WO2020101442A1 - 견사단백질을 갖는 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물을 함유하는 기억력 개선용 조성물 또는, 알츠하이머성 치매 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

견사단백질을 갖는 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물을 함유하는 기억력 개선용 조성물 또는, 알츠하이머성 치매 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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지상덕
김기영
김남숙
조유영
김수배
김성완
김종길
김영국
고영호
김아영
최보혜
누겐푸엉
박현우
서주원
김휘
송미경
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대한민국(농촌진흥청장)
명지대학교 산학협력단
한림대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for improving memory or a composition for preventing and treating Alzheimer's dementia, which contains cooked silkworm products having silk protein and an Angelica extract, and more specifically, shows two effects of improving memory and preventing Alzheimer's dementia. It is to provide a composition for improving memory, or a composition for the prevention and treatment of Alzheimer's dementia, containing cooked silkworm processing material and silkworm extract having a silk protein that exhibits more remarkable efficacy compared to a single material by combining the materials.
  • Alzheimer's dementia As of 2017, the population of the elderly aged 65 or over in Korea is 14%, or 7 million, and if the fertility rate and the aging trend continue, it is expected to increase to 41.0% of the total population by 2060. Is that older people over 65 suffer from one or more chronic diseases for the rest of their lives. The most feared disease among the elderly is dementia, which has not yet been cured. Dementia is largely divided into Alzheimer's dementia, vascular dementia, and Parkinson's disease dementia, among which more than 60% suffer from Alzheimer's disease (AD) .To date, treatments or methods to prevent or cure Alzheimer's dementia Is not developed.
  • AD Alzheimer's disease
  • the number of dementia patients in 2017 is expected to reach 724 thousand, to 1.68 million in 2040, and to 2127,000 in 2050.
  • a sharp increase in dementia management costs is also expected, with management expenses of KRW 1.3 trillion already invested in 2012, KRW 78 trillion in 2040, and KRW 134.60 trillion in 2050. Is expected to surge.
  • the prevalence of dementia is expected to decrease by 20% after 40 years if the onset of dementia is delayed by 2 years. National dementia management costs are expected to be reduced.
  • the current treatment method of dementia is a situation for the purpose of symptom relief rather than the resolution of the underlying cause, and there is a need to develop a substance for suppressing, delaying, or treating the onset.
  • An object of the present invention is to provide a composition for improving memory, or a composition for preventing and treating Alzheimer's dementia, containing cooked silkworm processed substances having silk protein and a Angelica extract having significantly improved efficacy for preventing dementia or improving memory.
  • the pharmaceutical composition or food composition for improving memory of the present invention for preventing and improving Alzheimer's dementia of the present invention for achieving the above object is characterized by including cooked silkworm processed products and Angelica extract.
  • the cooked silkworm processed material is characterized in that the whole silkworm having silkworm protein is cooked for 100 to 150 minutes under the heat of steam at 80 to 125 ° C and then ingested for dietary use while silkworm protein is included.
  • the cooked silkworm processed material and the Angelica extract are characterized by being composed in a weight ratio of 1: 0.1 to 1.
  • composition for preventing or treating Alzheimer's dementia and memory improvement by cooked silkworm processed substances and Angelica extract containing a large amount of functional substances derived from silk proteins and mulberry leaves various health supplements or medicines using the present invention It is expected to be developed and marketed, and this is expected to fundamentally prevent and treat aging and dementia caused by aging, which are emerging as a major problem in modern society. In addition, students, test preparation students, office workers, etc. It is expected to help improve memory.
  • 1 is a view showing the effect of increasing the life expectancy of the normal group Drosophila according to the composition of the present invention, cooked slumber and Angelica keiskei kombu extract.
  • AD Alzheimer's Dementia
  • Drosophila Drosophila according to the composition of the present invention
  • the cooked sleeping sleep and Angelica keiskei kombu extract combination treatment.
  • Figure 3 is a view showing the effect of improving the structure of the nerve junction according to the composition of the present invention, the cooked slumber and Angelica keiskei kombu extract.
  • Figure 4 is a view showing the neuroprotective activity according to the composition of the present invention, the ripened sleep and Angelica extract complex agent treatment.
  • FIG. 5 is a view showing the synergistic effect of the mitochondrial complex 1-4 according to the composition of the present invention, the cooked slumber and Angelica keiskei kombu extract combination treatment.
  • FIG. 6 is a view showing the effect of promoting the ability to produce ATP according to the composition of the present invention, the ripened sleep and Angelica keiskei kombu extract.
  • FIG. 7 is a view showing the effect of improving the memory according to the composition of the present invention for the sleeping short-term memory loss treatment mouse and a combination of ripened sleep and Angelica extract.
  • FIG. 8 is a view showing a comparison of the effect of improving the spatial memory according to the treatment of the cooked slumber and the true Angelica extract complex of the composition of the present invention in the Y-maze test.
  • SW cooked sleeping powder
  • CDG perilla
  • COM cooked sleeping and perilla compound
  • RG memory improvement red ginseng product
  • DO donepezil
  • SCO scopolamine
  • FIG. 9 is a view showing a comparison of the effect of enhancing the spatial memory according to the treatment of the cooked slumber and the true Angelica extract composites of the present invention in the Morris water maze test.
  • SW cooked sleeping powder
  • CDG perilla
  • COM cooked sleeping and persimmon complex
  • RG memory improvement red ginseng product
  • DO donepezil
  • SCO scopolamine
  • FIG. 10 is a view showing the effect of enhancing the self-regulation ability of 3xTG dementia mice according to the composition of the present invention, the cooked slumber and Angelica keiskei kombu extract combination treatment.
  • 11 is a view showing the effect of enhancing the recognition ability of a new object of the 3xTG dementia mouse according to the composition of the present invention, the cooked slumber and Angelica keiskei kombu extract.
  • FIG. 12 is a view showing the effect of enhancing the sociality of 3xTG dementia mice according to the composition of the present invention, the cooked slumber and Angelica keiskei kombu extract combination treatment.
  • the present invention is a composition or food composition for improving memory, including cooked silkworm processing products and Angelica extract containing functional substances derived from silk proteins and mulberry leaves; And a composition for preventing or treating Alzheimer's dementia; Or to provide a food composition for preventing or improving Alzheimer's dementia.
  • the present invention is characterized in that it uses a silkworm protein and a mulberry leaf-derived functional substance to improve the memory of the cooked silkworm and Angelica extract, or to prevent and treat Alzheimer's dementia.
  • the cooked silkworm processing product containing the silkworm protein means that it is manufactured through a process of cooking all silkworms having silkworm proteins such as 3-sleeved sleep and 4-sleep sleep, and is mixed with sedam or red sleep cooked in the present specification. .
  • silkworms having silk proteins may be selected from silkworms 5 days or 3 days after silkworms, or silkworms up to maturity.
  • the silkworm after the 5th and 3rd days the silkworm of the 5th and 4th day can be used, and more preferably, the silkworm of the sleeping period is best used. This is because it can be used for silkworms on the 5th and 3rd days, but the silkworm has less silky protein than silkworms after 5th and 4th days, but has a higher content of silkworm dung.
  • the silkworm silkworm refers to a silkworm that is full of silk protein in the silkworm body and before silkworms are built.Since silkworm dung is mostly discharged from the silkworm, the pharmaceutical composition or food composition (health function Food) is most suitable for use as an active ingredient.
  • the silkworm varieties of the cooked silkworm processed matter it is irrelevant to use any kind of silkworm, but among them, one of the white dog breed, the yellow dog breed (Golden Silk), the soft green dog breed, and the pink silkworm breed is used. , More preferably, the recovery effect of the yellow dog breed is the best, and it is best to apply it.
  • the silkworm is processed in the form of a processed product to process all of the silkworm protein contained in the silkworm as described above, and thus used as an active ingredient of a pharmaceutical composition or a food composition (including health functional food).
  • the silkworms are cooked using steam, and preferably, cooked for 80 to 150 minutes under the heat of steam at 80 to 125 ° C, so as to contain all silk protein.
  • the manufacturing time is too long, so the active ingredients of silkworm-containing silkworm itself may be destroyed, and more than 125 ° C less than 100 minutes. This is because there is a fear that the temperature is too high, and the silkworm containing silk protein itself may adversely affect the active ingredients.
  • the cooked process can be dried and dried in a conventional form to be used in powder form.
  • drying is performed through any one selected from hot air drying or vacuum freeze drying, and powdering is preferred.
  • vacuum freeze drying method is most suitable.
  • the powdering is not related to any grinder such as a household mixer, hammer mill, roller mill, or freeze grinder, but a method by roller mill or freeze crushing is preferred for minimizing sample loss, preventing component distortion, and fine powdering.
  • a method by roller mill or freeze crushing is preferred for minimizing sample loss, preventing component distortion, and fine powdering.
  • it is very difficult to crush the powder particles to a size of 0.1 mm or less when crushed with a home mixer or hammer mill, whereas when pulverized several times with a roller mill, the powdered particles can be finely powdered to an average of about 10 ⁇ m and consumed. And products are expected to work.
  • the cooked silkworm powder may be prepared in the form of an extract, and may be prepared by extracting with water, a lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms or a mixed solvent thereof.
  • the lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms may be selected from the group consisting of methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol and isobutanol.
  • the water, a lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms or a mixed solution thereof may be used in a volume of 1 to 40 times based on the weight of the cooked silkworm powder (1 to 40 liters per 1 kg), preferably 5 to 40 times the volume. Can be used.
  • the extraction conditions of the extract may be 1 to 48 hours at 20 to 100 ° C, and the process may be repeated 1 to 4 times.
  • a lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms or a mixed solvent thereof preferably, the weight of the extract is 1 ⁇
  • a solvent selected from the group consisting of hexane, chloroform, ethyl acetate, and butanol is added to the suspension. It can be prepared from the fraction obtained.
  • the preparation temperature of the extract or its fraction may be 20 to 100 ° C, but is not limited thereto.
  • the extraction or fractionation time is not particularly limited, but it is preferable to extract within 10 minutes to 2 days, and an ordinary extraction device, an ultrasonic pulverization extractor, or a fractionator may be used as the extraction device.
  • the thus prepared extract or fraction can be removed by hot air drying, vacuum drying or freeze drying.
  • the extract or fraction may be purified by column chromatography.
  • the chromatography is silica gel column chromatography, LH-20 column chromatography, ion exchange resin chromatography, medium pressure liquid chromatography chromatography, thin layer chromatography (TLC), silica gel vacuum liquid chromatography, and high performance liquid chromatography.
  • anegelica gigas Nakai is a perennial herbaceous plant belonging to the genus Angelica Linnaeus (Apiaceae), and has been reported to recover from anemia and enhance immune activity. Regarding the action, it suppresses vasoconstriction and inhibits platelet aggregation, promotes angiogenesis, antioxidant action, decreases the concentration of alcohol in the blood, antioxidant and antithrombotic functions, analgesic action, protects liver function, anticancer action, central inhibitory action, vasodilator effect However, studies on whitening effects have been reported.
  • the Angelica gig as Nakai , Angelica acutiloba Kitagawa or Angelica sinensis Diels may be used as the above Angelica , but preferably Angelica gig as Nakai .
  • This Angelica is characterized in that the present invention is prepared and used in the form of an extract in order to obtain the desired efficacy, such an extract can be isolated according to conventional methods known in the art.
  • a polar solvent or a non-polar solvent can be used.
  • Suitable polar solvents are (i) water, (ii) alcohol (preferably methanol, ethanol, propanol, butanol, normal-propanol, iso-propanol, normal-butanol, 1-pentanol, 2-butoxyethanol Or ethylene glycol), (iii) acetic acid, (iv) dimethyl-formamide (DMFO) and (v) dimethyl sulfoxide (DMSO).
  • Suitable non-polar solvents include acetone, acetonitrile, ethyl acetate, methyl acetate, fluoroalkane, pentane, hexane, 2,2,4-trimethylpentane, decane, cyclohexane, cyclopentane, diisobutylene, 1- Pentene, 1-chlorobutane, 1-chloropentane, o-xylene, diisopropyl ether, 2-chloropropane, toluene, 1-chloropropane, chlorobenzene, benzene, diethyl ether, diethyl sulfide, chloroform, dichloro Methane, 1,2-dichloroethane, aniline, diethylamine, ether, carbon tetrachloride and THF.
  • the extraction solvent used in the present invention is (a) water, (b) anhydrous or hydrous lower alcohols having 1 to 4 carbon atoms (methanol, ethanol, propanol, butanol, etc.), (c) the lower alcohol and water Mixed solvent with (d) acetone, (e) ethyl acetate, (f) chloroform, (g) butyl acetate, (h) 1,3-butylene glycol, (i) hexane and (j) diethyl ether.
  • the extract of the present invention is obtained by treating water, methanol, ethanol or a combination thereof to Angelica.
  • the term 'extract' used in the present specification has a meaning commonly used as a crude extract in the art as described above, but broadly also includes a fraction in which an extract is additionally fractionated. That is, the Angelica extract includes not only those obtained using the above-described extraction solvent, but also those obtained by additionally applying a purification process. For example, a fraction obtained by passing the extract through an ultrafiltration membrane having a constant molecular weight cut-off value, separation by various chromatography (made for separation according to size, charge, hydrophobicity or affinity), etc. The fraction obtained through the purification method is also included in the Angelica extract of the present invention.
  • Angelica extract used in the present invention can be prepared in powder form by additional processes such as distillation under reduced pressure and freeze drying or spray drying.
  • a lower alcohol such as methanol and ethanol is added to the root diameter of Angelica, preferably 95% ethanol, and 15 to 48 hours at 5 to 80 ° C, preferably 30 to 55 ° C, preferably It can be obtained by extracting for 30 minutes to 12 hours and drying under reduced pressure.
  • the life expectancy and health of both the normal control animal model and the Alzheimer's dementia model are increased when the mixture is used compared to the application of each of the single substances. And prevents memory loss, improves the neural junction structure, protects nerve cells, enhances mitochondrial activity, increases ATP production, improves spatial memory, improves posture control, and improves new objects. Since the effect of improving curiosity and promoting sociality was excellent, it was confirmed that Alzheimer's dementia was prevented and showed more remarkable efficacy in improving memory.
  • the pharmaceutical composition or food composition for improving memory or for preventing and treating Alzheimer's dementia ( It is characterized in that the two substances are used together as an active ingredient of a health functional food), more preferably, the cooked silkworm processed product and the Angelica extract are mixed in a weight ratio of 1: 0.1 to 1, which is the Angelica extract
  • the remarkable effect desired by the present invention is difficult to achieve, and when it exceeds 1 weight ratio, an elevated effect according to the excess content is not obtained.
  • cooked silkworm powder + Angelica extract mixture and “composite” used while referring to “a composition in which cooked silkworm processed material and Angelica extract are mixed together” and “combination agent” mean the active ingredient of the present invention, and are used interchangeably.
  • the mixture of the cooked silkworm processed material and the Angelica extract may be added to the pharmaceutical composition of the present invention as 0.001 to 100% by weight to the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition may be formulated and used in the form of oral dosage forms, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., according to a conventional method.
