의 용어, "개체"는 뇌졸중이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 쥐, 생쥐, 가축 등을 포함하는 포유 동물일 수 있으나, 본 발명의 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물로 뇌졸중의 예방 또는 치료가 가능한 개체는 제한 없이 포함된다. 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 개체에서 인간은 제외될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 상기 약학 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으며, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
예컨대, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
구체적으로, 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 동물에 하루 동안 0.1 내지 200 mg/체중(kg), 구체적으로는 1 내지 200 mg/체중(kg), 10 내지 150 mg/체중(kg) 또는 40 내지 110 mg/체중(kg), 더욱 구체적으로는 45 내지 55 mg/체중(kg), 보다 구체적으로는 약 50 mg/체중(kg)으로 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물의 투여 빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시 양태는 상기 약학 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 방법은 (a) 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피에 각각 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 또는 이들의 혼합 용매를 가하여 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물을 각각 추출하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 추출한 각 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물을 감압 농축하여 농축물을 제조하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 제조된 각 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 농축물을 건조하여 건조엑스를 제조하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 제조된 각 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 택사 및 목단피 건조엑스에 옥수수전분을 혼합하는 단계;
(e) 상기 (c) 단계에서 제조된 복령 건조엑스 또는 상기 (d) 단계에서 제조된 옥수수전분이 혼합된 각 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 택사 및 목단피 건조엑스를 1: 1: 0.5: 0.5: 0.25: 0.25: 0.25 중량비(w/w)로 혼합하여 생약 복합 추출물의 건조엑스를 제조하는 단계; 및
(f) 상기 (e) 단계에서 제조된 생약 복합 추출물의 건조엑스에 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 또는 이들의 혼합 용매를 추가하는 단계;를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제조 방법에 있어, 상기 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물은 상기 재료 각각을 건조, 분쇄 또는 추출하여 혼합하거나, 상기 재료 중 두 개 이상을 혼합하여 건조, 분쇄 또는 추출하여 제조하거나, 또는 상기 재료 중 일부는 추출하고 다른 일부는 건조 후 분쇄하여 혼합하여 제조할 수 있다.
이하, 본 발명의 제조 방법의 일 구체예를 설명한다.
먼저, 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피에 각각 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 또는 이들의 혼합 용매를 가하여 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물을 각각 추출한다((a) 단계).
본 발명의 제조 방법에 있어, 상기 (a) 단계 이전에, 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피를 각각 건조 후 파쇄하는 단계를 추가적으로 포함하여 제조할 수 있다.
상기 본 발명의 제조 방법에 있어, 추출하는 경우 상기 재료의 건조물 또는 분쇄물에 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합 용매를 가하여 추출할 수 있고, 구체적으로는 물을 용매로 가하여 추출할 수 있다.
본 발명의 제조 방법에 있어, 상기 가하는 용매의 양은 상기 추출하고자 하는 재료의 5 내지 15배 중량 또는 부피, 구체적으로 10 내지 12배를 가할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제조 방법에 있어, 상기 추출은 진탕 추출, Soxhlet 추출 또는 환류추출 방법을 이용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한 추출 온도는 40 내지 100℃, 추출 시간은 0.5 내지 24시간일 수 있으며, 추출회수는 1 내지 5회일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 추출은 90 내지 110℃의 온도 범위에서 2 내지 3시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이어서, 상기 (a) 단계에서 추출한 각 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물을 감압 농축하여 농축물을 제조한다((b) 단계).
이어서, 상기 (b) 단계에서 제조된 각 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 농축물을 건조하여 건조엑스를 제조한다((c) 단계).
본 발명의 제조 방법에 있어, 상기 추출물은 농축 및 건조될 수 있으며, 상기 농축은 감압농축, 진공 농축일 수 있으며, 구체적으로는 감압농축일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 건조는 동결건조, 감압건조, 진공건조, 비등건조 또는 분무건조 방법일 수 있고, 구체적으로는 동결건조일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 감압 농축은 40 내지 45℃의 온도 범위에서 수행 될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이어서, 상기 (c) 단계에서 제조된 각 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 건조엑스를 1: 1: 0.5: 0.5: 0.25: 0.25: 0.25 중량비(w/w)로 혼합하여 생약 복합 추출물의 건조엑스를 제조한다((d) 단계).
