WO2018056698A1 - 식물의 추출 복합물을 포함하는 항염 조성물 및 염증성 질환 치료용 조성물 - Google Patents

식물의 추출 복합물을 포함하는 항염 조성물 및 염증성 질환 치료용 조성물 Download PDF

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이승영
남보미
소양강
김동섭
강시용
김진백
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Definitions

  • the present invention relates to an anti-inflammatory composition comprising an extract complex of a natural plant, and more particularly, to an anti-inflammatory composition comprising an extract of axillary element and baekrye, and a pharmaceutical composition for treating inflammatory diseases.
  • Inflammation is a local protective response caused by injury or destruction of tissue, which acts to destroy, weaken or mask both the injury causing material and the injured tissue. Inflammation is characterized by perforation of microcirculation, leakage of blood components into niche spaces, and migration of white blood cells into inflamed tissue. In the macro aspect, it is usually accompanied by clinical symptoms such as erythema, edema, hyperalgesia and pain.
  • An inflammatory response is any response specified by inflammation as defined above. It is well known in the medical arts that an inflammatory response causes many physical discomforts associated with different diseases and injuries, such as pain and loss of function. Therefore, it is desirable to administer pharmaceutical agents that reduce the physical discomfort of the inflammatory response, and agents with these properties are classified as anti-inflammatory. Anti-inflammatory agents are used for the treatment of a wide range of diseases, and the same agent may often be used for the treatment of different diseases.
  • NSAIDs nonsteroidal anti-inflammatory agents
  • the most widely used among these is salicylate, and acetylsalicylic acid or aspirin is the most widely used analgesic, antipyretic and anti-inflammatory substance, and is disclosed in Korean Application No. 2008-7027164.
  • it has been known to cause various side effects such as respiratory stimulation, circulatory collapse, epigastric pain, vomiting, gastrointestinal bleeding, liver damage, and platelet inhibition when administered in large doses.
  • one aspect of the present invention is to provide an anti-inflammatory composition comprising an extract complex of plants excellent in anti-inflammatory activity and safe for humans.
  • Another aspect of the present invention is to provide a method for producing an anti-inflammatory composition comprising an extract complex of a plant having excellent anti-inflammatory activity and safe for humans.
  • Another aspect of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating inflammatory diseases, comprising an extract complex of a plant having excellent anti-inflammatory activity and safe for humans.
  • an anti-inflammatory composition comprising an extract complex of plants consisting of axillary japonicus and leachate extract.
  • a pharmaceutical composition for treating an inflammatory disease comprising an extract complex of a plant consisting of a leaflet and an extract of baekryeok.
  • the anti-inflammatory composition and the pharmaceutical composition for treating inflammatory diseases according to the present invention can be used for treating, preventing and treating a wide range of inflammation by using an extract complex composed of a mixture of extracts obtained from axillary japonicum and leachate with excellent isoegoma ketone content. Since it can be improved, it is expected that it can be usefully used for anti-inflammatory purposes in various fields such as cosmetics, health food, medicine, household goods and the like.
  • Figure 1 shows the growth process of antisperyl, a leaflet that can be used in the present invention.
  • Figure 2 shows the supercritical extraction process, which shows the pressure change over time.
  • Figure 3 shows the results of measuring the degree of toxicity of the extract complex.
  • Figure 4 is a result of measuring the amount of NO produced when each alcohol extract for the anti-inflammatory efficacy evaluation of each extract of white extract and leaf organ extract (a) and each supercritical extract of the extract and leaf extract The result of measuring the amount of NO produced in one case is shown (b).
  • Figure 5 shows the results of measuring the amount of NO production when the extract complex of Example was treated to evaluate the anti-inflammatory efficacy of the extract complex of the Example.
  • Figure 6 shows the hind limb changes after oral administration of the alcohol extraction complex (a) and the supercritical extraction complex (b) of the present invention to a mouse model of arthritis.
  • an anti-inflammatory composition comprising an extract complex of a plant comprising a leaf extract and a white extract.
  • an extract complex of a plant comprising a leaf extract and a white extract.
  • a thorn stem extract may further comprise a thorn stem extract.
  • baekchul ( Atractylodes japonica Koidz.) Uses a root stem, baekchul strengthens the spleen and strengthens, dries moisture to dry the urine well, stop sweating, pregnant women It is known to have a stabilizing effect. It is also known to be used for the treatment of anxiety, lack of appetite, dizziness, dizziness, dizziness when eating with diarrhea, sputum or asthma. have.
  • Gasiohgapi (Acanthopanaxsenticosus) uses the bark with deciduous broad-leaved shrub belonging to Araliaceae, such as ginseng, and gasiohgapi wood is also known that the appearance of wild ginseng as Siberian ginseng (Siberian Ginseng). Prickly Ogaphy tree has been found to contain acantosides and various useful components with excellent biological activity, and is used for neuralgia, hypertension, nervous breakdown, diabetes and tonic.
  • Perilla frutescens BRITT A perennial herb of Labiatae, uses leaves and is used for sweating, antitussive, dry, diuretic, soothing and analgesic. It is known to be effective in treating nasal congestion and runny nose.
  • the leaf extract used in the present invention contains isoegoma ketone (IK, isoegoma ketone) or a salt thereof as an active ingredient, especially the leaf extract used in the present invention is 10mg to 30mg per 1g extract It is preferable to have an isoegoma ketone (IK) content of and to have an isoegoma ketone concentration of 100 mg / mL to 300 mg / mL.
  • IK isoegoma ketone
  • the leaf extract of the present invention has an isoegoma ketone (IK) content of less than 10 mg per gram of extract or has an isoegoma ketone concentration of less than 100 mg / mL, the desired anti-inflammatory effect is insufficient. Toxicity tends to be increased when having an isoegoma ketone (IK) content of more than 30 mg per gram of extract or having an IK isoegoma ketone concentration of more than 300 mg / mL.
  • IK isoegoma ketone
  • the leaflet with the increased content of the isoegoma ketone can be obtained, for example, by irradiating with a radiation in the range of 50 to 500, preferably gamma rays of 150 to 250 Gy, more preferably gamma rays of about 200 Gy. .
  • FIG. 1 shows an exemplary growth process of Antisperill. More specifically, after irradiating the axial seedlings, the growth of the M1 generation was selected, and the growth was improved to the M3 generation, and the traits were fixed. CJ-29A can be selected, and the selection process can be focused on excellent growth.
  • the leaflet of which the content of isoegoma ketone is increased is antisperyl (Antisperill), which has been given the accession number of KCTC 13077BP.
  • the extract complex of the present invention means that the plant extracts, such as leaflet extract and baekchul extract, each independently prepared and then mixed.
  • the leaflet extract, baekchul extract and prickly pear extract each can be extracted by the ethanol solvent, more preferably the ethanol solvent has a ethanol concentration of 60% or more, more preferably the ethanol solvent Has an ethanol concentration of 100%.
  • the extraction is performed using an ethanol solvent, as shown in FIG. 4, a more remarkably improved anti-inflammatory effect can be obtained.