  • Carriers, excipients, and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose , Methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc. These solid preparations include at least one excipient in the mixtures of the present invention, for example starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, It is prepared by mixing gelatin. In addition, lubricants such as magnesium stearate and talc are used in addition to simple excipients.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, intravenous solutions, emulsions, syrups, etc.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • injectable esters such as ethyl oleate.
  • a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, and glycerogelatin may be used.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention will vary depending on the age, gender, weight of the subject to be treated, the specific disease or pathology to be treated, the severity of the disease or pathology, the route of administration, and the judgment of the prescriber. Dosage determinations based on these factors are within the level of those skilled in the art, and dosages generally range from 100 mg / kg / day to 5000 mg / kg / day. A more preferred dosage is 1000 mg / kg / day to 3000 mg / kg / day.
  • the administration may be administered once a day, or may be divided into several times. The above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to various mammals, such as rats, livestock, and humans. Any mode of administration can be expected, for example, oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dura or cerebral vascular injection. Since the mixture of the present invention has little toxicity and side effects, it is a drug that can be used safely even for a long period of time for prevention purposes.
  • the mixture consisting of the cooked silkworm processed material and Angelica extract is an effective content for showing the desired efficacy of the present invention, and preferably contains 1 to 100% by weight relative to the total weight of the composition in terms of powder weight, more preferably It is good to contain 10 to 90% by weight.
  • the present invention may also provide a food composition for improving memory or preventing Alzheimer's dementia, including a mixture of the cooked silkworm processed material and Angelica extract.
  • a food composition for improving memory or preventing Alzheimer's dementia including a mixture of the cooked silkworm processed material and Angelica extract.
  • the mixture of the cooked silkworm processed material and Angelica extract may be used as 1 to 100% by weight in the food composition of the present invention.
  • the food composition of the present invention includes tablets, capsules, pills or liquids, etc., various drinks, meat, sausage, bread, candy, snacks, noodles, ice cream, dairy products, soups, ionic beverages, beverages, alcoholic beverages , Chewing gum, tea and vitamin complexes.
  • the present invention provides a method for improving memory, comprising the step of administering to the subject a composition comprising the above-described cooked silkworm and Angelica extract.
  • the present invention provides a method for preventing or treating Alzheimer's dementia, comprising administering to a subject a composition comprising the cooked silkworm and the Angelica extract as described above.
  • the present invention provides a method for preparing a composition for improving memory, comprising the step of mixing the above-described cooked silkworm processed material and Angelica extract.
  • the present invention provides a method of preparing a composition for preventing or treating Alzheimer's dementia, comprising the step of mixing the cooked silkworm processed material and Angelica extract.
  • the present invention is expected to greatly assist in improving memory by improving brain functions of all citizens, including students at all levels of school, suffering from academic stress, and the elderly and the elderly, as well as the development of nervous system diseases including Alzheimer's dementia. By effectively reducing it, it is expected to greatly help improve the quality of life of people living in the aging age, and further contribute to the reduction of national dementia management costs.
  • the mixture was prepared by mixing 0.2 g / kg of the cooked silkworm powder of 1) and 0.16 g / kg of the Angelica ethanol extract of 2) to prepare a mixture and apply it as a sample of the following experiments.
  • the main ingredients were analyzed through a hammer mill pulverized product having a particle size of 0.1 mm, respectively.
  • the cooked silkworm processed product contains a large amount of crude proteins, amino acids such as glycine, alanine, serine, and unsaturated fatty acids such as linolenic acid and vitamins such as beta-carotene. Heavy metals such as trans fats and mercury harmful to the human body and sugars such as Sucrose were not detected.
  • cooked silkworms were found to have a very high amino acid content such as crude protein, glycine, alanine, and serine.
  • silkworm varieties all the same ingredients were detected in all varieties such as white hyacinth, golden silk, lotus green and red dog varieties, and the content comparison of each component is different in each varieties, so it is expected that there will be differences in functionality by each silkworm varieties. Became.
  • the cooked Sukjam powder / Angelica keiskei koid extract complex (Example 1) is 1.5 to 1.7 times (3.5 compared to the expected lifespan increase rate of the experimental group in which only the cooked Sukjam powder or Angelica Angelica extract was treated individually. ⁇ 4.4% p).
  • Example 3 Alzheimer's Dementia (AD) model according to the mixture treatment of Example 1 of the present invention confirms the effect of increasing life expectancy of Drosophila>
  • Alzheimer's dementia is a disease that causes behavioral changes due to loss of intellectual ability such as memory and thinking ability, and is known to account for more than 60% of all dementia cases. It has been reported that Alzheimer's dementia directly or indirectly decreases life expectancy, so a study was conducted using the Alzheimer's dementia model Drosophila, which expresses three genes causing human Alzheimer's dementia.
  • Drosophila models that simultaneously express the genes that cause human Alzheimer's disease, Amyloid precusor protein (APP), Beta site amyloid precusor protein cleaving eznyme 1 (BACE1), and Microtubule associated protein tau (MAPT).
  • APP Amyloid precusor protein
  • BACE1 Beta site amyloid precusor protein cleaving eznyme 1
  • MAT Microtubule associated protein tau
  • the life expectancy of the Alzheimer's dementia model Drosophila was 25.22 days, while the life expectancy of the Alzheimer's dementia model Drosophila, which consumed the feed with the Angelica extract, increased by 3.1% to 26.01 days, and the risk index.
  • the Alzheimer's dementia model Drosophila which consumed a feed with a cooked sleeper powder / Dragonfish combination, had an expected life of 28.49 days, an increase of 13.0% compared to the Alzheimer's dementia model Drosophila, and the risk index was 0.48 (95%).
  • the Alzheimer's dementia model Drosophila which ingested the feed with the compound of the matured sleep / sperm
  • the Alzheimer's alone consumed only the feed with the extract of the true Angelica extract (3.1% increase) or the matured sleep powder (5.4% increase).
  • the life expectancy of the dementia model Drosophila showed a surprising effect of 2.4 to 4.2 times (7.6 to 9.9% p) higher than the expected lifespan increase rate, and the result was a sleep / sperm combination agent (Example 1) cooked in the Alzheimer's dementia model Drosophila.
  • Alzheimer's dementia is initiated by a neurosensory structural abnormality in the human brain. Therefore, a study was conducted on changes in the neural junction structure between normal control Drosophila and Alzheimer's dementia model Drosophila.
  • Example 1 changes in the neural junction structure of a normal control Drosophila model without Alzheimer's dementia were tested.
  • the mixture of Example 1 was added to an amount of 10% of the total amount of yeast, which is the main protein source, among the components of the normal feed to the normal feed to cultivate the normal control Drosophila.
  • the larval stage which is the stage before adulthood, the third-aged homeless larva was dissected in a Ca 2 + -free anatomical solution, and then fixed using a 0.1M phosphate buffer solution of pH 7.2 containing 4% paraformaldehyde.
  • the fixed sample is washed three times at 10-minute intervals using 0.01M phosphate buffered saline containing 0.1% Triton X-100, and then stained with a nerve junction using anti-HRP-FITC, followed by fluorescence microscopy The number of nerve junctions was checked below.
  • the combination agent with the addition of the slumber powder / squirrel extract cooked in the general feed had a 11.7% increase in the number of neural connections in the case of the fruit flies ingesting the feed
  • the cooked slumber powder / squirrel extract complex was confirmed that it shows a significant synergistic effect showing an increase rate of 1.3 to 1.6 times (2.4 to 4.5% p) compared to the increase rate of nerve junctions of the test sphere in which only the Angelica keiskei kombu extract or cooked Sukjam powder was consumed.
  • AD model Drosophila ingesting only the normal feed had a number of nerve junctions that was 47.9% less than the normal control group.
  • the number of neural junctions increased by 12.7% compared to the Drosophila fed with only the normal feed, and 16.5% in the result of ingesting the feed supplemented with the ripened sleeper powder. It was found that has an increased neural junction.
  • the number of nerve junctions increased by 22.1% compared to the test intake fed only with normal feed, which was true.
  • L-glutamate L-glutamate induced in the HT22 cell damage model ripened sleep alone (SW), true sugar extract (AG) And the neuron protective activity of the ripened sleep / squirrel extract complex (SWA-1).
  • HT22 cells were incubated in a 96-well plate at 37 ° C and 5% CO 2 for 24 hours, treated with SW, AG and SWA-1 for each concentration, and then washed with PBS for 24 hours and washed with MTT. After adding the solution (5mg / ml) and reacting for 4 hours, the resulting formazan was dissolved in DMSO and measured at 570 nm.
  • mitochondrial complexes I to IV were confirmed using normal fruit flies and Alzheimer's dementia fruit flies.
  • the main function of mitochondria is to produce ATP, the main energy material of cells, and is produced by the five respiratory complexes present in the inner membrane of mitochondria.
  • Complexes I to IV generate potential differences in the mitochondrial lining by oxidative phosphorylation, and Complex V actually produces ATP. Therefore, a study was conducted to compare the activities of mitochondrial complexes 1 to 4.
  • the active assay of the mitochondrial complex III 80 ml of the buffer for active assay (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 4 mM NaN3, 0.1 mM decylubiquinone, 80 mM Succinate, 2 mM KCN, 3 mM rotenone, 40 mM Cytochrome C) After adding 10 ml of mitochondrial extract and 10 ml of enzyme reaction solution, the mixture was measured at 25 o C at 550 nm for 30 minutes at 30 second intervals.
  • the buffer for active assay 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 4 mM NaN3, 0.1 mM decylubiquinone, 80 mM Succinate, 2 mM KCN, 3 mM rotenone, 40 mM Cytochrome C
  • the fruit flies of the test group ingesting the feed with the Angelica keiskei koidus increased by 45.9% compared to the test group in which only the normal feed was ingested, and the cooked sleeping powder In the test group that consumed this added feed, it increased by 23.1%.
  • the feed supplemented with the cooked Sukjam powder / Dr. Angelica extract Example 1 was added, it increased by 100.9%.
  • the activity increase rate was 2.2 ⁇ 4.4 times (77.8 ⁇ 55.0% p) higher, and the result was cooked moxa powder / squirrel extract complex. This is a result of synergism by complementing the mitochondrial complex 2 activity.
  • the fruit flies of the test group ingesting the diet with the Angelica keiskei koki extract increased by 29.0% compared to the test group in which only the normal feed was consumed, and the cooked sleeping powder In the case of the test group consuming this added feed, 57.7% increased.
  • the increase was 111.2%.
  • the mitochondrial complex 3 activity increase rate of the test sphere the activity increased significantly by 1.9 to 3.8 times (53.5 to 82.2% p). This is a result of synergism by complementing the mitochondrial complex 3 activity.
  • the fruit flies in the test group ingesting the diet with the Angelica keiskei koidus increased by 24.1% compared to the test group in which only the normal feed was consumed, and the cooked sleeping powder 43.7% increased in the test group that consumed this added feed.
  • the increase was 81.3%.
  • the activity increase rate was 1.9 ⁇ 3.4 times (37.6 ⁇ 57.2% p) higher. It is the result that the extract complements the mitochondrial complex 4 activity and acts synergistically.
  • the activity of the mitochondrial complexes 1-4 is greatly increased when the cooked slumber powder or Angelica kerosene extract is consumed alone in the normal fruit fly.
  • the activity of mitochondrial complexes 1 to 4 has a synergistic effect that is significantly increased than that of a test sample treated with only a sample, and aging progresses. In this regard, it is believed that it will greatly contribute to preventing Alzheimer's dementia.
  • the Alzheimer's dementia model Drosophila was prepared by ingesting an Angelica extract and cooked Sukjam powder alone or in combination, and then the activity of mitochondrial complexes 1-4 was compared (FIG. 5).
  • the activity was significantly increased by 2.0 to 2.1 times (107.1 to 114.0% p), and the result was cooked moxa powder / squirrel extract complex. It is a result of synergism by complementing the mitochondrial complex 2 activity.
  • the mitochondrial complex activity in the Alzheimer's dementia model Drosophila is collectively summarized, the mitochondria when the normal control and the Alzheimer's dementia test group are ingested with a single sample of Shamjam powder or Angelica kerosene extract in normal fruit flies The activities of complexes 1-4 were significantly increased. In addition, the activity of mitochondrial complexes 1-4 is significantly greater than that of the cooked Sukjam powder or the Angelica extract alone treatment (min. 61.14% p ⁇ max.) It is believed that it will contribute to the prevention and treatment of Alzheimer's dementia by having an amazing synergy of 156.0% p).
  • the ATP amount of Drosophila brain ingested with Angelica kerosene extract and cooked sleeping powder alone or in combination with the amount of DTP in Drosophila brain ingested only normal feed Compared. It is known that the production of ATP decreases as aging progresses, and the amount of ATP between young and 20-day-old fruit flies aged 7 days after adult fables was compared and analyzed.
  • Sukjam powder is a significantly increased increase rate of 1.1 ⁇ 1.4 times (7.4 ⁇ 16.0% p) higher than the increase rate of ATP production in the treatment group, and the result is Sukjam powder / Sangjagwi extract, which is known to inhibit ATP production as aging progresses. It is a result of synergistic effect that prevents more when the combination agent (Example 1) is ingested alone or the Angelica kerosene extract when cooked.
  • mice were transported to the laboratory 30 minutes before the experiment on the first day of the experiment, subjected to an adaptation process, and then adapted for 2 minutes in a bright room of a passive avoidance test apparatus.
  • mice were injected with scopolamine dissolved in saline at a rate of 0.75 mg / Kg 30 minutes before starting the experiment.
  • the control group was injected with the same amount of saline.
  • After placing the mouse in the bright room of the passive evasion device after 30 seconds, the passage to the dark room was opened, and when it reached the tail of the mouse, an electric shock of 0.4 mA was given for 4 seconds. Thereafter, the time period for entering the dark room was measured.
  • the mice were transferred to a bright room, the passage to the dark room was opened, and the duration of entry to the tail was measured. After the experiment, statistical analysis was performed by performing ANOVA and T-test on the difference between the control group and the experimental group.
  • both the saline solution or the saline solution + scopolamine administration group entered the dark room on day 2, but there was no significant difference between 20.2 ⁇ 5.13 seconds and 13.1 ⁇ 2.06 seconds, but electricity
  • the time for the saline-treated mice to enter the dark room was 284.6 ⁇ 11.69 seconds, which had a memory for electric shock.
  • mice administered scopolamine it moved to a dark room in 50.1 ⁇ 11.9 seconds, showing that memory for the electric shock is lost.
  • the time spent in the illuminated room of the test group administered only with saline was 22.1 ⁇ 5.88 seconds on the 2nd day and 267.6 ⁇ 20.5 seconds on the 3rd day, compared to the control group consuming only the normal feed. There was not.
  • the test group in which the Angelica kerosene extract was consumed had a period of stay in the illuminated room at 18.8 ⁇ 4.2 seconds on the second day and 218.2 ⁇ 33.4 seconds on the third day after receiving the electric shock. There was no significant difference from the cooked dormant group.
  • test group treated with only saline was statistically different from the control group or other experimental groups in 30.3 ⁇ 8.7 seconds on the second day.
  • time to stay in a lighted room without entering a dark room was increased to 297.5 ⁇ 2.5 seconds.
