WO2010019016A2

WO2010019016A2 - 산삼 또는 인삼을 포함한 인삼류의 형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: WO2010019016A2
Application number: PCT/KR2009/004563
Authority: WO
Inventors: 진영우; 이은경; 임민정; 김영미; 홍선미; 장미옥; 구인숙; 최금이
Original assignee: 주식회사 운화바이오텍
Priority date: 2008-08-14
Filing date: 2009-08-14
Publication date: 2010-02-18
Also published as: EP2335712A4; US20120189660A1; US9289457B2; CA2734101A1; JP2011530583A; US20130202631A1; EP2335712A2; KR20100021369A; KR101179171B1; RU2011109257A; CN102316883B; WO2010019016A3; CN102316883A; AU2009280402A1

Abstract

본 발명은 산삼 또는 인삼을 포함하는 인삼류(Panax ginseng)의 형성층 유래 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물은 기존 간질환 치료제의 부작용을 최소화하여 인체에 안전하면서도, 간염 바이러스에 대한 s 항체 (HBsAb) 및 e 항체(HBeAb)를 증가시키는 효과가 있으며, 간염 바이러스의 증식을 억제할 수 있으므로, 간질환의 예방 및 치료에 유용하다. 아울러, 간손상 수치를 감소시키는 효과가 있는바, 간기능 개선용 기능성 식품으로서 유용하다.

Description

산삼 또는 인삼을 포함한 인삼류의 형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물

본 발명은 산삼 또는 인삼을 포함하는 인삼류의 형성층 유래 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

현대인은 과도한 스트레스와 음주, 흡연 및 각종 공해에 의한 환경오염, 바이러스 등을 원인으로 하여 다양한 간질환의 위험에 노출되어 있다. 대표적인 간질환으로는 간경화증, 알콜성 간경변, 지방간, 중독성 간질환, 급·만성 간염 등이 있다. 이 중 간염은 전 세계적으로 만연해 있는 심각한 질병으로 정도는 약하지만 전염성이 있기도 하다. 의료계는 간경변과 간암 환자 중 70%~80%가 만성간염의 악화로 인한 것으로 추정하고 있다.

특히 B형 간염 바이러스(HBV)는 인체에 특이적으로 감염되는 헤파드나비리대(Hepadnavirdae) 계통의 바이러스로서 잠복기는 60 내지 110 일 정도이며, 다양한 정도의 임상기를 거쳐 90 내지 95%는 완전히 회복된다. 그러나, 감염에서 회복되지 않는 환자의 경우에는, HBV DNA가 사람 간세포의 게놈 DNA에 동화되어 만성 활동성 간염, 간경병증, 간암 등으로 발전하게 된다. HBV 에 의한 만성간염은 다른 질환과 마찬가지로 만성 바이러스 감염증, 임파종 질환 및 만성 신장장애를 일으킨다. 따라서 만성간염은 더욱 강력한 형태의 질환으로 발전하여 결국 환자를 사망에까지 이르게 하는 치사율이 매우 높은 질환이라 할 수 있다.

이러한 이유로 간염 바이러스를 치료하기 위하여, 인터페론, 핵산 유도체 또는 면역 조절물질 등 여러 방법이 시도되었으나, 치료효과가 있는 것으로 보고된 인터페론-α는 지속적인 억제효과를 보이지는 못하였으며, 모자간의 수직감염에 의한 환자 등의 경우 인터페론-α에 내성을 나타내어 효과가 낮았다. 또한, 아직까지 간염을 완치시킬 수 있는 약은 아직 개발되지 않고, 다만 항바이러스제를 꾸준히 복용하여 심각한 간질환으로 발전하는 것을 막고 있는 실정이다. 그러나, 항바이러스제는 바이러스의 돌연변이를 일으켜 약에 대한 내성을 유도하여 약의 효능을 무력화시키는 것으로 보고되어 있다.

이에 현재까지의 간염치료는 바이러스의 증식을 억제하여 심각한 간질환으로 진행을 억제하는 방법으로 소극적인 치료에 그치고, 항체형성과 같은 직접적인 치료 방법은 없었는바, 새로운 간염의 예방 및 치료방법의 개발이 요구되었다.

이에 본 발명자들은 간염을 포함한 간질환의 예방 및 치료 효과가 우수한 천연물 유래 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 산삼 및 인삼을 포함한 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물이 간질환의 예방 및 치료에 우수한 효과를 가진다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 기존 간질환 치료제의 부작용을 최소화한 간질환의 예방 및 치료 활성을 나타내는 천연물 유래 조성물을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인삼류(Panax ginseng)의 형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다:

(a) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임;

(b) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임; 및

(c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.

본 발명은 또한, 상기 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 간기능 개선용 기능성 식품을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 간염 바이러스의 증식 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 간염 바이러스에 대한 항체를 증가시키는 면역 증진제를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상의 간질환의 예방 또는 치료용 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 적용하는 단계를 포함하는 간질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명의 다른 특징 및 구현예는 다음의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 명백해 질 것이다.

도 1에서 (a)는 본 발명에 따른 동질적인 세포주의 유도과정을 나타내는 사진((a)의 A 내지 D)이고, (b)는 산삼의 형성층 유래 동질적인 세포주(A) 및 인삼의 자엽 유래 캘러스 세포주(B)를 광학현미경 하에서 단세포 수준으로 관찰한 사진이다.

도 2는 본 발명에 따른 동질적인 세포주 및 산삼배양근의 간염 바이러스 억제 효과를 비교관찰한 전기영동 사진이다 (M: 1kb ladder marker; C: 대조군; G4: 본 발명에 따른 동질적인 세포주의 PBS 추출물; G5: 산삼배양근 PBS 추출물).

도 3은 본 발명에 따른 동질적인 세포주의 간염 바이러스 억제효과를 시간별로 관찰한 결과의 전기영동 사진이다 (M: 1kb ladder marker; C: 대조군; G4: 본 발명에 따른 동질적인 세포주의 PBS 추출물).

발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

본원에서 “형성층(cambium)”이란 부름켜라고도 하는 것으로 식물의 줄기와 뿌리를 굵어지게 해서 식물이 부피생장을 할 수 있도록 하는 조직이다. 형성층은 세포분열이 가장 활발하게 일어나는 분열조직으로써 식물조직배양의 절편체로 사용 시 세포의 고속 및 대량생산이 가능하다고 보고되어 있다 (대한민국 등록특허 제0533120호).

본원에서 “파쇄물”이란 세포를 detergent 등을 이용한 화학적 방법 또는 물리적 방법 등으로 파쇄하여 얻은 세포 용해물을 의미하며, 세포주의 “추출물”이란 세포를 용매에 녹여 분리한 물질로, 증류 또는 증발을 이용하여 농축될 수 있다. 추가적으로 본원에서 “배양물”이란 배양된 세포주 및/또는 배양액을 포함하는 물질로서, 이때 배양된 세포주는 배양조건에 의하여 분화되거나 유용물질의 생산능 및/또는 분비능이 향상된 세포주를 모두 포함하는 개념이다.