  • the extract complex of the plant is preferably 1 to 2 parts by weight of the other two extracts per 1 part by weight of any one of the extracts of leaflet extract, baekchul extract and prickly pear extract, respectively, more preferably
  • the extract complex of the plant is a mixture of axillary extract, baekchul extract and prickly pear extract in a weight ratio of about 1: 1: 1.
  • the leaf extract, baekchul extract and prickly pear extract are mixed in a weight ratio of about 1: 1: 1, as shown in FIG. 3, the toxicity may be remarkably reduced as compared to other mixing ratios.
  • the leaf extract and the extract of the extract is obtained by supercritical extraction, respectively, and when the extract is obtained by the supercritical extraction method from the leaf element isoegoma compared to alcohol extraction using ethanol
  • the content of ketone is increased by 7 times, and when the extract is obtained by the supercritical extraction method from Baekchul, the content of atlactilenolide is also significantly increased compared to alcohol extraction using ethanol. That is, in the case of using supercritical extraction, an extract of a different composition from alcoholic extraction using ethanol can be obtained, and as a result, a remarkable anti-inflammatory effect can be obtained without the addition of thorny ivy extract.
  • the freeze-drying step further comprising the step of washing each of the leaf element, baekchul, thorny skin, etc. to remove the contaminants.
  • the lyophilization step may be performed under conventional conditions performed in the art, and the lyophilization step is preferable because it has excellent drying efficiency and no residual solvent.
  • the extracting step is preferably performed by powdering the lyophilized plant.
  • the lyophilized plant is powdered, there is no residual solvent and there is an advantage of easy quantitative measurement in the future.
  • the step of obtaining each of the extract of the plant may be performed by supercritical extraction of each plant, in which case it is possible to obtain an anti-inflammatory composition having an improved anti-inflammatory effect.
  • a pharmaceutical composition for treating inflammatory diseases comprising an extract complex of a plant comprising a leaf extract and a white extract.
  • the extract complex of the plant may include a ethanol extract of each plant, wherein the extract complex of the plant may further comprise a bark extract. Meanwhile, the extract complex of the plant may include a supercritical extract of each plant, and at this time, a pharmaceutical composition for treating an inflammatory disease having a significantly increased anti-inflammatory effect may be obtained.
  • the inflammatory disease is selected from the group consisting of asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), allergic rhinitis, dermatitis, arthritis, allergy and inflammatory bowel disease, in particular the arthritis is rheumatoid arthritis.
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • allergic rhinitis dermatitis
  • arthritis allergy
  • inflammatory bowel disease in particular the arthritis is rheumatoid arthritis.
  • composition may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • the pharmaceutical composition for treating inflammatory diseases of the present invention is a powder, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, oral formulations, etc. It can be formulated and used in a variety of forms and can be administered orally or via a variety of routes including intravenous, intraperitoneal, subcutaneous, rectal, topical, and the like.
  • Suitable carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical compositions for treating inflammatory diseases include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, Calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, amorphous cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil and the like.
  • the pharmaceutical composition for treating inflammatory diseases may further include fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, flavors, emulsifiers, preservatives and the like.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like, which solid preparations contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, It can be formulated by mixing lactose, gelatin and the like. In addition to the simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc can also be used.
  • Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives, etc., in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • Bases for injectables may include conventional additives such as solubilizers, isotonic agents, suspending agents, emulsifiers, stabilizers and preservatives.
  • the pharmaceutical composition for treating the inflammatory disease of the present invention is a pharmaceutically effective amount To administer.
  • compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be single or multiple doses. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects, which can be easily determined by those skilled in the art.
  • the pharmaceutically effective amount of the compound according to the present invention may vary depending on the age, sex and weight of the patient, and generally 1 to 50 mg per kg body weight, preferably 1 to 10 mg daily or every other day. It may be administered or divided into 1 to 3 times a day.
  • the dosage may be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of the disease, sex, weight, age, etc., and the above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the leaflet extract of the present invention has an isoegoma ketone (IK) content of 10 mg or more per 1g leaflet extract, and is obtained from the leaflet having an IK concentration of 100 mg / mL or more.
  • IK isoegoma ketone
  • the CJ-29A strain showed the highest activity, and the metabolome analysis revealed that the iso-ego-marketing was increased. .
  • the CJ-29A system was given the name “antisperyl” and a quantity test and a local adaptation test were conducted at the Korea Atomic Energy Research Institute's Advanced Radiation Research Center.
  • Figure 1 schematically shows the development of the "antisperyl”.
  • the leaflet leaf obtained in step 1 was dried and powdered at about 45, and then 10g of the dried leaflet powder sample was stirred at 100 rpm at 45 ° C. for 6 hours using 100 mL of fermented alcohol (100% ethanol). Extracted using an extraction apparatus (product name: SI-600R, manufactured by JeioTech).
  • the extract thus obtained was filtered with filter paper, concentrated using a rotary vacuum concentrator (product name: N-1100, manufacturer: EYELA), and then a high efficiency centrifugal concentrator (product name: HT-4X, manufacturer: GeneVac). All solvents were removed to obtain the leaflet extract.
  • Extracts of Astragalus japonicus, Astragalus japonicus and Aquixia were obtained by the same process as in Preparation Example 1, except that 70% ethanol was used as a solvent for extracting Axillary japonicus, Schizophyllaceae and Baekchul.
  • the “antispheryl” leaflet leaves obtained in step 1 were harvested and dried in a drier at 24 ° C. for 24 hours, then crushed to produce a powder form. Using 200g of the leaflet powder produced, supercritical fluid extraction equipment (supercritical fluid extraction, Ilshin Autoclave, ISA-SEFE-0500-0700-080) was used for extraction under specific extraction conditions as shown in Table 1 below. .
  • Extractor Auxiliary solvent flow rate (ml / min) Separator CO2 flow rate (ml / min) Cooler (°C) Run time (min) Pressure (bar) Temperature (°C) Pressure (bar) Temperature (°C) 400 50 - 40 40 550/12 One 180
  • the extraction process was carried out as shown in FIG. 2 by depressurizing for 10 minutes, purging for 10 minutes, pressurizing for 10 minutes, and maintaining the extraction at 400 bar pressure for 180 minutes.
  • the final extract was obtained after removing water from the supercritical extract thus obtained.
  • Extracts of Astragalus japonica, Astragalus japonica and Paekchul, respectively, were obtained by the same process as in Preparation Example 1, except that water was used as a solvent for extracting Azalea japonica, Bacillus japonica and Baekchul.
  • the extraction complex of the present invention was prepared by mixing the white leach, antisperyl and prickly pear extracts obtained in Preparation Example 1 in a weight ratio of 1: 1: 1.
  • White extract, antisperyl and prickly pear extract obtained in Preparation Example 1 were mixed at a weight ratio of 1: 2: 1 to prepare an extract composite of the present invention.
  • White extract, antisperyl and prickly pear extract, respectively, obtained in Preparation Example 1 were mixed at a weight ratio of 2: 2: 1 to prepare an extract composite of the present invention.