  • the duration of stay in the illuminated room was 17.4 ⁇ 3.3 seconds on the second day, which was not different from or faster than the control group or other experimental groups, but after receiving an electric shock, 3 On the first day, memory was increased by 159.7% to 130.1 ⁇ 25.4 seconds.
  • the cooked Sukjam powder / Dr. Angelica extract complex (Example 1) is 2.0 times (76.6 ⁇ 79.1% p) higher than the short-term memory increase rate of the Angelica squirrel extract or cooked Sukjam powder single treatment test group.
  • the cooked Sukjam powder / Dr. Angelica extract complex (Example 1) is the result of the cooked Sukjam powder and the Angelica Dynasty extract complementing each other, synergistically improving short-term memory.
  • mice were purchased from an experimental animal supplier (Orient, Ga-Pyung, Korea), and 8-week-old C57BL / 6N male mice were placed for a 7-day environmental adaptation period. All experimental animals were divided into 4 animals / cage and kept at constant temperature (20 ⁇ 2 °C) and relative humidity (50-55%). They were kept in a lab environment that alternates between day and night at 12-hour intervals, and adequate drinking water. And feed.
  • the group was treated with a slumber, squirrel, cooked slumber and squirrel complex, red ginseng, and donepezil 205, 165, 205 + 164 308, 2mg / kg b.w.
  • Pre-treatment oral administration
  • Scopolamine was intraperitoneally administered (1 mg / kg b.w.) 30 minutes before entering the behavioral experiment, and Y-maze test and behavior evaluation were conducted 30 minutes after the administration of scopolamine. In this way, behavioral evaluation was conducted for a total of 7 days.
  • the Y-maze Used in the Y-maze test, the Y-maze consists of three branches, the length of each arm is 42 cm, the width is 3 cm, and the height is 12 cm, and the angle at which the three arms touch is 120 degrees. All experimental devices consist of black polyvinyl plastic. After setting each branch to A, B, and C, the mouse was placed on one branch, allowed to move freely for 8 minutes, and the branch into which the mouse entered was recorded. At this time, it was limited to the case where it had completely entered the tail, and the case of entering the branch again was recorded. In case of entering three different branches in turn, one point (actual alternation) was given. Alternation behavior is defined as entering all three in turn and calculated by the following equation:
  • the spontaneous alternation by administration of scopolamine (1 mg / kg, i.p.) was statistically significantly reduced compared to the control group (p ⁇ 0.05).
  • spontaneous alteration behavior by administration of cooked slumber and Angelica keiskei koen showed increased pattern compared to the scopolamine administration group.
  • the cooked sleep and combination group significantly increased. This increased voluntary alteration behavior means that learning and memory have been restored.
  • the labyrinth has a diameter of 90 cm and a height of 45 cm, and the diameter of the white platform is 6 cm.
  • the area around the underwater maze always kept the space cues constant, such as a computer system connected to a video camera and a water temperature control device.
  • the labyrinth was filled with water so that the height of the water was 30 cm, and the mouse was installed 1 cm below the water level so that the platform could not be seen.
  • the labyrinth was divided into four quarters using four markers, and the labyrinth was divided into northeast (NE), northwest (NW), southeast (SE), and southwest (SW) platforms. Did.
  • the Morris underwater maze test was conducted for 6 days. On the first day, the mice were allowed to swim freely in the maze for 1 minute so that they could adapt to the water. At this time, the platform was not installed and the day from the second day to the fifth day was not installed. Each mouse was allowed to swim in the maze at 10 minute intervals for 1 minute, 4 times a day. The first 4 days from the 2nd day to the 5th day, the test method is a mouse that has been installed in the labyrinth for 10 seconds within 1 minute. After completing the experiment, the mouse is unable to find the platform within 1 minute or the platform has not been raised for 10 seconds. After the experiment, the mouse was artificially placed on the platform for 10 seconds, and the experiment was terminated.
  • the 3xTG dementia mouse model is a transgenic mouse model that expresses the familial Alzheimer's dementia-associated mutation APP-swedish mutation, the PSEN1 M146V mutation, and the prefrontal dementia-associated mutation MAPT P301L mutation.
  • Alzheimer's dementia which is one of the abnormal behaviors of postural control ability
  • the dementia-induced transformed mouse model 3xTG dementia mouse Space intake was tested after ingestion of feed containing cooked slumber and Angelica kerosene extract. Ingested mice were ingested at a rate of 0.2 g / Kg body weight for cooked sleep and 0.16 g / Kg body weight for Angelica keiskei koidz, and then a mouse clasping test was conducted on mice 24 weeks old.
  • the video is recorded for 10 seconds, and the video is scored from 0 to 4 depending on how many legs the two researchers can observe. If all four legs are unfoldable, a score of four is given, and if all four legs are unfoldable, a score of zero is awarded. The results of the two analyzes were averaged. The better your posture control skills, the lower the score you get.
  • the posture control ability of the 3xTG dementia mouse ingesting the normal feed was 0.733 + 0.1532, and more than 70% of the 3xTG mice could not properly stretch one leg.
  • the 24 week-old 3xTG dementia mouse fed the cooked sleep and Angelica keiskei kombu extract diet had an improvement effect of 48.8% with a posture control ability of 0.375 + 0.1829.
  • the first and second days allow the experimental mice to move freely in an empty 50 cm width 50 cm height and 50 cm height experimental space.
  • the movement of the mouse was recorded for 10 minutes, and the time to stay in each object was measured.
  • each old and new object was put in, and after 10 minutes of recording, the time to stay in the old and new object was measured.
  • the 3xTG dementia mouse ingesting the cooked sleepiness and Angelica extract extracts had superior recognition ability for new objects compared to the 3xTG dementia mouse ingesting the normal feed.
  • the sociality analysis was performed using a mouse sociality analysis device (60 cm wide, 40 cm long, 40 cm high) divided into three spaces.
  • the three spaces are divided into two transparent acrylic plates with holes through which the mouse can pass.
  • experiment mice were placed in both cages without mice to allow free adaptation for 5 minutes.
  • a mouse that had never been met was placed in one cage, the mouse was placed in the middle space while the other was left in an empty cage, and the action was recorded for 10 minutes.
  • a new mouse was placed in an empty cage, and then the behavior was recorded for 10 minutes.
  • the recorded behaviors were analyzed to determine how long each experimental mouse stayed in an empty cage or in a mouse and the time in which the mouse had already met and the new mouse.
  • the 3xTG dementia mouse ingesting the cooked sleepover and Angelica keiskei koid extract had superior sociality than the 3xTG dementia mouse ingesting the normal feed.
  • the 23-week-old 3xTG dementia mouse consumed 48.75 + 5.772% in the untreated space, and the rate of staying in the space with the first mouse was 51.24 + 5.772%. And the next day, the ratio of the time to stay in the space where the new mouse was put was 46.71 + 6.683%, and the ratio of the time to stay in the space where the mouse had already met was 53.28 + 6.683%.
  • Example 2 200 g of the mixture of Example 1 was mixed with 175.9 g of lactose, 180 g of potato starch and 32 g of colloidal silicic acid. After adding 10% gelatin solution to this mixture, it was ground and passed through a 14 mesh sieve. This mixture was dried, and a mixture obtained by adding potato starch 160g, talc 50g, and magnesium stearate 5g was purified.
  • Example 1 1% by weight of the mixture of Example 1 was added to a cooking seasoning to prepare a cooking seasoning for promoting health.
  • Example 1 0.1% by weight of the mixture of Example 1 was added to milk, and various dairy products such as butter and ice cream were prepared using the milk.
  • Example 1 The mixture of Example 1 was added to tomato juice or carrot juice to prepare a vegetable juice for health promotion.

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Abstract

본 발명은 기억력 개선용 조성물 또는, 알츠하이머성 치매 예방 및 치료용 조성물 또는 상기 조성물들의 제조 방법 또는 치료 방법에 관한 것으로써, 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물을 유효성분으로 함유하는 것이 특징이다. 본 발명에 의해, 견사단백질과 뽕잎 유래 기능성물질이 다량 함유된 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물에 의한 기억력 개선 및 알츠하이머 치매의 예방 또는 치료용 조성물이 제공됨에 따라, 본 발명을 이용한 각종 건강보조식품 또는 의약품이 개발되어 시판될 것으로 예상되는 바, 이로 인하여 현대사회에 큰 문제로 부각되고 있는 고령화와 고령화로 인한 치매를 근본적으로 예방 및 치료할 수 있을 것으로 기대되며, 아울러 학생, 수험 준비생, 회사원 등 다양한 국민들의 기억력 개선에도 도움을 주게 될 것으로 기대된다.

Description

견사단백질을 갖는 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물을 함유하는 기억력 개선용 조성물 또는, 알츠하이머성 치매 예방 및 치료용 조성물
본 발명은 견사단백질을 갖는 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물을 함유하는 기억력 개선용 조성물 또는, 알츠하이머성 치매 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 기억력 개선 및 알츠하이머성 치매 예방 효능을 나타내는 2가지 물질을 결합함에 따라 단독물질 대비 보다 현저한 효능을 나타내는 견사단백질을 갖는 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물을 함유하는 기억력 개선용 조성물 또는, 알츠하이머성 치매 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
우리나라는 연도별 출산율이 급속하게 감소하고 있는 상황이다. 2017년에는 1.05명으로 역대 최저수치에 도달하였고 이는 경제협력개발기구 회원국 2015년 평균치인 1.68명에 0.53명이나 미달하는 수치이다. 2017년 12월의 신생아 출생자 수는 25,000명으로 사망자 수 26,900명보다 적었고, 2018년도에는 신생아 출생자 수가 더 줄어들어 1~4월의 출산 신생아 수가 117,300명으로 감소하여 출산율이 1.0미만으로 줄어들 것으로 예측되고 있다. 이렇게 낮은 저 출산율은 우리나라의 총인구가 줄어드는 시점을 2031년에서 2027년으로 앞당길 것으로 예측이 되고 있으며, 이에 따라 노인인구의 비율도 급속하게 증가될 것으로 예측되고 있다.
2017년 현재 우리나라의 65세 이상 노인 인구는 14%인 700만 명으로 집계되고 있으며, 상기와 같은 출산율 감소와 노령화 추세가 지속될 경우 2060년경에는 전체인구의 41.0% 정도로 급증할 것으로 예상되고 있는데, 문제는 65세 이상의 노인들은 남은 생애 동안 하나 이상의 만성질환으로 고통을 받는다는 것이다. 그 중에서도 노인들이 가장 두려워하는 질환은 현재까지 완치하는 방법이 개발되지 않은 치매이다. 치매는 크게 알츠하이머 치매, 혈관성 치매, 파킨슨병 치매 등으로 나누어지는데 그 중에서도 60% 이상이 알츠하이머 치매(Alzheimer's disease; AD)로 고통을 받고 있는데, 현재까지 알츠하이머 치매를 예방하거나 완치할 수 있는 치료약이나 방법은 개발되어 있지 않다.
중앙치매센터의 분석자료에 따르면 2017년도 치매 환자 수는 724천명에 달하고 2040년도에는 168만 명, 그리고 2050년도에는 212만7천명에 이를 것으로 예측되고 있다. 이에 따른 치매관리 비용의 급격한 증가도 예상이 되는데, 2012년도에 이미 10조 3천억 원이 관리비용이 투입되었고, 2040년도에는 78조 4천억 원, 2050년도에는 134조 6천억 원으로 치매관리비용의 급증이 예상되고 있다. 이에 따라 서울대학교병원이 2008년에 실시한 치매 유병율 조사결과보고서에 따르면 치매 발병을 2년 늦추면 40년 후에는 유병율이 20% 감소할 것으로 예측하고 있어서, 2040년을 기준으로 환산하면 15조 6천억 원의 국가치매관리비용이 경감될 것으로 예측된다.
그러나, 현재 치매의 치료방법은 근본적인 원인의 해결이 아닌 증상 완화 목적의 처치로서, 발병의 억제, 지연 또는 치료를 위한 물질의 개발이 필요한 상황이다.
또한 우리나라는 2015년 현재 학령인구가 755만 9천명에 달할 정도로 수많은 사람이 학업에 정진하고 있다. 이들 학생 이외에도 대학교 졸업생과 회사원들도 다양한 종류의 시험 준비 등을 위해서는 학업을 멀리할 수 없는 상황으로, 이들이 효율적으로 기억력을 증진시킬 수 있다면 학습 성과가 올라가서 원하는 목표를 달성하는데 동력을 줄 수 있을 것이다. 이에 호응하여 다양한 종류의 기억력 개선용 제품이 출시되어 있지만, 효과가 미미하여 소비자들의 요구에 완벽하게 호응하는 제품은 거의 없는 실정이다.
본 발명의 목적은 치매 예방 또는 기억력 개선 효능을 보다 현저하게 높인 견사 단백질을 갖는 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물을 함유하는 기억력 개선용 조성물 또는, 알츠하이머성 치매 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 기억력 개선, 알츠하이머성 치매 예방 및 개선용 약학 조성물 또는 식품 조성물은, 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물을 포함하는 것이 특징이다.
상기 익힌 누에가공물은 견사단백질을 갖고 있는 누에전체를 80~125℃의 증기의 열로 100~150분 동안 익혀 견사단백질이 포함된 상태에서 식이용으로 섭취가능한 것이 특징이다.
상기 익힌 누에가공물 및 상기 당귀 추출물은 1 : 0.1~1 중량비로 구성되는 것이 특징이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명에 의해, 견사단백질과 뽕잎 유래 기능성물질이 다량 함유된 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물에 의한 기억력 개선 및 알츠하이머 치매의 예방 또는 치료용 조성물이 제공됨에 따라, 본 발명을 이용한 각종 건강보조식품 또는 의약품이 개발되어 시판될 것으로 예상되는 바, 이로 인하여 현대사회에 큰 문제로 부각되고 있는 고령화와 고령화로 인한 치매를 근본적으로 예방 및 치료할 수 있을 것으로 기대되며, 아울러 학생, 수험 준비생, 회사원 등 다양한 국민들의 기억력 개선에도 도움을 주게 될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 조성물인 익힌 숙잠과 참당귀 추출물 복합제 처리에 따른 정상군 초파리의 기대수명 증대효과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 조성물인 익힌 숙잠과 참당귀 추출물 복합제 처리에 따른 알츠하이머치매(AD)모델 초파리의 기대수명 증대효과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 조성물인 익힌 숙잠과 참당귀 추출물 복합제 처리에 따른 신경연접구조 개선효과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 조성물인 익힌 숙잠과 참당귀 추출물 복합제 처리에 따른 신경세포보호활성을 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 조성물인 익힌 숙잠과 참당귀 추출물 복합제 처리에 따른 마이토콘드리아 컴플렉스 1~4의 활성도 상승효과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 조성물인 익힌 숙잠과 참당귀 추출물 복합제 처리에 따른 ATP 생성 능력증진효과를 나타낸 도면이다.
도 7은 단기기억상실제 처리 마우스에 대하여 본 발명의 조성물인 익힌 숙잠과 참당귀 추출물 복합제 처리에 따른 기억력 증진효과를 나타낸 도면이다.
