KR101068971B1

KR101068971B1 - 분열지연중심부 유래 식물줄기세포주 및 이의 분리방법

Info

Publication number: KR101068971B1
Application number: KR1020080092201A
Authority: KR
Inventors: 유영미; 이은경; 홍선미; 진영우
Original assignee: 주식회사 운화
Priority date: 2007-09-21
Filing date: 2008-09-19
Publication date: 2011-09-30
Also published as: ZA201001571B; WO2009038416A3; EP2188368A4; CN101939415A; RU2458122C2; AU2008301351A1; WO2009038416A2; JP2010539899A; AP2010005190A0; RU2010115794A; CA2700337A1; MX2010003027A; KR20090031299A; EP2188368A2; US20100255585A1

Abstract

본 발명은 식물 분열지연중심부 유래 세포주 및 이의 분리방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 식물의 분열지연중심부에서 별도의 탈분화 과정 없이 수득되는 것을 특징으로 하는 분열지연중심부 유래 단세포 기원의 동질적인 세포주 및 이의 분리방법에 관한 것이다.

분열지연중심부, 식물세포배양, 단세포주, 변이, 분화, 동결보존

Description

분열지연중심부 유래 식물줄기세포주 및 이의 분리방법{Plant Stem Cell Line Derived from Quiescent Center and Method for Isolating the Same}

식물은 과거 식량 자원의 의미였으나, 현재에는 약제, 향료, 색소, 농약, 염료 등을 포함한 광범위한 화학물질의 공급원으로서 그 의미가 확대되고 있다. 특히, 식물 유래 유용 물질의 대부분은 항바이러스, 항박테리아, 함암, 항산화 능력 등의 생리 활성이 있어, 신의약품으로서 발전가능한 이상적인 자원으로 주목받고 있으며, 많은 식물 유래 물질들의 화학 구조와 활성 사이의 관계를 규명하기 위한 연구들이 활발히 진행되고 있다.

그러나, 생리 활성 물질은 의약품으로 개발하기 어려운 실정이며, 그 주된 이유는 다음과 같다. 첫째, 식물 내 생리 활성 물질의 함량이 극히 제한적이다. 둘째, 식물의 생장 속도는 매우 느리다. 셋째, 식물 유래 생리 활성 물질은 식물의 특정 기관 내에만 소량 존재한다. 넷째, 자연 훼손이라는 환경 문제가 연루되어 있다. 다섯째, 식물 유래 생리 활성 물질의 경우 화학적인 구조가 매우 복잡하여, 다단계 중합 과정이 요구되어 생산 비용이 매우 높은 경제적인 문제가 있다. 따라서, 식물 유래 생리활성 물질들을 상업적으로 안정적으로 공급하기 매우 어려웠다.

그런데, 생물공학기법의 하나인 식물 세포 배양 방법은 환경문제를 유발시키지 않으면서도 식물 유래 유용물질을 안정적으로 공급할 수 있는, 가장 이상적인 기술로 오랫동안 평가받고 있다. 대한민국 공개특허 1995-0000870 (1995. 01. 03)에 따르면 식물 세포 배양에 의한 유용물질의 생산은 식물에서 직접적인 추출에 의한 방법보다 수많은 장점이 있다. 특히, 기존의 추출법과는 달리, 외부 환경의 영향을 받지 않고도 지속적인 생산이 가능하여, 생태계 파괴와 같은 현안 문제들을 해결할 수 있는 최적의 방법으로 여겨지고 있다. 그러나, 식물 세포 배양에 대한 많은 관심과 노력에도, 산업화에 성공한 예는 아직까지 극히 일부에 불과한 실정이다. 이는 다수의 식물 세포 배양에서 세포 증식과 생산성의 변이가 주요 문제로 여전히 남아있기 때문이다.