본 발명의 제조 방법에 있어, 상기 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물은 구기자 1 중량 대비하여, 숙지황 0.7 내지 1.3, 산수유 0.2 내지 0.8, 산약 0.2 내지 0.8, 복령 0.01 내지 0.55, 택사 0.01 내지 0.55 및 목단피 0.01 내지 0.55의 중량비로 혼합하여 제조될 수 있고, 구체적으로 구기자 1 중량 대비하여, 숙지황 0.9 내지 1.1, 산수유 0.4 내지 0.6, 산약 0.4 내지 0.6, 복령 0.15 내지 0.35, 택사 0.15 내지 0.35 및 목단피 0.15 내지 0.35의 중량비로 혼합하여 제조될 수 있고, 보다 구체적으로 구기자 1 중량 대비하여, 숙지황 0.95 내지 1.05, 산수유 0.45 내지 0.55, 산약 0.45 내지 0.55, 복령 0.2 내지 0.3, 택사 0.2 내지 0.3 및 목단피 0.2 내지 0.3의 중량비로 혼합하여 제조될 수 있다.
이어서, 상기 (d) 단계에서 제조된 생약 복합 추출물의 건조엑스에 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 또는 이들의 혼합 용매를 추가한다((e) 단계).
구체적으로는 물을 용매로 가할 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제조하기 위한, 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 조성물의 뇌졸중 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
이하 본 발명을 하기 예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 생약 추출물 건조엑스의 제조
실시예 1-1: 구기자 건조엑스의 제조
생약을 정선하여 대한약전 통칙[절도 및 분말도] 항목에 따라 조절로 한 구기자 1kg에 정제수를 5 내지 10배 부피로 넣고, 90 내지 110℃에서 2 내지 3시간 추출한 다음, 여과한 액을 저온(40 내지 45℃) 감압 농축하여 건조한 다음 건조엑스 약 367.6g을 얻은 후 옥수수전분(USP) 약 211.8g을 혼합하여 제조하였다.
실시예 1-2: 숙지황 건조엑스의 제조
생약을 정선하여 대한약전 통칙[절도 및 분말도] 항목에 따라 조절로 한 숙지황 1kg에 정제수를 5 내지 10배 부피로 넣고, 90 내지 110℃에서 2 내지 3시간 추출한 다음 여과한 액을 저온(40 내지 45℃) 감압 농축하여 건조한 다음 건조엑스 약 857.7g을 얻은 후 옥수수전분(USP) 약 403.6g을 혼합하여 제조하였다.
실시예 1-3: 산수유 건조엑스의 제조
생약을 정선하여 대한약전 통칙[절도 및 분말도] 항목에 따라 조절로 한 산수유 1kg에 정제수를 5 내지 10배 부피로 넣고, 90 내지 110℃에서 2 내지 3시간 추출한 다음 여과한 액을 저온(40 내지 45℃) 감압 농축하여 건조한 다음 건조엑스 약 270.2g을 얻은 후 옥수수전분(USP) 약 180.1g을 혼합하여 제조하였다.
실시예 1-4: 산약 건조엑스의 제조
생약을 정선하여 대한약전 통칙[절도 및 분말도] 항목에 따라 조절로 한 산약 1kg에 정제수를 5 내지 10배 부피로 넣고, 90 내지 110℃에서 2 내지 3시간 추출한 다음 여과한 액을 저온(40 내지 45℃) 감압 농축하여 건조한 다음 건조엑스 약 149.0g을 얻은 후 옥수수전분(USP) 약 73.3g을 혼합하여 제조하였다.
실시예 1-5: 복령 건조엑스의 제조
생약을 정선하여 대한약전 통칙[절도 및 분말도] 항목에 따라 조절로 한 산수유 1kg에 정제수를 5 내지 10배 부피로 넣고, 90 내지 110℃에서 2 내지 3시간 추출한 다음 여과한 액을 저온(40 내지 45℃) 감압 농축하여 건조한 다음 건조엑스 약 980.3g을 얻었다.
실시예 1-6: 택사 건조엑스의 제조
생약을 정선하여 대한약전 통칙[절도 및 분말도] 항목에 따라 조절로 한 택사 1kg에 정제수를 5 내지 10배 부피로 넣고, 90 내지 110℃에서 2 내지 3시간 추출한 다음 여과한 액을 저온(40 내지 45℃) 감압 농축하여 건조한 다음 건조엑스 약 247.5g을 얻은 후 옥수수전분(USP) 약 165g을 혼합하여 제조하였다.
