WO2021071321A1 - 원화, 위령선, 및 천마의 복합 생약 추출물을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

원화, 위령선, 및 천마의 복합 생약 추출물을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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wiryeongseon
neurodegenerative diseases
wonhwa
preventing
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최진규
김신연
박상철
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases comprising a complex herbal extract of Wonhwa, Wiryeongseon, and Chunma as an active ingredient.
  • the present invention relates to a food composition or feed composition for preventing or improving neurodegenerative diseases comprising the herbal extract as an active ingredient.
  • Neurodegenerative brain disease is a disease that causes various conditions such as motor disorders, memory disorders, and cognitive disorders due to neurodegenerative changes.
  • Parkinson's disease is a dopaminergic neuronal cell containing the melanin pigment of substantia nigra pars compactra (SNpc) through various stimuli such as excessive reactive oxygen species production, oxidative stress, misfolded proteins and impaired mitochondrial function. It is known as a disease caused by death and dopamine deficiency in striatum.
  • Dopamine is produced in the black matter of the brain, and the neurons of the black matter are intricately connected to the motor cortex and other parts of the brain, and are connected to a site called the basal ganglia that allows the body to perform smoothly and accurately. Regulates the function of the basal ganglia.
  • Parkinson's disease which is caused by a lack of dopamine secreted from the black matter, is accompanied by symptoms such as tremor, bradykinesia, rigidity, postural instability, and akinesia.
  • Parkinson's disease treatment methods to date have mainly used dopamine supplementation by administering L-dopa, a dopamine precursor, but it is known that continuous use of L-dopa causes serious side effects in many clinical studies (McGeer PL). , McGeer EG. Glial reactions in Parkinson's disease.Mov Disord. 2008;23(4):474-83.). Therefore, the development of natural drugs with fewer side effects than synthetic drugs in Parkinson's disease can be of great help to patients.
  • compositions for preventing or treating Parkinson's disease containing Baekryum extract as an active ingredient, and Mokdanskin extract.
  • a composition for preventing or treating Parkinson's disease is known.
  • the won (Genkwae Flos) is thymelaeaceae (Thymeleaceae) Daphne Genkwa as buds of (Daphne genkwa Siebold et Zuccarini), menopause ( ⁇ ), parenteral ( ⁇ ), it acts on nerve ( ⁇ ), and diuretic And it has the effect of removing phlegm, and has been used as an herbal medicine to treat asthma, seawater, tree species, and food poisoning.
  • Clematidis Radix is Clematis manshurica Ruprecht of Ranunculaceae and Clematis hexapetala Pallas, Clematis chinensis Osbeck, Clematis chinensis Osbeck, Clematis trichotoma Ruprecht, and Clematis trichotoma Ruprecht, which are close to the genus that can be replaced. the roots and the roots of clematis ahreuman di (clematis armandii) stems.
  • Wiryeongseon removes customs and treats joint flexion, limb paralysis, low back pain, limb pain, muscle paralysis, and bruises, and is used for pain caused by hyperfunction of the five intestines and obstruction of the meridians. The pharmacological action lowers blood pressure and excites smooth muscles. , Diuretic, hypoglycemic, analgesic, and antibacterial effects have been reported. Gastrodiae Rhizoma is a steamed and dried tuber of Gastrodia elata BLUME of the Orchidaceae family.It acts on the liver and is used for convulsive seizures, tetanus, acute panic attacks, dizziness, headaches, nervous breakdowns, and headaches. In addition, Chunma shows sedation, anticonvulsant, analgesic, anti-inflammatory, increased heart and brain blood flow, lowered blood pressure, increased antioxidant power, and immune activation.
  • the present inventors continued research to develop a method for treating neurodegenerative diseases, and when using complex herbal extracts of Wonhwa, Wiryeongseon, and Chunma, rather than using each single extract.
  • the present invention was completed by discovering that there is a remarkably excellent therapeutic effect.
  • Patent Document 1 Korean Patent Registration No. 10-1436017
  • Patent Document 2 Korean Patent Registration No. 10-1166481
  • the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases comprising a complex herbal extract of Wonhwa, Wiryeongseon, and/or Chunma as an active ingredient.
  • An object of the present invention is to provide a food composition for preventing or improving neurodegenerative diseases, comprising a compound herbal extract of Wonhwa, Wiryeongseon, and/or Chunma as an active ingredient.
  • An object of the present invention is to provide a feed composition for preventing or improving neurodegenerative diseases comprising a compound herbal extract of Wonhwa, Wiryeongseon, and/or Chunma as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating neurodegenerative diseases comprising extracts of two or more herbal medicines selected from the group consisting of Wonhwa, Wiryeongseon, and Chunma.
  • the pharmaceutical composition may include a herbal extract of Wonhwa and Wiryeongseon.
  • the pharmaceutical composition may include herbal extracts of Wonhwa and Cheonma.
  • the pharmaceutical composition may include herbal extracts of Wiryeongseon and Cheonma.
  • the pharmaceutical composition may include herbal extracts of Wonhwa, Wiryeongseon, and Chunma.
  • the herbal extract may be extracted with a solvent selected from the group consisting of water, C1 to C6 alcohol, acetic acid, a mixed solvent thereof, and a non-polar solvent.
  • a solvent selected from the group consisting of water, C1 to C6 alcohol, acetic acid, a mixed solvent thereof, and a non-polar solvent.
  • it is 0.01% to 90% ethanol extract, and most preferably, it is 50% to 70% ethanol extract.
  • the neurodegenerative disease is Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Peak's disease, Huntington's disease, Lou Gehrig's disease, prion disease, Lewy body dementia, multiple system atrophy, progressive nuclear paralysis, Friedreich's ataxia, temporal lobe epilepsy, or stroke.
  • Parkinson's disease is Parkinson's disease.
  • the pharmaceutical composition comprises a herbal extract of Wonhwa and Wiryeongseon, and the combined weight ratio of the two herbal medicines or herbal extracts thereof may be 1: 1 to 20, preferably 1: 5 to 15 , More preferably 1:10.
  • the pharmaceutical composition comprises herbal extracts of Wonhwa and Cheonma, and the blending weight ratio of the two herbal medicines or herbal extracts thereof may be 1: 1 to 20, preferably 1: 5 to 15 , More preferably 1:10.
  • the pharmaceutical composition comprises herbal extracts of Wiryeongseon and Cheonma, and the weight ratio of the two herbal medicines or herbal extracts thereof may be 1:0.05 to 20, and most preferably 1: 1.
  • the pharmaceutical composition comprises a herbal extract of Wonhwa, Wiryeongseon, and Chunma, and the blending weight ratio of Wonhwa, Wiryeongseon, and Cheonma may be 1: 1 to 20: 1 to 20, preferably 1: 5 to 15: 5 to 15, most preferably 1: 10: 10.
  • the pharmaceutical composition can prevent or treat neurodegenerative diseases by improving behavioral ability.
  • the pharmaceutical composition may prevent or treat neurodegenerative diseases by inhibiting toxic cell death in neurons.
  • the pharmaceutical composition may prevent or treat neurodegenerative diseases by inhibiting the production of reactive oxygen species (ROS) in neurons.
  • ROS reactive oxygen species
  • the pharmaceutical composition may prevent or treat neurodegenerative diseases by protecting mitochondrial function in neurons.
  • the pharmaceutical composition may prevent or treat neurodegenerative diseases by inhibiting apoptosis of neurons.
  • the pharmaceutical composition may prevent or treat neurodegenerative diseases by inhibiting the production of nitric oxide (NO).
  • NO nitric oxide
  • the present invention also provides a food composition for preventing or improving neurodegenerative diseases comprising two or more herbal extracts selected from the group consisting of Wonhwa, Wiryeongseon, and Chunma.
  • the present invention also provides a feed composition for preventing or improving neurodegenerative diseases comprising two or more herbal extracts selected from the group consisting of Wonhwa, Wiryeongseon, and Chunma.
  • the pharmaceutical composition comprising the extract of the herbal medicine Wonhwa, Wiryeongseon, and/or Cheonma of the present invention as an active ingredient exhibits excellent therapeutic effect in neurodegenerative diseases, particularly Parkinson's disease, and can be used as a novel therapeutic agent.
  • composition of the present invention can be used as a safe therapeutic agent to reduce side effects of existing therapeutic agents by including a natural product as an active ingredient.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of the Rotarod test in a Rotenone-induced Parkinson's disease animal model (####: p ⁇ 0.0001; ****: p ⁇ 0.0001 (Rotenone group and t-test); *: p ⁇ 0.05 (Rotenone group and t-test)).
  • Figure 2 is a graph showing the cell survival rate when using the herbal extract of the present invention (####: p ⁇ 0.0001; ****: p ⁇ 0.0001 (MPP group and t-test); ***: p ⁇ 0.001 (MPP group and t-test)).
  • Figure 3 is a graph showing the production rate of intracellular reactive oxygen species (ROS) when the herbal extract of the present invention is used (##: p ⁇ 0.01; **: p ⁇ 0.01 (MPP group and t-test)).
  • ROS reactive oxygen species
  • Figure 4 is a graph showing the mitochondrial function protective ability in the case of using the herbal extract of the present invention as a TMRE measurement rate (####: p ⁇ 0.0001; *: p ⁇ 0.05 (MPP group and t-test)).
  • FIG. 5 is a graph showing the ability to reduce apoptosis when the herbal extract of the present invention is used (####: p ⁇ 0.0001; ****: p ⁇ 0.0001 (MPP group and t-test); ***: p ⁇ 0.001 (MPP group and t-test)).
  • FIG. 6 is a graph showing the result of measuring the amount of nitric oxide (NO) production when the herbal extract of the present invention is used (####: p ⁇ 0.0001; ****: p ⁇ 0.0001 (LPS group and t- test); ***: p ⁇ 0.001 (LPS group and t-test)).
  • FIG. 7 is a graph showing the Rotarod test results in a Rotenone-induced Parkinson's disease animal model (####: p ⁇ 0.0001; ***: p ⁇ 0.001 (Rotenone group and t-test); **: p ⁇ 0.01 (Rotenone group and t-test)).
  • FIG. 8 is a graph showing the result of measuring the amount of nitric oxide (NO) production when the herbal extract of the present invention is used (####: p ⁇ 0.0001; **: p ⁇ 0.01 (LPS group and t-test) ; *: p ⁇ 0.05 (LPS group and t-test)).
  • 9A and 9B are graphs showing the effect of protecting cells against MPP+ or 6-OHDA toxicity when using the herbal extract of the present invention.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of the Pole test in an MPTP-induced Parkinson's disease animal model.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of the Rotarod test in an MPTP-induced Parkinson's disease animal model.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of neurodegenerative diseases comprising extracts of two or more herbal medicines selected from the group consisting of Wonhwa, Wiryeongseon, and Chunma.
  • the pharmaceutical composition may include a herbal extract of Wonhwa and Wiryeongseon.
  • the pharmaceutical composition may include herbal extracts of Wonhwa and Cheonma.
  • the pharmaceutical composition may include herbal extracts of Wiryeongseon and Cheonma.
  • the pharmaceutical composition may include herbal extracts of Wonhwa, Wiryeongseon, and Chunma.
  • herbal medicine extract or “complex herbal medicine extract” as used herein, as an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention, includes extracts extracted from herbal medicines selected from the group consisting of Wonhwa, Wiryeongseon, and Chunma, or these herbal medicines It may include an extract extracted from a mixture of.
  • the pharmaceutical composition comprises a herbal extract of Wonhwa and Wiryeongseon, and the combined weight ratio of the two herbal medicines or herbal extracts thereof may be 1: 1 to 20, preferably 1: 5 to 15 , More preferably 1:10.