  • the extraction complex of the present invention was prepared by mixing the baekchul, antisperyl and prickly pear extracts obtained in Preparation Example 1 in a weight ratio of 1: 1: 2.
  • the extraction complex of the present invention was prepared by mixing the baekchul and antisperyl extracts obtained in Preparation Example 3 in a weight ratio of 1: 1.
  • HPLC (Agilent Technologies) was used for the analysis of isoegoma ketone in the leaf and the common leaf extract obtained in (1) of Preparation Example 1. Operating conditions for the quantitative analysis are shown in Table 2 below.
  • IK isoegoma ketone
  • the concentration is 100 mg / mL or more. It was confirmed that up to 40-fold increase in the content of isoeegoma ketone compared to wild leaf stem.
  • Anti-inflammatory efficacy was evaluated by measuring the production of nitric oxide (NO), one of the markers of the inflammatory response.
  • NO nitric oxide
  • RAW264.7 cells which are mouse inflammatory cells, were incubated in 96 wells at a concentration of 2.0 ⁇ 10 5 cells / ml for 24 hours at 37 ° C. and 5% CO 2 , and then each extract was treated with a concentration of 50 ⁇ g / ml. . After incubating for 2 hours, LPS was treated at 1 ⁇ g / m concentration, and further cultured for 18 hours, and then NO production was measured using a grease reagent.
  • NO nitric oxide
  • the negative control in Figure 4 used RAW264.7 cells not treated with any extract
  • the positive control used RAW 264.7 cells treated with LPS.
  • Anti-inflammatory efficacy was evaluated by measuring NO (nitric oxide) production, one of the markers of inflammatory response.
  • RAW264.7 cells which are mouse inflammatory cells, were incubated in 96 wells at a concentration of 2.0 ⁇ 10 5 cells / ml for 24 hours at 37 ° C. and 5% CO 2 , followed by 50 ⁇ g / ml concentration of the extract complex of Example 1. Treated with. After incubating for 2 hours, LPS was treated at 1 ⁇ g / m concentration, and further cultured for 18 hours, and then NO production was measured using a grease reagent.
  • the arthritis animal model was prepared by injecting 2mg of ArthritoMab antibody cocktail (antibody cocktail, mabioscience) into Balb / c mice by IP, and then injecting 50 ⁇ g of LPS into IP 3 days later.
  • ArthritoMab antibody cocktail antibody cocktail, mabioscience
  • Figure 6 (a) shows the change in the hind limbs of the actual arthritis mouse model confirmed on the seventh day when the oral administration of the extract complex of the present invention Example 1 at a dose of 25 to 100 mg / kg daily.
  • the extract complex of the present invention was confirmed to increase the therapeutic effect of arthritis in a dose-dependent manner, and it was confirmed that a visible effect was obtained after 7 days.
  • Figure 6 (b) is 6 days by oral administration of the extract complex of Example 6, which is mixed with the supercritical extract of axillary and Baekchul at a ratio of 1: 66.5, and 133.0 mg / Kg each day The thickness and volume of the joint area are measured.
  • Figure 7 (a) to Figure 7 (c) in the arthritis mouse model arthritis confirmed on the 6th day when the oral administration of the extract complex of Example 1 of the present invention in a dose of 25 to 100 mg / kg Change (a), hind leg edema thickness change (b) and hind leg edema volume change (c) are shown.
  • the extract complex of the present invention was confirmed to increase the therapeutic effect of arthritis in a dose-dependent manner.
  • FIGS. 8 (a) to 8 (c) when the extract complex of Example 6 of the present invention is administered orally at doses of 66.5 and 133.0 mg / kg to the arthritis mouse model (CAIA), respectively, until the 7th day Arthritis level change (a), hind edema thickness change (b), and hind edema volume change (c) were shown.
  • CAIA arthritis mouse model
  • the extract complex of the present invention was confirmed that the therapeutic effect of arthritis significantly increased, especially when using the complex extract obtained by supercritical extraction.

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Abstract

본 발명은 식물의 추출 복합물을 포함하는 항염 조성물 및 염증성 질환 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 축엽자소 추출물 및 백출 추출물을 포함하는 식물의 추출 복합물을 포함하는 항염 조성물; 이의 제조방법; 및 상기 추출 복합물을 포함하는 염증성 질환 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

식물의 추출 복합물을 포함하는 항염 조성물 및 염증성 질환 치료용 조성물
본 발명은 천연 식물의 추출 복합물을 포함하는 항염 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 축엽자소 및 백출의 추출물을 포함하는 항염 조성물, 및 염증성 질환 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
염증이란 조직의 상해 또는 파괴에 의해 유발되는 국소 보호 반응으로, 이는 상해 유발 물질과 상해된 조직 모두를 파괴하거나, 약화시키거나 또는 차폐하는 작용을 한다. 염증의 특징은 미세 혈관이 천공되고, 혈액 성분이 틈새 공간으로 누출되고, 백혈구가 염증 조직으로 이동하는 것이다. 거시적 측면으로는, 이는 통상적으로 홍반, 부종, 통각과민 및 통증 등의 임상적 증상들을 동반한다.
염증 반응은 상기 정의된 바와 같이 염증에 의해 특정되는 임의의 반응이다. 염증 반응이 상이한 질병 및 상해와 관련되어 나타나는 많은 물리적 불편함, 예를 들어 통증 및 기능의 손실을 일으킨다는 것은 의학 분야에 잘 알려져 있는 사실이다. 따라서, 염증 반응의 물리적 불편함을 감소시키는 약학적 제제를 투여하는 것이 바람직하며, 이러한 특성을 갖는 작용 물질은 항염증성으로 분류된다. 항염증성 약제는 광범위한 질병의 치료에 사용되고, 동일한 약제가 종종 상이한 질병의 치료에 사용될 수도 있다.
항염증성 물질로써 천연 및 합성 코르티코스테로이드 제제는 혈압 상승, 염 및 물의 정체, 신장 손상, 칼륨 및 칼슘 분비의 증가를 비롯한 수많은 부작용을 일으킨다. 한편, 이와 같은 스테로이드계 물질의 부작용을 극복하기 위해 비스테로이드계 항염증성 작용물질 (NSAID) 들이 개발되어 왔다. 이들 중 가장 광범위하게 사용되는 것이 살리실산염으로, 아세틸살리실산 또는 아스피린은 가장 널리 사용되는 진통, 해열 및 항염증성 물질이며, 한국 출원 제 2008-7027164호 등에 개시되어 있다. 하지만 다량 투여 시 호흡촉진 현상, 순환계 붕괴, 상복부 통증, 구토, 위장출혈, 간 손상, 혈소판 저해 등 다양한 부작용을 나타내는 것으로 알려져 있다.
이와 같이 많은 종류의 항염증성 물질이 사용되고 있음에도 불구하고, 부작용이 없고 우수한 항염 효능을 보유한 물질의 필요성이 여전히 요구되고 있다.