실시예 1-7: 목단피 건조엑스의 제조
생약을 정선하여 대한약전 통칙[절도 및 분말도] 항목에 따라 조절로 한 목단피 1kg에 정제수를 5 내지 10배 부피로 넣고, 90 내지 110℃에서 2 내지 3시간 추출한 다음 여과한 액을 저온(40 내지 45℃) 감압 농축하여 건조한 다음 건조엑스 약 373.1g을 얻은 후 옥수수전분(USP) 약 183.7g을 혼합하여 제조하였다.
실시예 2: 생약 추출물의 건조엑스의 제조
상기 실시예 1-1 내지 실시예 1-7에서 제조한 건조 엑스를 1: 1: 0.5: 0.5: 0.25: 0.25: 0.25 중량비(w/w)로 포함하도록 혼합하여 제조하였다.
실험예 1: 본 발명의 생약 추출물 처리로 인한 in vitro 신경세포 보호 효과 확인
실험예 1-1: 실험 준비
일차배양한 신경세포는 임신한 쥐의 태아에서 얻은 배아(E14-15)에서 후두근, 선조체, 해마를 제거하여 피질 조직을 분리하였다. 상온에서 20분 동안 트립신 용액에 두었다. 미리 데워진 DMEM 배양액으로 트립신을 씻어낸 후, 세포를 분리하였고 폴리에틸렌아민으로 사전 코팅된 96-well 세포 배양 플레이트에서 배양을 시작하였다. 2~3일 간격으로 항산화 물질이 첨가된 배지(antioxidant, B27;+AO)를 교환하고, 배양 7일차부터 항산화효과를 배제하기 위해 항산화 물질이 배제된 배지(-AO)로 교환하였다.
본 발명의 생약 추출물의 뇌졸중 신경세포 손상에 대해 신경세포 보호효과를 측정하기 위하여 배양 10일차에 신경독성 물질(glutamate, Glu, G, 100uM), 상기 실시예 2에서 제조한 생약 건조엑스를 10% DMSO가 포함된 식염수(saline)에 용해한 생약 추출물(PM, 0.1mg/ml 또는 1mg/ml) 또는 대조군(10% DMSO가 포함된 식염수, Vehicle, Veh)을 배지와 함께 세포에 투여하였으며, 48시간 후 세포들은 면역세포화학(immunocytochemistry)을 위해 4% paraformaldehyde을 이용하여 고정하였다.
실험예 1-2: MAP2- 면역반응성 (MAP2-ir) 확인
도 2에 나타난 바와 같이, 신경독성 물질인 글루타메이트를 배양중인 신경세포에 첨가하였을 때, 대조군인 그룹(도 2의 A)에 비해 신경독성물질인 글루타메이트를 처리한 그룹(도 2의 B)에서 세포수가 현저히 감소되는 것을 확인하였다.
반면, 본 발명의 생약 추출물 처리군(도 2의 C 및 도 2의 D)은 신경독성 물질인 글루타메이트 처리 조건에서 글루타메이트에 의한 세포수의 감소를 방지할 수 있음을 확인하였다.
또한, 이를 Neuronal 세포들의 마커인 microtubulin-associated protein 2 (MAP2)를 이용하여, 면역세포화학 실험을 수행한 결과, 도 2의 E에 나타난 바와 같이, 본 발명의 생약 추출물 처리군은 신경 세포의 마커인 MAP2의 면역반응성(immunoreactivity)이 대조군(40%)에 비하여 저농도에서 약 20%, 고농도에서 약 40% 증가된 것을 확인하였다.
그에 따라, 본 발명의 생약 추출물이 신경세포 보호 효과로 인한 뇌졸중 예방 효과가 있음을 확인하였다.
실험예 1-3: TUNEL activity 확인
도 3에 나타난 바와 같이, 세포 자멸의 측면에서도 글루타메이트를 배양중인 신경세포에 첨가하였을 때, 대조군인 그룹(도 3의 A)에 비해 신경독성물질인 글루타메이트를 처리한 그룹(도 3의 B)에서는 세포 자멸이 유도되는 것을 확인하였다. 그러나, 본 발명의 생약 추출물을 투여한 저농도 그룹(도 3의 C) 및 고농도 그룹(도 3의 D)에서는 독성 물질인 글루타메이트에 의한 세포 자멸을 방지할 수 있음을 확인하였다.