  • the pharmaceutical composition comprises herbal extracts of Wonhwa and Cheonma, and the blending weight ratio of the two herbal medicines or herbal extracts thereof may be 1: 1 to 20, preferably 1: 5 to 15 , More preferably 1:10.
  • the pharmaceutical composition comprises herbal extracts of Wiryeongseon and Cheonma, and the weight ratio of the two herbal medicines or herbal extracts thereof may be 1:0.05 to 20, and most preferably 1: 1.
  • the pharmaceutical composition comprises a herbal extract of Wonhwa, Wiryeongseon, and Chunma, and the blending weight ratio of Wonhwa, Wiryeongseon, and Cheonma may be 1: 1 to 20: 1 to 20, preferably 1: 5 to 15: 5 to 15, most preferably 1: 10: 10.
  • composition of the present invention may further include extracts of other herbal medicines known in the art to have the same or similar effect as that of the composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include an active ingredient known to be effective in treating neurodegenerative diseases in the art.
  • an active ingredient known to be effective in treating neurodegenerative diseases in the art. Examples include L-dopa or dopamine agonists, MAO-A, B inhibitors, neuroprotective agents, and the like.
  • composition of the present invention may further include an active ingredient that exhibits an effect on diseases other than neurodegenerative diseases.
  • the herbal extract of the present invention When used together with an additional active ingredient, the herbal extract and the additional active ingredient may be administered simultaneously as one formulation, or may be administered simultaneously or sequentially as separate formulations.
  • composition of the present invention may be used alone or in combination with surgery, hormone therapy, drug therapy, or methods using biological response modifiers to treat neurodegenerative diseases.
  • the herbal extract used in the present invention can be obtained using a conventional extraction solvent known in the art.
  • a polar solvent or a non-polar solvent may be used.
  • Polar solvents include water, C1 to C6 alcohols (eg, methanol, ethanol, propanol, butanol, normal-propanol, iso-propanol and normal-butanol, etc.), acetic acid, or a mixture of the polar solvents.
  • Non-polar solvents include acetone, acetonitrile, ethyl acetate, methyl acetate, butyl acetate, fluoroalkane, hexane, ether, chloroform, dichloromethane, or mixtures of the above non-polar solvents.
  • the herbal extract may be extracted with a solvent selected from the group consisting of water, C1 to C6 alcohol, acetic acid, a mixed solvent thereof, and a non-polar solvent.
  • a solvent selected from the group consisting of water, C1 to C6 alcohol, acetic acid, a mixed solvent thereof, and a non-polar solvent.
  • it is 0.01% to 90% ethanol extract, most preferably 50% to 70% ethanol extract.
  • the herbal extract used in the present invention may be extracted through hot water extraction, cold needle extraction, reflux cooling extraction, ultrasonic extraction, or conventional extraction methods known in the art.
  • extract means commonly used as a crude extract in the art, but also includes a fraction obtained by further fractionating the extract in a broad sense. That is, the herbal extract includes not only those obtained using the above-described solvent, but also those obtained by additionally applying a purification process thereto. For example, fractions obtained by passing the extract through an ultrafiltration membrane having a certain molecular weight cut-off value, separation by various chromatographs (made for separation according to size, charge, hydrophobicity or affinity), etc. Fractions obtained through the purification method are also included in the herbal extract of the present invention.
  • the neurodegenerative disease is Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Peak's disease, Huntington's disease, Lou Gehrig's disease, prion disease, Lewy body dementia, multiple system atrophy, progressive nuclear paralysis, Friedreich's ataxia, temporal lobe epilepsy, or stroke.
  • Parkinson's disease is Parkinson's disease.
  • neurodegenerative includes all of the transition of nerve cells from a normal state to a deficient state, genetic decline, and sporadic decline, and in one or several parts of the nervous system. It involves the death of nerve cells, which are slowly and constantly progressing.
  • prevention refers to all actions of inhibiting or delaying the onset of neurodegenerative diseases by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention, and “treatment” refers to the treatment of neurodegenerative diseases by administration of the pharmaceutical composition. It refers to any action in which symptoms of suspected and affected individuals are improved or beneficially altered.
  • the pharmaceutical composition can prevent or treat neurodegenerative diseases by improving behavioral ability.
  • the pharmaceutical composition may prevent or treat neurodegenerative diseases by inhibiting toxic cell death in neurons.
  • the pharmaceutical composition may prevent or treat neurodegenerative diseases by inhibiting the production of reactive oxygen species (ROS) in neurons.
  • ROS reactive oxygen species
  • the pharmaceutical composition may prevent or treat neurodegenerative diseases by protecting mitochondrial function in neurons.
  • the pharmaceutical composition may prevent or treat neurodegenerative diseases by inhibiting apoptosis of neurons.
  • the pharmaceutical composition may prevent or treat neurodegenerative diseases by inhibiting the production of nitric oxide (NO).
  • NO nitric oxide
  • the present invention also provides a food composition for preventing or improving neurodegenerative diseases comprising two or more herbal extracts selected from the group consisting of Wonhwa, Wiryeongseon, and Chunma.
  • the term “improvement” refers to any action that at least reduces the severity of a parameter, such as a symptom, associated with the condition being treated by administration of a composition comprising an extract of the present invention.
  • the food composition of the present invention includes health functional foods and health foods.
  • the food composition of the present invention can be taken for a long time.
  • the food composition of the present invention includes various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavoring agents such as synthetic flavoring agents and natural flavoring agents, coloring agents and thickeners (cheese, chocolate, etc.), pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof. , Organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonates used in carbonated beverages, and the like.
  • the present invention provides a feed composition for preventing or improving neurodegenerative diseases comprising two or more herbal extracts selected from the group consisting of Wonhwa, Wiryeongseon, and Chunma.
  • Washed and dried Wonhwa, Wiryeongseon, and Cheonma were used. Each 75 g of Wonhwa, Wiryeongseon, and Chunma herbal medicines were added with a 10-fold 70% (v/v) aqueous ethanol solution, stirred at room temperature for 72 hours, and extracted to obtain an extract. Thereafter, each of the extracts was filtered, concentrated under reduced pressure at 50-65° C., and then lyophilized to obtain a powdery single herbal extract.
  • Washed and dried Wonhwa, Wiryeongseon, and Cheonma herbal medicines are mixed to a total of 75 g in a weight ratio of 1:1:1, and then extracted with 10 times 70% (v/v) ethanol aqueous solution and stirred well at room temperature for 72 hours. I did. Thereafter, the extract was filtered, concentrated under reduced pressure at 50-65° C., and then lyophilized to obtain a powdery complex herbal extract (mixed extract).
  • the washed and dried herbal medicines of Wiryeongseon and Cheonma were mixed to a total of 80 g in a weight ratio of 1:1, and then a 10-fold 70% (v/v) aqueous ethanol solution was added, followed by extraction with good stirring at room temperature for 72 hours. Thereafter, the extract was filtered, concentrated under reduced pressure at 50-65° C., and then lyophilized to obtain a powdery complex herbal extract (mixed extract).
  • a complex herbal extract was prepared as follows, and used in the experiments of Examples 9 to 11. In the case of the original painting, it was crushed to a size that passes through a sieve of control (4,750 ⁇ m), and in the case of the Wiryeongseon and Chunma, it was used in the experiment.
  • the Wonhwa, Wiryeongseon, and Cheonma were mixed according to the weight ratio (w/w) shown in Table 1, and then a 10-fold 70% ethanol (v/v) aqueous solution was added and extracted at room temperature for 72 hours. The extract was filtered, concentrated under reduced pressure at 50-65° C., and then freeze-dried to obtain a powdery complex herbal extract.
  • Rotenone is a substance used as an insecticide, and inhibits mitochondrial activity by inhibiting the mitochondrial electron transport system. In this case, brain cells are killed, resulting in decreased motor function. Therefore, in order to verify the effect of improving the behavioral ability of the extract of the complex herbal medicine, an experiment was performed to confirm the motor function in the Rotenone-induced Parkinson's disease animal model.
  • mice 5-week-old male C57BL/6 mice (Orient Bio Inc., Republic of Korea) weighing 20-22 g were used. Animals were maintained at a room temperature of 23 ⁇ 1° C. with 12 hours of daytime and 12 hours of night cycle following the guidelines of NIH (NIH publication No. 85-23, revised 1985). The mice were randomly divided into 7 groups as follows to perform an in vivo experiment.
  • each of the 4 extracts was orally administered to mice for 21 days.
  • intraperitoneal administration i.p.
  • 1mg/kg/day Rotenone dissolved in saline was administered intraperitoneally (i.p.) for 14 days from 7 days after the start of the extract administration.
  • Rotarod test was performed to confirm motor functionality.
  • the Rotarod test is a test that measures the running time on a rotating cylinder, and ROTA-ROD TREADMILL DJ345 (Daejong Machine Industries, Korea) was used. Before proceeding with this experiment, the mice were trained three times to run for 5 minutes on a cylinder rotating at a speed of 5, 15 rpm two days and a day before to become accustomed to the device.
  • the behavioral ability was only 11.9% (88.1% decrease) compared to the normal group without Rotenone administration.
  • the complex herbal extracts prepared in Preparation Example 2 were administered at a concentration of 1, 3, and 10 mg/kg, the behavioral ability was improved to 19.0%, 44.8%, and 75.0% levels, respectively, compared to the normal group. It was confirmed that the ability reduction phenomenon was suppressed.
  • the behavioral ability was slightly increased or similar to that of the negative control group, and the degree of improvement in the behavioral ability was lower than in the group administered with the complex herbal extract.
  • the degree of behavioral improvement in the positive control group administered with 25 mg/kg of L-DOPA was similar to that of the group administered with 3 mg/kg of the complex herbal extract, and the group administered with 10 mg/kg of the complex herbal extract was treated with L-DOPA.
  • the degree of improvement in behavioral ability was better than that of the administered positive control group.
  • the complex herbal extracts significantly improved the behavioral ability than the negative control as well as the single herbal extracts. It was confirmed that it can be used to treat Parkinson's disease because it exhibits similar or superior effects at a lower dose even when compared to the case where L-DOPA, a precursor of dopamine, was administered.
  • human neuroblastoma SH-SY5Y cells contain 10% fetal bovine serum (Fetal Bovine Serum, FBS, Gibco TM , USA) and antibiotics (1% Penicillin, Streptomycin [P/S], Gibco-BRL, USA) It was cultured in RPMI 1640 medium (Gibco TM , USA) medium. The incubator was kept at a temperature of 37°C, and a gas mixed with 95% air and 5% CO2 was continuously supplied to obtain appropriate conditions for cell culture. The cells were coated with PDL (Poly-D-lysine, Sigma-Aldrich, USA) in a 96-well plate at 1X concentration condition, washed with PBS and dried, and then the cells were cultured. Cells were cultured 24 hours before the experiment so as to be 5 ⁇ 10 4 cells/well. When an appropriate number of cells were cultured, the cells were differentiated by replacing them with a medium containing 0.5% FBS and culturing for an additional 24 hours.
  • FBS Fetal Bovine
  • the complex herbal extracts of Wonhwa, Wiryeongseon and Cheonma prepared in Preparation Example 2 were treated in a 96-well plate in which the SH-SY5Y cell line was cultured at a concentration of 1, 10, 100 ⁇ g/ml for 30 minutes, and then 2 mM MPP+ was treated. After 48 hours of MPP+ treatment, 100 ⁇ l of a 10% WST-1 solution was added to a 96-well plate. After reacting in an incubator at 37° C. for 30 minutes, absorbance was measured at 450 and 630 nm wavelength values, and the results are shown in FIG. 2.