따라서, 항염 활성이 우수하고, 인체에 안전한 천연 항염제를 개발하는 경우 관련 분야에서 유용하게 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
이에 본 발명의 한 측면은 항염 활성이 우수하고 인체에 안전한 식물의 추출 복합물을 포함하는 항염 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은 항염 활성이 우수하고 인체에 안전한 식물의 추출 복합물을 포함하는 항염 조성물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 항염 활성이 우수하고 인체에 안전한 식물의 추출 복합물을 포함하는 염증성 질환 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면, 축엽자소 및 백출 추출물로 이루어진 식물의 추출 복합물을 포함하는 항염 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 견지에 의하면, 축엽자소 및 백출 추출물을 포함하는 식물의 추출물을 각각 획득하는 단계; 및 각각 획득된 식물의 추출물을 혼합하여 추출 복합물을 제조하는 단계를 포함하는 항염 조성물의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 축엽자소 및 백출 추출물로 이루어진 식물의 추출 복합물을 포함하는 염증성 질환 치료용 약학 조성물이 제공된다.
본 발명에 따른 항염 조성물 및 염증성 질환 치료용 약학 조성물은 아이소에고마 케톤(isoegoma ketone) 함량이 우수한 축엽자소 및 백출로부터 획득한 추출물의 혼합물로 이루어진 추출 복합물을 이용하여 광범위한 염증을 치료, 예방 및 개선할 수 있으므로, 화장품, 건강기능식품, 의약, 생활용품 등의 다양한 분야에서 항염 목적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에 사용될 수 있는 축엽자소인 안티스페릴의 육성 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 초임계 추출 공정을 나타낸 것으로, 시간에 따른 압력 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 추출 복합물의 독성 정도를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 백출 추출물 및 축엽자소 추출물 각각의 항염증 효능 평가를 위해 각 주정 추출물을 처리한 경우의 NO 생성량을 측정한 결과(a) 및 백출 추출물 및 축엽자소 추출물의 각 초임계 추출물을 처리한 경우의 NO 생성량을 측정한 결과(b)를 나타낸 것이다.
도 5는 실시예의 추출 복합물의 항염증 효능 평가를 위해 실시예의 추출 복합물을 처리한 경우의 NO 생성량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 관절염 마우스 모델에 본 발명의 주정 추출 복합물(a) 및 초임계 추출 복합물(b)을 경구 투여한 후 뒷다리 변화를 나타낸 것이다.
도 7(a) 내지 도 7(c)에서는 각각 관절염 마우스 모델에 실시예 1의 추출 복합물을 25 내지 100 mg/kg의 투여량으로 경구 투여한 경우 6일째 되는 날까지 확인한 관절염 수치 변화(a), 뒷다리 부종 두께 변화(b) 및 뒷다리 부종 부피 변화(c)를 나타낸 것이다.
도 8(a) 내지 도 8(c)에서는 각각 관절염 마우스 모델에 실시예 6의 추출 복합물을 66.5 및 133.0 mg/kg의 투여량으로 경구 투여한 경우 7일째 되는 날까지 확인한 관절염 수치 변화(a), 뒷다리 부종 두께 변화(b) 및 뒷다리 부종 부피 변화(c)를 나타낸 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의하면 축엽자소 추출물 및 백출 추출물을 포함하는 식물의 추출 복합물을 포함하는 항염 조성물이 제공된다. 또한, 본 발명에 있어서 필요한 경우 가시오가피 추출물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 백출(Atractylodes japonica Koidz.)은 뿌리줄기를 사용하며, 백출은 비장을 튼튼하게 하고 기운을 나게 하며, 습기를 말려주어 소변이 잘 통하게 하고, 땀을 멈추게 하고, 임산부의 태기를 안정시키는 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 백출은 비장이 약해 식욕이 없고 소식하는 증상, 설사, 가래 또는 천식으로 음식을 섭취할 때 어지러움을 느끼는 증상, 수종, 다한증, 임산부의 복중 태아의 움직임이 불안한 증상을 치료하는데 사용하는 것으로 알려져 있다.
가시오가피(Acanthopanaxsenticosus )는 인삼과 같은 두릅나무과에 속하는 낙엽성 활엽관목으로 나무 껍질을 사용하며, 가시오가피나무는 그 생김새가 산삼을 시베리아 산삼(Siberian Ginseng)으로 불리기도 한다. 가시오가피나무는 생물활성이 뛰어난 아칸토사이드 및 여러 유용 성분을 다량 함유하고 있는 것으로 밝혀져 있고, 신경통, 고혈압, 신경쇠약, 당뇨 및 강장제 등으로 이용되고 있다.
또한 꿀풀과(Labiatae)의 일년생 초본인 축엽자소(Perilla frutescens BRITT.; 차조기; 소엽)는 잎을 사용하며, 발한, 진해, 건위, 이뇨, 진정 및 진통제로 사용되고 있으며, 현기증과 신체의 통증 및 코막힘, 콧물을 치료하는데 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
본 발명에 사용되는 상기 축엽자소 추출물은 아이소에고마 케톤(IK, isoegoma ketone) 또는 이의 염을 유효 성분으로 함유하는 것으로, 특히 본 발명에 사용되는 상기 축엽자소 추출물은 추출물 1g 당 10mg 내지 30mg의 아이소에고마 케톤(IK, isoegoma ketone) 함량을 가지며, 100 mg/mL 내지 300 mg/mL의 아이소에고마 케톤 농도를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명의 축엽자소 추출물이 추출물 1g 당 10mg 미만의 아이소에고마 케톤(IK, isoegoma ketone) 함량을 가지거나 100 mg/mL 미만의 아이소에고마 케톤 농도를 갖는 경우에는 목적하는 항염 효과가 불충분할 수 있으며, 추출물 1g 당 30mg을 초과하는 아이소에고마 케톤(IK, isoegoma ketone) 함량을 가지거나 300 mg/mL 초과의 IK 아이소에고마 케톤 농도를 갖는 경우에는 독성이 증가되는 경향이 있다.
상기 아이소에고마 케톤의 함량이 증가된 축엽자소는 예를 들어 50 내지 500 범위의 방사선, 바람직하게는 150 내지 250 Gy의 감마선, 더욱 바람직하게는 약 200 Gy의 감마선을 조사하여 획득될 수 있다.
도 1은 안티스페릴(Antisperill)의 예시적인 육성 과정을 나타낸 것이다. 보다 상세하게, 축엽자소 종자에 방사선을 조사한 뒤 M1 세대에서 생육이 우수한 것을 선별하여 M3 세대까지 키우면서 형질이 고정되는지 확인한 후 최종 150주를 계통화하고, 생리활성 평가를 통해 항염증 효능이 우수한 CJ-29A를 선발할 수 있으며, 이때 선발 과정은 우수 생육 위주로 진행할 수 있다.
이와 같이 획득한 안티스페릴(Antisperill)은 2016.8.17일에 한국생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTK)에 기탁하였으며, KCTC 13077BP의 기탁번호를 부여 받았다.