식물 발현 시스템에 식물 세포를 이용하는 경우, 식물 세포의 분화 조직, 예컨대 잎, 줄기, 종자 등은 분열능이 상실된 영구 조직이므로, 분열능을 가진 세포주로 전환시키기 위해 탈분화 과정이 필수적으로 선행되고 있다. 상기 탈분화 과정은 식물체의 한 조직이나 기관을 이용하여 배양하였을 때 그 조직이나 세포가 이미 특정 기능을 수행하도록 분화된 상태를 해체하는 것을 의미한다. 그러나, 이러한 탈분화 과정 중에 염색체 변이에 의해 세포주의 심각한 변이가 발생될 수 있다.

특히, 식물 세포 배양을 통한 유용물질의 생산은 장기간의 배양기간 동안 빠른 세포 증식과 높은 대사물질 생산능이 안정적으로 유지되어야만 산업화가 가능하지만, 대부분의 세포주는 계대 배양에 의해 본래와는 다른 수많은 변이를 접하게 된다. 따라서, 이와 같은 변이 문제점을 극복하여, 식물 세포 배양을 통한 유용물질 생산에서 유전적으로 안정한 세포주를 획득하기 위한 방안이 절실한 실정이었다.

한편, 식물은 생장에 필요한 충분한 물과 무기물질을 흡수해야 하기 때문에 뿌리의 표면적이 굉장히 넓다. 이러한 뿌리의 끝에는 근단분열조직 세포들이 있으며, 이들은 분열, 확장, 신장, 분화하여 뿌리의 1기 조직을 형성한다. 근단분열조직은 근관 (뿌리골무)으로 싸여져 보호되고 있으며, 근단분열조직의 가운데에 있는 세포들은 매우 느리게 분열하기 때문에 분열지연중심부라고 하며, 분열지연중심부 주위에는 1기 분열조직을 만드는 시원세포들이 둘러싸고 있다.

그러나, 식물의 근계에 있어 매우 중요함에도 불구하고 근단분열조직의 생리적 특성에 관한 연구는 미비한 실정이다. 즉, 옥수수 등의 식물을 이용하여 분열지연중심부의 생리적 특성을 연구하거나 이를 배지에서 배양함에 따라 뿌리로 발달시킨 연구는 있었지만, 근관, 유관속 조직, 내초, 내피, 피츨, 표피 등의 근계를 이루는 여러 조직 중에서 분열지연중심부만을 분리하여 세포주로 확립한 예는 없었다.

따라서, 분열지연중심부는 유전적으로 가장 안정한 세포조직으로서, 이를 분 리함으로써 식물의 발생 및 유전학적 기원 연구가 가능해 질 수 있기 때문에, 분열지연중심부 유래의 동질적인 세포주를 분리하는 방법의 개발이 요구되었다. 또한, 최근 줄기세포 생물학(stem cell biology) 분야가 새로이 대두가 되고 있고, 발생과정에 관여하는 시그널에 대한 연구 등 줄기세포와 관련된 많은 실험들이 진행되고 있다. 그러나, 동물에서는 줄기세포를 분리 배양하는 방법이 일찍 확립된 반면, 식물의 경우 줄기세포 분리에 대한 연구가 전무한 상태이다. 이에 분열지연중심부 유래 세포주를 유도 및 분리함으로써 식물 줄기세포 생물학의 발전을 앞당길 것으로 사료된다.

이에 본 발명자는 분열지연중심부 유래 단세포 기원의 동질적인 세포주를 분리하는 방법 및 탈분화 과정 없이도 식물 발현 시스템에 사용할 수 있는 식물세포를 개발하고자 예의 노력한 결과, 분열지연중심부 유래 세포주를 분리하고, 상기 분리된 세포주가 장기간 배양 시 변이가 거의 없으며, 안정적인 배양이 가능하고, 동결보존 시 생존율이 높다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은, 안정적인 배양이 가능한 분열지연중심부 유래 세포주를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 탈분화 과정없이 분열지연중심부 유래 세포주를 분리하는 방법을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식물의 분열지연중심부 함유 뿌리조직을 배양한 다음, 분화되지 않은 흰색조직을 회수하는 것을 특징으로 하는 분열지연중심부 유래 세포주의 분리방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 식물의 분열지연중심부에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 식물의 분열지연중심부 유래 세포주를 제공한다:

(a) 현탁배양 시 단세포로 존재함;

(b) 분열지연중심부 이외 조직 유래의 세포주에 비하여 큰 핵을 가지는 형태학적 특징을 나타냄;

(c) 점액물질로 둘러싸여 있음;

(d) 장기간 배양에서 형태적인 변이 없이 안정적으로 유지됨; 및

(e) 동결보존 시 높은 생존율을 나타냄.