본원에서 “선천적인 미분화 상태(innately undifferentiated)”란 탈분화 과정을 거쳐 미분화 상태로 존재하는 것이 아닌, 본래부터 분화 전 상태를 유지하는 것을 말한다.

본 발명은 일 관점에서, 인삼류(Panax ginseng)의 형성층 유래 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 인삼류(Panax ginseng)는 산삼 또는 인삼을 포함하며 (Lian M.L. et al., J. Plant Biology, 45: 201, 2002; Han J.Y. et al., J. Plant Biology, 49:26, 2006; Teng W.L. et al., Tissue and Organ Culture, 68:233, 2002), 이때, 본 발명에서 상기 산삼 또는 인삼은 노지삼 또는 조직배양삼류(부정근 및 부정근 유래 세포주)를 포함한다.

본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 세포주는 (a) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임; (b) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임; 및 (c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타내는 것을 특징으로 한다. 또한, 추가적으로 (a) 현탁배양 시 단세포 수준으로 존재함; (b) 인삼류의 형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐; 및 (c) 인삼류의 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 동질적인 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 수득된 것임을 특징으로 할 수 있다:

(a) 인삼류의 형성층 함유 조직을 수득하는 단계;

(b) 상기 수득된 형성층 함유 조직을 IAA(Indole-3-acetic acid) 또는 IBA(Indole-3-butyric acid)를 포함하는 배지에서 배양하여 형성층 유래 세포주를 유도하는 단계,

이때, 상기 배양의 수행 중 또는 배양 전단계 또는 후단계에서 상기 형성층 함유 저장근 조직에 삼투 스트레스를 가하는 것을 특징으로 함; 및

(c) 상기 유도된 형성층 유래 세포주를 회수하는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 세포주는 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 피콜로람 (picloram) 및 IBA (Indole-3-butyric acid) 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 증식하는 단계를 추가로 수행하여 수득된 것임을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 상기 배양물은, 상기 세포주를 엘리시터로서 3~5중량%의 원당 또는 설탕; 또는 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 키토산, 페닐알라닌(phenylalanin), 벤조익산, ABA, 살리실산(salicylic acid) 및 아세트산 나트륨(sodium acetate) 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 추가로 배양하는 단계를 추가로 수행하여 수득된 것임을 특징으로 할 수 있다. 이때, 바람직하게는 상기 배지는 3~5중량%의 원당 또는 설탕; 및 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 진균류 추출물, 세균류 추출물, 효모(yeast) 추출물, 키토산, 글루코마난(glucomanan), 글루칸(glucan), 페닐알라닌(phenylalanine), 벤조산(benzoic acid), 살리실산(salicylic acid), 아라키돈산(arachonic acid), STS, mevalonalonate N-benzolyglycine, ABA, SNP, IPP, BHT, CCC, 에테폰(ethephon), 히푸익산(hippuic acid), 암모니움 세릭 니트레이트(amminoium ceric nitrate), AgNO₃, 바나딜 설페이트(vanadyl sulfate), p-아미노벤조익산(p-aminobenzoic acid), 브라시노스테로이드(brassinosteroids), 소디움 알지네이트(sodium alginate), 아세트산 나트륨 (sodium acteate)로 구성되는 군에서 선택된 물질;을 포함하는 배지임을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 또한, 상기 세포주에 엘리시터로서 광, 광주기, shear, 자외선, 열, 에틸렌, 항진균제, 항생제, 중금속 염 및 높은 염농도 등을 처리하여 물리적 화학적 스트레스를 가하여 수득된 배양물을 이용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 엘리시터로서 에어 스트레스를 가한 세포주 배양물을 이용하였다.

본 발명에서 사용한 배지는 통상의 식물 조직 배양을 위한 배지로써, 일례로 N6배지, SH배지, MS 배지, AA 배지, LS 배지, B5배지, WPM 배지, LP배지, White배지, GD배지, DKW배지, DCR 배지 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 저급알코올 등 알코올, 아세톤, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출된 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, 저급알코올은 메탄올, 에탄올 등 탄소수가 1 내지 5인 알코올을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 간질환은 간염, 간암, 간경변, 간경화증, 지방간 및 중독성 간질환 중 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, 상기 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물, 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 간염 바이러스의 증식 억제용 조성물 또는 간염 바이러스에 대한 항체를 증가시키는 면역 증진제에 관한 것이다.

본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따른 동질적인 세포주 추출물을 in vitro로 HepG2.2.15 세포주에 투여하고 HBV virion 생성여부를 PCR 증폭을 통하여 확인한 결과, 산삼배양근 추출물이 HBV 바이러스 생성억제 효과가 없음에 반하여 본 발명에 따른 세포주 추출물은 HBV 바이러스 생성을 억제하는 것으로 나타났다.

한편, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 상기 동질적인 세포주를 환자에게 투여한 후, HBsAg, HBeAg의 항원과, HBsAb, HBeAb, HBcAb의 항체 및 B형 간염 바이러스 (HBV) DNA 정량검사를 실시하였으며, 그 결과, 임상적으로 B형 간염의 완치로 해석하는 s 항체가 형성됨 및, B형 간염 바이러스의 항원이 감소함을 확인하였다.

B형 간염 바이러스 복제 시 3개(c, s, e 항원)의 주요 항원이 만들어지는데, c(core) 항원 (HBcAg)은 구조적 항원 결정체이며, s (surface) 항원 (HBsAg)은 바이러스 표면 단백질에 의해 나타나는 항원 결정체이다. 이중 e 항원 (HBeAg)은 B형 간염 바이러스 감염여부를 알아내는 표시물질이다.

표 1

즉, 상기 실시예를 통하여 본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주가 간염을 예방하고 치료하는 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주가 s 항체뿐만 아니라, e 항체도 증가시키는 것을 확인하여, 간염 바이러스에 대한 항체를 증가시키는 면역 증진 효과가 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명에서는 상기 동질적인 세포주 파쇄물을 함유하는 조성물이 간질환의 예방 및 치료 효과를 나타냄을 제시하는 구체적인 실시예가 없다 하더라도, 상기에서 살펴본 바와 같이 그 동질적인 세포주, 그 추출물 및 그 배양물이 간질환의 예방 및 치료에 활성을 가지는 것을 확인한바, 본 발명에 따른 동질적인 세포주 파쇄물을 함유한 조성물의 경우에도 간질환의 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다고 할 것이다.

본 발명에 따른 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물, B형 간염 바이러스의 증식 억제용 조성물 및 면역증진제는, 상기 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 각각 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학 조성물로 제공될 수 있으며, 상기 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 또는 그 배양물은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료 기간 등에 따라 적절한 약학적으로 유효한 양으로 약학 조성물에 포함될 수 있다.