도 8은 Y-미로 시험(Y-maze test)에서의 본 발명의 조성물인 익힌 숙잠과 참당귀추출물 복합제의 처리에 따른 공간기억력 증진 효과 비교를 나타낸 도면이다.
데이터는 평균 ± S.E.M (N = 6)을 나타낸다.
(# : p<0.05 Control vs Con+Sco
*: p<0.05 Con+Sco vs SW+Sco or CDG+Sco or COM+Sco or RG+Sco or DO+Sco)
(SW : 익힌숙잠분말, CDG : 참당귀, COM: 익힌 숙잠 및 참당귀 복합제, RG : 기억력 개선 홍삼제품, DO: 도네페질(Donepezil), SCO : 스코폴라민(scopolamine))
도 9는 Morris 수중미로시험 (moriss water maze test)에서의 본 발명의 조성물인 익힌 숙잠과 참당귀추출물 복합제의 처리에 따른 공간기억력 증진 효과 비교를 나타낸 도면이다.
데이터는 평균 ± S.E.M (N = 5)을 나타낸다.
(##: p<0.01 Control vs Con+Sco
*: p<0.05 Con+Sco vs SW+Sco or CDG+Sco or COM+Sco or RG+Sco or DO+Sco
**: p<0.01 Con+Sco vs SW+Sco or CDG+Sco or COM+Sco or RG+Sco or DO+Sco
***: p<0.001 Con+Sco vs SW+Sco or CDG+Sco or COM+Sco or RG+Sco or DO+Sco)
(SW : 익힌숙잠 분말, CDG : 참당귀, COM: 익힌 숙잠 및 참당귀 복합제, RG : 기억력 개선 홍삼제품, DO: 도네페질(Donepezil), SCO : 스코폴라민(scopolamine))
도 10은 본 발명의 조성물인 익힌 숙잠과 참당귀 추출물 복합제 처리에 따른 3xTG 치매 마우스의 자제조절능력 증진 효과를 나타낸 도면이다.
도 11은 본 발명의 조성물인 익힌 숙잠과 참당귀 추출물 복합제 처리에 따른 3xTG 치매 마우스의 새로운 물건에 대한 인식능력 증진 효과를 나타낸 도면이다.
도 12는 본 발명의 조성물인 익힌 숙잠과 참당귀 추출물 복합제 처리에 따른 3xTG 치매 마우스의 사회성 증진 효과를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하며, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 견사단백질과 뽕잎 유래 기능성물질을 포함하고 있는 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물을 포함하는 기억력 개선용 조성물 또는 식품 조성물; 및 알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 조성물; 또는 알츠하이머성 치매 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
즉, 본 발명은 견사단백질과 뽕잎 유래 기능성물질을 포함하고 있는 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물의 기억력 개선 용도 또는, 알츠하이머성 치매 예방 및 치료 용도에 관한 것이 특징이다.
설명하면, 상기 견사단백질을 포함하고 있는 익힌 누에가공물은, 3면잠, 4면잠 등의 견사단백질을 갖는 모든 누에를 익힌 과정을 통해 제조한 것을 의미하며, 본 명세서 내에서 익힌 숙잠 또는 홍잠과 혼용된다.
즉, 견사단백질을 갖는 누에는 바람직하게는 4면잠 누에 중 5령3일 이후의 누에부터 또는 숙잠기까지의 누에 중 선택될 수 있다. 이때, 5령3일 이후의 누에로서 바람직하게는 5령4일의 누에부터 사용할 수 있으며, 더 바람직하게는 숙잠기의 누에를 사용하는 것이 가장 좋다. 이는, 5령3일의 누에도 사용할 수는 있으나 5령4일 이후의 누에에 비해서 누에가 갖는 견사단백질은 적으면서도 누에똥의 함량은 더 많기 때문이다. 한편, 숙잠기의 누에라 함은 누에 몸속에 견사단백질이 가득 차 있는 누에로서 고치를 짓기 전의 누에를 의미하는 것으로써, 숙잠기의 누에는 누에똥이 대부분 배출되었기 때문에 약학 조성물 또는 식품 조성물(건강기능식품)의 유효성분으로 사용하기에 가장 적합하다. 또한, 상기 익힌 누에가공물의 누에 품종으로는 어떠한 품종의 누에를 사용하여도 무관하나, 그 중에서도 백견품종, 황견품종(골든실크), 연녹견품종, 연홍견품종 중 어느 하나를 사용하는 것을 특징으로, 더욱 바람직하게 황견품종의 회복효과가 가장 우수하게 나타나는 바, 이를 적용하는 것이 가장 좋다.
본 발명에서는 상기와 같은 누에에 함유되어 있는 견사단백질까지 모두 식이섭취 가능하도록 하기 위해 상기 누에를 가공하여 가공물 형태로 제조하여 약학 조성물 또는 식품 조성물(건강기능식품 포함)의 유효성분으로 사용하게 되는데, 이때 상기 누에를 증기의 열로 익혀 사용하며, 바람직하게는 80~125℃의 증기의 열로 100~150분 동안 익혀 견사단백질이 모두 함유되도록 제조하는 것이 특징이다. 즉, 80℃ 미만의 증기 열로 150분을 초과하여 제조할 경우에는 제조시간이 너무 길어 오히려 견사단백질이 포함된 누에 자체가 갖고 있는 유효성분들이 파괴될 우려가 있으며, 125℃를 초과하여 100분 미만으로 제조할 경우에는 온도가 너무 높아 이 또한, 견사단백질이 포함된 누에 자체가 갖고 있는 유효성분들에 악영향을 미칠 우려가 있기 때문이다.
이러한, 상기 익힌 과정 후에는 통상의 방법으로 건조하여 분말형태로 제조하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 열풍건조 또는 진공동결건조 중 선택된 어느 하나를 통해 건조시켜 분말화하는 것이 좋으며, 유효성분의 손실을 최소화하기 위해서는 진공동결건조 방법이 가장 적합하다.
상기 분말화는 가정용 믹서기, 해머밀, 롤러밀, 동결분쇄기 등 어떠한 분쇄기를 사용해도 무관하지만, 시료유실의 최소화, 성분 왜곡현상 방지 및 미세분말화를 위해서는 롤러밀 또는 동결분쇄에 의한 방법이 좋다. 보통 가정용 믹서기나 해머밀로 분쇄하면 분말입자의 크기가 0.1㎜정도 이하로 분쇄하기가 매우 어려운데 비하여, 롤러밀로 수차례 반복 분쇄하면 분말화된 입자의 크기가 평균 10㎛ 정도까지 미세분말화가 가능하여 섭취와 제품에 유리하게 작용할 것으로 예상된다.
또한, 상기 분말형태 제조 후에는 상기 익힌 누에가공물 분말을 추출물 형태로 제조할 수 있으며, 이때 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 제조될 수도 있다. 상기 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용액은 익힌 누에가공물 분말의 중량을 기준 1~40배 부피(1kg 기준 1~40ℓ)를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 5~40배 부피를 사용할 수 있다. 상기 추출물의 추출조건은 20~100℃에서 1~48시간일 수 있으며, 상기 과정은 1~4번까지 반복할 수 있다.
또 다른 방법으로는, 상기 익힌 누에가공물 분말을 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출 농축하여 얻은 추출물에, 물을 가하여 현탁한 후, 바람직하게는 추출물의 중량의 1~1000배, 더 바람직하게는 1~500배, 가장 바람직하게는 1~50배의 물을 가하여 현탁한 후, 상기 현탁물에 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 및, 부탄올로 이루어진 군에서 선택되는 용매를 가하여 얻은 분획물로 제조할 수 있다.
상기 추출물 또는 이의 분획물의 제조온도는 20 내지 100℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추출 또는 분획 시간은 특별히 제한되는 것은 아니나, 10분 내지 2일 이내에 추출하는 것이 바람직하며, 추출용 기기로는 통상의 추출기기, 초음파분쇄추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 이렇게 제조된 추출물 또는 분획물은 열풍건조, 감압건조 또는 동결건조하여 용매를 제거할 수 있다. 또한, 상기 추출물 또는 분획물은 칼럼크로마토그래피를 이용하여 정제하여 사용할 수도 있다. 상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 이온교환수지 크로마토그래피(ion exchange resin chromatography), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography), 박층 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography), 실리카겔 진공 액체 크로마토그래피(silica gel vacuum liquid chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 중에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명의 유효성분 중 하나인 당귀( Anegelica gigas Nakai)는 산형과(Apiaceae) 당귀속(genus Angelica Linnaeus)에 속한 다년생 초본 식물로서, 빈혈회복효과, 면역증강작용이 보고된 바 있으며, 활혈작용과 관련해서는 혈관수축 억제효과 및 혈소판응집억제, 혈관신생촉진, 항산화 작용, 혈중 알코올농도 감소, 항산화능 및 항혈전 기능, 진통작용, 간기능 보호작용, 항암작용, 중추억제 작용, 혈관이완효과, 미백효과에 대한 연구가 보고 된바 있다. 이러한 상기 당귀로는 참당귀( Angelica gig as Nakai), 왜당귀( Angelica acutiloba Kitagawa) 또는 중국당귀( Angelica sinensis Diels)가 사용될 수 있으나, 바람직하게는 참당귀를 사용하는 것이 가장 좋다.
이러한 당귀는 본 발명이 목적하는 효능을 얻기 위해 추출물 형태로 제조하여 사용하는 것을 특징으로, 이러한 상기 추출물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 분리될 수 있다.
본 발명에 이용되는 당귀 추출물을, 당귀에 추출용매를 처리하여 얻는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 알코올(바람직하게는, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함한다.
보다 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 추출용매는 (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 부틸아세테이트, (h) 1,3-부틸렌글리콜, (i) 헥산 및 (j) 디에틸에테르를 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 추출물은 물, 메탄올, 에탄올 또는 이의 조합을 당귀에 처리하여 수득한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 당귀 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 당귀 추출물에 포함되는 것이다.
본 발명에서 이용되는 당귀 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 당귀의 근경에 메탄올, 에탄올과 같은 저급 알코올, 바람직하게는 95% 에탄올을 가하고 5 내지 80℃, 바람직하게는 30 내지 55℃에서 15분 내지 48 시간, 바람직하게는 30분 내지 12시간 동안 추출하여 감압 건조시킨 후 얻을 수 있다.
본 발명에서는 이렇게 제조한 상기 익힌 누에가공물과 상기 당귀 추출물을 함께 혼합된 조성물을 제공함에 따라, 상기 각각의 단독 물질 적용대비 혼합 사용시 정상 대조군 동물 모델과 알츠하이머 치매 모델의 기대수명과 건강수명을 모두 증대시키고, 기억력 상실을 예방하고, 신경연접 구조를 개선시키며, 신경세포를 보호하고, 마이토콘드리아의 활성을 증진시켜서 ATP의 생성을 증가시키고, 공간기억력 증진, 자세조절능력 증진, 새로운 물건에 대한 호기심 증진, 사회성 증진 효과가 뛰어나므로, 알츠하이머 치매가 예방되고 기억력을 개선하는데 보다 현저한 효능을 나타냄을 확인한 바, 본 발명에서는 기억력 개선용 또는, 알츠하이머성 치매 예방 및 치료용으로써 약학 조성물 또는 식품 조성물(건강기능식품)의 유효성분으로 상기 2 가지 물질을 함께 사용하는 것이 특징이며, 보다 바람직하게는 상기 익힌 누에가공물과 상기 당귀 추출물을 1 : 0.1~1 중량비로 혼합되는 것을 특징으로, 이는 상기 당귀 추출물이 상기 익힌 누에가공물 중량을 기준으로 0.1 중량비 미만으로 혼합될 경우 본 발명이 목적하는 현저한 효과는 이루기 어렵게 되며, 1 중량비를 초과할 경우에는 초과 함량에 따른 상승된 효능은 얻지 못한다.
본 명세서에서, “익힌 누에가공물과 당귀 추출물을 함께 혼합한 조성물”을 언급하면서 사용되는 용어 “익힌 숙잠 분말 + 참당귀 추출물 혼합물” 및 “복합제”는 본 발명의 유효성분을 의미하며, 혼용된다.
또한, 상기 본 발명의 약학 조성물에는 상기 익힌 누에가공물 및 상기 당귀 추출물이 혼합된 혼합물이 본 발명의 약학 조성물에 0.001~100 중량%로 하여 첨가될 수 있다. 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 혼합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 100㎎/㎏/일 내지 5000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1000㎎/㎏/일 내지 3000㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 혼합물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
이때, 상기 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물로 이루어진 혼합물은 본 발명이 목적하는 효능을 나타내기 위한 유효한 함량으로, 분말 중량면에서 조성물 총 중량에 대하여 1~100 중량%로 함유하는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 10~90 중량%로 함유하는 것이 좋다.
또한, 본 발명은 상기 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물로 이루어진 혼합물을 포함하여 기억력 개선 또는, 알츠하이머성 치매 예방 및 개선효과를 위한 식품 조성물로도 제공할 수 있다. 이때, 상기 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물로 이루어진 혼합물은 본 발명의 식품 조성물에 1~100 중량%로 하여 사용될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하는 것으로서, 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제 등이 있다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 기억력 개선 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 알츠하이머 치매 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물을 혼합하는 단계를 포함하는, 기억력 개선용 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물을 혼합하는 단계를 포함하는, 알츠하이머 치매 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 방법들은 상술한 조성물을 이용하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
이와 같이 본 발명은 학업스트레스에 시달리는 각급학교의 학생을 비롯한 청 장년층과 노인층을 망라한 모든 국민들의 뇌 기능을 개선함으로서 기억력 개선에 큰 도움을 줄 것으로 기대되며, 아울러 알츠하이머 치매를 포함한 신경계질환의 발병을 효과적으로 감소시킴으로서 고령화시대를 살고 있는 국민들의 삶의 질 개선에도 큰 도움을 주고, 나아가서는 국가 치매관리비용 절감에도 큰 기여를 할 것으로 기대된다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명에 관하여 더욱 상세하게 설명할 것이나, 이들 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것으로 본 발명의 보호 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
<실시예 1. 익힌 누에가공물들과 당귀 추출물로 구성된 혼합물 제조>
1) 익힌 누에가공물(익힌 숙잠; 홍잠) 제조
황색 견사단백질을 갖는 골든실크(일본종계 원종 잠311과 중국종계 원종 잠312를 교배하여 생산한 교배종)를 사육하여 5령7일 전후, 즉 숙잠이 되면 100℃ 수증기로 120~130분 동안 익혀 황견품종 익힌 누에가공물(steamed mature silkworm product; 또는 boiled mature silkworm product)을 제조한 후, 상기 황견품종 익힌 누에가공물을 24시간동안 진공동결건조하여 분말형태로 제조하였다.
2) 당귀 에탄올 추출물 제조
국산 참당귀를 사용하여 원재료 계량 후 원물대비 10배수의 70%(v/v) 주정을 85℃에서 1회 각 4시간 총 2회 연속 추출 후 추출물을 여과 및 농축 공정을 진행하고 덱스트린 40%(w/w, 전체중량기준)를 배합하여 분무건조를 통해 분말형태로 제조하였다.