이하 본 명세서에서 아이소에고마 케톤의 함량이 증가된 축엽자소는 상기 KCTC 13077BP의 기탁번호를 부여 받은 안티스페릴(Antisperill)인 것이 바람직하다.
한편, 본 발명의 상기 추출 복합물은 축엽자소 추출물 및 백출 추출물 등의 식물 추출물을 각각 독립적으로 제조한 후 혼합한 것을 의미하는 것이다.
한편, 본 발명에 있어서 상기 축엽자소 추출물, 백출 추출물 및 가시오가피 추출물은 각각 에탄올 용매에 의해 추출될 수 있으며, 보다 바람직하게 상기 에탄올 용매는 60% 이상의 에탄올 농도를 갖는 것이고, 더욱 바람직하게 상기 에탄올 용매는 100%의 에탄올 농도를 갖는 것이다. 에탄올 용매를 이용하여 추출을 수행하는 경우에는 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이 보다 현저하게 향상된 항염증 효과를 획득할 수 있다.
이때 상기 식물의 추출 복합물은 축엽자소 추출물, 백출 추출물 및 가시오가피 추출물 중 어느 하나의 추출물 1 중량부 당 다른 두 추출물의 중량이 각각 1 중량부 내지 2 중량부로 혼합된 것이 바람직하며, 보다 바람직하게 상기 식물의 추출 복합물은 축엽자소 추출물, 백출 추출물 및 가시오가피 추출물이 약 1:1:1의 중량비로 혼합된 것이다. 축엽자소 추출물, 백출 추출물 및 가시오가피 추출물이 약 1:1:1의 중량비로 혼합되는 경우 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이 다른 혼합 비율에 비하여 독성이 현저하게 저하될 수 있다.
한편, 상기 축엽자소 추출물 및 백출 추출물은 각각 초임계 추출에 의해 획득되는 추출물인 것이 보다 바람직하며, 축엽자소로부터 초임계 추출 방법으로 추출물을 획득할 경우 에탄올을 이용한 주정 추출에 비해 이소에고마케톤의 함량이 7배 가량 증가하고, 백출로부터 초임계 추출 방법으로 추출물을 획득할 경우 에탄올을 이용한 주정 추출에 비해 아트락틸레노라이드의 함량 역시 현저하게 증가한다. 즉, 초임계 추출을 이용하는 경우 에탄올을 이용한 주정 추출과 상이한 조성의 추출물이 획득될 수 있으며, 그 결과 가시오가피 추출물 등의 추가 없이도 현저한 항염 효과를 획득할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 식물의 추출 복합물을 포함하는 항염 조성물의 제조 방법은 축엽자소 및 백출 추출물을 포함하는 식물의 추출물을 각각 획득하는 단계; 및
각각 획득된 식물의 추출물을 혼합하여 추출 복합물을 제조하는 단계를 포함하여 수행된다.
상기 식물의 추출물을 각각 획득하는 단계는 각 식물을 동결건조 하는 단계; 동결건조된 식물을 분말화 하는 단계; 및 상기 동결건조된 식물을 독립적으로 에탄올 용매에 현탁한 후 추출하는 단계를 포함하여 수행될 수 있으며, 이때 상기 식물의 추출물은 가시오가피 추출물을 추가로 포함할 수도 있다.
이때, 상기 동결건조하는 단계 수행 전에 오염물질의 제거를 위하여 축엽자소, 백출, 가시오가피 등을 각각 수세하는 단계를 추가로 포함하여, 상기 동결건조 하는 단계는 축엽자소, 백출 및 가시오가피를 각각 수세하는 단계에 후속적으로 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 동결건조 단계의 수행은 당해 기술분야에서 수행되는 통상적인 조건 하에서 수행될 수 있으며, 동결건조 단계는 건조 효율이 우수하고 잔류 용매가 없어 바람직하다.
상기 추출하는 단계는 동결건조된 식물을 분말화 하여 수행되는 것이 바람직하다. 상기 동결건조된 식물을 분말화 하는 경우에는 잔류 용매가 없고 향후 정량 측정이 용이한 장점이 있다.
나아가, 상기 식물의 추출물을 각각 획득하는 단계는 각 식물을 초임계 추출하여 수행될 수 있으며, 이 경우 보다 향상된 항염증 효과를 갖는 항염 조성물을 획득할 수 있다.
한편, 본 발명에 의하면 축엽자소 추출물 및 백출 추출물을 포함하는 식물의 추출 복합물을 포함하는 염증성 질환 치료용 약학 조성물이 제공된다.
상기 식물의 추출 복합물은 각 식물의 주정 추출물을 포함할 수 있고, 이때 상기 식물의 추출 복합물은 가시오가피 추출물을 추가로 포함할 수 있다. 한편, 상기 식물의 추출 복합물은 각 식물의 초임계 추출물을 포함할 수 있으며, 이 때 보다 현저하게 증가된 항염 효과를 갖는 염증성 질환 치료용 약학 조성물을 획득할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 염증성 질환은 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 알레르기 비염, 피부염, 관절염, 알레르기 및 염증성 장질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이며, 특히 상기 관절염은 류마티스 관절염인 것이다.
나아가, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 염증성 질환 치료용 약학 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구 제형, 멸균 주사 용액의 형태 등 다양한 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 경구 투여하거나 정맥 내, 복강 내, 피하, 직장, 국소 투여 등을 포함한 다양한 경로를 통해 투여될 수 있다.
이러한 염증성 질환 치료용 약학 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 비정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다.
또한, 상기 염증성 질환 치료용 약학 조성물은 충전제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 염증성 질환 치료용 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제형화 할 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
경구용 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 주사제의 기제로는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제 및 방부제와 같은 종래의 첨가제를 포함할 수 있다.
이와 같은 본 발명의 조성물을 환자에게 투여함으로써 염증성 질환에 있어서, 염증의 진행 및 심화를 억제 및 개선하여 염증성 질환을 예방 및 치료할 수 있으며, 본 발명의 염증성 질환 치료용 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 화합물의 약제학적으로 유효한 양은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 ㎏당 1 내지 50 mg, 바람직하게는 1 내지 10 mg을 매일 또는 격일로 투여하거나 1일 1 내지 3 회로 나누어 투여할 수 있다.
그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 아이소에고마 케톤( IK ) 함량이 증가된 축엽자소의 제조
본 발명의 축엽자소 추출물은 축엽자소 추출물 1g 당 10mg 이상의 아이소에고마 케톤(IK, isoegoma ketone) 함량을 가지며, 100 mg/mL 이상의 IK 농도를 갖는 축엽자소로부터 획득한다. 이와 같은 높은 함량의 IK를 갖는 축엽자소는 하기와 같은 구체적인 품종 육성 과정에 의해 획득하였다.