상기에서 “약학적으로 허용되는”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리톤, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사 용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

한편, 본 발명의 일 실시예에서는, 또한 본 발명에 따른 동질적인 세포주가 간손상을 나타내는 수치인 AST 및 ALT 수치를 감소시키는 것으로 나타나 간기능 개선 효과가 있음이 확인되었다. 따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 간기능 개선용 기능성 식품에 관한 것이다. 이때, 간기능 개선 효과란 상기 간질환 예방 및 개선효과를 포함하는 개념으로서 전반적인 간기능 자체를 개선시키는 것을 의미한다.

본원에서 ‘기능성 식품’이란, 일반 식품에 본 발명에 따른 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 첨가함으로써 식품의 기능성을 향상시킨 것을 의미한다.

실시예

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 산삼의 형성층 유래 동질적인 세포주, 그 추출물 및 그 배양물의 간질환의 예방 및 억제 효과를 확인하였으나, 그 파쇄물을 사용해서도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.

실시예 1. 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주의 제조

1-1: 식물재료의 준비

(1) 도 1의 (a)의 A는 본 발명에 사용한 산삼의 전형적인 모습을 보여준다. 산삼을 준비한 다음, 산삼의 주근부를 사용하기 위해 흐르는 물로 겉표면에 묻어 있는 흙이나 그 외의 오염물질을 제거하고 액체 세제를 이용하여 주근의 표면을 씻어 준 다음, 흐르는 물에 방치를 하였다. 깨끗하게 씻은 조직은 클린벤치 내에 준비된 멸균된 플라스크에 넣고 70% 에탄올로 30초 내지 1분 정도 살균하였다. 그 후 멸균수로 헹궈 주고 1% 내지 1.5% 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite, Junsei, Japan)을 이용하여 5분 내지 15분 정도로 소독액을 처리하였다. 이때, 소독액이 효과적으로 조직 내로 침투하게 하기 위해 TWEEN 20(Polyoxyethylenesorbitan monolaurate, Junsei, Japan)을 몇 방울 정도 떨어뜨려 처리하였다. 이 과정이 마쳐지면 멸균수로 3회 내지 5회 정도로 헹궈 주었다. 이 후에 살균 처리한 조직의 갈변화를 방지하기 위해 항산화제가 포함된 BIM(browning inhibition medium)에 살균된 주근을 넣고 30분 내지 1시간 정도 진탕배양하고 멸균된 여과지에 놓고 물기를 제거하였다.

사용된 BIM의 조성 및 사용농도는 표 2와 같다.

표 2

여기서, 염농도는 전체의 1/4에 해당하는 양만 첨가한다.

그 후, 상기 재료를 갈변이 되는 것을 방지하기 위해 항산화제가 포함된 CS solution (cutting sloution, 표 3)이 담긴 멸균 접시에 놓고, 겉껍질을 얇게 벗겨 내고 반으로 갈라 각 부분에서 분열능이 왕성한 형성층 부분이 포함되게 해서 가로×세로×높이=0.5~0.7cm×0.5~0.7cm×0.2~0.5mm 의 크기로 절단을 하였다. 도 1의 (a)의 B는 산삼의 주근부에서 형성층이 포함되도록 상기 크기로 절단을 하여 절편체를 제조한 모습이다.

표 3

(2) 생물반응기(bioreactor)에서 유지 중인 100년 된 산삼부정근을 준비하고 역시 표 3의 CS solution이 담긴 멸균접시에 놓고 역시 상기와 동일한 방법으로 형성층을 포함하는 절편체를 수득하였다.

1-2: 산삼 주근부 형성층 포함 절편체에의 삼투제의 처리

실시예 1-1에서 제조된 절편체에서, 분화된 조직 즉, 사부, 목부, 수 등은 괴사시키고 분열조직인 형성층만을 생존시키기 위해 삼투 스트레스를 처리하였다. 상기 형성층 포함 절편체를 여과지가 깔린 전치상 배지(배지 1, 표 4)에 블로팅(blotting)을 하여 1M 수크로오즈(Duchefa, Netherland) 용액이 담긴 플라스크에 넣어 냉장상태에서 16~24시간 동안 삼투스트레스를 처리한 후 0.05M 수크로오즈 용액(sucrose solution)에서 5분간, 0.1M sucrose 용액에서 5분간 처리하여 고농도의 sucrose에 의한 스트레스를 해제하였다. 그 후 상기 삼투 스트레스가 해제된 형성층 포함 절편체를 여과지가 깔린 전치상 배지(배지 1)에 올려서 물기를 제거하였다.

표 4

1-3: 산삼의 형성층 포함 절편체에서 형성층 기원의 동질적인 세포주 유도

형성층 기원의 분열능을 갖는 동질적인 세포주를 유도하기 위하여, 상기 실시예 1-2에서 삼투 스트레스를 처리한 절편체를 세포주 유도 배지 (배지 2, 표 5)에 치상하였다. 치상에 사용된 배지는 하기 <표 5>에 수록된 바와 같다. 치상된 절편체는 22±1℃ 암조건에서 배양하였다.

표 5

이때, 삼투 처리를 하지 않고 바로 동질적인 세포주 유도배지에 치상한 절편체에서는 <표 6>에 수록된 바와 같이 치상 초기(2~3일 내)에 빠르게 형성층 중심으로 노랗게 반응을 보이다가 시간이 지나면서 절편체 전체가 노랗게 변하는 양상을 보였다. 형성층 중심의 노란 반응을 보인 절편체를 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질적인 세포주 분리 및 증식 최적 배지(배지 3)에 계대를 하여 계속적인 동질적인 세포주 유도 및 증식을 시도하였으나 갈변 양상이 심화되었고, 시간이 경과해도 갈변 반응외에 어떤 반응도 보이지 않았다.

반면, 삼투 처리를 하고 해제를 한 후 동질적인 세포주 유도배지에 치상한 절편체는 <표 6>에 기재된 바와 같이, 다른 조직에서는 세포가 유도되지 않고 형성층에서만 특이적으로 동질적인 세포가 유도됨이 관찰되었다. 즉, 삼투 처리를 한 후, 해제를 하여 치상한 절편체에서는 배양 3~7일 사이에 절편체의 형성층 부위가 연노랑색으로 변하기 시작하였다. 이로부터 약 7~14일 후 연노랑색으로 변한 부위에서 동글동글한 세포주가 유도됨을 관찰하였다. 이때, 노지산삼의 형성층 포함 절편체 및 산삼부정근의 형성층 포함 절편체 모두 동일한 결과가 관찰되었다. 도 1의 (a)의 C는 산삼의 형성층 포함 절편체 중 형성층 특이적 분열능을 갖는 동질적인 세포주가 유도된 모습을 나타낸다.