  • the complex herbal extracts of Wonhwa, Wiryeongseon and Chunma prepared in Preparation Example 2 were treated with SH-SY5Y cells at a concentration of 1, 10, and 100 ⁇ g/ml for 30 minutes, followed by treatment with 2 mM MPP+. After 48 hours of MPP+ treatment, DCF-DA was treated in a 96-well plate at a concentration of 10 ⁇ M for 30 minutes. After washing once with PBS, fluorescence was measured in the wavelength range of 485 and 530 nm.
  • the SH-SY5Y cells cultured in Example 2 were treated with the complex herbal extracts of Wonhwa, Wiryeongseon and Chunma prepared in Preparation Example 2 at a concentration of 100 ⁇ g/ml for 30 minutes, and then 2 mM MPP+ for 48 hours. I did. Thereafter, TMRE was treated for 30 minutes at a concentration of 0.5 ⁇ M. After washing once with PBS, 100 ⁇ l of PBS was added to each well. Fluorescence was measured in the wavelength region of 549 and 575 nm, and the results are shown in FIG. 4.
  • Caspase is a type of cysteine protease, a protein essential for programmed apoptosis called apoptosis. Caspase-activated apoptosis induces apoptosis and induces apoptosis of related cells. In Parkinson's disease, brain cell apoptosis exacerbates the disease. When caspase reacts with the Caspase-Glo reagent containing DEVD luciferin, it encounters ATP and emits light.
  • the SH-SY5Y cells cultured in Example 2 were treated with the complex herbal extracts of Wonhwa, Wiryeongseon and Chunma prepared in Preparation Example 2 at a concentration of 1, 10, 100 ⁇ g/ml for 30 minutes, and 2 mM MPP+ was 48 Treated for hours. Thereafter, Caspase-Glo buffer and substrate (Promega, USA) were mixed, 50 ⁇ l was added to each well, and the mixture was treated at room temperature for 30 minutes in the absence of light.
  • BV2 cells in DMEM medium (Gibco TM , USA) containing fetal bovine serum (Fetal Bovine Serum, FBS, Gibco TM , USA) and antibiotics (1% Penicillin, Streptomycin [P/S] Gibco-BRL, USA) Cultured. Specifically, the incubator was kept at a temperature of 37°C, and a gas mixed with 95% air and 5% CO2 was continuously supplied to ensure that appropriate conditions for cell culture were established. Cells were cultured 24 hours before the experiment so that the cells were 3x10 4 cells/well in a 12-well plate.
  • the complex herbal extracts of Wonhwa, Wiryeongseon and Cheonma prepared in Preparation Example 2 were pretreated at 1, 10, 30, 100 ⁇ g/ml concentrations for 1 hour, and then 1 ⁇ g/ml LPS concentration was added for 24 hours. During the treatment. Thereafter, the supernatant was taken and the change in the nitric oxide content was evaluated by measuring the absorbance at 520 and 550 nm wavelength values through the Griess assay kit (G2930, Promega, USA). The results are shown in FIG. 6.
  • the negative control group (LPS) treated with only LPS produced higher levels of nitric oxide (1123%) compared to the non-LPS treatment group (normal group; NC).
  • the complex herbal extracts were treated at concentrations of 1, 10, 30, and 100 ⁇ g/ml, the increase in nitric oxide production decreased at all concentrations.
  • the complex herbal extracts were treated at concentrations of 10, 30, and 100 ⁇ g/ml, the negative control group Compared to that, they decreased by 56.4%, 91.4%, and 99.5%. Therefore, it was confirmed that the extract of the complex herbal medicine has excellent ability to inhibit the inflammatory response induced by LPS.
  • a 5-week-old male C57BL/6 mouse (Orient Bio Inc., Republic of Korea) weighing 20-22 g was used. Animals were maintained at a room temperature of 23 ⁇ 1° C. under the conditions of a 12 hour day and 12 hour night cycle according to the guidelines of NIH (NIH publication No. 85-23, revised 1985). Mice were randomly divided into 5 groups as follows to perform an in vivo experiment.
  • Rotarod test was performed to confirm motor functionality.
  • the Rotarod test is a test that measures the running time on a rotating cylinder, and ROTA-ROD TREADMILL DJ345 (Daejong Machine Industries, Korea) was used. Before proceeding with this experiment, the mice were trained three times to run for 5 minutes on a cylinder rotating at a speed of 5, 15 rpm two days and a day before to become accustomed to the device.
  • BV2 cells in DMEM medium (Gibco TM , USA) containing fetal bovine serum (Fetal Bovine Serum, FBS, Gibco TM , USA) and antibiotics (1% Penicillin, Streptomycin [P/S] Gibco-BRL, USA) Cultured. Specifically, the incubator was kept at a temperature of 37°C, and a gas mixed with 95% air and 5% CO2 was continuously supplied to ensure that appropriate conditions for cell culture were established. Cells were cultured 24 hours before the experiment so that the cells were 3x10 4 cells/well in a 12-well plate.
  • the complex herbal extracts of Wonhwa, Wiryeongseon and Chunma prepared in Preparation Example 2 and the complex herbal extracts of Wiryeongseon and Cheonma prepared in Preparation Example 3 were pretreated at a concentration of 10 ⁇ g/ml for one hour, and then 1 ⁇ g LPS at a concentration of /ml was treated for 24 hours. Thereafter, the supernatant was taken and the change in the nitric oxide content was evaluated by measuring the absorbance at 520 and 550 nm wavelength values through the Griess assay kit (G2930, Promega, USA). The results are shown in FIG. 8.
  • the negative control group (LPS) treated with only LPS produced higher levels of nitric oxide (1123%) compared to the non-LPS treatment group (normal group; NC).
  • the complex herbal extracts of Wonhwa, Wiryeongseon and Chunma (indicated as “complex herbal extracts” in Fig. 8) and the complex herbal extracts of Wiryeongseon and Chunma (indicated as “wiryeongseon/cheonma complex extracts” in Fig.
  • general symptom changes such as weight change and vomiting in beagle dogs after oral administration of a compound herbal extract according to a combination ratio of 1:1:1, 1:5:5 or 1:10:10 of Wonhwa, Wiryeongseon and Chunma was observed.
  • Beagle dogs used in the test were 5 males and females (male G1101, G1201, G1301, G1401, G1501; female G2101, G2201, and females) aged 9-14 months (Beijing Marshall Biotechnology Co., Ltd., China) G2301, G2401, G2501) was used, and the test substances were prepared in Preparation Example 4-1 (mixing ratio 1:1:1), 4-2 (1:5:5), and 4-3 (1:10:10).
  • the freeze-dried powder prepared by was weighed according to the required amount and suspended in water for injection (JW Joongwae Pharmaceutical, Korea) and prepared on the day of administration, or it was used by filling it in general gelatin capsules or enteric capsules the day before administration.
  • the amount of liquid to be administered was 5 ml/kg body weight.
  • the test design was conducted as shown in Table 2, and the test was conducted with a wash-out period of at least 5 days or more for each test.
  • Example 4-1 50 mg/kg single 2 G1101 G2101 Manufacturing Example 4-1 50 mg/kg single Filled in general gelatin capsules and administered 3 G1201 G2201 Manufacturing Example 4-1 50 mg/kg single Filled in enteric capsules and administered 4 G1101, G1201 G2101, G2201 Manufacturing Example 4-1 25 mg/kg once a day for 4 days 5 G1101 G2101 Manufacturing Example 4-2 41.25 mg/kg once a day for 5 days 6 G1301, G1401 G2301, G2401 Manufacturing Example 4-3 50 mg/kg single 7 G1501 G2501 Manufacturing Example 4-3 100 mg/kg once a day for 7 days
  • human neuroblastoma SH-SY5Y cells contain 10% fetal bovine serum (Fetal Bovine Serum, FBS, Gibco TM , USA) and antibiotics (1% Penicillin, Streptomycin [P/S], Gibco-BRL, USA) DMEM medium (Gibco TM , USA) was cultured in the medium.
  • the incubator was kept at a temperature of 37°C, and a gas mixed with 95% air and 5% CO2 was continuously supplied to obtain appropriate conditions for cell culture. Cells were cultured 24 hours before the experiment so that it became 4 ⁇ 10 5 cells/ml. When an appropriate number of cells were cultured, the cells were differentiated by replacing them with a medium containing 0.5% FBS and cultured for an additional 20 hours.
  • the SH-SY5Y cell line is cultured in a 96-well plate prepared in Preparation Examples 4-1, 4-2, and 4-3 of Wonhwa, Wiryeongseon and Chunma 1:1:1, 1:5:5, 1:10
  • the :10 complex herbal extracts were treated at concentrations of 3, 10, and 30 ⁇ g/ml, respectively, for 4 hours, followed by treatment with 1 mM MPP+. After 44 hours of MPP+ treatment, 100 ⁇ l of MTT solution at a concentration of 1 mg/ml was added to a 96-well plate. After reacting in an incubator at 37° C. for 1 hour and removing the MTT solution, 100 ⁇ l/well of 100% DMSO was added, shaking for about 15 minutes, and absorbance was measured at a wavelength of 570 nm.
  • the cell survival rate was 55.6% in the negative control group treated with MPP+ compared to the non-MPP+ treatment group (normal group; NC), and statistically significant cell death was confirmed.
  • the complex herbal extracts having a combination ratio of 1:1:1, 1:5:5, and 1:10:10 were treated at concentrations of 3, 10, and 30 ⁇ g/ml, respectively, 1:1:1 complex herbal extracts (10, 30 ⁇ g/ml), 1:5:5 complex herbal extract (3, 10, 30 ⁇ g/ml), 1:10:10 complex herbal extract (10, 30 ⁇ g/ml) by MPP+ It was suppressed in a concentration-dependent manner.
  • the 1:10:10 complex herbal extract treatment group exhibited the highest cytoprotective activity at the same concentration compared to the 1:1:1 or 1:5:5 complex herbal extract treatment group, It was confirmed that it has excellent neuronal cell protection efficacy.
  • 1:1:1, 1:5:5, and 1:10:10 complex herbal extracts of Wonhwa, Wiryeongseon and Chunma prepared in Preparation Examples 4-1, 4-2, and 4-3 were respectively used for the same cells.
  • 50 ⁇ M of 6-OHDA was treated instead of MPP+ as a neurocytotoxic inducing substance.
  • absorbance was measured in the same manner as MPP+, and the results are shown in FIG. 9B, and the cytoprotective effects on 6-OHDA neurotoxicity were 1:1:1, 1:5:5, It was similar in the complex herbal extracts according to the 1:10:10 combination ratio.
  • MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) inhibits mitochondrial activity by inhibiting the mitochondrial electron transport system. In this case, brain cells are killed, resulting in decreased motor function. Therefore, in order to verify the effect of improving the behavioral ability of the extract of the complex herbal medicine, an experiment was performed to confirm the motor function in an MPTP-induced Parkinson's disease animal model.
  • mice 8-week-old male C57BL/6J mice (DBL Inc., Korea) were used in the experiment after a 5-day acclimatization period. Animals were maintained at a room temperature of 23 ⁇ 1° C. with 12 hours of daytime and 12 hours of night cycle following the guidelines of NIH (NIH publication No. 85-23, revised 1985). Mice were randomly divided into 5 groups as follows to perform an in vivo experiment.
  • the extracts were each orally administered to mice for 12 days.
  • 30 mg/kg/day MPTP dissolved in saline was administered intraperitoneally for 5 days from the start of the extract administration (intraperitoneal injection, i.p.).