한편, TUNEL은 apoptotic DNA fragmentation을 검출하는 방법으로, apoptotic cell을 식별 및 정량화 하거나 개별 세포에서 과도한 DNA 파손을 검출하는데 사용한다. 구체적으로, TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase) 효소를 이용하여, UTP(uridine triphosphate)를 DNA 말단에 붙여 DNA fragmentation이 일어났는지 여부를 확인하였다(In Situ Cell Death Detection Kit; Roche, Indianapolis, IN).
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 생약 추출물을 투여한 그룹에서 세포 자멸도가 현저하게 줄어든 것을 확인하였다.
그에 따라, 본 발명의 생약 추출물이 신경세포 보호 효과로 인한 뇌졸중 예방 효과가 있음을 확인하였다.
실험예 1-4: lntracellular Ca 2+ fluorescence 확인
비가역성 뇌손상은 Ca2+의 세포 내 축적으로 인한 염기성 탈분극화(anoxic depolarization of the cell membrane) 후에 일어난다. N-메틸-D 아스파르트산염 수용체(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR)는 Ca2+ 매개의 neuronal death에 밀접하게 관계가 있기 때문에, NMDAR의 활성화를 통해 유발된 Ca2+ 축적을 gCaMP5라는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표 단백질의 형광을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, NMDAR을 자극하기 위해 NMDA 첨가하였을 때, 대조군인 그룹(도 5의 A)에서 신경세포내 Ca2+ 유입으로 세포 내 Ca2+ 농도가 증가하는 것을 확인하였다. 그러나, NMDA를 첨가하기 3분(180초) 전에 본 발명의 생약 추출물을 투여한 그룹(도 5의 B)에서는 신경세포 내 Ca2+ 유입이 현저하게 적은 것을 확인하였다.
구체적으로, 도 6의 A는 신경세포 배양 중 NMDA 물질을 처리하기 3초 전의 대조군(control)이며, 도 6의 A1은 신경세포 배양 중 NMDA 물질 처리 5초 후의 대조군(control)이고, 도 6의 B는 신경세포 배양 중 NMDA 물질을 처리하기 3초 전의 본 발명의 생약 추출물을 투여한 그룹(PM012)이며, 도 6의 B1은 NMDA 물질 처리 5초 후의 발명의 생약 추출물을 투여한 그룹(PM012)이다 (NMDA 실험).
이어서, 상기 NMDA 실험 이후, 세포들을 고정하여 면역세포화학법을 이용하여 각각의 marker들에 대한 발현양을 분석하여 도 6의 C에 나타내었다.
구체적으로, 도 6의 C의 상단 부분은 대조군(control), 도 6의 C의 하단 부분은 각각 본 발명의 생약 추출물을 투여한 그룹(PM012)이다.
이어서, 상기 NMDA 실험의 각각의 실험군에서 각각 대조군 44개(control), 본 발명의 생약 추출물을 투여한 그룹 33개(PM012)의 세포들에 대해 칼슘유입 지표인 녹색 (GFP)의 발현량을 시간에 따라 비교한 결과를 도 6의 D에 나타내었다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, gCaMP5로 확인된 Ca2+은 NMDA 5μM를 투여한 시점에서 2초(s)이내에 세포 내 유입이 증가하였지만, 본 발명의 생약 추출물 투여군은 NMDA로 인한 Ca2+ 유입이 억제되고, Ca2+ 수준이 유지되는 것을 확인하였다.
그에 따라, 본 발명의 생약 추출물이 칼슘대사 조절에 의한 신경세포 보호 효과로 인한 뇌졸중 예방 효과가 있음을 확인하였다.
실험예 1-5: 신경세포 손상에 대한 특이적인 보호 효과 확인
신경독성 물질(glutamate, Glu, G, 100uM), 상기 실시예 2에서 제조한 생약 추출물(PM, 0.1mg/ml 또는 1mg/ml) 또는 대조군(Vehicle, Veh)을 DMSO를 용매로 이용하여 제조한 것을 제외하고는, 상기 실험예 1-2과 동일한 방법으로 상기 실시예 2에서 제조한 생약 추출물의 신경세포 보호 효과를 확인하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, DMSO 독성 또는 본 발명의 생약 추출물 자체로는 MAP2의 면역반응성(immunoreactivity)을 변화시키지 않음을 확인하였다. 반면, 신경독성 물질인 글루타메이트 및 본 발명의 생약 추출물 처리군에서는 MAP2의 면역반응성(immunoreactivity)이 글루타메이트 단독 처리군 또는 글루타메이트 및 DMSO 처리군에 비하여 증가하는 것을 확인하였다.