본 발명은 또한, 상기 식물의 분열지연중심부 유래 세포주를 동결하는 것을 특징으로 하는 식물 세포주의 보존방법을 제공한다.

본 발명은 식물 구성조직 중 가장 유전적으로 안정한 분열지연중심부로부터 탈분화 과정 없이 단세포 기원의 세포주를 유도 및 배양함으로써 안정적인 배양이 가능한 식물 세포주 및 이의 분리방법을 제공하는 효과가 있다.

본 발명에 따른 방법으로 분리된 분열지연중심부 유래의 동질적인 세포주는 발생 및 유전학적 기원의 연구도구로 유용하며, 식물 줄기세포 생물학의 발전에 도움이 된다. 한편, 본 발명에 따른 분열지연중심부 유래 세포주는 장기간 형태적 변이 없이 안정적으로 유지되며, 현탁배양 시 단세포 상태로 배양되므로 각종 식물유용물질을 안정적이고 효율적으로 생산할 수 있으며, 타 식물세포와 달리 동결보존 시 생존율이 85%이상으로 동결보존방법을 이용해 식물 세포 은행의 구축이 가능하게 한다. 즉, 본 발명에 따른 세포주는 식물 세포 은행으로 구축됨으로써, 연구소재의 공급을 원활하게 할 수 있으며, 식물세포주를 이용한 연구기간을 단축시킬 수 있는 장점이 있다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 일 관점에서, 식물의 분열지연중심부 함유 뿌리조직을 배양한 다음, 분화되지 않은 흰색조직을 회수하는 것을 특징으로 하는 분열지연중심부 유래 세포주의 분리방법에 관한 것이다.

이때 바람직하게는, 상기 식물의 분열지연중심부 함유 뿌리조직은 무균 처리된 식물종자를 발아시켜 수득한 것이거나, 식물체의 일부로부터 유도된 캘러스로부터 분화된 뿌리조직을 사용한다. 또한, 상기 배양에서 사용되는 배지는 당업자에게 공지된 임의의 세포주 유도배지를 사용할 수 있으나, 바람직하게는 N6 배지, MS 배지, Gamborg B5 배지, LS 배지 및 KAOM 배지 중 어느 하나의 배지에서 배양한다. 이때, 더욱 바람직하게는 상기 배양은 2,4-D을 포함한 배지에서 이루어진다. 그리고, 본 발명에서 상기 분열지연중심부 유래 세포주의 회수는 3~6주간 배양한 후 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 "분열지연중심부"는 근단분열조직(root apical meristem)의 중앙에 500~1,000개의 비활성 세포로 구성된 반구형 또는 원반형의 단일 세포군을 의미한다. 이들 세포군은 세포주기가 G1 시기에 오랫동안 머물고, 약 15~20일 주기로 분열하는 것으로 알려져 있는데 평상시에는 비활성 상태로 존재하다가 외과적 또는 방사능 상해 처리시 분열 활성을 재계한다. 즉, 뿌리가 흙을 헤치고 나갈 때 근관은 근단분열조직을 효과적으로 보호하지만 완벽하지는 않아, 분열조직은 때로는 뿌리가 자라는 동안 상처를 입게 된다. 이때 분열지연중심부에 있던 세포들이 분열하 여 손상된 분열조직과 근관을 다시 형성하게 된다. 또한, X-ray 노출시 분열세포들의 분열이 정지되지만, 분열지연중심부 세포들은 X-ray에 영향을 받지 않고 곧 분열을 개시하여 분열세포를 재형성한다. 즉, 분열지연중심부는 유전적으로 안정적인 세포들이 저장되어 있는 장소이다. 분열지연중심부는 뿌리의 1기 분열조직인 전형성층, 기본분열조직, 원표피로 분화된다.