  • Pole test was performed to confirm the functionality of the rotational motion. Pole test is a test that measures the time it takes for the mouse to rotate downward by placing the mouse upward at the upper end of the vertical bar. Training was conducted twice.
  • the mouse was placed at the upper end of the vertical bar, and the time it took for the mouse to rotate the body in the downward direction was measured, and the results are shown in FIG. 10.
  • the Rotarod test was performed to evaluate the overall athletic ability.
  • the Rotarod test is a test that evaluates motor ability by placing an experimental animal on a rotating cylinder, and was conducted using ROTA-ROD TREADMILL (Jeongdo B&P, Korea). Before proceeding with this experiment, training was performed twice so that the mice run for 3 minutes on a cylinder rotating at a speed of 9 rpm one day before to become accustomed to the device. In this experiment, the number of times that the mouse ran for 3 minutes on a cylinder rotating at 11 rpm and then fell to the floor was measured, and the results are shown in FIG. 11.

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Abstract

본 발명은 원화, 위령선, 및 천마의 복합 생약 추출물을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 생약 추출물을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물 또는 사료 조성물에 관한 것이다. [대표도] 도 1

Description

원화, 위령선, 및 천마의 복합 생약 추출물을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 원화, 위령선, 및 천마의 복합 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물 또는 사료 조성물에 관한 것이다.
최근 노인 인구의 급증과 더불어 다양한 신경퇴행성 뇌질환 환자의 증가로 이에 대한 치료와 예방에 관심이 고조되고 있다. 신경퇴행성 뇌질환은 신경의 퇴행성 변화로 인해 운동장애, 기억장애, 인지장애 등 여러 가지 병증을 유발하는 질병이다.
특히, 파킨슨병은 과도한 활성산소종 생성, 산화 스트레스, 잘못 접힌 (misfolded) 단백질 및 손상된 미토콘드리아 기능과 같은 다양한 자극들을 통한 뇌 흑색질(substantia nigra pars compactra; SNpc)의 멜라닌 색소를 함유한 도파민 신경의 세포 사멸과 선조체(striatum)의 도파민 결핍으로 인해 나타나는 질환으로 알려져 있다. 도파민은 뇌의 흑색질에서 생성되는데, 흑색질의 신경세포는 뇌의 운동피질 및 기타 여러 부위와 복잡하게 연결되어 있어 인체의 운동을 부드럽고 정확하게 수행할 수 있도록 해주는 기저핵이라는 부위와 연결되어 있고, 도파민은 이러한 기저핵의 기능을 조절한다. 흑색질에서 분비되는 도파민이 부족하여 발병하는 파킨슨 질환은 진전(tremor), 운동완서(bradykinesia), 근육경직(rigidity), 비정상적 자세(postural instability), 운동 불능(akinesia) 등의 증상을 동반한다. 현재까지의 파킨슨병 치료 방법은 주로 도파민 전구물질인 L-dopa를 투여하여 도파민을 보충하는 방법을 사용하였으나, 많은 임상 연구에서 지속적인 L-dopa의 사용이 심각한 부작용을 초래하는 것으로 알려져 있다(McGeer PL, McGeer EG. Glial reactions in Parkinson's disease. Mov Disord. 2008;23(4):474-83.). 따라서, 파킨슨병에서 합성의약품보다 부작용이 적은 천연물 의약품의 개발은 환자들에게 큰 도움이 될 수 있다.
따라서, 부작용을 최소화하기 위해 천연 물질을 이용한 치료제가 개발되고 있으며, 그 예로 백렴 추출물을 유효성분으로 포함하는 파킨슨병 예방 또는 치료용 조성물(한국 등록특허 제10-1436017호), 목단피 추출물을 포함하는 파킨슨병 예방 또는 치료용 조성물(한국 등록특허 제10-1166481호) 등이 알려져 있다.
한편, 원화(Genkwae Flos)는 팥꽃나무과(Thymeleaceae) 팥꽃나무(Daphne genkwa Siebold et Zuccarini)의 꽃봉오리로서, 폐경(肺經), 비경(脾經), 신경(腎經)에 작용하고, 이뇨작용 및 담을 없애는 효능을 가지며, 천식, 해수, 수종, 식중독을 치료하는 한방약재로 사용되어 왔다. 위령선(Clematidis Radix)은 미나리아재비과(Ranunculaceae)의 으아리(Clematis manshurica Ruprecht) 및 대체가능한 동속 근연식물인 가는잎사위질빵(Clematis hexapetala Pallas), 위령선(Clematis chinensis Osbeck), 할미밀망(Clematis trichotoma Nakai), 클레마티스 아르만디(Clematis armandii)의 뿌리 및 뿌리줄기이다. 위령선은 풍습을 제거하고 관절굴신불리, 사지마비, 요통, 사지동통, 근육마비, 및 타박상을 치료하고, 오장의 기능 항진 및 경락이 막혀 생기는 통증에 사용되며, 약리작용으로는 혈압강하, 평활근 흥분, 이뇨작용, 혈당하강작용, 진통, 항균작용이 보고되었다. 천마(Gastrodiae Rhizoma)는 난초과(Orchidaceae)의 천마(Gastrodia elata BLUME)의 덩이줄기를 쪄서 건조한 것으로, 간에 작용하여 경련발작, 파상풍, 소아급만경풍, 어지럼증, 두통, 신경쇠약, 두통 등에 사용된다. 또한 천마는 진정, 항경련, 진통, 항염증, 심장과 뇌혈류 증가, 혈압강하, 항산화력증가, 면역활성화작용을 나타낸다.
그러나 현재까지 원화, 위령선, 천마의 복합 생약 추출물이 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 질환의 치료에 효과적으로 사용될 수 있는지는 공지된 바 없다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 신경퇴행성 질환을 치료할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 지속적인 연구를 거듭한 결과, 원화, 위령선, 및 천마의 복합 생약 추출물을 사용하였을 때, 각각의 단일 추출물을 사용하는 것 보다 월등하게 우수한 치료 효과가 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 한국 등록특허 제10-1436017호
(특허문헌 2) 한국 등록특허 제10-1166481호
본 발명은 원화, 위령선, 및/또는 천마의 복합 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 원화, 위령선, 및/또는 천마의 복합 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 원화, 위령선, 및/또는 천마의 복합 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 원화, 위령선, 및 천마로 이루어진 군으로부터 선택되는 두 가지 이상의 생약 추출물을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
일 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 원화 및 위령선의 생약 추출물을 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 원화 및 천마의 생약 추출물을 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 위령선 및 천마의 생약 추출물을 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 원화, 위령선, 및 천마의 생약 추출물을 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 생약 추출물은 물, C1 내지 C6의 알코올, 아세트산, 이들의 혼합 용매, 및 비극성 용매로 이루어지는 군으로부터 선택되는 용매로 추출된 것일 수 있다. 바람직하게는, 0.01% 내지 90% 에탄올 추출물이며, 가장 바람직하게는, 50% 내지 70% 에탄올 추출물이다.
일 실시태양에서, 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 피크병, 헌팅톤병, 루게릭병, 프리온 질환, 루이소체 치매, 다계통 위축증, 진행성 핵상 마비, 프리드라이히 운동실조증, 측두엽 간질, 또는 뇌졸중일 수 있다. 바람직하게는, 파킨슨병이다.
일 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 원화 및 위령선의 생약 추출물을 포함하고, 상기 두 가지 생약 또는 이들의 생약 추출물의 배합 중량비는 1 : 1 내지 20일 수 있으며, 바람직하게는 1 : 5 내지 15이고, 더욱 바람직하게는 1 : 10이다.
일 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 원화 및 천마의 생약 추출물을 포함하고, 상기 두 가지 생약 또는 이들의 생약 추출물의 배합 중량비는 1 : 1 내지 20일 수 있으며, 바람직하게는 1 : 5 내지 15이고, 더욱 바람직하게는 1 : 10이다.
일 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 위령선 및 천마의 생약 추출물을 포함하고, 상기 두 가지 생약 또는 이들의 생약 추출물의 배합 중량비는 1 : 0.05 내지 20일 수 있으며, 가장 바람직하게는 1 : 1이다.
일 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 원화, 위령선, 및 천마의 생약 추출물을 포함하고, 원화, 위령선, 및 천마의 배합 중량비는 1 : 1 내지 20 : 1 내지 20일 수 있으며, 바람직하게는 1 : 5 내지 15 : 5 내지 15이고, 가장 바람직하게는 1 : 10 : 10이다.
일 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 행동 능력을 향상시킴으로써 신경퇴행성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 신경세포에서 독성에 의한 세포 사멸을 억제함으로써 신경퇴행성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 신경세포에서 활성산소종(ROS)의 생성을 억제함으로써 신경퇴행성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 신경세포에서 미토콘드리아의 기능을 보호함으로써 신경퇴행성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 신경세포의 아폽토시스(apoptosis)를 억제함으로써 신경퇴행성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 산화질소(NO)의 생성을 억제함으로써 신경퇴행성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명은 또한 원화, 위령선, 및 천마로 이루어진 군으로부터 선택되는 두 가지 이상의 생약 추출물을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 원화, 위령선, 및 천마로 이루어진 군으로부터 선택되는 두 가지 이상의 생약 추출물을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명의 원화, 위령선, 및/또는 천마의 복합 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 신경퇴행성 질환, 특히 파킨슨병에 있어서 우수한 치료 효과를 나타내어, 신규한 치료제로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 천연물을 유효성분으로 포함함으로써 기존 치료제의 부작용을 줄이고 안전한 치료제로 사용될 수 있다.
도 1은 Rotenone으로 유도된 파킨슨병 동물 모델에서의 Rotarod test 결과를 나타내는 그래프이다 (####: p<0.0001; ****: p<0.0001 (Rotenone 군과 t-test); *: p<0.05 (Rotenone 군과 t-test)).
도 2는 본 발명의 생약 추출물을 사용한 경우의 세포 생존률을 나타내는 그래프이다 (####: p<0.0001; ****: p<0.0001 (MPP 군과 t-test); ***: p<0.001 (MPP 군과 t-test)).
도 3은 본 발명의 생약 추출물을 사용한 경우의 세포 내 활성산소종(ROS) 생성률을 나타내는 그래프이다 (##: p<0.01; **: p<0.01 (MPP 군과 t-test)).
도 4는 본 발명의 생약 추출물을 사용한 경우의 미토콘드리아 기능 보호능을 TMRE 측정률로 나타내는 그래프이다 (####: p<0.0001; *: p<0.05 (MPP 군과 t-test)).
도 5는 본 발명의 생약 추출물을 사용한 경우의 apoptosis 감소능을 나타내는 그래프이다 (####: p<0.0001; ****: p<0.0001 (MPP 군과 t-test); ***: p<0.001 (MPP 군과 t-test)).
도 6은 본 발명의 생약 추출물을 사용한 경우의 산화질소(NO) 생성량을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다 (####: p<0.0001; ****: p<0.0001 (LPS 군과 t-test); ***: p<0.001 (LPS 군과 t-test)).
도 7은 Rotenone으로 유도된 파킨슨병 동물 모델에서의 Rotarod test 결과를 나타내는 그래프이다 (####: p<0.0001; ***: p<0.001 (Rotenone 군과 t-test); **: p<0.01 (Rotenone 군과 t-test)).
도 8은 본 발명의 생약 추출물을 사용한 경우의 산화질소(NO) 생성량을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다 (####: p<0.0001; **: p<0.01 (LPS 군과 t-test); *: p<0.05 (LPS 군과 t-test)).