3) 혼합물 제조
상기 1)의 익힌 누에가공물 분말 0.2g/kg과 상기 2)의 당귀 에탄올 추출물 0.16g/kg을 혼합하여 혼합물을 제조하여 하기 실험들의 시료로 적용하였다.
<실험예 1. 익히기 전 숙잠 및 익힌 누에가공물 또는 품종별 익힌 누에가공물의 성분 분석 비교>
1) 익히기 전 숙잠 및 익힌 누에가공물 성분 분석 비교
익히기 전 숙잠 및 익힌 누에가공물을 각각 0.1mm 입자크기를 갖는 해머밀 분쇄물을 통해 주요성분 분석을 실시하여 하기 표 1 및 표 2와 같이 나타내었다.
Figure PCTKR2019015688-appb-img-000001
Figure PCTKR2019015688-appb-img-000002
상기 결과를 통해, 익히기 전의 숙잠 내에 있던 각종 구성성분의 함량이 익힌 누에가공물이 되면서 다양하게 변화된 것으로 확인되며, 이러한 익힌 누에가공물의 성분 변화로 인해 상기 익힌 누에가공물이 갖는 약리학적 효과에도 변화가 있을 것임을 확인할 수 있다.
2) 누에 품종별 롤러밀 분쇄법을 통한 성분분석 비교
원료 유실이 적으면서도 성분변화가 적은 분쇄방법인 롤러밀 분쇄법을 통해 누에 품종별 익힌 누에가공물의 성분분석을 비교해 보았다.
그 결과, 하기 표 3 내지 표 8과 같이 나타났다.
Figure PCTKR2019015688-appb-img-000003
Figure PCTKR2019015688-appb-img-000004
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Figure PCTKR2019015688-appb-img-000008
상기 실험결과, 누에 품종별로 익힌 누에분말에 함유된 성분에서 차이가 있으며, 이를 토대로 하기와 같은 효과에서도 품종별로 달리 나타낼 것으로 예측된다. 다시 말해, 익힌 누에가공물에 대하여 누에품종별로 성분을 분석한 결과, 익힌 누에가공물에는 조단백질과 글리신, 알라닌, 세린 등의 아미노산과 리놀렌산을 비롯한 불포화지방산 및 베타카로틴 등의 비타민 등이 다량 함유돼 있고, 인체에 유해한 트랜스지방, 수은 등의 중금속 및 Sucrose 등의 당류는 검출되지 않았다. 그리고, 5령3일 건조누에 및 익히지 않은 숙잠에 비하여 익힌 숙잠이 조단백질과 글리신, 알라닌, 세린 등의 아미노산 함량이 매우 많은 것으로 나타났다. 누에품종별로는 백옥잠, 골든실크, 연녹잠 및 홍견품종 등 모든 품종에서 동일한 모든 성분이 검출되었으며, 각 성분별 함량비교에서는 각 품종별로 상이하게 함유되어 있어 각 누에품종별 기능성에서는 차별성이 있을 것으로 예상되었다.
<실험예 2. 본 발명의 실시예 1의 혼합물 처리에 따른 정상군 초파리의 기대수명 증대효과 확인>
1. 실험방법
알츠하이머 치매에 걸리게 되면 기대수명이 크게 감소하는 것으로 보고되고 있는바, 치매에 걸리지 않은 정상 대조군과 알츠하이머 치매에 걸린 시험군에 대하여 초파리 모델을 이용하여 익힌 숙잠 분말, 참당귀 추출물 및 실시예 1의 익힌 숙잠 분말 + 참당귀 추출물 혼합물(이하, 복합제라 한다)에 대한 시험을 실시하였다.
먼저, 알츠하이머 치매에 걸리지 않은 정상군(대조군)에 대하여 익힌 숙잠 분말과 참당귀 추출물의 복합제(실시예 1)가 가지는 기대수명 증가에 대한 상승작용을 확인하기 위한 연구를 진행하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과 도 1 및 하기 표 9와 같이 나타났다.
Figure PCTKR2019015688-appb-img-000009
상기 표 9 및 도 1에 나타낸 바와 같이, 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제(실시예 1)는 익힌 숙잠 분말 또는 참당귀 추출물만을 개별적으로 처리한 실험군의 기대수명 증가율에 비하여 1.5~1.7배(3.5 ~ 4.4 %p)로 현저히 증가됨을 확인하였다.
구체적으로 설명하면, 일반사료만을 섭취한 정상 초파리의 경우는 기대수명이 29.29일이었는데, 참당귀 추출물을 섭취한 시험군의 경우에는 기대수명이 31.18일로 6.8% 증가되었고, 위험지수는 0.66 (95% 신뢰구간 (CI): 0.5 ~ 0.87, p value = 0.003)으로 통계학적으로 유의하게 감소하였다. 익힌 숙잠 분말을 섭취한 시험군의 경우에는 기대수명이 31.02일로 일반사료에 비하여 5.9% 증가하였고, 위험지수는 0.7 (95% CI: 0.53~0.92, p value = 0.01)로 일반사료에 비하여 통계적으로 유의하게 감소시켰다. 이에 비하여 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제(실시예 1)를 포함한 사료를 섭취한 동물의 경우는 기대수명이 32.32일로 10.3% 증가하였고, 위험지수는 0.5 (95% CI =0.38~0.67, p value = 3.21 x 10 -6)로 감소함을 확인하였다. 본 결과는 익힌 숙잠 분말 또는 참당귀 추출물을 단독으로 처리하는 것 보다, 복합제(실시예 1)로 처리하는 경우에 상호 상승작용으로 각각의 단독물질만을 처리한 시험구의 기대수명 증가율에 비하여 1.5~1.7배(3.5 ~ 4.4%p)가 더 늘어난 현저한 기대수명의 증가와 더욱 감소된 위험지수를 가짐을 나타내고 있다.
<실험예 3. 본 발명의 실시예 1의 혼합물 처리에 따른 알츠하이머치매(AD) 모델 초파리의 기대수명 증대효과 확인>
1. 실험방법
알츠하이머치매는 기억력과 사고력 등의 지적능력 상실에 따른 행동변화를 가져오는 질환으로 전체 치매사례의 60% 이상을 차지한다고 알려져 있다. 알츠하이머치매는 직,간접적으로 기대수명을 감소시킨다고 보고되고 있어서, 인간의 알츠하이머치매 원인 유전자 3개를 발현하는 알츠하이머치매모델 초파리를 이용한 연구를 진행하였다.
설명하면, 인간의 알츠하이머질환을 발병하는 원인 유전자인 Amyloid precusor protein (APP)과 Beta site amyloid precusor protein cleaving eznyme 1 (BACE1)과 Microtubule associated protein tau (MAPT)를 동시에 발현시키는 초파리 모델에게 정상사료 또는 익힌 숙잠 분말과 참당귀 추출물의 복합제(실시예 1) 10% 사료를 이용하여 배양하였다. 배양된 100마리 이상의 성충 초파리하나의 바이알에 10마리씩 나누어 넣은 후에 3일 간격으로 모든 초파리가 소멸할 때 까지 살아있는 초파리의 수를 확인하였다. 초파리는 28℃, 상대습도 60%의 조건에서 사육하였다. 통계분석은 카플란-메이어 생존분석을 수행하여 통계학적인 차이를 구명하였다.
이에, 알츠하이머 치매(Alzheimer's disease; AD)에 걸린 시험군에 대한 기대수명 증가효과를 시험하였다. 이때, 상기 실험예 2와 동일한 실험방법으로 초파리의 기대수명 증대효과를 확인하되, 정상군 초파리 대신 알츠하이머 치매 모델 초파리를 대상으로 기대 수명 증대효과를 확인하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과 도 2 및 하기 표 10과 같이 나타났다.
Figure PCTKR2019015688-appb-img-000010
상기 표 10 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 알츠하이머치매모델 초파리의 경우 정상 대조군(29.29일)에 비하여 기대수명이 25.22일로 13.9% 감소하였는바, 감소된 알츠하이머치매모델 초파리의 기대수명은 참당귀 추출물 단독, 익힌 숙잠 분말 단독, 또는 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제(실시예 1) 처리에 의하여 증가함을 확인하였으며, 특히 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제(실시예 1)는 단독물질 투여 시험구의 기대수명 증가율에 비하여 2.4~4.2배가 증가하였는바, 이는 정상군의 기대수명에 육박하는 놀라운 상승효과이다.
구체적으로 설명하면, 일반사료만 섭취시킨 알츠하이머치매모델 초파리의 기대수명은 25.22일인데 비하여, 참당귀 추출물이 첨가된 사료를 섭취시킨 알츠하이머치매모델 초파리의 기대수명은 26.01일로 3.1% 증가하였고, 위험지수도 0.6 (95% CI = 0.46 ~ 0.8, p value = 0.0004)으로 통계적으로 유의하게 감소하였다. 또한 익힌 숙잠 분말이 첨가된 사료를 섭취시킨 알츠하이머치매모델 초파리의 기대수명은 26.58일로 5.4% 증가하였고, 위험지수도 0.57 (95% CI = 0.57 ~ 1.0, p value = 0.05)로 통계적으로 유의하게 감소하였다. 이에 비하여 익힌 숙잠 분말/참당귀 복합제를 첨가한 사료를 섭취시킨 알츠하이머치매모델 초파리의 경우는 기대수명이 28.49일로 일반사료만 먹인 알츠하이머치매모델 초파리에 비하여 13.0% 증가하였고, 위험지수도 0.48 (95% CI = 0.36 ~ 0.64, p value = 7.6 x 10 -7)로 통계적으로 유의하게 감소하는 상승효과가 나타났다.
결과를 요약하면 익힌 숙잠/참당귀 복합제를 첨가한 사료를 섭취시킨 알츠하이머치매모델 초파리의 경우 참당귀 추출물(3.1% 증가)이나 익힌 숙잠 분말(5.4% 증가)이 첨가된 사료만을 단독으로 섭취시킨 알츠하이머치매모델 초파리의 기대수명 증가율보다 기대수명이 2.4~4.2배(7.6 ~ 9.9%p) 상승하는 놀라운 효과를 보였는바, 이 결과는 알츠하이머치매모델 초파리에 익힌 숙잠/참당귀 복합제(실시예 1)를 투여할 경우 정상군에 육박하는 기대수명을 나타낸 결과로서, 익힌 숙잠 분말 과 참당귀 추출물간의 상호 상승작용으로 각각의 물질을 개별적으로 첨가한 사료에 비하여 현저히 증가된 기대수명과 감소된 위험지수를 유도함을 보여주고 있다.
<실험예 4. 본 발명의 실시예 1의 혼합물 처리에 따른 신경연접의 구조변화 확인>
1. 실험방법
알츠하이머치매는 인간 뇌의 신경연접 구조이상에 의하여 시작된다고 알려져 있는바, 정상 대조군 초파리와 알츠하이머치매모델 초파리의 신경연접구조 변화에 대한 연구를 진행하였다.
먼저, 알츠하이머치매에 걸리지 않은 정상 대조군 초파리 모델의 신경연접구조 변화에 대하여 시험하였다. 이때, 실시예 1의 혼합물을 정상 사료의 구성성분 중 주 단백질원인 효모 총 양의 10%에 달하는 양을 정상사료에 첨가하여 정상 대조군 초파리를 배양하였다. 성충이 되기 전 단계인 유충단계에서 3령 노숙 유충을 Ca 2+이 없는 해부용액에서 해부를 한 후, 4% 파라포말알데하이드를 포함하는 산도 7.2의 0.1M 인산완충용액을 이용하여 고정하였다. 고정된 시료는 0.1% 트리톤 엑스-100을 포함한 0.01M 인산완충식염수를 이용하여 3회 10분 간격으로 세척을 진행 한 후, anti-HRP-FITC를 이용하여 신경연접을 염색을 한 후, 형관현미경아래서 신경연접의 수를 확인하였다.
또한, 상기 실험방법을 적용하여 알츠하이머 치매에 걸린 초파리 모델의 신경연접 구조 변화에 대하여도 시험하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 일반사료만을 섭취한 정상 대조군 초파리의 신경연접 구조를 100%로 하여 환산한 결과, 일반사료에 참당귀 추출물을 첨가한 사료만을 섭취한 시험군의 경우는 7.2%가 증가된 신경연접의 수를 가지고 있었으며, 일반사료에 익힌 숙잠 분말을 첨가한 사료만을 섭취한 시험군의 경우에는 9.3%가 증가된 신경연접의 수를 가지고 있었다. 이에 비하여 일반사료에 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물을 첨가한 복합제(실시예 1) 사료를 섭취시킨 초파리의 경우는 11.7% 증가된 신경연접의 수를 가지고 있었는바, 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제(실시예 1)는 참당귀 추출물 또는 익힌 숙잠 분말만을 섭취시킨 시험구의 신경연접 증가율에 비하여 1.3~1.6배(2.4~4.5%p)의 증가율을 보이는 현저한 상승효과를 나타냄을 확인하였다.
다음으로 알츠하이머치매에 걸린 초파리 모델의 신경연접 구조 변화에 대하여 시험한 결과, 일반사료만을 섭취시킨 AD모델 초파리는 상기 정상 대조군에 비하여 47.9%가 적은 수의 신경연접을 가지고 있음을 확인하였다.
이에 AD모델 초파리에 참당귀 추출물이 첨가된 사료를 섭취시킨 결과 일반사료만을 섭취시킨 초파리에 비하여 신경연접의 수가 12.7%증가됨을 알 수 있었고, 익힌 숙잠 분말이 첨가된 사료를 섭취시킨 결과에서는 16.5%가 증가된 신경연접을 가지고 있음을 알 수 있었다. 이에 비하여 AD모델 초파리에 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제(실시예 1) 사료를 섭취시킨 시험구에는 일반사료만을 섭취시킨 시험구에 비하여 22.1%가 증가된 신경연접 숫자를 가지고 있었는바, 이는 참당귀 추출물과 익힌 숙잠 분말을 단독으로 섭취시킨 시험구의 신경연접 증가율에 비하여 1.3~1.7배(5.6~9.4%p) 높은 현저히 상승적인 신경연접의 증가율을 보여준 것이다.
이러한 결과는 정상 대조군이나 알츠하이머치매모델 모두에서 참당귀 추출물 또는 익힌 숙잠 분말을 단독으로 처리하였을 경우에 비하여 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제(실시예 1)를 처리한 경우 상호작용에 의한 상승효과가 있음을 보여주는 것이다.
<실험예 5. 본 발명의 실시예 1의 혼합물 처리에 따른 신경세포보호 활성 확인>
본 발명의 실시예 1의 혼합물 처리에 따른 신경세포 보호효과를 규명하기 위하여, L-글루타메이트(L-glutamate)로 유도한 HT22 세포손상모델에서 익힌숙잠 단독(SW), 참당귀추출물 단독(AG) 및 익힌숙잠/참당귀 추출물 복합제(SWA-1)의 신경세포보호활성을 확인하였다.
세포 생존율은 3-(4,5-dimethythiazol2-yl)-2,5-di-phenytetrazolium bromide (MTT, Sigma, USA) assay로 측정하였다. 살아있는 세포의 mitochondria dehydrogenase의 능력을 이용하여 노란색의 수용성 기질인 MTT를 진청색의 비수용성 formazan으로 변환시키는 방법으로 생성된 formazan의 양은 살아있는 세포 수에 비례한다.