상기 분열지연중심부는 식물체의 뿌리로부터 수득할 수 있는데, 바람직하게는 무균 처리된 종자를 발아시킨 소식물체의 뿌리로부터 수득하거나, 식물체의 일부로부터 유도된 캘러스로부터 분화된 뿌리 조직에서 수득할 수 있다. 이때 바람직하게는, 뿌리 끝에서 근관을 제거하고 절단면로부터 1mm 내외 부위의 절편체를 수득하여 이를 세포주 유도 배지에 배양한다. 이때 배양에 앞서, 살균공정을 식물체의 뿌리조직 수득 후 당업자에게 공지된 일반적인 방법에 따라 실시할 수 있는데, 무균 처리된 종자를 발아시킨 소식물체의 뿌리를 사용하는 경우 등에는 뿌리조직 수득 후, 별도의 살균과정을 거치지 아니할 수 있다.

상기 세포주 유도 배지는, 당업계에 공지된 임의의 것일 수 있으며, 예로 N6 배지(Chu C.C., Proc . Symp . Plant Tissue Cult ., Peking, 43, 1978), MS 배지(Murashige T. and Skoog F., Physiol . Plant, 15:473, 1962), Gamborg B5 배지(Gamborg O.L. et al., Exp . Cell Res., 50:151, 1968), LS 배지(Linsmaier E.M. and Skoog F., Physiol . Plantarum ., 18:100, 1965), KAO M 배지(Kao K.N. and Michayluk M.R., Planta . (Berl.), 126:105, 1975) 등이 있으나 이로 한정되는 것은 아니다.

이때, 더욱 바람직하게는 옥신류 중 2,4-D를 포함하여 배양한다. 이때, 바람직하게는 2,4-D는 2mg/L의 농도로 포함하며, 더욱 바람직하게는 2~7mg/L의 농도로 포함한다. 구체적인 세포주 유도를 위한 배양 조건, 배양기간 등은 식물 세포의 종류나 특성에 따라 결정되며, 이러한 실시는 당업자에게 자명한 것이다.

상기 배양시 분열지연중심부 이외의 뿌리 조직 유래 세포주와 분열지연중심부 유래 세포주는 형태적인 차이가 관찰되는데, 뿌리 조직 유래 세포주에서는 이질적이고 국소적인 분화가 관찰되지만, 분열지연중심부 유래 세포주는 동질적이었으며 국소적인 분화는 관찰되지 않는다. 또한, 뿌리 조직 유래 세포주의 경우 육안상 관찰했을 때 노란빛을 띠고 있음에 반하여, 분열지연중심부 유래 세포주는 흰색을 띠고 있으며, 점액물질에 둘러싸여 있는 것으로 나타났다. 즉, 분열지연중심부 유래 세포주는 "분화되지 않은 흰색조직"으로 나타났다. 상기 점액물질은 뮤시젠으로 예상되는데, 뮤시젠이란 근관의 주변세포와 뿌리의 표피세포에 의해 분비되는 물질로 당, 유기산, 비타민, 효소, 아미노산 등을 함유하는 복합 다당류로 알려져 있다.

따라서, 이러한 형태적 차이를 토대로, 분열지연중심부 유래 세포주만을 선별할 수 있다. 도 1A는 분열지연중심부 유래 세포주의 분리 전 사진으로 적색 원 부분이 분열지연중심부 유래 세포주이고, 도 1B는 분리 후, 유도된 분열지연중심부 유래 세포주를 분리해 내어 4주간 배양한 사진이다.

상기 분열지연중심부 유래 세포주의 회수는 바람직하게는 식물의 분열지연중심부 함유 뿌리조직을 배지에 접종 후, 바람직하게는 3~6주간, 더욱 바람직하게는 4~5주간 배양한 후 수행한다. 접종 후 약 3~6주가 지나면 분열지연중심부 유래 세포주가 유도되며, 이에 분리가 용이해진다.