한편, 삼투 처리를 한 절편체를 형성층 특이적 분열능을 갖는 동질적인 세포주 유도배지가 아닌 통상적인 인삼, 산삼 등 인삼류 배양에서 사용하는 2,4-D를 포함하는 배지를 사용하였을 때는 배양 7~10일 사이에 절편체의 전체 부분이 노랑색으로 변하기 시작해서 이로부터 약 7~14일 후 전체 절단면에서 세포가 유도됨이 관찰되었다.

표 6

1-4: 분리된 산삼 형성층 유래 동질적인 세포주의 증식

상기 실시예 1-3에서 유도된 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질적인 세포주를 이용하여 증식에 사용하였다. 배지는 하기 <표 7>에 제시된 기본 염(salt) 조성을 바탕으로 <표 8>에 제시된 대로 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질적인 세포주의 증식 최적 배지를 사용하였다. 이때, <표 8>에서 2,4-D는 노지산삼의 형성층으로부터 유도된 동질적인 세포주의 증식에, IBA는 산삼부정근으로부터 유도된 동질적인 세포주의 증식에 사용하였다.

표 7

표 8

도 1의 (a)의 C에 나타난 바와 같이 삼투 스트레스 처리와 배지 2를 사용하여 형성층에서만 특이적으로 동질적인 세포가 유도된 후, <표 8>에 제시된 배지 3으로 계대한 결과, 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질적인 세포가 계속적으로 분열·증식하여 배양 약 10~20일 후에 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질적인 세포주를 분리할 수 있었다. 이렇게 분리된 산삼 형성층 유래 동질적인 세포주를 동일 배지에서 배양하여 분열능을 갖는 동질적인 세포주를 다시 증식시켰다. 도 1의 (a)의 D는 분리된 형성층 특이적 동질적인 세포주를 <표 8>에 제시된 배지 3에서 증식시킨 모습이다.

1-5: 분리된 세포주의 특성관찰

상기 산삼 형성층 유래 동질적인 세포주를 하기 <표 9>의 액상 배지가 함유된 플라스크에 넣어 암조건에서 25±1℃에서 100rpm의 회전 교반기(shaker)에서 배양하였다. 계대배양 주기는 2주일로 고정함으로써 배양세포가 항상 대수생장기 상태에서 높은 활력을 유지할 수 있도록 하였다. 이때, <표 9>에서 2,4-D는 노지산삼의 형성층으로부터 유도된 동질적인 세포주의 배양에, IBA는 산삼부정근으로부터 유도된 동질적인 세포주의 배양에 사용하였다.

한편, 인삼의 자엽 유래 캘러스(callus)도 <표 9>의 배지 4에서 배양하여 본 발명에 따른 산삼 형성층 유래 동질적인 세포주와 비교하였다.

표 9

먼저 세포 응집정도(biological microscope CX31, Olympus, Japan)를 살펴 볼 때, <표 10>와 같이 본 발명에 따른 2,4-D를 처리한 노지산삼의 형성층 유래 세포주는 현탁배양 시 95%이상의 단세포 수준으로 존재함을 관찰할 수 있었고, 본 발명에 따른 IBA를 처리한 부정근의 형성층 유래 세포주 역시 60%이상이 단세포 수준으로 존재함을 관찰되어, 본 발명에 따른 세포주는 현탁배양 시 단세포 수준으로 존재하는 특징이 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 도 1(b)의 A에 나타난 바와 같이, 2,4-D를 처리한 노지산삼의 형성층 유래 세포주 및 IBA를 처리한 부정근의 형성층 유래 세포주 모두 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 관찰할 수 있었으며, 미분화상태임을 확인할 수 있었다. 그러나, 도 1(b)의 B에 나타난 바와 같이, 인삼의 자엽 유래 캘러스 세포주에서는 이러한 형태학적 특징을 관찰할 수 없었다.

표 10

한편, 대량 배양 가능성을 살펴보기 위하여, 3L의 내용적을 갖는 공기 부양식 생물반응기(airlift bioreactor, 성원사이텍, Korea)에서 인삼의 자엽(cotyledon) 유래 캘러스와 본 발명에 따른 산삼의 형성층 유래 동질적인 세포를 배양하였다. 배지는 <표 8>의 액상배지를 사용하였고, 암조건에서 25±1℃로 일정하게 유지하였다.

그 결과, <표 11>에 나타난 바와 같이, 인삼의 자엽(cotyledon) 유래 배양물의 배가시간(doubling time)은 플라스크에서는 21일인데 반해 반응기(reactor)에서는 28일로 길어졌다. 즉, 플라스크에서 배양 시 본 발명에 따른 형성층 유래 동질적인 세포주가 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도에서도 3~5배 정도의 높은 증식율을 보임을 확인하였으며, 대량 반응기에서는 본 발명에 따른 형성층 유래 동질적인 세포주가 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 5~9배의 높은 증식율을 보임을 확인하였다. 이것은 반응기 내에서의 생장고리 생성과 배양중의 식물 배양체 응집성과 세포벽이 단단하여 전단에 대한 민감성으로 세포 생존율(cell viability)이 급격히 감소한 것이 원인인 것으로 판단되었다.

한편, 본 발명에 따른 2,4-D를 처리한 노지산삼의 형성층 유래 동질적인 세포 배양물의 배가시간은 3~4일로, IBA를 처리한 산삼부정근의 형성층 유래 동질적인 세포 배양물의 배가시간은 5~6일로, 모두 플라스크와 반응기 사이에 차이가 없거나 오히려 단축되었다. 형성층 유래 동질적인 세포 배양물은 생물반응기 내의 생장고리 면적을 아주 작게 형성하고, 배양기에 간단한 자극을 주어 배지를 움직여주면 내벽의 링(ring)이 간단하게 해소되었다. 또한 응집이 작고, 많은 액포(vacuole)를 가지고 있어 전단에 대한 민감성이 약하여 세포 생존율(cell viability)의 감소를 가져오지 않았다.

즉, 본 발명에 따른 형성층 유래 동질적인 세포주는 대량배양을 위한 생물 반응기에서 교반작용에 따른 전단 스트레스에 대하여 낮은 민감성을 가지므로, 생물반응기 내에서 급속 대량 생장이 가능함을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 형성층 유래 동질적인 세포주가 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 전단스트레스에 대하여 5~9배의 낮은 민감성을 가짐을 알 수 있었다.

표 11

실시예 2: 산삼의 형성층 유래 동질적인 세포주의 건조 및 추출물 제조

실시예 1의 산삼부정근의 형성층 유래 동질적인 세포주로부터 다음과 같이 건조 및 추출하였다.

(1) 건조 세포주의 제조

(i) 배양액을 제거시킨 세포주를 동결건조 또는 열풍건조 하였다.

(ii) 상기 건조된 세포주는 분쇄기를 이용하여 분쇄하여 얻었다.