1995 년 축엽자소 종자에 200 Gy의 감마선을 조사하여 2000개의 종자를 채종하였다. M1 세대 2000주에서 채종한 종자를 파종 육묘하여, M3 세대에서 150주를 계통화하여 계통명을 부여하였다. M9 세대에서 생육이 우수한 것을 기준으로 선발된 150 계통의 균일성과 안정성을 검정하기 위해 1본씩 30주씩 재배하여 농경 형질이 우수한 6계통을 선발하였고, 선발된 6계통의 성분분석을 통해 항염증에 탁월한 효과를 가지는 이소에고마케톤 (isoegoma ketone)의 함량이 증대된 CJ-29A 계통을 선발 하였다. 이때, 기본적으로 생육이 우수한 계통을 선발하였고 선발된 계통을 이용해 항염증 생리활성을 측정한 결과 CJ-29A 계통이 가장 높은 활성을 보였으며 대사체 분석을 통해 아이소에고마케톤이 증가하였음을 규명하였다. 그 후 CJ-29A 계통에 “안티스페릴” 명칭을 부여하고 한국원자력연구원 첨단방사선연구소 육종시험장에서 수량검정 및 지역적응 시험을 실시하였다. 도 1은 상기 “안티스페릴”의 육성 경과를 도식적으로 나타낸 것이다.
이와 같이 획득한 안티스페릴(Antisperill)은 2016.8.17일에 한국생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTK)에 기탁하였으며, KCTC 13077BP의 기탁번호를 부여 받았다.
2. 추출 복합물의 제조
제조예 1
(1) 축엽자소 주정 추출물의 제조
상기 1.에서 획득한 축엽자소 잎을 약 45에서 건조하여 분말화 한 후 건조된 축엽자소 분말 시료 10g을 발효 주정(100% 에탄올) 100mL를 이용하여 45℃에서 100rpm으로 6 시간 동안 교반 추출법을 이용하여 추출 장치(제품명:SI-600R, 제조사: JeioTech))에서 추출하였다.
이렇게 획득된 추출물을 필터 페이퍼(filter paper)로 여과하고, 회전식 진공 농축기(제품명: N-1100, 제조사: EYELA)를 사용하여 농축한 후 고효율 원심 농축기(제품명: HT-4X, 제조사: GeneVac)를 이용하여 용매를 모두 제거하여 축엽자소 추출물을 획득하였다.
(2) 백출 추출물 및/또는 가시오가피 주정 추출물의 제조
약 45에서 건조하여 분말화 한 가시오가피 및 백출 시료를 각각 10g씩 발효 주정(100% 에탄올) 100mL를 이용하여 60℃에서 100rpm으로 6 시간 동안 교반 추출법을 이용하여 추출하였다(제품명:SI-600R, 제조사: JeioTech).
이렇게 획득된 가시오가피 추출물 및 백출 추출물을 각각 필터 페이퍼(filter paper)로 여과하고, 회전식 진공 농축기(제품명: N-1100, 제조사: EYELA)를 사용하여 농축한 후 고효율 원심 농축기(제품명: HT-4X, 제조사: GeneVac)를 이용하여 용매를 모두 제거하여 가시오가피 추출물 및 백출 추출물 각각을 획득하였다.
제조예 2
축엽자소, 가시오가피 및 백출 추출 시 용매로써 70%에탄올을 이용한 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 공정에 의해 축엽자소, 가시오가피 및 백출의 추출물을 각각 획득하였다.
제조예 3
(1) 축엽자소 초임계 추출물의 제조
상기 1.에서 획득한 “안티스페릴” 축엽자소 잎을 수확하여 건조기에서 50℃, 24시간 동안 건조한 뒤 파쇄하여 분말 형태로 제작하였다. 제작된 축엽자소 분말 200g을 이용해 초임계 유체 추출 장비(supercritical fluid extraction, 일신오토클래이브, ISA-SEFE-0500-0700-080)를 사용하여 하기 표 1과 같은 구체적인 추출 조건으로 추출을 진행하였다.
추출조(Extractor) 보조용매유량(ml/min) 분리조(Separator) CO2 유량(ml/min) 냉각기(℃) 유지시간(Run-time, min)
압력(bar) 온도(℃) 압력(bar) 온도(℃)
400 50 - 40 40 550/12 1 180
추출 공정은 10분간 등압, 10 분간 퍼징, 10 분간 가압, 180분간 400 bar 압력에서 추출 유지 후 20분간 감압으로 도 2와 같이 진행하였다. 이렇게 획득된 초임계 추출물에서 수분을 제거한 뒤 최종 추출물을 얻었다.
(2) 백출 추출물의 제조
건조된 식품용 백출을 구입한 뒤 파쇄하여 분말 형태로 제작하였다. 제작된 백출 분말 200g을 이용해 초임계 유체 추출 장비(supercritical fluid extraction, 일신오토클래이브, ISA-SEFE-0500-0700-080)를 사용하여 상기 (1)과 동일한 조건으로 추출을 진행하였다. 이렇게 획득된 초임계 추출물에서 수분을 제거한 뒤 최종 추출물을 얻었다.
비교제조예 1
축엽자소, 가시오가피 및 백출 추출 시 용매를 물을 이용한 것을 제외하고는 제조예 1과 동일한 공정에 의해 축엽자소, 가시오가피 및 백출의 추출물을 각각 획득하였다.
(3) 추출 복합물의 제조
실시예 1
상기 제조예 1에서 각각 획득한 백출, 안티스페릴 및 가시오가피 추출물을 1:1:1의 중량비로 혼합하여 본 발명의 추출 복합물을 제조하였다.
실시예 2
상기 제조예 1에서 각각 획득한 백출, 안티스페릴 및 가시오가피 추출물을 2:1:1의 중량비로 혼합하여 본 발명의 추출 복합물을 제조하였다.
실시예 3
상기 제조예 1에서 각각 획득한 백출, 안티스페릴 및 가시오가피 추출물을 1:2:1의 중량비로 혼합하여 본 발명의 추출 복합물을 제조하였다.
실시예 4
상기 제조예 1에서 각각 획득한 백출, 안티스페릴 및 가시오가피 추출물을 2:2:1의 중량비로 혼합하여 본 발명의 추출 복합물을 제조하였다.
실시예 5
상기 제조예 1에서 각각 획득한 백출, 안티스페릴 및 가시오가피 추출물을 1:1:2의 중량비로 혼합하여 본 발명의 추출 복합물을 제조하였다.
실시예 6
상기 제조예 3에서 각각 획득한 백출 및 안티스페릴 추출물을 1:1의 중량비로 혼합하여 본 발명의 추출 복합물을 제조하였다.
3. 축엽자소 추출물 내 이소에고마케톤의 정량 분석
상기 제조예 1의 (1)에서 획득된 축엽자소와 일반 출엽자소 추출물 내 이소에고마케톤 (isoegoma ketone)의 분석을 위하여 HPLC(Agilent Technologies)를 사용하였다. 상기 정량 분석을 위한 운전 조건은 하기 표 2와 같다.