도 9a 및 9b는 본 발명의 생약 추출물을 사용한 경우, MPP+ 또는 6-OHDA 독성에 대한 세포 보호 효과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 MPTP로 유도된 파킨슨병 동물 모델에서의 Pole test 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 MPTP로 유도된 파킨슨병 동물 모델에서의 Rotarod test 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시태양 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시태양 및 실시예에 한정되지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 원화, 위령선, 및 천마로 이루어진 군으로부터 선택되는 두 가지 이상의 생약 추출물을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
일 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 원화 및 위령선의 생약 추출물을 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 원화 및 천마의 생약 추출물을 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 위령선 및 천마의 생약 추출물을 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 원화, 위령선, 및 천마의 생약 추출물을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "생약 추출물" 또는 "복합 생약 추출물"은 본 발명의 약학 조성물의 유효성분으로서, 원화, 위령선, 및 천마로 이루어진 군으로부터 선택되는 생약으로부터 추출된 추출물 각각을 포함하거나, 이들 생약의 혼합물로부터 추출된 추출물을 포함할 수 있다.
일 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 원화 및 위령선의 생약 추출물을 포함하고, 상기 두 가지 생약 또는 이들의 생약 추출물의 배합 중량비는 1 : 1 내지 20일 수 있으며, 바람직하게는 1 : 5 내지 15이고, 더욱 바람직하게는 1 : 10이다.
일 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 원화 및 천마의 생약 추출물을 포함하고, 상기 두 가지 생약 또는 이들의 생약 추출물의 배합 중량비는 1 : 1 내지 20일 수 있으며, 바람직하게는 1 : 5 내지 15이고, 더욱 바람직하게는 1 : 10이다.
일 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 위령선 및 천마의 생약 추출물을 포함하고, 상기 두 가지 생약 또는 이들의 생약 추출물의 배합 중량비는 1 : 0.05 내지 20일 수 있으며, 가장 바람직하게는 1 : 1이다.
일 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 원화, 위령선, 및 천마의 생약 추출물을 포함하고, 원화, 위령선, 및 천마의 배합 중량비는 1 : 1 내지 20 : 1 내지 20일 수 있으며, 바람직하게는 1 : 5 내지 15 : 5 내지 15이고, 가장 바람직하게는 1 : 10 : 10이다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 조성물이 나타내는 것과 동일하거나 유사한 효과를 갖는 것으로 당업계에 알려져 있는 다른 생약의 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 당업계에 신경퇴행성질환 치료 효과가 있는 것으로 알려져 있는 유효 성분을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, L-dopa 또는 도파민항진제, MAO-A, B 억제제, 신경보호제 등이 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 신경퇴행성질환 외 다른 질환에 효과를 나타내는 유효성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 생약 추출물이 추가의 유효성분과 함께 사용되는 경우, 생약 추출물 및 추가의 유효성분은 하나의 제형으로 동시에 투여되거나, 또는 별개의 제형으로 동시에 또는 순차적으로 투여되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 신경퇴행성질환을 치료하기 위하여 단독 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 또는 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명에 이용되는 생약 추출물은 당업계에서 공지된 통상적인 추출용매를 이용하여 얻을 수 있다. 추출용매로는 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로는 물, C1 내지 C6의 알코올(예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), 아세트산, 또는 상기 극성 용매들의 혼합물을 포함한다. 비극성 용매로는 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸아세테이트, 메틸아세테이트, 부틸아세테이트, 플루오로알칸, 헥산, 에테르, 클로로포름, 디클로로메탄 또는 상기 비극성 용매들의 혼합물을 포함한다.
일 실시태양에서, 상기 생약 추출물은 물, C1 내지 C6의 알코올, 아세트산, 이들의 혼합 용매, 및 비극성 용매로 이루어지는 군으로부터 선택되는 용매로 추출된 것일 수 있다. 바람직하게는, 0.01% 내지 90% 에탄올 추출물이며, 가장 바람직하게는 50% 내지 70% 에탄올 추출물이다.
본 발명에 이용되는 생약 추출물은 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출, 초음파 추출 또는 당업계에 알려진 통상적인 추출방법을 통해 추출한 것일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "추출물"은 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 것을 의미하지만, 광의적으로 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉 생약 추출물은 상술한 용매를 이용하여 얻은 것 뿐만 아니라, 여기에 정제 과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것을 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래프(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 생약 추출물에 포함된다.
일 실시태양에서, 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 피크병, 헌팅톤병, 루게릭병, 프리온 질환, 루이소체 치매, 다계통 위축증, 진행성 핵상 마비, 프리드라이히 운동실조증, 측두엽 간질, 또는 뇌졸중일 수 있다. 바람직하게는, 파킨슨병이다.
본원에 사용된 용어 "신경퇴행성"은 신경세포(nerve cell)가 정상상태에서 기능이 떨어진 상태로의 이행, 유전적인 기능 저하, 산발적인 기능 저하를 모두 포함하며, 신경계의 한 부분 혹은 여러 부분에서 서서히 끊임없이 진행하는 신경세포의 사멸을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "예방"은 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 신경퇴행성 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"는 상기 약학 조성물의 투여에 의해 신경퇴행성 질환의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
일 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 행동 능력을 향상시킴으로써 신경퇴행성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 신경세포에서 독성에 의한 세포 사멸을 억제함으로써 신경퇴행성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 신경세포에서 활성산소종(ROS)의 생성을 억제함으로써 신경퇴행성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 신경세포에서 미토콘드리아의 기능을 보호함으로써 신경퇴행성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 신경세포의 아폽토시스(apoptosis)를 억제함으로써 신경퇴행성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 산화질소(NO)의 생성을 억제함으로써 신경퇴행성 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명은 또한 원화, 위령선, 및 천마로 이루어진 군으로부터 선택되는 두 가지 이상의 생약 추출물을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본원에 사용된 용어 "개선"은 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품 및 건강식품 등을 포함한다.
본 발명의 식품 조성물은 장기 복용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
본 발명은 원화, 위령선, 및 천마로 이루어진 군으로부터 선택되는 두 가지 이상의 생약 추출물을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본원 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.
[제조예 1]
단일 생약 추출물 제조
세척 및 건조된 원화, 위령선, 천마를 사용하였다. 각각 75 g의 원화, 위령선, 천마 생약에 10배의 70%(v/v) 에탄올 수용액을 가하여 상온에서 72시간 동안 교반시키며 추출하여 추출물을 수득하였다. 그 후, 상기 각각의 추출액을 여과하고 50-65℃에서 감압농축한 뒤, 동결건조하여 분말 상태의 단일 생약 추출물을 수득하였다.
[제조예 2]
원화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물 제조
세척 및 건조된 원화, 위령선, 천마 생약을 1:1:1의 중량비로 총 75 g이 되도록 혼합한 뒤 10배의 70%(v/v) 에탄올 수용액을 가하여 상온에서 72시간 동안 잘 교반시키며 추출하였다. 그 후, 상기 추출액을 여과하고 50-65℃에서 감압농축한 뒤, 동결건조하여 분말 상태의 복합 생약 추출물(혼합 추출물)을 수득하였다.
[제조예 3]
위령선 및 천마의 복합 생약 추출물 제조
세척 및 건조된 위령선 및 천마 생약을 1:1의 중량비로 총 80 g이 되도록 혼합한 뒤 10 배의 70%(v/v) 에탄올 수용액을 가하여 상온에서 72시간 동안 잘 교반시키며 추출하였다. 그 후, 상기 추출액을 여과하고 50-65℃에서 감압농축한 뒤, 동결건조하여 분말 상태의 복합 생약 추출물(혼합 추출물)을 수득하였다.
[제조예 4]
원화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물 제조
세척 및 건조된 원화, 위령선, 천마를 이용하여 다음과 같이 복합 생약 추출물을 제조하여, 실시예 9 내지 11의 실험에 사용하였다. 원화의 경우 원형으로, 위령선과 천마의 경우 조절(4,750 μm)의 체를 통과하는 크기로 분쇄한 후 실험에 사용하였다. 상기 원화, 위령선, 천마를 표 1에 기재된 중량비(w/w)에 따라 혼합한 뒤 10 배의 70% 에탄올(v/v) 수용액을 가하여 상온에서 72시간 동안 추출하였다. 추출액을 여과한 후, 50-65℃에서 감압농축한 뒤, 동결건조하여 분말 상태의 복합 생약 추출물을 수득하였다.
중량비 (w/w) 원생약 총량(g) 수율(%)
원화 위령선 천마
제조예 4-1 1 1 1 1200 17.3
제조예 4-2 1 5 5 55 17.7
제조예 4-3 1 10 10 315 7.7
[실시예 1] Rotenone-유도 파킨슨병 동물모델에 대한 복합 생약 추출물의 운동 능력 개선 효능
Rotenone은 살충제로 사용되는 물질이고, 미토콘드리아의 전자전달계를 저해함으로써 미토콘드리아의 활성을 억제시키는데, 이 경우 뇌세포가 사멸하여 결국 운동 기능이 저하된다. 따라서 복합 생약 추출물의 행동 능력을 향상시키는 효능을 검증하기 위하여 Rotenone으로 유도된 파킨슨병 동물 모델에서 운동 기능성을 확인할 수 있는 실험을 수행하였다.
20~22 g의 무게를 갖는 5주령 수컷 C57BL/6 마우스(Orient Bio Inc., Republic of Korea)를 이용하였다. 동물들은 NIH(NIH publication No.85-23, revised 1985)의 가이드라인을 따라 12시간의 낮, 12시간의 밤의 사이클을 갖는 23 ± 1℃의 실내 온도에서 유지하였다. 마우스를 무작위적으로 아래와 같이 7개의 그룹으로 나누어 생체 내 실험을 수행하였다.
(1) 정상군 (n=8)
(2) Rotenone (음성대조군; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) (n=8; 복강내 1 mg/kg/일 농도로 Rotenone 주사)
(3) 원화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물 (1:1:1 비율) 1, 3, 10 mg/kg (n=8; 추출물 경구투여, 복강내 Rotenone 주사)
(4) 원화 추출물 1, 3 mg/kg (n=8; 추출물 경구투여, 복강내 Rotenone 주사)
(5) 위령선 추출물 1, 3 mg/kg (n=8; 추출물 경구투여, 복강내 Rotenone 주사)
(6) 천마 추출물 1, 3 mg/kg (n=8; 추출물 경구투여, 복강내 Rotenone 주사)
(7) L-DOPA 25 mg/kg (양성대조군; Sigma-Aldrich, USA) (n=8; L-DOPA 복강내 주사, 복강내 Rotenone 주사)
3일간의 하우징(housing)후, 21일 동안 생쥐에게 4가지 추출물을 각각 경구투여하였다. 양성대조군인 L-DOPA의 경우에도 21일 동안 복강내 투여(i.p.)를 진행하였다. 정상군을 제외한 그룹에는 식염수에 녹인 1mg/kg/일 Rotenone를 추출물 투여 시작시점 7일 후부터 14일 동안 복강내 투여(i.p.)하였다.
운동 기능성을 확인하기 위하여 Rotarod test를 수행하였다. Rotarod test는 돌아가는 원통 위에서 달리는 시간을 측정하는 검사로서, ROTA-ROD TREADMILL DJ345 (㈜대종기기산업, 대한민국)을 사용하였다. 본 실험을 진행하기에 앞서, 마우스들이 해당 기구에 익숙해지기 위하여 이틀 및 하루 전에 5, 15 rpm 속도로 돌아가는 원통 위에서 5분간 달리도록 3회 트레이닝을 진행하였다.