(2) 증류수 추출물의 제조

(i) 배양액을 제거시킨 세포주 및 열풍건조, 동결건조 세포주 500g에 5000ml의 증류수를 가하여 50℃에서 6시간 교반시키면서 추출하여 얻었다.

(ii) 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리시켜 상층액을 취함으로써 증류수 가용성물질을 얻었다.

(iii) 상기에서 얻은 증류수 가용성물질을 회전진공농축기를 이용하여 감압 농축하였다.

(3) 에탄올 추출물의 제조

(i) 배양액을 제거시킨 세포주 및 열풍건조, 동결건조 세포주 500g에 5000ml의 에탄올를 가하여 50℃에서 6시간 교반시키면서 추출하여 얻었다.

(ii) 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리시켜 상층액을 취함으로써 에탄올 가용성물질을 얻었다.

(iii) 상기에서 얻은 에탄올 가용성물질을 회전진공농축기를 이용하여 감압 농축하였다.

(4) PBS(Phosphate buffered saline) 추출물의 제조

(i) 실시예 2-(1)의 동결건조 세포주 500g에 5000ml의 PBS 용액을 가하여 열탕중탕법으로 80℃에서 2~3시간 열을 가하여 추출하였다.

(ii) 상기에서 얻은 추출물을 냉동건조시켜 500㎍/㎕이 되도록 PBS(pH7.4)에 녹여 준비하였다.

실험예 1: 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주의 B형 간염 바이러스에 대한 항바이러스 효과의 확인

본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주의 B형 간염 바이러스에 대한 항바이러스 효과를 확인하기 위하여, 수원대학교 생명과학과 미생물학실험실에 의뢰하여 B형 간염 바이러스 억제 실험을 수행하였다.

먼저, HepG2에서 유래된 재조합 세포주로서 HBV virion particle를 만들어 방출하는 특징을 가진 세포주인 HepG2.2.15 세포주를 DMEM10 배지(Hyclone-high glucose, 10% FBS, 10㎍/㎕ Gentamycin)을 사용하여, 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터에서 배양하였다. HepG2 세포는 공지되고 널리 분포되고 쉽게 구할 수 있는 사람 간종양 세포로서, HepG2 세포주의 확립 및 특성은 미국특허 4,393,133에 기술된다. 이 세포주의 샘플은 또한 American Type Culture Collection, Rockville, Maryland로부터 수탁번호 ATCC HB 8065하에, 그리고 European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, UK로부터 구할 수 있다. 이들 세포는 다양한 단백질들, 예컨대 Broze 및 Miletich, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 84, 1886-1890 (1987)와 미국특허 4,996,852, 5,106,833 및 5,212,091에 리포단백질 연합 응집저해인자(LACI)로도 알려진 조직인자 저해인자(TFI)의 원천으로 사용되었다. HepG 2.2.15 세포는 이러한 HepG2 세포의 유도체이고, Sells et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 84, 1005-1009 (1987)에 기재된 대로 제조되었다.

그 후 HepG2.2.15 세포주가 24-well에서 70% 정도 자란 다음, 상기 실시예 2의 (4)의 PBS 추출물을 24well 크기의 세포배양액에 대하여 5mg의 농도로 첨가하였다. 또한, 통상의 산삼조직과의 효과 비교를 위하여 동결건조한 산삼배양근을 상기 실시예 2의 (4)와 동일한 방법으로 PBS 추출물을 제조한 다음, 역시 동일한 농도로 HepG2.2.15 세포주 배양액에 첨가하였다. 상기 실시예 2의 (4)의 PBS 추출물 및 상기 산삼배양근 PBS 추출물을 각각 첨가한 후에는 배양배지를 DMEM2(Hyclone-high glucose, 2% FBS, 10㎍/㎕ Gentamycin)로 바꾸어 사용하였고 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.

72시간 배양한 다음, HBV virion의 생성여부를 측정하기 위해 배양액 5㎕를 선별하여 열 불활성화(heat inactivation) 시킨 후 주형(template)으로 사용하여, PCR을 수행하였다. 이때 대조군으로는 아무것도 처리하지 않고 DMEM2에서 배양한 배양액을 사용하였다.

PCR 수행에 사용되는 프라이머 염기서열은 HBV 바이러스 HBsAg 유전자의 공통적인 부분을 택하여 제조하였는데, forward primer는 157~179; 5’-GGGGGAATTCATGGAGAACATCACATCAGGATTC-3’(서열번호 1)를 사용하였고, backward primer는 814~837; 5’-GGGCTGCAGTTAAATGTATACCCAAAGACAAAA-3’(서열번호 2)를 사용하였다. 좌측 primer와 우측 primer 사이의 DNA 크기는 750bp가 되도록 하였다. PCR을 수행한 후 각각의 샘플들은 1.0% 아가로스 겔에서 전기영동 하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 대조군(C)과 동결건조 산삼배양근 추출물을 처리한 군(G5)에서는 HBsAg DNA가 증폭된 것으로 나타났으나, 본 발명에 따른 세포주인 산삼 형성층 유래 동질적인 세포주의 추출물을 처리한 군(G4)에서는 HBsAg DNA가 증폭되지 않은 것으로 나타났다. 본 발명에 따른 동질적인 세포주를 처리한 경우 PCR 생성물이 합성되지 않은 것은 본 발명에 따른 세포주가 억제제가 작용하여 바이러스 생성과정을 억제한 것으로 판단되었다.

한편, 상기에서 효과를 확인한 본 발명에 따른 동질적인 세포주 추출물에 대하여 시간별 억제효과를 관찰하기 위하여, 상기와 동일한 방법으로 동질적인 세포주 추출물 5mg을 처리하고 각각 24hr, 48hr, 72hr 배양한 다음, 배양액 5㎕를 선별하여 열 불활성화(heat inactivation) 시킨 후 주형(template)으로 사용하여, 역시 상기와 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 처리 후 24시간 배양한 후 PCR을 수행하여 관찰하였을 때는 HBsAg DNA 증폭산물이 확인되었으나, 48시간 경과 후부터 증폭산물 생성 억제효과가 관찰되기 시작하였고, 72시간 경과 후에는 증폭산물이 관찰되지 않는 것으로 나타났다. 즉, 처리 후 48시간 경과 시 B형 간염 바이러스 억제효과가 나타나는 것으로 확인되었다.

아울러, 추가적으로 실시예 1의 14일간 현탁배양한 산삼 형성층 유래 동질적인 세포주에 엘리시터로서 air stress를 3~5일간 처리한 세포주 배양물을 상기 실시예 2의 (4)의 방법으로 PBS 추출물로 제조한 다음, 상기와 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다. 그 결과, 산삼 형성층 유래 동질적인 세포주의 배양물 또한, 도 3과 유사한 수준으로 B형 간염 바이러스 억제 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.