그에 따라, 본 발명의 생약 추출물이 신경세포 손상에 대한 특이적인 보호 효과를 보여 뇌졸중 예방 효과가 있음을 확인하였다.
실험예 2: 본 발명의 생약 추출물 처리로 인한 in vivo 뇌졸중 예방 효과 확인
실험예 2-1: 실험동물의 준비
실험동물로 300g 내외의 8 ~ 9주령의 수컷 스프라그 돌리(Sprague Dawley, BioLASCO, Taiwan) 랫트(rat)를 구입하여 사료와 물을 충분히 공급하면서 실험환경에 적응하도록 하였다. 본 발명의 생약 추출물의 국소 뇌허혈에 의한 신경세포 손상에 대하여 신경세포 보호 효과를 측정하기 위하여 허혈성 뇌졸중 동물실험 모델(중대뇌동맥 결찰, Middle Cerebral Artery occlusion; MCAo)을 사용하였다. 뇌졸중 수술 2일 전부터 대조군에는 10% DMSO가 포함된 식염수(saline), 상기 실시예 2에서 제조한 생약 건조엑스는 10% DMSO가 포함된 식염수(saline)에 용해하여 복강주사로 주입한 후, 2일차에 중대뇌동맥폐쇄술(MCAo)을 진행하였다 (도 9)(Yu SJ, Reiner D, Shen H, Wu KJ, Liu QR, Wang Y. Time-dependent protection of CB2 receptor agonist in stroke. PLoS One. 2015;10: e0132487).
구체적으로, 먼저 상기 랫트를 클로랄 하이드레이트(chloral hydrate, 400mg/kg, i.p.) 마취를 한 후, 오른쪽 두개골에서 약 2 ~ 4㎜의 개두술을 진행하였다. 오른쪽 MCA는 10-0으로 봉합하고, 경동맥은 클립으로 혈류를 막았다. 그 후, 60분 후에 MCA의 봉합과 경동맥의 클립을 제거함으로써 혈류의 재관류를 시행하였다. 수술은 체온은 37℃에서 모니터링 및 유지하였고, 마취에서 회복된 동물들은 온도 조절 인큐베이터안에서 체온을 37℃로 유지시켰다.
실험예 2-2: TTC(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride) 염색에 의한 생약 추출물의 뇌졸중 예방 효과 확인
뇌혈류 감소가 일정 시간 이상 지속되면 뇌조직의 괴사(조직이나 세포의 일부가 죽는 것)가 시작된다. 뇌조직이 괴사되어 회복 불가능한 상태에 이르렀을 때 이를 뇌경색(cerebral infarction)이라고 하며, 이를 미토콘드리아의 디하이드로게네이즈(dehydrogenase) 반응을 이용한 TTC(2,3,5-Triphenyltetrazolium Chloride) 염색을 하면 죽은 조직은 흰색으로, 살아있는 조직은 붉게 염색할 수 있다.
생약 추출물의 뇌졸중 예방 효과를 확인하기 위하여, 실험동물에 50mg/㎏, 100mg/㎏로 용량을 달리하여 생약 추출물을 2일간 복강 투여한 후, 상기 실험예 2-1의 방법으로 뇌손상을 유도하였다. 이어서, 뇌졸중 유발 2일 경과 후, 실험동물(실험군 및 대조군)의 뇌를 적출하였다.
적출된 뇌는 2mm 간격으로 브레인 매트릭스(brain matrix)를 사용하여 절편을 만든 후, 2% TTC(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride) 용액에서 5분간 배양한 후, 4% PFA 용액으로 고정시켰다. 염색이 끝난 뇌조직 절편은 디지털 스캐너와 이미지 도구 프로그램(텍사스 대학교 보건 과학 센터)으로 뇌손상 부위를 측정하였다. 그 결과는 도 9(도 9의 A: 염색된 뇌 절편 사진, 도 9의 B: A의 손상부분을 수치화한 그래프)에 나타내었다.