HT22 세포를 96 웰 플레이트에서 24 시간 동안 37℃, 5% CO 2 조건으로 항온배양한 후, 각 농도별로 SW, AG 그리고 SWA-1 를 처리 후, 24 시간 동안 배양한 세포를 PBS로 세척하고 MTT 용액 (5mg/ml)을 첨가하여 4 시간 동안 반응시킨 후, 생성된 formazan을 DMSO에 녹여 570 nm에서 측정하였다.
2. 실험결과
상기 실험 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군과 대비했을 때, 익힌 숙잠을 단독(SW)으로 50, 100ug/mL 처리시 세포 생존율은 각각 5.33%, 17.49% 증가하였고, 참당귀 추출물을 단독(AG)으로 50, 100ug/mL 처리시 세포 생존율은 각각 12.55%, 17.23% 증가하였으며, 익힌숙잠/참당귀 추출물 복합제(SWA-1)를 50, 100ug/mL 처리시 세포 생존율이 각각 25.99%, 35.84% 증가함을 확인하였다.
이러한 결과는 신경세포 손상 모델에서 참당귀 추출물 또는 익힌 숙잠 분말을 단독으로 처리하였을 경우에 비하여 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제(실시예 1)를 처리한 경우 상호작용에 의한 상승효과가 있음을 보여주는 것이다.
<실험예 6. 본 발명의 실시예 1의 혼합물 처리에 따른 마이토콘드리아 컴플렉스 1~4의 활성도 상승효과 확인>
1. 실험방법
정상적으로 노화가 진행되더라도 마이토콘드리아의 활성이 떨어져서 ATP생성 능력이 낮아진다고 알려져 있다. 더욱 중요하게는 알츠하이머치매 환자들에게서 공통으로 관찰되는 분자세포 수준의 병인은 마이토콘드리아 기능이상이 정상인들보다 조기에 나타난다는 것이다.
그러므로, 정상 대조군 초파리와 알츠하이머치매 모델 초파리를 각각 일반사료만 섭취시키면서 사육한 경우, 일반사료에 참당귀 추출물을 첨가한 사료를 섭취시키면서 사육한 경우, 일반사료에 익힌 숙잠 분말을 첨가한 사료를 섭취시키면서 사육한 경우, 그리고 일반사료에 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제를 첨가한 사료를 섭취시키면서 사육한 경우에 변화되는 마이토콘드리아 컴플렉스 1~4까지의 활성을 비교하였다.
구체적으로 설명하면, 실시예 1의 혼합물을 섭취시키면서 정상 초파리와 알츠하이머성 치매 초파리를 이용하여 마이토콘드리아 컴플렉스 I에서 IV까지의 기능을 확인하였다. 마이토콘드리아의 주요 기능은 세포의 주요 에너지 물질인 ATP를 생산하는 것으로, 마이토콘드리아의 내막에 존재하는 5개의 respiratory complex들에 의하여 생성이 된다. Complex I에서 IV까지는 산화적 인산화 과정(Oxidative phosphorylation)에 의하여 마이토콘드리아 내막에 전위차를 생성하고 Complex V는 실제로 ATP를 생성한다. 그러므로 마이토콘드리아 complex 1에서 4까지의 활성을 비교하는 연구를 진행하였다.
마이토콘드리아 complex I의 활성검정을 위해서는 초파리 성충의 뇌에서 추출한 마이토콘드리아 10 ml를 182 ml의 활성 검정용 완충용액(25mM PB, 0.35% BSA, 0.06mM DCIP, 0.07mM decylubiquinone, 1mM AA)과 섞어 준 후, 5mM NADH 8 ml와 섞은 후에 37℃에서 30분간 반응을 시킨 후, 600nm에서 4분간 30초 간격으로 흡광도 변화를 측정하여 활성을 5개의 반복시료에서 측정하였다. 마이토콘드리아 complex II의 활성검정을 위해서는 184ml의 활성 검정용 완충용액(80mM PB pH 7.8, 0.1% BSA, 2mM EDTA, 0.2mM ATP, 80mM DCIP, 50 mM decylubiquinone, 1 mM AA, 3 mM rotenone)에 1 ml malonate와 마이토콘드리아 추출액 10 ml를 추가한 후, 37℃에서 30분간 반응을 시킨 후, 600nm에서 4분간 30초 간격으로 흡광도 변화를 측정하여 활성을 5개의 반복시료에서 측정하였다. 마이토콘드리아 complex III의 활성검정을 위해서는 80ml의 활성 검정용 완충용액(50mM Tris-HCl pH 7.5, 4mM NaN3, 0.1mM decylubiquinone, 80 mM Succinate, 2mM KCN, 3 mM rotenone, 40 mM Cytochrome C)에 마이토콘드리아 추출액 10 ml과 효소반응액 10 ml를 추가한 후, 25 oC에서 550nm로 30초 간격으로 3분간 측정하였다. 마이토콘드리아 complex IV의 활성검정을 위해서는 188ml의 활성 검정용 완충용액(10mM Tris-HCl pH 7.0, 120mM KCl)에 10 ml Ferrocytochrome C substrate (0.22mM Ferrocytochrome과 0.5 mM DTT)와 효소반응액 2 ml 와 마이토콘드리이아 추출액 2 ml를 추가한 후, 25℃에서 550nm로 10초 간격으로 1분간 측정하였다. 5개의 반복시료에서 측정하였다. 군집간의 차이를 ANOVA로 확인 후, Tukey-Kramer post hoc분석을 실시하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과 도 5에 나타낸 바와 같이, 일반사료에 참당귀 추출물 또는 익힌 숙잠 분말만을 단독으로 섭취시키거나 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제(실시예 1)를 섭취시킨 결과, 정상 대조군 초파리와 알츠하이머치매 모델 초파리 모두에서 마이토콘드리아 컴플렉스 1~4의 활성이 증가됨을 확인할 수 있었으며, 특히 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제(실시예 1)를 섭취시킨 초파리 모델의 활성이 두드러지게 증가하는 것을 확인하였다.
1) 먼저 알츠하이머 치매에 걸리지 않은 정상 대조군에 대한 마이토콘드리아 컴플렉스 활성에 대하여 자세히 설명하면 아래와 같다.
정상 대조군에 대한 마이토콘드리아 컴플렉스 1 활성의 경우, 일반사료만을 섭취시킨 시험군과 비교하여 참당귀 추출물이 첨가된 사료를 섭취시킨 시험군의 초파리는 20.5%가 증가되었고, 익힌 숙잠 분말이 첨가된 사료를 섭취시킨 경우는 33.7% 증가되었다. 이에 비해, 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제(실시예 1)가 첨가된 사료를 섭취시킨 초파리의 경우는 45.5% 증가되었는바, 이는 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제가 참당귀 추출물 또는 익힌 숙잠 분말 단독처리 시험구의 마이토콘드리아 콤플렉스 1 활성 증가율에 비하여 1.4~2.2배(11.8~25.0%p)로 더 크게 증가하는 현저한 높은 활성으로, 이 결과는 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제는 익힌 숙잠 분말과 참당귀 추출물이 마이토콘드리아 컴플렉스 1의 활성에 상호 보완하여 상승작용을 한다는 결과이다.
또한, 정상 대조군에 대한 마이토콘드리아 컴플렉스 2 활성의 경우, 일반사료만을 섭취시킨 시험군과 비교하여 참당귀 추출물이 첨가된 사료를 섭취시킨 시험군의 초파리는 45.9%가 증가하였고, 익힌 숙잠 분말이 첨가된 사료를 섭취시킨 시험군 경우는 23.1%가 증가되었다. 이에 비해 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제(실시예 1)가 첨가된 사료를 섭취시킨 시험군에서는 100.9% 증가되었는바, 이는 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제가 참당귀 추출물 또는 익힌 숙잠 분말 단독처리 시험구의 마이토콘드리아 컴플렉스 2 활성 증가율에 비하여 2.2~4.4배(77.8~55.0%p)가 더 높은 놀라운 활성 증가율로, 이 결과는 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제는 익힌 숙잠 분말과 참당귀 추출물이 마이토콘드리아 컴플렉스 2 활성에 상호 보완하여 상승작용을 한다는 결과이다.
또한, 정상 대조군에 대한 마이토콘드리아 컴플렉스 3 활성의 경우, 일반사료만을 섭취시킨 시험군과 비교하여 참당귀 추출물이 첨가된 사료를 섭취시킨 시험군의 초파리는 29.0%가 증가하였고, 익힌 숙잠 분말이 첨가된 사료를 섭취시킨 시험군의 경우는 57.7%가 증가되었다. 이에 비하여 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제가 첨가된 사료를 섭취시킨 시험군에서는 111.2% 증가되었는바, 이는 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제(실시예 1)가 참당귀 추출물 또는 익힌 숙잠 분말 단독처리 시험구의 마이토콘드리아 콤플렉스 3 활성 증가율에 비하여 1.9~3.8배( 53.5~82.2%p)가 더 높은 현저한 활성 증가율로서, 이 결과는 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제는 익힌 숙잠 분말과 참당귀 추출물이 마이토콘드리아 컴플렉스 3 활성에 상호보완하여 상승작용을 한다는 결과이다.
또한, 정상 대조군에 대한 마이토콘드리아 컴플렉스 4 활성의 경우, 일반사료만을 섭취시킨 시험군과 비교하여 참당귀 추출물이 첨가된 사료를 섭취시킨 시험군의 초파리는 24.1%가 증가하였고, 익힌 숙잠 분말이 첨가된 사료를 섭취시킨 시험군의 경우는 43.7%가 증가되었다. 이에 비하여 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제(실시예 1)가 첨가된 사료를 섭취시킨 시험군에서는 81.3% 증가되었는바, 이는 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제가 참당귀 추출물 또는 익힌 숙잠 분말 단독처리 시험구의 마이토콘드리아 콤플렉스 4의 활성 증가율에 비하여 1.9~3.4배(37.6~57.2%p)가 더 높은 현저한 활성 증가율로서, 이 결과는 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제는 익힌 숙잠 분말과 참당귀 추출물이 마이토콘드리아 컴플렉스 4 활성에 상호보완하여 상승작용을 한다는 결과이다.
또한, 정상 대조군 초파리에서의 마이토콘드리아 컴플렉스 활성을 종합하여 정리하면, 익힌 숙잠 분말 또는 참당귀 추출물을 정상 초파리에 단독으로 섭취시킬 경우 마이토콘드리아 컴플렉스 1~4의 활성이 크게 증가되지만, 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물을 복합제(실시예 1)를 처리한 경우에는 마이토콘드리아 컴플렉스 1~4의 활성이 단독 시료만 처리한 시험구보다 현저하게 증가되는 상승작용을 하여 노화가 진행되는 과정에서 알츠하이머 치매를 예방하는데 크게 기여할 수 있을 것으로 판단된다.
2) 다음으로 알츠하이머치매 모델 초파리에 참당귀 추출물과 익힌 숙잠 분말을 단독 또는 복합제 형태 제조하여 섭취시킨 다음 마이토콘드리아 컴플렉스 1~4의 활성을 비교하였다(도 5).
그 결과 참당귀 추출물과 익힌 숙잠 분말을 단독 또는 복합제로 포함한 사료에서 배양된 알츠하이머치매 모델 초파리의 마이토콘드리아 컴플렉스 1~4의 활성이 증가함을 확인하였고, 복합제의 경우에는 단독시료보다 현저하게 상승된 증가율을 보임을 확인하였다.
자세히 설명하면, 알츠하이머치매 모델 초파리에 대한 마이토콘드리아 컴플렉스 1 활성의 경우, 일반사료만을 섭취시킨 시험군과 비교하여 참당귀 추출물이 첨가된 사료를 섭취시킨 시험군의 경우 76.8%가 증가하였고, 익힌 숙잠 분말이 첨가된 사료를 섭취시킨 시험군의 경우는 70.2%가 증가되었다. 이에 비하여 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제(실시예 1)가 첨가된 사료를 섭취시킨 시험군에서는 155.3% 증가되었는바, 이는 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제가 참당귀 추출물 또는 익힌 숙잠 분말 단독처리 시험구의 마이토콘드리아 콤플렉스 1 활성 증가율에 비하여 2.0~2.2배 (78.5~85.1%p)가 더 높은 현저한 활성 증가율로서, 이 결과는 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제는 익힌 숙잠 분말과 참당귀 추출물이 마이토콘드리아 컴플렉스 1 활성에 상호보완하여 상승작용을 한다는 결과이다.
또한, 알츠하이머치매 모델 초파리에 대한 마이토콘드리아 컴플렉스 2 활성의 경우, 일반사료만을 섭취시킨 시험군과 비교하여 참당귀 추출물이 첨가된 사료를 섭취시킨 시험군의 경우 100.0%가 증가하였고, 익힌 숙잠 분말이 첨가된 사료를 섭취시킨 시험군의 경우는 106.9%가 증가되었다. 이에 비하여 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제(실시예 1)가 첨가된 사료를 섭취시킨 시험군에서는 214.0% 증가되었는바, 이는 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제가 참당귀 추출물 또는 익힌 숙잠 분말 단독처리 시험구의 마이토콘드리아 콤플렉스 2 활성 증가율에 비하여 2.0~2.1배 (107.1~114.0%p) 더 높은 현저한 활성 증가율로서, 이 결과는 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제는 익힌 숙잠 분말과 참당귀 추출물이 마이토콘드리아 컴플렉스 2 활성에 상호보완하여 상승작용을 한다는 결과이다.
또한, 알츠하이머치매 모델 초파리에 대한 마이토콘드리아 컴플렉스 3 활성의 경우, 일반사료만을 섭취시킨 시험군과 비교하여 참당귀 추출물이 첨가된 사료를 섭취시킨 시험군의 경우 168.1%가 증가하였고, 익힌 숙잠 분말이 첨가된 사료를 섭취시킨 시험군의 경우는 263.0%가 증가되었다. 이에 비하여 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제(실시예 1)가 첨가된 사료를 섭취시킨 시험군에서는 324.1% 증가되었는바, 이는 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제가 참당귀 추출물 또는 익힌 숙잠 분말 단독처리 시험구의 마이토콘드리아 콤플렉스 3의 활성 증가율에 비하여 1.2~1.9배(61.1~156.0%p)가 더 높은 현저한 활성 증가율로서, 이 결과는 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제는 익힌 숙잠 분말과 참당귀 추출물이 마이토콘드리아 컴플렉스 3 활성에 상호보완하여 상승작용을 한다는 결과이다.