마우스가 20 rpm으로 돌아가는 원통 위에서 달리다가 바닥으로 떨어지는 시간을 측정하였으며, 측정시간은 기기에 부착된 자동타이머를 이용하였고, 최대 측정 시간은 300초로 고정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
C57BL/6 마우스에 Rotenone만을 주입한 음성대조군의 경우, 행동 능력이 Rotenone을 투여하지 않은 정상군 대비 11.9% 밖에 미치지 못하였다(88.1% 감소). 상기 제조예 2에서 제조한 복합 생약 추출물을 1, 3, 10 mg/kg 농도로 투여하였을 때 행동 능력이 각각 정상군 대비 19.0%, 44.8%, 75.0% 수준으로 향상되었는 바, Rotenone 처리에 따른 행동 능력 감소현상이 억제되었음을 확인하였다. 각 단일 생약 추출물을 처리한 군에서는 행동 능력이 음성대조군에 비해 약간 증가하거나 유사한 정도를 보여 복합 생약 추출물을 투여한 군보다 행동 능력 향상 정도가 낮았다. L-DOPA 25 mg/kg을 투여한 양성대조군에서 나타난 행동 능력 향상 정도는 복합 생약 추출물 3 mg/kg를 투여한 군과 유사하였고, 복합 생약 추출물 10 mg/kg를 투여한 군은 L-DOPA를 투여한 양성대조군에 비해 행동 능력 향상 정도가 더 우수하였다.
복합 생약 추출물은 음성대조군은 물론, 단일 생약 추출물보다도 행동 능력을 유의하게 향상시켰다. 도파민의 전구물질인 L-DOPA를 투여한 경우와 비교하더라도 더 낮은 용량에서 유사하거나 우수한 효과를 나타내어 파킨슨 병을 치료하는데 활용될 수 있음을 확인하였다.
[실시예 2]
도파민성 신경세포주에서 복합 생약 추출물의 MPP+에 의한 세포 독성 보호 효능
본 실시예에서는 복합 생약 추출물의 세포 보호 활성을 평가하였다. 원화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물의 MPP+를 처리한 신경세포 손상을 보호하는 효과가 있는지를 확인하기 위해, SH-SY5Y 세포주를 이용하여 WST-1 assay를 진행하였다.
구체적으로, 인간 신경아세포종 SH-SY5Y cell을 10％ 소태아혈청 (Fetal Bovine Serum, FBS, GibcoTM, USA) 및 항생제 (1% Penicillin, Streptomycin [P/S], Gibco-BRL, USA)가 함유된 RPMI 1640 medium (GibcoTM, USA) 배지 하에서 배양하였다. 배양기는 37℃로 온도를 유지했고 95％ 공기 및 5％ CO2가 혼합된 기체가 계속 공급되어 세포 배양의 적절한 조건을 갖추었다. 세포를 96-웰 플레이트에 1X 농도조건으로 PDL (Poly-D-lysine, Sigma-Aldrich, USA)으로 코팅한 뒤, PBS로 세척 및 건조한 후 세포를 배양하였다. 세포는 5x104 cell/well이 되도록 실험 24시간 전에 배양하였다. 적당한 수의 세포가 배양되면 0.5% FBS가 포함된 배지로 교체한 후 24시간 추가적으로 배양하여 세포를 분화시켰다.
SH-SY5Y 세포주가 배양되어 있는 96-웰 플레이트에 제조예 2에서 제조한 원화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물을 1, 10, 100 μg/ml의 농도로 30분 동안 처리한 후, 2 mM의 MPP+을 처리하였다. MPP+ 처리 48시간 후 96-웰 플레이트에 10%의 WST-1 용액을 웰에 100 μl씩 첨가하였다. 37℃ 배양기에서 30분 동안 반응시키고 450, 630 nm 파장 값에서 흡광도를 측정하여, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
MPP+를 처리한 결과, 음성대조군에서 MPP+ 무처리군(정상군; NC)에 비하여 세포 생존률이 26.4% 수준으로, 세포 사멸이 높게 유발됨을 확인되었다. 복합 생약 추출물을 1, 10, 100 μg/ml 농도로 처리하였을 때에는 모든 농도에서 MPP+에 의한 세포 사멸이 농도의존적으로 억제되었다(정상군 대비 46.3%, 83.1%, 101.8% 수준의 세포 생존률 확인). 특히 100 μg/ml 농도 처리군의 경우 MPP+ 미처리군(정상군; NC) 수준으로 세포 사멸이 억제되었다(즉, 100% 세포 생존). 따라서, 복합 생약 추출물의 세포 보호 활성이 매우 우수함을 확인하였다.
[실시예 3]
도파민성 신경세포주에서 복합 생약 추출물의 MPP+에 의한 활성산소종 생성 감소 효능
본 실시예에서는 SH-SY5Y 신경세포 독소물질인 MPP+을 처리하였을 경우 원화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물의 활성산소종(ROS) 감소능을 확인하였다. 활성산소종에 의해 세포 안에서 DCF로 전환되어 녹색 형광을 발하는 DCF-DA(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, Sigma-Aldrich, USA)를 이용하여 상기 실시예 2에서 배양한 SH-SY5Y 세포 내의 활성산소종 수준을 측정하였다.
구체적으로, SH-SY5Y 세포에 상기 제조예 2에서 제조한 원화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물을 1, 10, 100 μg/ml의 농도로 30분 동안 처리한 후 2 mM의 MPP+을 처리하였다. MPP+ 처리 48시간 후 96-웰 플레이트에 DCF-DA를 10 μM 농도로 30분간 처리하였다. PBS로 1회 세척한 후 485, 530 nm 파장영역에서 형광을 측정하였다. 파장 보정을 위하여 Hoechst 33342 (ThermoFisher, USA)를 10 mg/ml로 3차 증류수에 녹인 후 1:2000 비율로 처리하여 350, 461nm 파장 조건에서 형광을 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
MPP+를 처리한 결과, MPP+만을 처리한 음성대조군(MPP)에서 MPP+ 무처리군(정상군; NC)에 비하여 활성산소종이 증가하였다. 복합 생약 추출물을 농도별로 처리하였을 때 음성대조군(MPP) 대비 활성산소종 생성이 감소하였고, 특히 100 μg/ml 농도 처리군의 경우 MPP+ 무처리군(정상군;NC) 수준으로 활성산소종이 억제되었다. 따라서, 복합 생약 추출물의 활성산소종 억제능이 우수함을 확인하였다.
[실시예 4]
도파민성 신경세포주에서 복합 생약 추출물의 MPP+에 의한 미토콘드리아 기능 손상 개선 효능
본 실시예에서는 SH-SY5Y 신경세포 독소물질인 MPP+을 처리하였을 경우 원화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물의 미토콘드리아의 기능을 보호하는 효과를 분석하였다. 정상 미토콘드리아의 세포 내로 흡수되어 형광을 발하는 TMRE (Tetramethylrhodamine, Ethyl Ester, Perchlorate, Sigma-Aldrich, 87917)를 이용하여 형광 수준을 측정함으로써 미토콘드리아의 기능을 분석하였다.
상기 실시예 2에서 배양한 SH-SY5Y 세포에 상기 제조예 2에서 제조한 원화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물을 100 μg/ml의 농도로 30분 동안 처리한 후 2 mM MPP+를 48시간 동안 처리하였다. 그 후, TMRE를 0.5 μM의 농도로 30분간 처리해 주었다. PBS로 1회 세척한 후 각 well에 100 μl씩 PBS를 첨가하였다. 549, 575 nm 파장영역에서 형광을 측정하여 그 결과를 도 4에 나타내었다.
MPP+를 처리한 결과, MPP+만 처리한 음성대조군(MPP)에서 MPP+ 무처리군(정상군; NC)에 비하여 미토콘드리아 기능 손실이 확인되었다. 복합 생약 추출물을 100 μg/ml 농도로 처리하였을 때 MPP+ 처리에 따른 미토콘드리아 기능 손실이 억제되었다. 특히 복합 생약 추출물은 MPP+ 무처리군(정상군; NC) 수준으로 미토콘드리아 기능 손실이 억제되어 해당 추출물의 미토콘드리아 기능 회복능이 우수함을 확인하였다. 따라서, 복합 생약 추출물의 미토콘드리아 기능 회복능이 우수함을 확인하였다.
[실시예 5]
도파민성 신경세포주에서 복합 생약 추출물의 MPP+에 의한 세포사멸 감소 효능
본 실시예에서는 SH-SY5Y 신경세포 독소물질인 MPP+을 처리하였을 경우 원화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물의 세포 내 apoptosis 감소능 효과를 분석하였다.
Caspase는 시스테인 프로테아제의 한 종류로, 세포자살이라는 프로그램된 apoptosis에 필수적인 단백질이다. Caspase에 의해 활성화된 apoptosis는 세포자살을 유도하여 관련된 세포의 사멸을 유도하며 파킨슨병에서 뇌세포 apoptosis는 질환을 악화시킨다. DEVD 루시페린이 함유되어 있는 Caspase-Glo 시약과 caspase가 반응하면 ATP와 만나 빛을 발산한다.
상기 실시예 2에서 배양한 SH-SY5Y 세포에 상기 제조예 2에서 제조한 원화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물을 1, 10, 100 μg/ml의 농도로 30분 동안 처리하고 2 mM MPP+를 48시간 동안 처리하였다. 그 후, Caspase-Glo buffer와 substrate (Promega, USA)를 혼합하여 각 well당 50 μl를 첨가하고 빛이 없는 조건에서 30분 동안 상온 처리해 주었다. 그 후, 490, 570 nm 파장영역에서 값을 측정하고, 파장 보정을 위하여 Hoechst 33342 (ThermoFisher, USA)를 10 mg/ml로 3차 증류수에 녹인 후 1:2000 비율로 추가하여 350, 461nm 파장으로 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
MPP+를 처리한 결과, MPP+만을 처리한 음성대조군(MPP)에서 MPP+ 무처리군(정상군; NC)에 비하여 279%의 caspase가 측정되어 apoptosis 현상이 높은 수준으로 유발되었다. 복합 생약 추출물을 1, 10, 100 μg/ml 농도로 처리하였을 때 정상군 대비 caspase의 증가량은, 음성대조군 대비 29.0%, 46.5%, 21.9% 감소되어 MPP+ 처리에 따른 apoptosis 현상이 억제됨을 알 수 있었다. 상기 결과를 통하여 추출물의 apoptosis 현상 억제능이 우수함을 확인하였다.
[실시예 6]
미세아교세포주에서 복합 생약 추출물의 LPS에 의한 염증반응 억제 효능
원화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물의 항염증 효능을 확인하기 위하여 Griess assay를 이용하여 쥐 미세아교세포인 BV2 세포 내 산화질소(NO) 함량의 변화를 측정하였다.
BV2 세포를 소태아혈청 (Fetal Bovine Serum, FBS, GibcoTM, USA) 및 항생제 (1% Penicillin, Streptomycin [P/S] Gibco-BRL, USA)가 함유된 DMEM medium (GibcoTM, USA) 배지 하에서 배양하였다. 구체적으로, 배양기는 37℃로 온도를 유지하였고, 95％ 공기와 5％ CO2가 혼합된 기체가 계속 공급되어 세포 배양의 적절한 조건이 갖추어지도록 하였다. 세포는 12-웰 플레이트에 3x104 cell/well이 되도록 실험 24시간 전에 배양하였다.