실험에서 사용된 TTC 염색은 정상세포에서는 미토콘드리아 내의 디하이드로제나제(dehydrogenase)와 반응하여 붉게 보이나, 뇌경색의 경우는 디하이드로제나제가 소실되어 염색되지 않으므로 백색으로 보여 세포의 비가역적 손상의 유무를 알 수 있는 지표로 널리 사용된다.
그 결과, 도 9의 A에 나타난 바와 같이, 뇌조직 중에서 손상으로 인하여 조직이 자멸한 부위는 염색이 되지 않아 흰색, 정상 부위 조직은 염색이 되어 흑적색을 나타내는 것을 확인하였다. MCAo 수술이 뇌 조직의 손상을 유발하는 것을 확인하였고(Veh), 본 발명의 생약 추출물을 사전 투여한 경우, 대조군에 비해 뇌손상이 현저히 적어 흑적색 부위의 면적이 넓고, 신경세포가 자멸한 흰색 부위의 면적이 적음을 확인하였다.
또한, 도 9의 B에 나타난 바와 같이, MCAo 수술이 뇌 조직의 손상을 유발하는 것을 확인하였고(Veh), 생약 추출물을 사전 투여한 경우, 50㎎/㎏(p=0.017), 100㎎/㎏(p=0.034)로 유의적인 뇌 조직의 손상 감소 효과를 보임을 확인하였다. 그 이상의 용량인 200mg/kg에서는 뇌 손상의 감소를 보이기는 하였지만, 100mg/kg 투여와는 달리 통계적으로 유의한 뇌 손상의 감소를 보이지는 않았다.
따라서, 본 발명의 생약 추출물의 뇌경색 감소로 인한 뇌졸중 예방 효능을 확인하였다. 즉, 본 발명은 상기에서 사용한 본 발명의 중대뇌동맥 결찰(middle cerebral artery occlusion; MCAo)에 의한 뇌손상 유도 모델을 통해 생약 추출물의 뇌졸중 예방 효과를 명확히 확인한 것으로, 이는 치료 효능을 확인한 것과는 또 다른 측면에서 생약 추출물의 뇌졸중 예방 효능을 명확히 확인한 것이다.
실험예 2-3: 행동테스트 분석을 통한 생약 추출물의 뇌졸중 예방 효과 확인
뇌졸중 유발모델처럼 신경 손상이 유발된 모델은 근육과 신경의 기능이 쇠퇴하여 자발적 행동량이 감소하는 경향을 보인다. 본 실험에서는 뇌졸중이 유발된 실험동물의 행동에 생약 추출물의 투여가 미치는 영향을 확인하기 위하여, 13마리의 실험군(PM012)에 50mg/㎏ 용량으로 본 발명의 생약 추출물을, 9마리의 비히클군(veh)에 비히클을 각각 2일간 복강 투여한 후, 상기 실험예 2-1의 MCAo를 사용하여 뇌손상을 유도하였다. 5마리의 대조군(naive)의 경우, MCAo를 받지 않고 순수 대조군으로 사용되었다. 이어서, 각각의 실험동물을 외부에 바닥에서 10cm 떨어진 곳에 8개의 적외선 센서가 설치된 42×42×31㎤ 사이즈의 투명한 아크릴 상자에 두고 2일(D2, 뇌졸중 유발 2일경과)차에 2시간 동안 활동성을 측정하였다. 투명상자 외부에는 바닥에서 10cm 떨어진 곳에 8개의 적외선 센서가 포함되어 동물들의 움직임을 기록할 수 있다 (Acccuscan, Columbus, OH). 구체적으로, 수직 활동(수직 센서에서 발생한 총 빔 중단 수, VACTV), 총 이동 거리(센티미터로 이동한 거리, TOTDIST), 수평 활동(수평 센서에서 발생한 총 빔 중단 수, HACTV)는 Versamax 프로그램(Accus, Columbus, O)에 의해 분석되었다. 그 결과는 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, 비히클군(veh)에서 실험동물의 움직임이 최소화 된 반면, 본 발명의 생약 추출물(50mg/㎏)을 미리 투여한 실험군(PM012)에서는 뇌졸중의 유도로 감소된 HACTV (도 10의 A), TOTDIST (도 10의 B) 및 VACTV (도 10의 C)를 뇌졸중이 유도되지 않은 대조군(naive) 수준으로 회복함을 확인하였다. 즉, 본 발명의 생약 추출물의 처리는 뇌졸중 쥐에서 전체적인 운동량을 현저하게 증가시킴을 확인하였다.