실험예 2: 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주의 간질환 예방 및 치료 효과의 확인 (1)

본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주의 간염 예방 및 치료 효과를 확인하기 위하여, B형 간염 바이러스 보균자 및 급성 간염, 간암 환자에 대하여 상기 실시예 2의 (1)에서 제조된 건조 세포주 분쇄물을 파우더 형태로 투여하였다. 복용은 하루에 두 번 (아침 및 저녁) 1g씩 물에 용해한 형태로 경구투여되었다.

투여 기간은 환자별로 상이하며, 투여 후 HBsAg, HBeAg의 항원과, HBsAb, HBeAb, HBcAb의 항체는 면역혈청검사(EIA, Enzygnost, Behringwerke, Germany)법으로, B형 간염 바이러스 (HBV) DNA 정량검사는 Hybrid Capture Ⅱ test (HC-Ⅱ, Digene Corp., Beltsville, MD, USA)으로 각 제조사가 제시한 설명서의 측정방법에 따라 실시하였다. 한편, AST 수치 및 ALT 수치는 Hitachi 7600 시리즈(Hitachi, Tokyo, Japan) 자동화학분석기를 이용하여 제조원의 검사지침에 따라 측정하였다.

측정한 결과 및 각 환자별 투여기간은 다음과 같다.

표 12

본 발명에 따른 세포주의 투여 전 HBsAg (B형간염표면항원)이 양성이었으나, 투여 7개월 후 음성으로 측정되었다. 또한, HBsAb (B형간염표면항체)는 음성에서 투여 7개월 후 양성으로 측정된바, 본 발명에 따른 동질적인 세포주의 투여에 의하여 s 항체 (HBsAb)가 형성됨을 확인할 수 있었다.

s 항체의 형성은 B형 간염의 완치로 해석하는바, 본 발명에 따른 세포주의 투여에 의하여 B형 간염이 치료되었음을 확인할 수 있었다.

표 13

투여 3개월 후 측정한 결과, HBsAg (B형간염표면항원)가 음성으로, HBsAb (B형간염표면항체)는 양성으로 측정되었다. s 항체의 양성은 B형 간염에 대한 완치를 의미하는 바, 이는 본 발명에 따른 동질적인 세포주의 투여로 인하여 s 항체가 형성됨을 반증한다.

이에 본 발명에 따른 동질적인 세포주의 투여에 의하여 B형 간염이 치료되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 간암을 개선시키는 효과도 아울러 확인할 수 있었다.

표 14

투여 15일 후 측정한 결과, 투여 전 HBeAg (B형간염피막항원)이 23.25 수치에서, 3.22로 감소한바, 바이러스의 증식이 감소한 것으로 나타났다. 한편, HBeAb와 HBsAb 모두 양성으로 측정되었다.

따라서, 본 발명에 따른 동질적인 세포주가 B형 간염의 치료효과를 가짐을 확인할 수 있었다.

한편, 상기 환자에 대한 이후의 투여기간 동안의 측정결과는 다음과 같다.

표 15

상기와 같이, 투여 45일 이후의 결과를 살펴보면, 상기 표 14의 투여 전 및 투여 15일 후의 데이터와 비교할 때, HBsAg 및 HBeAg는 감소하는 것으로 나타났으며, HBsAb 및 HBeAb도 증가수준을 보이다가 점차 감소하는 것으로 나타났다. 그러나, 항체의 감소는 정상범위(기준치 참조)인 양성 구간으로, 이러한 감소는 본 발명에 따른 동질적인 세포주 투여에 의해 항원이 현저히 감소함에 따른 것으로 보인다.

한편, 간의 파괴정도를 나타내는 간수치 측정항목인 AST 및 ALT 항목을 측정한 결과, 변동을 보이나 점차 감소추세인 것으로 나타나 간기능 개선 및 간질환의 치료 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

표 16

투여 후 15일 및 44일 후 각각 측정한 결과, 15일자 측정결과에서는 HBeAg, HBV-DNA 모두 양성으로 나타나고, HBeAb는 음성으로 나타났으나, 44일자 측정결과에서는 HBeAg, HBV-DNA 모두 음성으로 나타나고, HBeAb는 양성으로 나타났다. 본 발명에 따른 동질적인 세포주의 투여에 의하여 간염바이러스에 대한 항원이 감소된 바, 본 발명에 따른 동질적인 세포주가 간염바이러스의 증식을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 간염바이러스에 대한 항체가 증가 되었는바, 간염바이러스에 대한 면역 증진효과가 있음을 확인할 수 있었다.

표 17

상기와 같이, 투여 후 2달 반 경과 후의 결과를 추가로 살펴보면, HBeAg, HBV-DNA 모두 음성으로 나타나고, HBeAb는 양성 측정 결과가 유지되고 있음을 확인할 수 있었다. 한편, 간의 파괴정도를 나타내는 간수치 측정항목인 AST 및 ALT 항목을 측정한 결과를 살펴볼 때, 투여 전의 수치와 비교하여 투여 2달 반 이후 정상 범주로 진입한 것을 확인할 수 있었으며, 이에 본 발명에 따른 동질적인 세포주가 간기능 개선 및 간질환의 치료 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

표 18

투여 후 15일 후 측정한 결과, HBeAg(B형간염피막항원)이 투여 전 306.30 수치에서 투여 15일 후 23.60으로 항원이 감소하였고, HBV-DNA 역시 투여 전 1.0 x 10⁸에서 211 수치로 현저한 감소를 나타내었다.

이에 본 발명에 따른 동질적인 세포주가 B형 간염바이러스의 증식을 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

표 19

투여 후 15일 후 측정한 결과, HBeAg(B형간염피막항원)이 투여 전 460.1 수치에서 투여 15일 후 301.0으로 항원이 감소한 것으로 나타났다.

표 20

투여 후 15일 후 측정한 결과, HBsAg(B형간염표면항원)이 투여 전 5292 수치에서 투여 15일 후 100으로 항원이 감소한 것으로 나타났다.

이에 본 발명에 따른 동질적인 세포주가 B형 간염을 완화시키는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

표 21

투여 15일 후 측정한 결과, HBV-DNA 의 수치가 투여 전 23,889에서 2000이하로 현저한 감소를 나타내었다.

상기 측정 결과를 종합하면, 본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주는 40일 이상 장기간 투여 시 임상적으로 B형 간염의 완치로 해석하는 s 항체가 형성되는 것으로 측정되어 간염을 치료하는 효과 및 면역을 증진시키는 효과가 있는 것으로 나타났으며. 15일 투여한 경우에서는 B형 간염 바이러스의 항원이 감소하는 것으로 측정된바 B형 간염 바이러스의 증식을 억제하고 간염을 완화시키는 효과가 있는 것으로 나타났다. 또한, 간손상 정도를 나타내는 AST 및 ALT 수치를 낮추는 효과가 있는 것으로 확인되었다.