또한, 알츠하이머치매 모델 초파리에 대한 마이토콘드리아 컴플렉스 4 활성의 경우, 일반사료만을 섭취시킨 시험군과 비교하여 참당귀 추출물이 첨가된 사료를 섭취시킨 시험군의 경우 187.6%가 증가하였고, 익힌 숙잠 분말이 첨가된 사료를 섭취시킨 시험군의 경우는 126.6%가 증가되었다. 이에 비하여 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제(실시예 1)가 첨가된 사료를 섭취시킨 시험군에서는 270.4% 증가되었는바, 이는 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제가 참당귀 추출물 또는 익힌 숙잠 분말 단독처리 시험구의 마이트콘드리아 콤플렉스 4 활성 증가율에 비하여 1.4~2.1배 (82.8~143.8%p) 더 높은 현저한 활성 증가율로서, 이 결과는 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제는 익힌 숙잠 분말과 참당귀 추출물이 마이토콘드리아 콤플렉스 4 활성에 상호보완하여 상승작용을 한다는 결과이다.
이와 같이, 알츠하이머치매 모델 초파리에서의 마이토콘드리아 컴플렉스 활성을 종합하여 정리하면, 정상 대조군과 알츠하이머 치매 시험군 모두 익힌 숙잠 분말 또는 참당귀 추출물을 정상 초파리에 단독시료로 섭취시킬 경우 마이토콘드리아 컴플렉스 1~4의 활성이 크게 증가되었다. 여기에 더하여, 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제를 처리한 경우에는 마이토콘드리아 컴플렉스 1~4의 활성이 익힌 숙잠 분말 또는 참당귀 추출물 단독 처리보다 더 크게 현저하게 증가(최소 61.14%p~최대 156.0%p)되는 놀라운 상승작용을 하여 알츠하이머 치매의 예방 및 치료에 크게 기여할 수 있을 것으로 판단된다.
<실험예 7. 본 발명의 실시예 1의 혼합물 처리에 따른 ATP 생성 능력증진효과 확인>
1. 실험방법
위에서 살펴본 마이토콘드리아 컴플렉스의 활성 증가가 ATP 생성에 주는 영향을 확인하기 위하여 일반사료만을 섭취시킨 초파리 뇌의 ATP 양과 비교하여 참당귀 추출물과 익힌 숙잠 분말 단독 또는 복합제를 섭취시킨 초파리 뇌의 ATP 양을 비교하였다. 노화가 진행되면 ATP의 생성이 감소된다고 알려져 있는바, 성충 우화 후 7일된 젊은 초파리와 20일된 노화된 초파리의 ATP 양을 비교분석하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과 도 6에 나타낸 바와 같이, 참당귀 추출물과 익힌 숙잠 분말이 단독으로 처리된 시험군의 경우 20일된 노화 초파리의 ATP 양이 일반사료만 섭취한 초파리에 비하여 43.9~52.5%로 증가돼 비록 노화는 진행 되었지만 7일된 젊은 초파리와 비슷한 활력을 보이게 됨을 확인하였으며, 여기에 더하여 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제(실시예 1)가 처리된 시험구의 경우에는 더욱 더 증가하여 59.9%까지 증가(1.1~1.4배)함으로서 7일된 젊은 초파리보다도 더 높은 활력을 보이는 현저한 상승효과를 나타냄을 확인하였다.
자세히 설명하면, 일반사료만 먹인 20일된 초파리는 노화가 진행되어 7일된 초파리에 비하여 ATP생성이 31.0% 감소되었지만, 참당귀 추출물이 첨가된 사료를 섭취한 초파리는 일반사료만 섭취한 초파리에 비하여 43.9%가 증가하였고, 익힌 숙잠 분말이 첨가된 사료를 섭취한 초파리는 52.5%가 증가하였다. 이에 비하여 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제(실시예 1)가 첨가된 사료를 섭취한 초파리는 59.9% 증가되었는바, 이는 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제(실시예 1)가 참당귀 추출물 또는 익힌 숙잠 분말 단독처리 시험구의 ATP 생성 증가율에 비하여 1.1~1.4배 (7.4~16.0%p) 더 높은 현저히 증가된 증가율로서, 이 결과는 노화가 진행됨에 따라 나타나는 ATP생성 저해를 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제(실시예 1)가 처리되었을 때 익힌 숙잠 분말 또는 참당귀 추출물 단독 섭취시 보다 더 막아주는 상승작용을 한다는 결과이다.
<실험예 8. 본 발명의 실시예 1의 복합제 복용에 따른 단기기억력 상실에 대한 기억력 증진효과 확인>
1. 실험방법
초기 알츠하이머성 치매의 특징인 단기기억력 상실에 대한 기억력 증진효과를 확인하기 위하여 실험용 마우스에 실시예1의 혼합물을 섭취시키면서 단기기억력 상실제인 스코폴아민을 처리하여 실험하였다. 태어난지 4주된 수컷 마우스에 혼합물 중 황견품종 익힌누에 가공물을 1.0 g/Kg체중의 비율로 3주간 투여하였다. 3주간의 투여가 종료된 후, 마우스는 실험 1일차에는 실험 30분 전에 마우스를 실험실로 운반하여 적응과정을 거친 후, 수동회피(Passive avoidance)실험기구의 밝은 방에서 2분간 적응시켰다. 실험 2일차에는 마우스에 실험을 시작하기 30분 전에 식염수에 녹인 스코폴아민을 0.75mg/Kg체중 비율로 주사하였다. 대조군은 동일 량의 식염수를 주사하였다. 수동회피 기구의 밝은 방에 마우스를 넣은 후, 30초 후 어두운 방으로 들어가는 통로를 열어 주고, 마우스의 꼬리까지 들어가면 0.4mA의 전기충격을 4초간 주었다. 이후 어두운 방으로 들어가는 기간을 측정하였다. 실험 3일째에는 마우스를 밝은 방으로 옮겨 준 후, 어두운 방으로의 통로를 열은 후, 꼬리까지 들어가는 기간을 측정하였다. 실험이 끝나면, 대조군과 실험군 간의 차이를 ANOVA와 T-test를 수행하여 통계분석을 실시하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과 도 7에 나타낸 바와 같이, 일반사료만 섭취시킨 대조군 마우스의 경우에는 2일째 식염수 또는 식염수+스코폴아민 투여군 모두 어두운 방으로 들어가는데 20.2 ± 5.13 초와 13.1 ± 2.06 초로 큰 차이가 없었지만, 전기충격을 받고 24시간 후인 3일째에는 식염수만 처리된 마우스가 어두운 방으로 들어가는 시간은 284.6 ± 11.69 초로 전기충격에 대한 기억력을 가지고 있었다.
이와 비교하여 스코폴아민을 투여한 마우스의 경우는 50.1 ± 11.9 초 만에 어두운 방으로 이동하여 전기충격에 대한 기억이 상실됨을 보여준다.
이와 비교하여 익힌 숙잠 분말을 섭취한 쥐의 경우는 식염수만 투여한 시험군의 조명있는 방에서 머무는 시간이 2일째에 22.1 ± 5.88 초와 3일째 267.6 ± 20.5 초로 일반사료만 섭취시킨 대조군과 큰 차이가 없었다.
이에 비하여 스코폴아민을 투여한 시험군의 경우에는 2일째에 22.2 ± 4.1초로 차이가 없지만, 전기 충격 후 3일째는 90.7 ± 17.4 초로 일반사료만 섭취시킨 대조군에 비하여 81.3% 증가한 기억력을 보여주었다.
참당귀 추출물을 섭취한 시험군의 경우에는 식염수만 투여한 시험군은 조명된 방에 머무는 기간이 2일째 18.8 ± 4.2 초, 전기충격을 받은 후 3일째 218.2 ±33.4 초로 일반사료만 섭취시킨 대조군 및 익힌 숙잠 투여군과 큰 차이가 없었다.
하지만, 스코폴아민을 섭취시킨 단기기억상실 유도군의 경우에는 2일째 17.0 ± 4.8 초에서 전기충격 후 3일째에는 90.3 ± 27.7 초로 일반사료만 섭취시킨 대조군에 비하여 기억력이 80.6% 증가되었다.
이에 비하여 익힌 숙잠 분말과 참당귀 추출물 복합제(실시예 1)를 투여한 실험군의 경우, 식염수만을 처리한 시험군은 조명되는 방에 머무는 시간이 2일째 30.3 ± 8.7 초로 대조군이나 다른 실험군과 통계적으로 차이가 없었지만, 전기충격을 받은 후에는 어두운 방으로 들어가지 않고 조명이 있는 방에 머무르는 시간이 297.5 ± 2.5 초로 증가되었다.
그리고 스코폴아민을 섭취시켜 단기기억력 상실을 유도한 시험군의 경우는 조명이 되는 방에 머무는 기간이 2일째는 17.4 ± 3.3 초로 대조군이나 다른 실험군과 차이가 없거나 빨랐지만, 전기충격을 받은 후 3일째에는 130.1 ± 25.4 초로 기억력이 159.7%가 증가되었다.
이는 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제(실시예 1)가 참당귀 추출물 또는 익힌 숙잠 분말 단독처리 시험구의 단기기억력 상승율에 비하여 2.0배(76.6~79.1%p) 더 높은 현저한 기억력 회복효과로서, 이 결과는 익힌 숙잠 분말/참당귀 추출물 복합제(실시예 1)는 익힌 숙잠 분말과 참당귀 추출물이 서로 상호보완작용을 하여 단기기억력 개선에 상승작용을 한다는 결과이다.
<실험예 9. 본 발명의 실시예 1의 복합제 복용에 따른 공간기억력 증진효과 확인>
1) Y-미로 시험(Y-maze test) 에서의 본 발명의 실시예 1의 익힌 숙잠과 참당귀추출물 복합제의 처리에 따른 공간기억력 증진 효과 비교
1. 실험방법
실험동물은 실험동물공급업체(Orient, Ga-Pyung, Korea)로부터 8주령의 C57BL/6N 수컷 마우스를 구입하여 7일간의 환경 적응 기간을 두었다. 모든 실험동물은 4마리/cage로 나누어 항온(20±2℃)과 상대습도(50-55%)가 유지되며, 12시간 간격으로 낮과 밤을 교대시키는 실험실 환경에서 사육하였고, 충분한 양의 식수와 사료를 공급하였다.
군 분리 및 시료처리는 다음과 같다:
1) 대조군 (0.25% methyl cellulose); 2) 단기기억력 상실제인 스코폴라민(scopolamine) 처리군(scopolamine-injection+saline administration group); 3) 익힌 숙잠 205 mg/kg 단독처리군(scopolamine-injection+205 mg/kg b.w. 익힌 숙잠 administration group); 4) 참당귀 165 mg/kg 단독처리군(scopolamine-injection+165mg/kg b.w. 참숙잠 administration group); 5) 익힌숙잠 및 참당귀 205+164 mg/kg 처리군(scopolamine-injection+205+164 mg/kg b.w.); 6) 홍삼 처리군(308mg/kg scopolamine-injection+Red ginseng); 및/또는 7) 알츠하이머형 치매 치료제인 도네페질(donepezil) 처리군 (scopolamine injection+1 mg/kg b.w. donepezil administrationgroup).
상기 군에게 24일 간 24 시간 간격으로 익힌 숙잠, 참당귀, 익힌 숙잠 및 참당귀 복합제, 홍삼, 도네페질(donepezil)을 205, 165, 205+164 308, 2mg/kg b.w. 농도로 전처리(경구투여)하였다. 행동실험에 들어간 지 30분 전 스코폴라민을 복강투여(1 mg/kg b.w.)하였으며 스코폴라민을 투여한 지 30분 후에 Y-미로 시험 및 행동평가를 실시하였다. 이와 같은 방식으로 총 7일간 행동평가를 수행하였다.
Y-미로 시험에 이용된, Y-미로는 3개의 가지로 구성되어 있으며, 각 가지(arm)의 길이는 42 cm, 넓이 3cm, 높이 12cm이고 세팔이 접하는 각도는 120도이다. 모든 실험 장치는 검정색의 polyvinyl plastic 으로 구성되어 있다. 각 가지를 A, B, C로 정한 후 한쪽 가지에 마우스를 놓고 8분 동안 자유롭게 움직이게 한 다음 마우스가 들어간 가지를 기록하였다. 이 때 꼬리까지 완전히 들어갔을 경우에 한하며, 갔던 가지에 다시 들어간 경우도 기록하였다. 세 개의 서로 다른 가지에 차례로 들어간 경우 1점(실제 변경, actual alternation)씩 부여하였다. 변경 행동력(alternation behavior)은 3 가지 모두에 차례로 들어가는 것으로 정의되며, 하기 수학식에 의해 계산하였다:
변경 행동력 (%) = 실제 변경/최고변경 × 100 (최고변경: 총 입장횟수-2)
2. 실험결과
상기 실험결과 도 8에 나타낸 바와 같이, 스코폴라민(1 mg/kg, i.p.)의 투여에 의한 자발적 변경 행동(spontaneous alternation)이 대조군에 비해 통계적으로 유의성있게 감소하였다(p < 0.05). 반면, 익힌 숙잠과 참당귀 추출물 투여에 의한 자발적 변경 행동은 스코폴라민 투여군에 비해 증가 양상이 나타났다. 또한, 익힌 숙잠 및 복합제 투여군은 유의성 있게 증가하였다. 이러한 자발적 변경 행동이 증가한다는 것은 학습 및 기억력이 회복되었다는 것을 의미한다.
2) Morris 수중미로시험 (moriss water maze test)에서의 본 발명의 실시예 1의 익힌 숙잠과 참당귀추출물 복합제의 처리에 따른 공간기억력 증진 효과 비교
1. 실험방법
당업계에서 Morris 수중미로시험을 통한 공간학습 및 인지력 개선에 대한 실험은 이미 치매 개선약물의 스크리닝의 한 방법으로 알려져 있다. 본 미로의 재원은 지름 90cm, 높이 45cm이며 플랫폼(white platform)의 지름은 6cm로 구성되어 있다. 수중미로의 주변은 비디오카메라와 연결된 컴퓨터 시스템과 수온 조절용 장치 등 공간단서들을 항상 일정하게 유지시켰다. 실험방법으로는 미로에 물의 높이가 30cm가 되도록 물을 채우고 마우스가 플랫폼을 볼 수 없도록 물 높이의 1cm 밑에 설치하였다. 미로에는 4개의 마커(marker)를 사용하여 미로를 4분원이 되도록 나누어서 북동(NE), 북서(NW), 남동(SE), 남서(SW)로 구분하였고, 미로의 한 4분원에 플랫폼을 설치하였다.