그에 따라, 본 발명의 생약 추출물이 뇌졸중 예방 효능이 있음을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명은 상기에서 사용한 본 발명의 중대뇌동맥 결찰 (middle cerebral artery occlusion; MCAo)에 의한 뇌손상 유도 모델을 통해 생약 추출물을 미리 투여한 경우, 뇌졸중 후 동반되는 행동장애의 개선이 나타남을 확인하여 뇌졸중 예방 효과를 명확히 확인한 것으로, 이는 치료 효능을 확인한 것과는 또 다른 측면에서 생약 추출물의 뇌졸중 예방 효능을 명확히 확인한 것이다.
실험예 2-4: 염증 관련 유전자 확인
염증 관련 유전자를 확인하기 위하여, 실험동물에 50mg/㎏ 용량으로 본 발명의 생약 추출물을 2일간 복강 투여한 후, 상기 실험예 2-1의 방법으로 뇌손상을 유도하였다. 상기 랫트는 MCAo 수술 2일차에 염증 관련 특이 유전자 발현 분석을 위해 대뇌피질 조직을 채취했다. 이는 PCR 실험을 위해 사용되었으며, 소교세포 마커(IBA1; Anti-ionized Ca2+ binding adapter molecule 1), 염증 촉진 사이토카인(IL-6; Interleukin-6), M1 표시인자(CD86; pro-inflammatory), M2 표지인자(CD206; anti-inflammatory)를 통해 유전자 분석을 하였다(각각, 도 11의 A 내지 도 11의 D). 구체적으로, lesioned는 뇌졸중이 유발된 뇌 반구를 나타내는 것이며, Non-lesioned는 뇌졸중이 유발되지 않은 뇌 반구를 나타내는 것이다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, IBA1과 IL-6의 마커들을 이용하여 확인한 결과, 본 발명의 생약 추출물 그룹에서 발현된 소교세포 마커(IBA1)와 염증 촉진 사이토카인(IL-6)은 대조군에 비해 유의하게 감소한 것을 확인하였다. 이를 통해 본 발명의 생약 추출물이 소교세포 활성 등 염증을 억제하여 신경세포 자멸을 억제하는 것을 확인하였다.
또한, 구기지황탕 추출물을 처리한 그룹에서 MCAo 수술로 인해 증가된 M1 표시인자(proinflammatory marker; CD86)의 발현을 억제하는 것을 확인하였고, 활성화된 M2표시인자(anti-inflammatory marker; CD206)가 대조군에 비해 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 생약 추출물 처리가 염증 촉진 인자들을 분비하여 신경 손상을 유발하는 M1 type을 대식작용에 의해 손상된 세포 잔해 제거 및 신경보호를 촉진하는 M2 type으로의 변화를 유도하고, M2 type의 증가는 허혈성 뇌졸중을 회복하는 동안 뇌 조직 복구에 기여하는 것을 시사한다.
그에 따라, 본 발명의 생약 추출물이 항염증 효능에 의한 신경세포 보호 효과로 인한 뇌졸중 예방 효과가 있음을 확인하였다.
실험예 2-5: ER stress 및 세포 자멸 관련 유전자 확인
소포체(endoplasmic reticulum, ER)에 존재하는 ATF6, BIP, CHOP, IRE1, PERK, SIGMAR1 등 유전자들은 신호전달 과정은 세포의 생존에 관련되어 있을 뿐만 아니라 세포자멸에도 관여하는데, 세포에 대한 스트레스 상황이 매우 강하거나 지속적으로 일어나면 소포체의 기능이 비 정상적으로 작용하여 소포체 스트레스에 의한 세포자멸사를 유도한다.
소포체 스트레스 및 세포 자멸에 관여하는 유전자의 발현 변화를 확인하기 위하여, 실험동물에 50mg/㎏ 용량으로 본 발명의 생약 추출물을 2일간 복강 투여한 후, 상기 실험예 2-1의 방법으로 뇌손상을 유도하였다. 상기 랫트는 MCAo 수술 2일차에 소포체 스트레스와 세포자멸에 대한 특이 유전자 발현 분석을 위해 대뇌피질 조직을 채취했다. 이는 PCR 실험을 사용하였으며, 소포체 막통과 신호전달 물질 ARF6(activating transcription factor 6), BIP(immunoglobulin-binding protein), CHOP(C/EBP homologous protein), IRE1(inositol requiring 1), PERK(protein kinase PKR-like ER kinase), SIGMAR1(Sigma Non-Opioid Intracellular Receptor 1); 및 세포자멸사의 마커인 Caspase-3 발현을 측정하였다(각각, 도 12의 A 내지 도 12의 G). 구체적으로, lesioned는 뇌졸중이 유발된 뇌 반구를 나타내는 것이며, Non-lesioned는 뇌졸중이 유발되지 않은 뇌 반구를 나타내는 것이다.