이에 본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주는 간염을 예방하고 치료하는 효과가 있을 뿐만 아니라, 간기능을 개선하고 간질환을 예방 및 치료하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

대조예 1. 대조군인 산삼부정근의 간염 예방 및 치료 효과의 검사

본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주의 간염 예방 및 치료 효과와 대조하기 위하여, B형 간염 바이러스 보균자에 대하여 산삼부정근 건조분을 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 투여한 후, 15일간 투여한 간염보균자 및 1달간 투여한 간염보균자에 대하여 역시 실험예 1과 동일한 방법으로 HBsAg, HBeAg의 항원과, HBsAb, HBeAb, HBcAb의 항체는 면역혈청검사(EIA)법으로, B형 간염 바이러스 (HBV) DNA 정량검사는 Hybrid Capture II test로 측정하였다. 그 결과는 다음의 표 22 내지 24와 같다.

표 22

표 23

표 24

대조군인 산삼부정근을 투여한 후 측정한 결과, 표 22 내지 24에 나타난 바와 같이, 15일 투여시 간염 바이러스에 대한 항원을 거의 감소시키지 않는 것으로 나타났다. 또한, 한 달간 투여한 경우에도 간염 바이러스에 대한 항원 감소효과나 항체 증가 효과 역시 매우 미미하였다.

이에 통상의 인삼류 유래 세포주에 비하여, 본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주의 간질환의 예방 및 치료효과가 현저함을 확인할 수 있었다.

실험예 3: 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주의 간질환 예방 및 치료 효과의 확인 (2)

본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주의 간염 예방 및 치료 효과를 확인하기 위하여, 추가적으로 B형 간염 환자에 대하여 상기 실시예 2의 (1)에서 제조된 건조 세포주 분쇄물을 파우더 형태로 투여하였다. 복용은 하루에 두 번 (아침 및 저녁) 1g씩 물에 용해한 형태로 경구투여되었다.

투여 기간은 환자별로 상이하며, 투여 후 HBeAg, HBsAg의 항원과, HBeAb의 항체는 면역혈청검사(EIA, Enzygnost, Behringwerke, Germany)법으로, B형 간염 바이러스 (HBV) DNA 정량검사는 Hybrid Capture II test (HC-II, Digene Corp., Beltsville, MD, USA)으로 각 제조사가 제시한 설명서의 측정방법에 따라 실시하였다. 한편, AST 수치 및 ALT 수치는 Hitachi 7600 시리즈(Hitachi, Tokyo, Japan) 자동화학분석기를 이용하여 제조원의 검사지침에 따라 측정하였다.

측정한 결과 및 각 환자별 투여기간은 다음과 같다.

표 25

투여 후 20일 및 약 2달 반 후 각각 측정한 결과, 투여 약 2달 반 후 HBeAg 가 현저히 감소되는 것으로 나타나, 본 발명에 따른 세포주가 간염바이러스의 증식을 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 간염바이러스에 대한 항체가 나타난바, 간염바이러스에 대한 면역 증진효과가 있음을 확인할 수 있었다.

표 26

투여 시작 후 4개월간은 불규칙한 투여가 이루어졌으나, 이후 규칙적인 투여가 시작된 다음, 투여 6개월째부터 간염바이러스에 대한 항원이 음성으로 정상화되었으며, 항체 역시 양성으로 정상화되어, 본 발명에 따른 세포주가 B형 간염의 치료효과를 가짐을 확인할 수 있었다.

또한, 간수치 측정결과에서도 투여 6개월째부터 간수치가 정상화된 것으로 확인된 바, 간기능 개선 및 간질환을 치료하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

표 27

투여 후 약 6개월 정도 경과한 시점에서, 간염바이러스에 대한 항체가 확인된바, 간염바이러스에 대한 면역 증진효과가 있음을 볼 수 있었으며, 또한, HBeAg 역시 점차 감소하여 약 6개월 경과한 시점에서는 현저한 감소치를 관찰할 수 있었는바, 본 발명에 따른 세포주가 간염바이러스의 증식을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

표 28

투여 후 5개월 18일 정도 경과한 시점에서, 간염바이러스에 대한 항체가 확인된바, 간염바이러스에 대한 면역 증진효과가 있음을 볼 수 있었으며, 또한, HBeAg 역시 점차 감소하여 5개월 18일 경과한 시점에서는 현저한 감소치를 관찰할 수 있었는바, 본 발명에 따른 동질적인 세포주가 간염바이러스의 증식을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

표 29

본 발명에 따른 동질적인 세포주 투여에 따라, HBV-DNA의 수치가 감소하여, 약 2달 정도 경과한 시점부터는 정상범위 내의 안정적인 수치를 보이고 있어, 본 발명에 따른 동질적인 세포주가 B형 간염바이러스의 증식을 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

표 30

HBV-DNA의 수치를 측정한 결과, 증감하는 변화를 보인 후 약 7달 경과 시점부터는 정상범위 내의 안정적인 수치를 보이고 있어, 본 발명에 따른 동질적인 세포주가 B형 간염바이러스의 증식을 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 한편, HBsAg 항원의 경우에도 양성 수준이나 점차 감소하는 것으로 나타나 억제에 효과가 있는 것으로 나타났다.

표 31

본 발명에 따른 동질적인 세포주 투여에 따라, HBV-DNA의 수치가 감소하여, 약 7달 정도 경과한 시점부터는 정상범위 내의 안정적인 수치를 보이고 있어, 본 발명에 따른 동질적인 세포주가 B형 간염바이러스의 증식을 억제하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

표 32

투여 15일 후 간의 파괴정도를 나타내는 간수치 측정항목인 AST 및 ALT 항목을 측정한 결과, 투여 전의 수치와 비교하여 정상 범주로 진입한 것을 확인할 수 있었으며, 이에 본 발명에 따른 동질적인 세포주가 간기능 개선 및 간질환 치료 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

표 33

투여 후 1개월 9일 경과한 시점에서, 간염 바이러스에 대한 항체가 확인되고 HBV-DNA 수치가 정상화되었으며, 4개월 10일 경과한 시점에서는 항원치도 정상화되었음을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따른 동질적인 세포주가 B형 간염의 치료효과를 가짐을 확인할 수 있었다.

상기 추가적인 간염 환자에 대한 측정 결과를 종합하면, 본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주가 간염 바이러스의 증식은 억제하면서 이에 대한 면역증진효과를 가져오는 효과가 있는 것으로 나타났다. 또한, 역시 간손상 정도를 나타내는 AST 및 ALT 수치를 낮추는 효과가 있는 것으로 확인되어, 본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주는 간염을 예방하고 치료하는 효과가 있을 뿐만 아니라, 간기능을 개선하고 간질환을 예방 및 치료하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

제조예 1: 약학제제 제조예

제제예 1. 정제의 제조

실시예 2에서 제조된 세포주 추출물 100㎎을 옥수수 전분 100㎎, 유당 100㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2㎎을 혼합하여 통상의 정제제조방법에 따라 제조하였다.