Morris 수중미로시험은 6일 동안 진행하는데, 첫째 날에는 각 마우스들이 물에 대하여 적응을 할 수 있도록 1분간 미로 안에서 자유로이 수영하도록 하였으며, 이때 플랫폼은 설치하지 않고 두 번째 날부터 5일째 되는 날까지는 하루에 각각의 마우스가 1일 4회씩 1분 동안 10분 간격으로 미로에서 수영하도록 하였다. 두 번째 되는 날부터 5일 째가 되는 4일간 1회의 실험 방법은 이미 미로안에 설치한 플랫폼에 1분 이내에 10초간 올라가 있는 마우스는 실험을 마치고 1분 이내에 플랫폼을 찾지 못하거나 플랫폼에 10초간 올라가 있지 않은 마우스는 실험종료 후 인위적으로 10초간 플랫폼에 올려둔 후 실험을 종료하였으며, 이때 플랫폼의 위치는 같은 자리에 고정시켰다. 6일째 되는 날에는 플랫폼을 미로에서 제거한 후 플랫폼이 있던 위치에 마우스가 머문 시간을 측정하였다. 건망증 유발물질로는 스코폴라민(scopolamine)을 사용하였으며, 투여는 매일 첫 번째 입수 30분 전에 1 mg/kg로 복강으로 투여하였고, 모든 실험 데이터는 Smart3.0 program (Noldus, Netherlands)을 이용하여 기록 및 측정하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과 도 9에 나타낸 바와 같이, Morris 수중미로 실험 결과, 6일째 플랫폼을 제거한 후 1분 동안 미로에 풀어놓고 플랫폼이 있던 target zone에 머문 시간을 비율로 측정했을 때, 대조군(Control)은 26.87%, 대조군 + 스코폴라민 군(Con+Sco)은 14.81%; 스코폴라민 + 익힌 숙잠(SW+Sco) 투여군은 43.03%; 스코폴라민 + 참당귀(CDG+Sco) 투여군은 40.28%; 스코폴라민 + 익힌숙잠 및 참당귀 복합제(COM+Sco) 투여군은 43.66%; 및 스코폴라민 + 홍삼 기억력 개선 제품(RG+Sco) 투여군은 44.67%으로 나타나, 본 발명의 익힌숙잠 및 참당귀 복합제(COM) 군의 효과가 현저히 좋음을 확인하였다.
<실험예 10. 본 발명의 실시예 1의 복합제 복용에 따른 치매 마우스 모델(3xTG-AD)에서의 개선 효과 비교>
1) 3xTG 치매 마우스 모델에서의 본 발명의 실시예 1의 익힌 숙잠과 참당귀추출물 복합제의 처리에 따른 자세조절능력 증진 효과 비교
1. 실험방법
3xTG 치매 마우스 모델은 가족성 알츠하미머 치매 연관 돌연변이인 APP-swedish돌연변이, PSEN1 M146V돌연변이와 동시에 전두엽성 치매 연관 돌연변이인 MAPT P301L돌연변이를 발현하는 형질전환 마우스 모델이다.
앞서 실험예들에서 우수한 효과를 나타낸 익힌 숙잠과 참당귀 추출물 복합제를 이용하여 알츠하이머 치매의 이상 행동 중 하나인 자세조절능력 상실에 대한 효과를 비교하기 위하여 치매-유발 형질전환 마우스 모델인 3xTG 치매 마우스에 익힌 숙잠과 참당귀 추출물을 포함한 사료를 섭취시킨 후 공간기억력을 실험하였다. 취매 마우스들은 익힌 숙잠은 0.2g/Kg체중, 참당귀 추출물은 0.16g/Kg체중의 비율로 섭취시킨 후, 태어 난지 24주된 마우스들에 대하여 자세조절능력 실험(mouse clasping test)을 실시하였다.
자세조절능력실험은 실험대상 마우스의 꼬리를 잡은 후에 10초간 동영상을 녹화를 한 후, 동영상을 두 명의 연구원들이 각각 관찰하여 몇 개의 다리를 펼 수 있냐에 따라서 0에서 4까지로 점수를 준다. 4개의 다리를 모두 펼 수 없으면 4점을 주고, 모두 펼 수 있으면 0점을 준다. 두 명의 분석 결과를 평균내었다. 자세조절 능력이 좋을수록 0에 가까운 낮은 점수를 받는다.
2. 실험결과
상기 실험결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 일반사료를 섭취한 3xTG 치매 마우스의 자세조절능력은 0.733 + 0.1532로서 70%이상의 3xTG마우스가 하나의 다리를 제대로 펴지 못하였다. 하지만, 익힌 숙잠과 참당귀 추출물 복합제 사료를 섭취한 24주 령 3xTG 치매 마우스는 자세조절능력이 0.375 + 0.1829 로서 48.8%의 개선효과가 있었다.
2) 3xTG 치매 마우스 모델에서의 본 발명의 실시예 1의 익힌 숙잠과 참당귀추출물 복합제 처리에 따른 새로운 물건에 대한 인식능력 증진 효과 비교
1. 실험방법
앞서 실험예들에서 우수한 효과를 나타낸 익힌 숙잠과 참당귀추출물 복합제가 3xTG 치매 마우스의 이상 행동 중의 하나인 새로운 물건에 대한 인식능력 악화를 억제할 수 있는지에 대한 연구를 치매 마우스에 익힌 숙잠과 참당귀추출물 복합제 사료를 섭취시킨 후 새로운 물건에 대한 인식능력확인 연구(Novel objective recognition assay)를 실시하여 확인하였다.
첫 날과 둘째 날은 비어있는 가로 50 cm 세로 50 cm, 높이 50 cm인 실험 공간에 실험 마우스를 10분간 자유롭게 이동할 수 있게 해준다. 세 번째 날에는 동일한 두 개의 물건을 넣어 준 후, 마우스의 이동을 10분 동안 녹화를 한 후, 각각의 물건에 머무는 시간을 측정하였다. 마지막 날에는 오래된 물건과 새로운 물건을 각각 하나 씩 넣어 준 후, 10분 동안 녹화를 한 후, 오래된 물건과 새로운 물건에 머무는 시간을 측정하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 익힌 숙잠과 참당귀추출물 복합제를 섭취한 3xTG 치매 마우스는 일반사료 섭취 3xTG 치매 마우스대비 하여 새로운 물건에 대한 뛰어난 인식능력을 가지고 있었다.
22주된 일반사료 섭취 3xTG 치매 마우스의 경우는 훈련일에 동일한 물건 두 개의 근처에 머무는 시간이 각각 42.30 + 7.843 %와 57.69 + 7.843 %로서 통계적 ( p > 0.05)으로 차이가 없었고 시험일에 새로운 모양의 물건으로 하나를 바꾸어 주면 새로운 물건에 대해서는 53.89 + 11.089 %, 오래된 물건에는 46.10 + 11.089 %로 머무슨 시간이 통계적으로 차이가 없었다. 하지만 익힌 숙잠과 참당귀 추출물 복합제 섭취 치매 마우스의 경우는 훈련일에 동일한 물건 두 개 근처에 머무는 시간이 각각 41.03 + 7.758%와 58.96 + 7.758 %로 통계적으로는 차이가 없었지만, 시험일에 새로운 물건이나 오래된 물건에 대한 관심도가 각각 67.46 + 3.819 %와 32.54 + 3.810 %로 통계적으로 유의한 차이가 있었다. 이러한 결과는 익힌 숙잠과 참당귀 추출물 복합제의 섭취가 치매 마우스에서 나타나는 새로운 물건에 대한 호기심의 감소를 억제하여 줄 수 있음을 보여주고 있다.
3) 3xTG 치매 마우스 모델에서의 본 발명의 실시예 1의 익힌 숙잠과 참당귀 추추물 복합제 처리에 따른 사회성 증진 효과 비교
1. 실험방법
앞서 실험예들에서 우수한 효과를 나타낸 익힌 숙잠과 참당귀 추출물 복합제를 이용하여 알츠하이머 치매의 특징인 사회성 상실에 대한 효과를 비교하기 위하여 3xTG 치매 마우스에 복합제를 섭취시킨 후 사회성(Social interaction assay)의 변화를 실험하였다.
사회성 분석은 3개의 공간으로 나뉘어진 마우스 사회성 분석 장치(가로 60cm, 세로 40cm, 높이 40cm)를 이용하여 수행하였다. 3개의 공간은 마우스가 통과할 수 있는 구멍이 있는 투명한 아크릴판 2개로 나누어 준다. 양쪽의 공간에는 마우스를 넣을 수 있는 철망으로 된 지름 10cm 높이 6cm의 케이지가 있다. 처음에는 양쪽의 케이지에 마우스가 없는 상황에서 실험 마우스를 넣어서 5분 동안 자유롭게 적응을 할 수 있도록 하였다. 적응이 종료되면 한쪽의 케이지에 한 번도 만나지 않았던 마우스를 넣어 주고 다른 쪽은 빈 케이지로 둔 상태에서 마우스를 가운데 공간에 넣어준 후 행동을 10분간 녹화하였다. 마지막에는 새로운 마우스를 빈 케이지에 넣어 준 후, 행동을 10분간 녹화하였다. 녹화된 행동을 분석하여 각각의 실험 마우스가 빈 케이지가 있는 공간이나 마우스가 있는 공간에 머무는 시간과 이미 만났던 마우스와 새로운 마우스가 있는 공간에 머무는 시간을 측정하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 익힌 숙잠과 참당귀 추출물 복합제를 섭취한 3xTG 치매 마우스는 일반사료를 섭취 3xTG치매 마우스보다 뛰어난 사회성을 가지고 있었다.
23주 된 일반사료 섭취 3xTG 치매 마우스는 무처리 공간에 머무는 비율이 48.75 + 5.772%고 처음 만나는 마우스가 있는 공간에 머무는 시간의 비율이 51.24 + 5.772%로 차이가 없었다. 그리고 다음날 새로운 마우스를 넣어 준 공간에 머무는 시간의 비율이 46.71 + 6.683 %로서 이미 한번 만난 마우스가 있는 공간에 머무는 시간의 비율인 53.28 + 6.683 %으로 차이가 없었다. 하지만, 익힌 숙잠과 참당귀 추출물 복합제 섭취 3xTG 치매 마우스의 경우는 새로운 마우스가 있는 공간에 머무는 시간비율인 68.82 + 5.907 %로 빈 케이지가 있는 공간에 머무는 시간의 비율인 31.17 + 5.907 %에 비하여 통계적으로 유의하게 오래 머물럿고, 다음날 새로운 마우스가 있는 공간에 머무는 시간 비율이 70.55 + 6.341 %로서 이미 한번 만난 마우스가 있는 공간에 머무는 시간인 29.44 + 6.341 %에 비하여 통계적으로 유의하게 높았다. 이러한 결과는 익힌 숙잠과 참당귀 추출물 복합제의 섭취가 3xTG 치매 마우스의 사회성 결핍을 개선시킬 수 있음을 제시한다.
이와 같이, 본 발명에서는 새로운 형태의 식의약용 원료인 익힌 숙잠 분말과 참당귀 추출물 복합제(실시예 1)를 섭취할 경우 우수한 기억력 개선 효과와 알츠하이머치매의 예방 및 치료효과를 나타낸다는 것으로, 익힌 숙잠 분말 또는 참당귀 추출물 단독으로 섭취하는 것에 비하여 보다 더 상승된 효과를 나타낸다는 것이다. 이는 익힌 숙잠 분말과 참당귀 추출물은 서로 다른 신경계 작용기전을 갖고 있어서 이들을 혼합한 복합제 형태로 제조하였을 경우 상호간에 보완작용을 하여 상승효과를 발휘하는 것으로 예상된다.
상기 결과로 인하여 현대사회에 큰 문제로 부각되고 있는 고령화와 고령화로 인한 치매를 근본적으로 예방 및 치료할 수 있을 것으로 기대되며, 아울러 학생, 수험 준비생, 회사원 등 다양한 국민들의 기억력 개선에도 도움을 주게 될 것으로 기대되는바, 본 발명을 이용한 기억력개선과 치매의 예방 및 치료용 건강기능식품 및 의약품이 개발되어 시판될 것으로 예상돼 익힌 숙잠과 당귀의 새로운 활용도 창출 및 고부가가치화로 건강기능식품 생산업과 양잠산업, 당귀 생산업의 발전과 농업발전에 기여하는 효과가 클 것으로 기대된다.
<제제예 1. 약학적 제조>
실시예 1의 혼합물 200g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
<제제예 2. 식품 제조>
제제예 2-1. 조리용 양념의 제조
실시예 1의 혼합물 1 중량%를 조리용 양념에 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.
제제예 2-2. 유제품(dairy products)의 제조
실시예 1의 혼합물 0.1 중량%를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
제제예 2-3. 야채주스 제조
실시예 1의 혼합물을 토마토주스 또는 당근주스에 첨가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.
상기의 본 발명은 바람직한 실시예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (22)

  1. 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물을 유효성분으로 포함하는,
    기억력 개선용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 익힌 누에가공물은 누에 전체를 80~125℃의 증기의 열로 100~150분 동안 익혀 견사단백질이 포함된 상태에서 식이용으로 섭취가능한 것이 특징인,
    기억력 개선용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 익힌 누에가공물과 상기 당귀 추출물은 1 : 0.1~1 중량비로 포함되는 것이 특징인,
    기억력 개선용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 누에가공물의 누에 품종은 황견품종인 것이 특징인,
    기억력 개선용 약학 조성물.
  5. 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물을 유효성분으로 포함하는,
    알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 익힌 누에가공물은 누에전체를 80~125℃의 증기의 열로 100~150분 동안 익혀 견사단백질이 포함된 상태에서 식이용으로 섭취가능한 것이 특징인,
    알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 익힌 누에가공물과 상기 당귀 추출물은 1 : 0.1~1 중량비로 포함되는 것이 특징인,
    알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 누에가공물의 누에 품종은 황견품종인 것이 특징인,
    알츠하이머성 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물을 유효성분으로 포함하는,
    기억력 개선용 식품 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 익힌 누에가공물은 누에전체를 80~125℃의 증기의 열로 100~150분 동안 익혀 견사단백질이 포함된 상태에서 식이용으로 섭취가능한 것이 특징인,
    기억력 개선용 식품 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 익힌 누에가공물과 상기 당귀 추출물은 1 : 0.1~1 중량비로 포함되는 것이 특징인,
    기억력 개선용 식품 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 누에가공물의 누에 품종은 황견품종인 것이 특징인,
    기억력 개선용 식품 조성물.
  13. 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물을 유효성분으로 포함하는,
    알츠하이머성 치매 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 익힌 누에가공물은 누에전체를 80~125℃의 증기의 열로 100~150분 동안 익혀 견사단백질이 포함된 상태에서 식이용으로 섭취가능한 것이 특징인,
    알츠하이머성 치매 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 익힌 누에가공물과 상기 당귀 추출물은 1 : 0.1~1 중량비로 구성되는 것이 특징인,
    알츠하이머성 치매 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 누에가공물의 누에 품종은 황견품종인 것이 특징인,
    알츠하이머성 치매 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  17. 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 기억력 개선 방법.
  18. 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물을 포함하는 조성물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 알츠하이머 치매 예방 또는 치료 방법.
  19. 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물을 혼합하는 단계를 포함하는, 기억력 개선용 조성물의 제조방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 익힌 누에가공물은 누에전체를 80~125℃의 증기의 열로 100~150분 동안 익히는 단계를 통해 제조되고;
    상기 당귀 추출물은 물, 메탄올, 에탄올 또는 이의 조합을 당귀에 처리하여 수득한 것을 특징으로 하는,
    기억력 개선용 조성물의 제조방법.
  21. 익힌 누에가공물 및 당귀 추출물을 혼합하는 단계를 포함하는, 알츠하이머 치매 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 익힌 누에가공물은 누에전체를 80~125℃의 증기의 열로 100~150분 동안 익히는 단계를 통해 제조되고;
    상기 당귀 추출물은 물, 메탄올, 에탄올 또는 이의 조합을 당귀에 처리하여 수득한 것을 특징으로 하는,
    알츠하이머 치매 예방 또는 치료용 조성물의 제조방법.
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