컬럼 ZORBAX eclipse XDB-C18
검출 254 nm (DAD1)
유속 1 mL/분
온도 27 ℃
용매 A 5% 아세트산(물)
용매 B 5% 아세트산 (아세토나이트릴)
구배(gradient) 시간 B(%)
0 10
40 30
42 100
45 100
47 10
60 10
상기 제조예 1의 (1)에서 획득된 축엽자소와 일반 축엽소 추출물 내 이소에고마케톤 (isoegoma ketone)의 분석 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
품종 수확시기 IK 농도(mg/mL) IK(mg)/추출물(g)
안티스페릴 7월 23일 212.74 21.27
203.20 20.87
216.16 21.98
8월 26일 102.71 10.27
102.58 10.26
106.55 10.65
9월 23일 215.53 21.55
236.92 23.69
232.93 23.29
야생 축엽자소 7월 23일 26.60 2.66
20.96 2.09
21.03 2.10
8월 26일 73.30 7.33
73.85 7.39
71.21 7.12
9월 23일 6.37 0.64
6.36 0.64
6.48 0.65
상기 표 3에서 확인할 수 있는 바와 같이 제조예 1의 (1)에서 획득된 축엽자소의 경우에는 IK(isoegoma ketone) 가 축엽자소 추출물 1g 당 10mg 이상이며, 농도가 100 mg/mL 이상이며, 일반 야생 축엽자소에 비하여 이소에고마케톤 (isoegoma ketone) 함량이 최대 40배 가량 증가한 것을 확인할 수 있었다.
4. 추출 방식에 따른 추출물 내 유효 성분의 정량 분석
(1) 축엽자소 추출물
상기 제조예 3의 (1)에서 획득된 축엽자소 초임계 추출물 1mg에 메탄올 1ml을 취해 0.45μm 필터로 여과 한 것을 HPLC(Agilent technology)를 사용하여 분석하였다. 상기 정량 분석을 위한 운전 조건은 하기 표 4와 같다.
컬럼 YMC-Triart C18 250x4.6mm, S-5um, 12nm
검출 254 nm
유속 1 ml/min
온도 25 ℃
용매 A 물
용매 B 아세토니트릴
구배(gradient) Time(min) B(%)
0 45
30 55
그 결과 축엽자소로부터 초임계 추출 방법으로 추출물을 획득할 경우, 하기 표 5에 나타난 바와 같이 일반적인 주정 추출에 비해 이소에고마케톤의 함량이 7배 가량 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
　 주정 추출(제조예 1) 초임계 추출(제조예 3)
축엽자소 내 이소에고마케톤의 함량 9-10mg/g 75-76mg/g
(2) 백출 추출물
상기 제조예 3의 (2)에서 획득된 백출로부터 초임계 추출 방법으로 추출물을 획득할 경우 일반적인 주정 추출에 비해 하기 표 6에 나타난 바와 같이 아트락틸레노라이드의 함량이 2배 가량 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
　 주정추출(제조예 1) 초임계 추출(제조예 3)
백출 내 아트락틸레노라이드의 함량 3-4 mg/g 8.2~8.5 mg/g
5. 추출 복합물의 세포 독성 실험
마우스 염증 세포인 RAW264.7 세포를 96 웰(well)에 2.0×105 cell/ml 농도로 37℃, 5% CO2 환경에서 24시간 배양한 뒤 실시예 1 내지 5로부터 획득한 각각의 추출 복합물을 50 μg/ml 농도로 처리하였다. 이후 24시간 동안 추가 배양한 뒤 EZ-Cytox(대일랩서비스) 키트를 이용해 세포 독성 정도를 측정하였다.
각각의 추출 복합물의 독성 정도를 측정한 결과를 도 3에 나타내었으며, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이 백출 추출물, 축엽자소 추출물 및 가시오가피 추출물을 각각 혼합한 추출 복합물은 무처리 대조구에 비하여 수용가능한 정도의 독성을 나타내었으며, 특히 각각의 추출물을 동일한 중량비로 혼합한 실시예 1의 추출 복합물의 경우 다른 혼합 비율에 비하여 독성이 10% 이상 현저하게 낮은 것을 확인할 수 있었다.
6. 항염증 효능 평가
(1)각 추출물의 항염증 효능 평가
항염증 효능은 염증 반응의 마커 중 하나인 NO(nitric oxide) 생성 여부를 측정하여 평가하였다. 마우스 염증 세포인 RAW264.7 세포를 96 웰(well)에 2.0×105 cell/ml 농도로 37℃, 5% CO2 환경에서 24시간 배양한 뒤 각각의 추출물을 50 μg/ml 농도로 처리하였다. 이후 2시간 동안 배양한 뒤 LPS를 1 μg/m농도로 처리한 후 18시간 동안 추가 배양한 뒤 그리스 시약(Griess reagent)을 이용해 NO 생성량을 측정하였다.
이때 상기 실험은 제조예 1, 제조예 2 및 비교제조예 1로부터 획득한 각각의 백출 추출물, 축엽자소 추출물 및 가시오가피 추출물에 대하여 수행하였고, 또한 제조예 3의 백출 추출물 및 축엽자소 추출물 각각에 대해 수행하였다.
각 추출물을 처리한 경우의 NO 생성량을 측정한 결과를 도 4에 나타내었으며, 도 4(a)에서 확인할 수 있는 바와 같이 백출 추출물, 축엽자소 추출물 및 가시오가피 추출물은 모두 제조예 1 및 2와 같이 에탄올 용매를 사용하는 경우가 비교제조예 1과 같이 물을 사용하는 경우에 비하여 현저한 항염 효과를 획득할 수 있는 것을 확인할 수 있었고, 나아가 제조예 2의 70% 에탄올에 비해 제조예 1의 100% 에탄올을 용매로 사용하는 경우 보다 효과적인 항염 효과를 획득할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
나아가, 도 4(b)에서 확인할 수 있는 바와 같이 제조예 3과 같이 초임계 추출에 의해 추출물을 획득하는 경우 더욱 현저한 항염 효과를 획득할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
이때 도 4에서 음성 대조구는 어떠한 추출물도 처리하지 않은 RAW264.7 세포를 사용하였고, 양성 대조구는 LPS를 처리한 RAW 264.7 세포를 사용하였다.
(2) 복합 추출물의 항염증 효능평가
항염증 효능은 염증 반응의 마커 중 하나인 NO(nitric oxide) 생성여부를 측정하여 평가하였다. 마우스 염증 세포인 RAW264.7 세포를 96 웰(well)에 2.0×105 cell/ml 농도로 37℃, 5% CO2 환경에서 24시간 배양한 뒤 실시예 1의 추출 복합물을 50 μg/ml 농도로 처리하였다. 이후 2시간 동안 배양한 뒤 LPS를 1 μg/m농도로 처리한 후 18시간 동안 추가 배양한 뒤 그리스 시약(Griess reagent)을 이용해 NO 생성량을 측정하였다.