제제예 2. 캡슐제의 제조

실시예 2에서 제조된 세포주 추출물 500㎎을 연질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 3. 시럽제의 제조

실시예 1에서 제조된 세포주 1g, 이성화당 10g, 만니톨 5g, 적량의 정제수의 함량으로 통상적인 액제제의 제조방법에 따라 100㎖의 시럽제를 제조하였다.

제제예 4. 주사제의 제조

실시예 2에서 제조된 세포주 추출물 200㎎을 폴리옥시에틸렌 수소화 카스트로 오일을 함유하는 생리 식염수 200㎎에 가열 용해시켜 혼합 추출물을 0.1%의 농도로 함유하는 주사제를 제조하였다.

제조예 2: 기능성 식품의 제조 - 기능성 음료의 제조

제조예 1.

실시예 1에서 제조한 세포주 200㎎을 96㎖의 물에 용해시킨 후 보조제로서 비타민 C 500㎎, 교미제로서 구연산, 올리고당을 각각 1g 가하고, 보존재로서 나트륨벤조에이트 0.05g을 가한 후 정제수를 가하여 전량을 100㎖로 만들어 기능성 음료를 제조하였다.

제조예 2.

실시예 2에서 제조한 세포주 추출물 200㎎을 96㎖의 물에 용해시킨 후 보조제로서 비타민 C 500㎎, 교미제로서 구연산, 올리고당을 각각 1g 가하고, 보존재로서 나트륨벤조에이트 0.05g을 가한 후 정제수를 가하여 전량을 100㎖로 만들어 기능성 음료를 제조하였다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물은 천연물 유래 조성물로서 기존 간질환 치료제의 부작용을 최소화하여 인체에 안전하면서도, 간염 바이러스에 대한 s 항체 (HBsAb) 및 e 항체(HBeAb)를 증가시키며, 간염 바이러스의 증식을 억제할 수 있으므로, 간질환의 예방 및 치료에 유용하다. 아울러, 간손상 수치를 감소시키는 효과가 있는바, 간기능 개선용 기능성 식품으로서 유용하다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

전자파일 첨부하였음.

Claims

인삼류(Panax ginseng)의 형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물:

(a) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임;

(b) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임; 및

(c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.
제1항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 특성을 추가로 가지는 것을 특징으로 하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물:

(a) 현탁배양 시 단세포 수준으로 존재함;

(b) 인삼류의 형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐; 및

(c) 인삼류의 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨.
제1항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 수득된 것임을 특징으로 하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물:

(a) 인삼류의 형성층 함유 조직을 수득하는 단계;

(b) 상기 수득된 형성층 함유 조직을 IAA(Indole-3-acetic acid) 또는 IBA(Indole-3-butyric acid)를 포함하는 배지에서 배양하여 형성층 유래 세포주를 유도하는 단계,

이때, 상기 배양의 수행 중 또는 배양 전단계 또는 후단계에서 상기 형성층 함유 저장근 조직에 삼투 스트레스를 가하는 것을 특징으로 함; 및

(c) 상기 유도된 형성층 유래 세포주를 회수하는 단계.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인삼류는 산삼 또는 인삼인 것을 특징으로 하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간질환은 간염, 간암, 간경변, 간경화증, 지방간 및 중독성 간질환 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 알코올, 아세톤, DMSO (Dimethyl Sulfoxide), PBS(phosphate buffered saline) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출된 것임을 특징으로 하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물.
인삼류의 형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 간기능 개선용 기능성 식품:

(a) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임;

(b) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임; 및

(c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.
제7항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 특성을 추가로 가지는 것을 특징으로 하는 간기능 개선용 기능성 식품:

(a) 현탁배양 시 단세포 수준으로 존재함;

(b) 인삼류의 형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐; 및

(c) 인삼류의 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨.
제7항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 수득된 것임을 특징으로 하는 간기능 개선용 기능성 식품:

(a) 인삼류의 형성층 함유 조직을 수득하는 단계;

(b) 상기 수득된 형성층 함유 조직을 IAA(Indole-3-acetic acid) 또는 IBA(Indole-3-butyric acid)를 포함하는 배지에서 배양하여 형성층 유래 세포주를 유도하는 단계,

이때, 상기 배양의 수행 중 또는 배양 전단계 또는 후단계에서 상기 형성층 함유 저장근 조직에 삼투 스트레스를 가하는 것을 특징으로 함; 및

(c) 상기 유도된 형성층 유래 세포주를 회수하는 단계.
인삼류의 형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 간염 바이러스의 증식 억제용 조성물:

(a) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임;

(b) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임; 및

(c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.
제10항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 특성을 추가로 가지는 것을 특징으로 하는 간염 바이러스의 증식 억제용 조성물:

(a) 현탁배양 시 단세포 수준으로 존재함;

(b) 인삼류의 형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐; 및

(c) 인삼류의 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨.
제10항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 수득된 것임을 특징으로 하는 간염 바이러스의 증식 억제용 조성물:

(a) 인삼류의 형성층 함유 조직을 수득하는 단계;

(b) 상기 수득된 형성층 함유 조직을 IAA(Indole-3-acetic acid) 또는 IBA(Indole-3-butyric acid)를 포함하는 배지에서 배양하여 형성층 유래 세포주를 유도하는 단계,

이때, 상기 배양의 수행 중 또는 배양 전단계 또는 후단계에서 상기 형성층 함유 저장근 조직에 삼투 스트레스를 가하는 것을 특징으로 함; 및

(c) 상기 유도된 형성층 유래 세포주를 회수하는 단계.
인삼류의 형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양물 중 어느 하나 이상을 함유하는 간염 바이러스에 대한 항체를 증가시키는 면역 증진제:

(a) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임;

(b) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임; 및

(c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.
제13항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 특성을 추가로 가지는 것을 특징으로 하는 간염 바이러스에 대한 항체를 증가시키는 면역 증진제:

(a) 현탁배양 시 단세포 수준으로 존재함;

(b) 인삼류의 형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐; 및

(c) 인삼류의 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨.
제13항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 수득된 것임을 특징으로 하는 간염 바이러스에 대한 항체를 증가시키는 면역 증진제:

(a) 인삼류의 형성층 함유 조직을 수득하는 단계;

(b) 상기 수득된 형성층 함유 조직을 IAA(Indole-3-acetic acid) 또는 IBA(Indole-3-butyric acid)를 포함하는 배지에서 배양하여 형성층 유래 세포주를 유도하는 단계,

이때, 상기 배양의 수행 중 또는 배양 전단계 또는 후단계에서 상기 형성층 함유 저장근 조직에 삼투 스트레스를 가하는 것을 특징으로 함; 및

(c) 상기 유도된 형성층 유래 세포주를 회수하는 단계.