준비된 12-웰 플레이트에 상기 제조예 2에서 제조한 원화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물을 1, 10, 30, 100 μg/ml 농도로 한시간 동안 전처리한 후 1 μg/ml 농도의 LPS를 24시간 동안 처리하였다. 그 후, 상층액을 취하여 Griess assay kit (G2930, Promega, USA)을 통해 산화질소 함량의 변화를 520, 550 nm 파장값에서 흡광도를 측정함으로써 평가하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
BV2 미세아교세포에 LPS를 처리한 결과, LPS만을 처리한 음성대조군(LPS)은 LPS 무처리군(정상군; NC)에 비하여 산화질소가 높은 수준으로 생성되었다(1123%). 복합 생약 추출물을 1, 10, 30, 100 μg/ml 농도로 처리하였을 때에는 모든 농도에서 산화질소 생산 증가량이 감소되었고, 특히 복합 생약 추출물을 10, 30, 100 μg/ml 농도로 처리하였을 때 음성대조군 대비 56.4%, 91.4%, 99.5% 만큼 감소하였다. 따라서, 복합 생약 추출물의 LPS에 의해 유도된 염증반응 억제능이 우수함을 확인하였다.
[실시예 7]
Rotenone-유도 파킨슨병 동물모델에 대한 복합 생약 추출물의 운동 능력 개선 효능
20~22 g의 무게를 갖는 5주령 수컷 C57BL/6 마우스 (Orient Bio Inc., Republic of Korea)를 이용하였다. 동물들은 NIH (NIH publication No.85-23, revised 1985)의 가이드라인을 따라 12시간의 낮, 12시간의 밤의 사이클의 조건하에 23 ± 1℃의 실내 온도에서 유지하였다. 마우스를 무작위적으로 아래와 같이 5개의 그룹으로 나누어 생체 내 실험을 수행하였다.
(1) 정상군 (n=8)
(2) Rotenone (음성대조군; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) (n=8; 복강내 1 mg/kg/일 농도로 Rotenone 주사)
(3) 원화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물 (1:1:1 비율) 5 mg/kg (n=8; 추출물 경구투여, 복강내 Rotenone 주사)
(4) 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물 (1:1 비율) 5 mg/kg (n=8; 추출물 경구투여, 복강내 Rotenone 주사)
(5) L-DOPA 25 mg/kg (양성대조군; Sigma-Aldrich, USA) (n=8; L-DOPA 복강내 주사, 복강내 Rotenone 주사)
3일간의 하우징 (housing)후, 21일 동안 생쥐에게 2가지 종류의 복합 생약 추출물을 각각 경구투여하였다. 양성대조군인 L-DOPA의 경우에도 21일 동안 복강내 투여(i.p.)를 진행하였다. 정상군을 제외한 그룹에는 식염수에 녹인 1mg/kg/일 Rotenone를 추출물 투여 시작시점 7일 후부터 14일 동안 복강내 투여(i.p.)하였다.
운동 기능성을 확인하기 위하여 Rotarod test를 수행하였다. Rotarod test는 돌아가는 원통 위에서 달리는 시간을 측정하는 검사로서, ROTA-ROD TREADMILL DJ345 (㈜대종기기산업, 대한민국)을 사용하였다. 본 실험을 진행하기에 앞서, 마우스들이 해당 기구에 익숙해지기 위하여 이틀 및 하루 전에 5, 15 rpm 속도로 돌아가는 원통 위에서 5분간 달리도록 3회 트레이닝을 진행하였다.
마우스가 20 rpm으로 돌아가는 원통 위에서 달리다가 바닥으로 떨어지는 시간을 측정하였으며, 측정시간은 기기에 부착된 자동타이머를 이용하였고, 최대 측정 시간은 300초로 고정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.
C57BL/6 마우스에 Rotenone만을 주입한 음성대조군의 경우, 행동 능력이 Rotenone을 투여하지 않은 정상군 대비 28.6% 밖에 미치지 못하였다(71.4% 감소). 상기 제조예 2에서 제조한 원화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물(도 7에서 "복합 생약 추출물"로 표기됨) 및 제조예 3에서 제조한 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물(도 7에서 "위령선/천마 복합 추출물"로 표기됨)을 각각 5 mg/kg 농도로 투여하였을 때 행동 능력이 각각 정상군 대비 57.5%, 48.4% 수준으로 향상되었는 바, Rotenone 처리에 따른 행동 능력 감소현상이 억제되었음을 확인하였다.
[실시예 8]
미세아교세포주에서 복합 생약 추출물의 LPS에 의한 염증반응 억제 효능
원화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물 및 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물의 항염증 효능을 확인하기 위하여 Griess assay를 이용하여 쥐 미세아교세포인 BV2 세포 내 산화질소(NO) 함량의 변화를 측정하였다.
BV2 세포를 소태아혈청 (Fetal Bovine Serum, FBS, GibcoTM, USA) 및 항생제 (1% Penicillin, Streptomycin [P/S] Gibco-BRL, USA)가 함유된 DMEM medium (GibcoTM, USA) 배지 하에서 배양하였다. 구체적으로, 배양기는 37℃로 온도를 유지하였고, 95％ 공기와 5％ CO2가 혼합된 기체가 계속 공급되어 세포 배양의 적절한 조건이 갖추어지도록 하였다. 세포는 12-웰 플레이트에 3x104 cell/well이 되도록 실험 24시간 전에 배양하였다.
준비된 12-웰 플레이트에 상기 제조예 2에서 제조한 원화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물 및 제조예 3에서 제조한 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물을 10 μg/ml 농도로 한시간 동안 전처리한 후 1 μg/ml 농도의 LPS를 24시간 동안 처리하였다. 그 후, 상층액을 취하여 Griess assay kit (G2930, Promega, USA)을 통해 산화질소 함량의 변화를 520, 550 nm 파장값에서 흡광도를 측정함으로써 평가하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
BV2 미세아교세포에 LPS를 처리한 결과, LPS만을 처리한 음성대조군(LPS)은 LPS 무처리군(정상군; NC)에 비하여 산화질소가 높은 수준으로 생성되었다(1123%). 원화, 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물(도 8에서 "복합 생약 추출물"로 표기됨) 및 위령선 및 천마의 복합 생약 추출물(도 8에서 "위령선/천마 복합 추출물"로 표기됨)을 각각 10 μg/ml 농도로 처리하였을 때에는 산화질소 생산 증가량이 감소되었고, 특히 음성대조군 대비 각각 56.4%, 54.1% 만큼 감소하였다. 따라서, 복합 생약 추출물 및 위령선/천마 추출물의 LPS에 의해 유도된 염증반응 억제능이 우수함을 확인하였다.
[실시예 9]
배합비율별 복합 생약 추출물의 비글견에서의 구토 발생 여부 비교
본 실시예에서는 원화, 위령선 및 천마의 1:1:1, 1:5:5 또는 1:10:10 배합비율에 따른 복합 생약 추출물을 경구 투여 후 비글견에서의 체중 변화 및 구토 등 일반 증상 변화를 관찰하였다.
시험에 사용된 비글견 (Beagle dog)은 9-14개월경 (Beijing Marshall Biotechnology Co., Ltd., China)의 암수 각 5마리(수컷 G1101, G1201, G1301, G1401, G1501; 암컷 G2101, G2201, G2301, G2401, G2501)를 사용하였으며, 시험물질은 상기 제조예 4-1 (배합비율 1:1:1), 4-2 (1:5:5) 및 4-3 (1:10:10)에 의해 제조된 동결건조분말을 필요량에 맞게 칭량하여 주사용수 (JW 중외제약, 대한민국)에 현탁시켜 투여 당일 조제하거나, 일반 젤라틴캡슐 또는 장용캡슐에 투여 전일 충진하여 사용하였다. 투여액량은 5 ml/kg 체중으로 하였다. 시험설계는 표 2와 같이 진행하였으며, 각 시험별로 최소 5일 이상의 wash-out 기간을 두고 시험을 진행하였다.
시험 번호 개체번호 투여물질 투여기간 및 용량 비고
수컷 암컷
1 G1101 G2101 제조예 4-1 50 mg/kg 단회 　
2 G1101 G2101 제조예 4-1 50 mg/kg 단회 일반 젤라틴캡슐에 충진하여 투여
3 G1201 G2201 제조예 4-1 50 mg/kg 단회 장용캡슐에충진하여 투여
4 G1101, G1201 G2101, G2201 제조예 4-1 25 mg/kg1일 1회 4일간
5 G1101 G2101 제조예 4-2 41.25 mg/kg1일 1회 5일간
6 G1301, G1401 G2301, G2401 제조예 4-3 50 mg/kg 단회
7 G1501 G2501 제조예 4-3 100 mg/kg1일 1회 7일간 　
각 시험별 동물의 체중을 측정한 결과 (단회 투여: 투여 다음 날, 반복 투여: 마지막 투여 다음 날)를 하기 표 3에 나타내었다. 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 암수 모두 시험물질 투여에 의한 체중변화는 관찰되지 않았다.
몸무게 (kg) 개체번호 시험번호
1 2 3 4 5 6 7
수컷 G1101 7.19 7.51 - 7.94 8.75 -
암컷 G2101 6.49 6.51 - 6.93 7.2 -
수컷 G1201 - - 8.46 8.98 - -
암컷 G2201 - - 5.88 6.12 - -
수컷 G1301 - - - - - 9.79
암컷 G2301 - - - - - 7.23
수컷 G1401 - - - - - 7.73
암컷 G2401 - - - - - 6.68
수컷 G1501 - - - - - - 8.96
암컷 G2501 - - - - - - 7.06
(- : 측정 결과 없음)
또한, 각 시험별 동물의 일반증상 (구토 여부, 분변 상태 등)을 관찰한 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
시험번호 투여 물질 투여기간 및 용량 일반증상 관찰 결과
1 제조예 4-1 50 mg/kg 단회 암컷: 투여 후 30분-1시간 구토 관찰수컷: 투여 후 1시간 구토 관찰
2 제조예 4-1 50 mg/kg 단회(일반 젤라틴 캡슐 충진) 암컷: 투여 후 1시간 구토 관찰수컷: 투여 후 30분 구토 관찰
3 제조예 4-1 50 mg/kg 단회(장용캡슐 충진) 암수 모두 투여 후 30분-4시간 구토 관찰
4 제조예 4-1 25 mg/kg1일 1회 4일간 암컷: 투여 2-3일간 구토 관찰수컷: 투여 2-4일간 구토 관찰
5 제조예 4-2 41.25 mg/kg1일 1회 5일간 암수 모두 투여 1일째 구토 관찰, 이후 구토 없음
6 제조예 4-3 50 mg/kg 단회 암수 모두 구토 없음
7 제조예 4-3 100 mg/kg1일 1회 7일간 암컷에서만 투여 1일째 구토 관찰, 이후 구토 없음
상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 원화, 위령선 및 천마를 1:1:1 배합비율로 포함하는 제조예 4-1을 단회 또는 반복 투여한 모든 시험 (시험번호 1 내지 4)에서 암수 모두 구토가 발생하는 것을 확인하였다. 또한 원화, 위령선 및 천마를 1:5:5 배합비율로 포함하는 상기 제조예 4-2을 반복 투여한 시험 (시험번호 5)에서는 암수 모두 1일째 구토가 발생하는 것을 확인하였다.
반면, 원화, 위령선 및 천마를 1:10:10 배합비율로 포함하는 상기 제조예 4-3을 단회 투여한 시험 (시험번호 6)의 경우, 제조예 4-1을 동일 용량으로 투여한 시험 (시험번호 1 내지 3)과 달리 암수 모두 구토를 포함한 이상증상이 나타나지 않는 것을 확인하였다.