그 결과, 도 12의 A 내지 도 12의 F에 나타난 바와 같이, 본 발명의 생약 추출물 처리 그룹(빨강)에서 소포체 스트레스에 의해 발현이 증가되는 유전자들은 대조군(검정)에 비해 모두 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다.
아울러, 도 12의 G에 나타난 바와 같이, 본 발명의 생약 추출물 처리 그룹(빨강)에서는 대조군(검정)과 비교하였을 때, 세포자멸사의 마커인 Caspase-3의 발현량이 감소하는 것을 확인하였다.
그에 따라, 본 발명의 생약 추출물이 소포체 스트레스에 의한 자멸에 대한 신경세포 보호 효과로 인한 뇌졸중 예방 효과가 있음을 확인하였다.
실험예 2-6: 신경영양인자 관련 유전자 확인
신경영양인자 관련 유전자의 발현 변화를 확인하기 위하여, 실험동물에 50mg/㎏ 용량으로 본 발명의 생약 추출물을 2일간 복강 투여한 후, 상기 실험예 2-1의 방법으로 뇌손상을 유도하였다. 상기 랫트는 MCAo 수술 2일차에 신경영양인자 발현 분석을 위해 대뇌피질 조직을 채취했다. 이는 PCR 실험을 사용하였으며, 신경영양인자인 BDNF(brain-derived neurotrophic factor)와 GDNF(glial cell line-derived neurotrophic factor) 발현을 측정하였다(각각, 도 13의 A 및 도 13의 B). 신경영양인자는 신경세포의 성장 및 분화, 생존에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 본 발명의 생약 추출물 처리 그룹(빨강)에서는 대조군(검정)과 비교하였을 때, 신경인자인 BDNF 및 GDNF의 발현량이 증가하는 것을 확인하였다.
그에 따라, 본 발명의 생약 추출물이 신경인자를 통한 신경세포 보호 효과로 인한 뇌졸중 예방 효과가 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (12)

1: 1: 0.5: 0.5: 0.25: 0.25: 0.25 중량비(w/w)의 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 뇌졸중은 허혈성 뇌졸중인 것인, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 및 이들의 혼합용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매로 추출하여 제조되는 것인, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 열수 추출물인 것인, 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인, 약학 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항의 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 뇌졸중의 예방 또는 치료 방법.
1: 1: 0.5: 0.5: 0.25: 0.25: 0.25 중량비(w/w)의 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 뇌졸중 예방 또는 개선용 식품 조성물.
1: 1: 0.5: 0.5: 0.25: 0.25: 0.25 중량비(w/w)의 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는, 뇌졸중 예방 또는 개선용 사료 조성물.
(a) 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피에 각각 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 또는 이들의 혼합 용매를 가하여 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물을 각각 추출하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 추출한 각 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 추출물을 감압 농축하여 농축물을 제조하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 제조된 각 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 농축물을 건조하여 건조엑스를 제조하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 제조된 각 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피 건조엑스를 1: 1: 0.5: 0.5: 0.25: 0.25: 0.25 중량비(w/w)로 혼합하여 생약 복합 추출물의 건조엑스를 제조하는 단계; 및
(e) 상기 (d) 단계에서 제조된 생약 복합 추출물의 건조엑스에 물, 탄소수 1 내지 6의 알코올 또는 이들의 혼합 용매를 추가하는 단계;
를 포함하는, 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조방법.
제9항에 있어서, 상기 (a) 단계 이전에, 구기자, 숙지황, 산수유, 산약, 복령, 택사 및 목단피를 각각 건조 후 파쇄하는 단계를 추가적으로 포함하는 것인, 방법.
제9항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 추출은 90 내지 110℃의 온도 범위에서 2 내지 3시간 동안 수행되는 것인, 방법.
제9항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 상기 감압 농축은 40 내지 45℃의 온도 범위에서 수행되는 것인, 방법.
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