실시예 1의 추출 복합물의 NO 생성량을 측정한 결과를 도 5에 나타내었으며, 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이 백출 추출물, 축엽자소 추출물 및 가시오가피 추출물을 혼합한 본 발명의 추출 복합물의 경우 본 발명의 추출 복합물을 처리하지 않은 대조구에 비하여 현저한 항염 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이때 도 4에서 음성 대조구는 어떠한 추출물도 처리하지 않은 RAW264.7 세포를 사용하였고, 양성 대조구는 LPS를 처리한 RAW 264.7 세포를 사용하였다. 본 발명의 실시예 1 추출물을 처리할 경우 양성 대조구에 비해 염증 효과가 감소하는지 여부를 확인할 수 있었다.
7. 관절염에 대한 효능 평가
(1) 관절염 동물 모델 제작
본 발명의 추출 복합물의 항염증 효능을 동물 모델에서 검증하기 위하여 관절염 동물 모델을 제작하였다.
이때, 상기 관절염 동물 모델은 Balb/c 마우스에 ArthritoMab 항체 칵테일(antibody cocktail, mabioscience사)을 IP로 2mg 주입한 뒤 3일 뒤에 LPS을 IP(복강투여)로 50ug 주입하여 제작하였다.
(2)관절염 동물 모델에 대한 효능 평가
상기 (1)에서 획득된 마우스 모델을 이용하여 마우스에 LPS를 주입한 날부터 매일 본 발명의 실시예 1 및 실시예 6의 추출 복합물을 25 내지 100 mg/kg의 투여량으로 경구 투여하여 관절부위의 두께, 부피 정도를 측정하였다.
도 6(a)은 매일 본 발명 실시예 1의 추출 복합물을 25 내지 100 mg/kg의 투여량으로 경구 투여한 경우 7일째 되는 날에 확인한 실제 관절염 마우스 모델의 뒷다리 변화를 나타낸 것이다.
도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명의 추출 복합물은 투여량 의존적으로 관절염 치료 효과가 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 7일 후 가시적인 효과가 획득되는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 도 6(b)는 축엽자소와 백출의 초임계 추출물을 1:1 의 비율로 혼합한 실시예 6의 추출 복합물을 매일 각각 66.5, 및 133.0 mg/Kg 의 농도로 경구 투여하여 6일 째 관절 부위의 두께, 부피 정도를 측정한 것이다.
도 6 (b)에서 확인할 수 있는 바와 같이 역시 추출 복합물은 투여량 의존적으로 관절염 치료 효과가 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 나아가 주정 추출복합물의 경우 관절염을 완화시키는 효과가 농도 의존적으로 보이지만 초임계 추출복 합물에 비해서는 효과가 떨어지는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 도 7(a) 내지 도 7(c)에서는 각각 관절염 마우스 모델에 본 발명 실시예 1의 추출 복합물을 25 내지 100 mg/kg의 투여량으로 경구 투여한 경우 6일째 되는 날에 확인한 관절염 수치 변화(a), 뒷다리 부종 두께 변화(b) 및 뒷다리 부종 부피 변화(c)를 나타낸 것이다.
도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명의 추출 복합물은 투여량 의존적으로 관절염 치료 효과가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
나아가, 도 8(a) 내지 도 8(c)에서는 각각 관절염 마우스 모델(CAIA)에 본 발명 실시예 6의 추출 복합물을 66.5 및 133.0 mg/kg의 투여량으로 경구 투여한 경우 7일째 되는 날까지 확인한 관절염 수치 변화(a), 뒷다리 부종 두께 변화(b) 및 뒷다리 부종 부피 변화(c)를 나타낸 것이다.
도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명의 추출 복합물은 특히 초임계 추출에의해 획득된 복합 추출물을 사용하는 경우 관절염 치료 효과가 현저하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.
기탁기관명 : 한국생명공학연구원
수탁번호 : KCTC13077BP
수탁일자 : 2016817
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Figure PCTKR2017010338-appb-I000002

Claims (20)

  1. 축엽자소 추출물 및 백출 추출물을 포함하는 식물의 추출 복합물을 포함하는 항염 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 축엽자소 추출물은 아이소에고마 케톤(IK, isoegoma ketone) 또는 이의 염을 유효 성분으로 함유하는 항염 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 축엽자소는 안티스페릴(Antisperill, KCTC 13077BP)인, 항염 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 축엽자소 추출물은 추출물 1g 당 10mg 내지 30mg의 아이소에고마 케톤(IK, isoegoma ketone) 함량을 가지며, 100 mg/mL 내지 300 mg/mL의 IK 아이소에고마 케톤 농도를 갖는 항염 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 축엽자소 추출물 및 백출 추출물은 각각 에탄올 용매에 의한주정 추출에 의해 획득되는 추출물인 항염 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 축엽자소 추출물 및 백출 추출물은 각각 초임계 추출에 의해 획득되는 추출물인 항염 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 식물의 추출 복합물은 가시오가피의 에탄올 용매에 의한 주정 추출물을 추가로 포함하는 항염 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 식물의 추출 복합물은 축엽자소 추출물, 백출 추출물 및 가시오가피 추출물 중 어느 하나의 추출물 1 중량부 당 다른 두 추출물의 중량이 1중량부 내지 2 중량부로 혼합된 항염 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 식물의 추출 복합물은 축엽자소 추출물, 백출 추출물 및 가시오가피 추출물이 1:1:1의 중량비로 혼합된 항염 조성물.
  10. 축엽자소 및 백출 추출물을 포함하는 식물의 추출물을 각각 획득하는 단계; 및
    각각 획득된 식물의 추출물을 혼합하여 추출 복합물을 제조하는 단계
    를 포함하는, 식물의 추출 복합물을 포함하는 항염 조성물의 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 축엽자소는 안티스페릴(Antisperill, KCTC 13077BP)인, 항염 조성물의 제조방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 식물의 추출물을 각각 획득하는 단계는 각 식물을 동결건조 하는 단계; 동결건조된 식물을 분말화 하는 단계; 및 상기 동결건조된 식물을 독립적으로 에탄올 용매에 현탁한 후 추출하는 단계를 포함하여 수행되는, 식물의 추출 복합물을 포함하는 항염 조성물의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 식물의 추출물은 가시오가피 추출물을 추가로 포함하는 항염 조성물의 제조방법.
  14. 제10항에 있어서, 상기 식물의 추출물을 각각 획득하는 단계는 각 식물을 초임계 추출하여 수행되는 항염 조성물의 제조방법.
  15. 축엽자소 추출물 및 백출 추출물을 포함하는 식물의 추출 복합물을 포함하는 염증성 질환 치료용 약학 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 축엽자소는 안티스페릴(Antisperill, KCTC 13077BP)인, 염증성 질환 치료용 약학 조성물.
  17. 제15항에 있어서, 상기 식물의 추출 복합물은 가시오가피 추출물을 추가로 포함하는 염증성 질환 치료용 약학 조성물.
  18. 제15항에 있어서, 상기 염증성 질환은 천식, 만성폐쇄성폐질환(COPD), 알레르기 비염, 피부염, 관절염, 알레르기 및 염증성 장질환으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 염증성 질환 치료용 약학 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 관절염은 류마티스 관절염인 염증성 질환 치료용 약학적 조성물.
  20. 제15항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 더 포함하는 염증성 질환 치료용 약학적 조성물.
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