또한 상기 제조예 4-3 (배합비율 1:10:10)의 복합 생약 추출물을 반복 투여한 시험 (시험번호 7)의 경우, 제조예 4-1 (배합비율 1:1:1) 및 4-2 (배합비율 1:5:5)의 복합 생약 추출물의 반복 투여 시험 (시험번호 4 및 5)과 비교하여 더 높은 투여 용량 및 투여 기간의 조건에도 불구하고 상대적으로 경미한 구토 발생 정도를 나타내는 것을 확인하였다.
따라서, 원화, 위령선 및 천마의 배합비율이 1:10:10인 복합 생약 추출물 투여군은 구토 유발 등의 부작용이 현저히 개선되는 것을 확인하였다.
[실시예 10]
배합비율별 복합 생약 추출물의 MPP+ 또는 6-히드록시도파민에 의한 세포 독성 보호 효능 비교
원화, 위령선 및 배합비율별 복합 생약 추출물이 MPP+ 또는 6-히드록시도파민(6-hydroxydopamine, 6-OHDA) 유도 신경세포 손상을 보호하는 효과가 있는지를 확인하기 위해, SH-SY5Y 세포주를 이용하여 MTT assay를 진행하였다.
구체적으로, 인간 신경아세포종 SH-SY5Y cell을 10％ 소태아혈청 (Fetal Bovine Serum, FBS, GibcoTM, USA) 및 항생제 (1% Penicillin, Streptomycin [P/S], Gibco-BRL, USA)가 함유된 DMEM medium (GibcoTM, USA) 배지 하에서 배양하였다. 배양기는 37℃로 온도를 유지했고 95％ 공기 및 5％ CO2가 혼합된 기체가 계속 공급되어 세포 배양의 적절한 조건을 갖추었다. 세포는 4x105 cell/ml이 되도록 실험 24시간 전에 배양하였다. 적당한 수의 세포가 배양되면 0.5% FBS가 포함된 배지로 교체한 후 20시간 추가적으로 배양하여 세포를 분화시켰다.
SH-SY5Y 세포주가 배양되어 있는 96-웰 플레이트에 제조예 4-1, 4-2, 4-3에서 제조한 원화, 위령선 및 천마의 1:1:1, 1:5:5, 1:10:10 복합 생약 추출물을 각각 3, 10, 30 μg/ml의 농도로 4시간 동안 처리한 후, 1 mM의 MPP+를 처리하였다. MPP+ 처리 44시간 후 96-웰 플레이트에 1 mg/ml 농도의 MTT 용액을 웰에 100 μl씩 첨가하였다. 37℃ 배양기에서 1시간 동안 반응시키고 MTT 용액 제거 후, 100% DMSO 100 μl/well을 첨가하여 약 15분간 shaking 후 570 nm 파장 값에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 9a에 나타낸 바와 같이 MPP+를 처리한 음성대조군에서 MPP+ 무처리군 (정상군; NC)에 비하여 세포 생존률이 55.6% 수준으로, 통계적으로 유의한 세포 사멸이 확인되었다. 또한 1:1:1, 1:5:5, 1:10:10의 배합비율을 갖는 복합 생약 추출물을 각각 3, 10, 30 μg/ml 농도로 처리하였을 때, 1:1:1 복합 생약 추출물 (10, 30 μg/ml), 1:5:5 복합 생약 추출물 (3, 10, 30 μg/ml), 1:10:10 복합 생약 추출물 (10, 30 μg/ml)에서 MPP+에 의한 세포 사멸이 농도의존적으로 억제되었다. 특히 10, 30 μg/ml 농도에서 1:10:10 복합 생약 추출물 처리군은 1:1:1 또는 1:5:5 복합 생약 추출물 처리군과 비교하여 동일 농도에서 가장 높은 세포 보호 활성을 나타내어, 우수한 신경세포 보호 효능을 가지는 것을 확인하였다.
또한, 동일한 세포에 대해서 제조예 4-1, 4-2, 4-3에서 제조한 원화, 위령선 및 천마의 1:1:1, 1:5:5, 1:10:10 복합 생약 추출물을 각각 10, 30 μg/ml의 농도로 1시간 동안 처리한 후, 신경세포 독성 유도 물질로 MPP+ 대신 50 μM의 6-OHDA를 처리하였다. 6-OHDA 처리 23시간 후, MPP+와 동일한 방법으로 흡광도를 측정하여, 그 결과를 도 9b에 나타냈으며, 6-OHDA 신경독성에 대한 세포 보호 효과는 1:1:1, 1:5:5, 1:10:10 배합비율에 따른 복합 생약 추출물에서 유사하게 나타났다.
[실시예 11]
MPTP 유도 파킨슨병 동물모델에 대한 복합 생약 추출물의 운동 능력 개선 효능
MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine )는 미토콘드리아의 전자전달계를 저해함으로써 미토콘드리아의 활성을 억제시키는데, 이 경우 뇌세포가 사멸하여 결국 운동 기능이 저하된다. 따라서 복합 생약 추출물의 행동 능력을 향상시키는 효능을 검증하기 위하여 MPTP로 유도된 파킨슨병 동물 모델에서 운동 기능성을 확인할 수 있는 실험을 수행하였다.
8주령 수컷 C57BL/6J 생쥐 (DBL Inc., 대한민국)를 5일의 순화기간을 거쳐 실험에 사용하였다. 동물들은 NIH (NIH publication No.85-23, revised 1985)의 가이드라인을 따라 12시간의 낮, 12시간의 밤의 사이클을 갖는 23 ± 1℃의 실내 온도에서 유지하였다. 마우스를 무작위적으로 아래와 같이 5개의 그룹으로 나누어 생체 내 실험을 수행하였다.
(1) 정상군 (n=8)
(2) MPTP (음성대조군; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) (n=8; 30 mg/kg/일 농도로 1일 1회 5일간 복강 내 투여)
(3) MPTP + 원화, 위령선 및 천마의 1:5:5 복합 생약 추출물 (제조예 4-2) 30 mg/kg (n=8; 1일 1회 12일간 추출물 경구투여, MPTP 복강 내 투여)
(4) MPTP+원화, 위령선 및 천마의 1:10:10 복합 생약 추출물 (제조예 4-3) 30 mg/kg (n=8; 1일 1회 12일간 추출물 경구투여, MPTP 복강 내 투여)
순화기간 후, 12일 동안 생쥐에게 추출물을 각각 경구투여 하였다. 또한 정상군을 제외한 그룹에는 식염수에 녹인 30 mg/kg/일 MPTP를 추출물 투여 시작일부터 5일 동안 복강 내 투여 (intraperitoneal injection, i.p.)하였다.
회전 운동에 대한 기능성을 확인하기 위해 Pole test를 수행하였다. Pole test는 수직 막대의 위쪽 끝에 마우스를 위를 향하도록 놓고 마우스가 아래 방향으로 회전하는데 걸리는 시간을 측정하는 검사로, 본 실험을 진행하기에 앞서 마우스들이 해당 기구에 익숙해지도록 하루 전에 동일한 방법으로 1회 트레이닝을 진행하였다.
마우스를 수직 막대의 위쪽 끝에 놓고 마우스가 아래 방향으로 몸을 회전하는데 걸리는 시간을 측정하여 그 결과를 도 10에 나타냈다.
도 10에서 확인되는 바와 같이, C57BL/6 마우스에 MPTP 만을 주입한 음성대조군의 경우, Pole test의 T-turn 소요 시간 측정결과에서 정상군 대비 68.2%의 시간이 더 소요되었다. 반면, 원화, 위령선 및 천마의 1:5:5 또는 1:10:10 복합 생약 추출물을 각각 30 mg/kg 농도로 투여하였을 때, 음성대조군 대비 각각 49.7% 및 46.4%의 소요 시간이 감소하여, MPTP 처리에 따른 회전 운동 능력 감소현상이 억제되었음을 확인하였다.
또한, 종합적인 운동 능력을 평가하기 위하여 Rotarod test를 수행하였다. Rotarod test는 돌아가는 원통 위에서 실험동물을 두고 운동 능력을 평가하는 검사로, ROTA-ROD TREADMILL (㈜정도비앤피, 대한민국)을 사용하여 진행하였다. 본 실험을 진행하기에 앞서, 마우스들이 해당 기구에 익숙해지기 위하여 하루 전에 9 rpm 속도로 돌아가는 원통 위에서 3분간 달리도록 2회 트레이닝을 진행하였다. 본 실험은 마우스가 11 rpm으로 돌아가는 원통 위에서 3분간 달리다가 바닥으로 떨어진 횟수를 측정하였으며, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에서 확인되는 바와 같이, 3분간 원통에서 마우스가 떨어진 횟수를 측정한 결과 MPTP 만을 주입한 음성대조군의 경우 정상군 대비 52.6% 증가하였다. 이에 반해, 원화, 위령선 및 천마의 1:5:5 또는 1:10:10 복합 생약 추출물을 각각 30 mg/kg를 투여한 군은 음성대조군 대비 원통에서 떨어진 횟수가 각각 57.9%, 47.4% 감소하여, MPTP 처리에 따른 전반적인 운동 능력 감소현상이 억제되었음을 확인하였다.
결국, 상기 파킨슨병 동물모델 시험을 통하여 본 발명의 원화, 위령선 및 천마 복합 생약 추출물은 우수한 운동 능력 개선 효능을 갖는 것을 확인하였다.

Claims (21)

  1. 원화, 위령선, 및 천마로 이루어진 군으로부터 선택되는 두 가지 이상의 생약 추출물을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 생약 추출물은 원화, 위령선, 및 천마로 이루어진 군으로부터 선택되는 생약으로부터 추출된 추출물 각각을 포함하거나, 원화, 위령선, 및 천마로 이루어진 군으로부터 선택되는 생약의 혼합물로부터 추출된 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 생약 추출물은 물, C1 내지 C6의 알코올, 아세트산, 및 이들의 혼합 용매로 이루어지는 군으로부터 선택되는 용매로 추출된 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 생약 추출물은 0.01% 내지 90% 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 생약 추출물은 50% 내지 70% 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병, 알츠하이머병, 피크병, 헌팅톤병, 루게릭병, 프리온 질환, 루이소체 치매, 다계통 위축증, 진행성 핵상 마비, 프리드라이히 운동실조증, 측두엽 간질, 및 뇌졸중으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병인 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 원화 및 위령선의 생약 추출물을 포함하고, 원화 및 위령선의 배합 중량비는 1 : 1 내지 20인 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 원화 및 천마의 생약 추출물을 포함하고, 원화 및 천마의 배합 중량비는 1 : 1 내지 20인 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 위령선 및 천마의 생약 추출물을 포함하고, 위령선 및 천마의 배합 중량비는 1 : 0.05 내지 20인 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물이 원화, 위령선, 및 천마의 생약 추출물을 포함하고, 원화, 위령선, 및 천마의 배합 중량비는 1 : 1 내지 20 : 1 내지 20인 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 원화, 위령선, 및 천마의 배합 중량비는 1 : 5 내지 15 : 5 내지 15인 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 원화, 위령선, 및 천마의 배합 중량비는 1 : 10 : 10인 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 행동 능력을 향상시키는 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 신경세포에서 독성에 의한 세포 사멸을 억제하는 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 신경세포에서 활성산소종(ROS)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 신경세포에서 미토콘드리아의 기능을 보호하는 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  18. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 신경세포의 아폽토시스를 억제하는 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  19. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 산화질소(NO)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  20. 원화, 위령선, 및 천마로 이루어진 군으로부터 선택되는 두 가지 이상의 생약 추출물을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  21. 원화, 위령선, 및 천마로 이루어진 군으로부터 선택되는 두 가지 이상의 생약 추출물을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물.
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