분열지연중심부는 모든 식물체가 가지고 있는 조직이므로, 본 발명의 분열지연중심부 유래 세포주의 분리방법은 모든 식물체에 적용가능하며, 이에 모든 식물체에서 분열지연중심부 유래 세포주 수득이 가능하다. 즉, 본 발명의 일 실시예에서는 벼 및 옥수수의 뿌리조직의 분열지연중심부로부터 세포주를 분리하였으나, 이에 한정되지 않고 분열지연중심부를 가지는 식물이라면 본 발명의 방법을 적용할 수 있음은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가지는 자에게 자명하다. 예컨대, 분열지연중심부 유래 세포주를 수득할 수 있는 식물로 벼, 옥수수, 완두, 귀리, 양파, 애기장대 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 분열지연중심부의 생리적 특성이 연구되어진 예로써는 옥수수(Maize), 애기장대(Arabidopsis), 양파(Allium cepa), 귀리(Avena sativa), 및 완두(Pisum sativum) 등을 들 수 있다[Maize: Georgina Ponce et al., Plant Cell and Environment , 28:719, 2005; Keni Jiang et al., Development, 130:1429, 2003: Arabidopsis : Noriko Kamiya et al., The Plant J ournal, 35:429, 2003; Peter Doerner, Current Biology, 8:R42, 1998; Allium cepa : R.Liso, New Phytol ., 110:469, 1998; Avena sativa : F.A.L. CLOWES, New Phytol., 129, 1982; Pisum sativum: Peter Doerner, Current Biology , 8:R42, 1998].

본 발명은 다른 관점에서, 식물의 분열지연중심부에서 유도되고, 다음과 같은 특성을 가지는 식물의 세포주에 관한 것이다:

(a) 현탁배양 시 단세포로 존재함;

(c) 점액물질로 둘러싸여 있음;

(e) 동결보존 시 높은 생존율을 나타냄.

본 발명의 분열지연중심부 유래 세포주는 상대적으로 큰 핵을 가지는 형태학적 특징을 나타내는데, 핵의 크기가 2~4㎛ 정도로 분열지연중심부 이외의 타 조직 유래 일반 세포주에 비하여 큰 것으로 나타났다.

본 발명의 분열지연중심부 유래 세포주는 또한, 장기간 배양시에도 형태적인 변이가 없는 매우 안정적인 증식을 보인다. 본 발명의 일 실시예에서는 16주 이상 배양한 경우에도 형태적 변이 없이 안정적으로 배양되는 것으로 나타났다. 반면에, 뿌리 조직 유래 세포주를 장기간 배양하는 경우 세포괴 내에 여러 개의 국소적인 분화가 관찰되고, 특히 부정근 발달이 현저하게 확인되었다.

아울러, 식물 세포는 미생물 세포와는 달리 단세포로 배양되지 않고 세포괴 형태로 배양되는데, 이러한 세포 응집은 세포괴의 내부와 외부 사이의 환경적인 차이를 유발하여 세포 증식과 유용물질 생산에 변이를 유발한다. 그러나, 본 발명의 분열지연중심부 유래 세포주는 현탁배양 시 단세포로 배양되어, 이러한 변이 가능 성이 없다.

이에 본 발명에 따른 분열지연중심부 유래 세포주는 식물 발현 시스템에 사용하여 유용한 물질을 안정적으로 생산시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 분열지연중심부 유래 세포주는 식물 현탁 배양 방법으로 배양할 수 있으며, 구체적인 배양 방법은 당업계에 공지된 바에 따라 실시할 수 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 식물의 분열지연중심부 유래 세포주를 동결하는 것을 특징으로 하는 식물 세포주의 보존방법에 관한 것이다.

또한, 식물세포의 경우 동결보존 시 생존율이 낮은 것으로 나타났으나, 본 발명의 분열지연중심부 유래 세포주는 통상의 세포 동결보존 방법에 따라 동결보존하였을 때, 세포 생존율이 85% 이상으로 매우 높다. 세포주를 동결보존할 수 있는 경우 원료의 안정적인 공급 및 실질적인 마스터 세포은행(master cell bank)을 구축하는 것이 가능하며, 이에 본 발명의 분열지연중심부 유래 세포주를 이용하여 장기적이고도 안정적인 세포주 공급이 가능하다.

세계는 지금 연구소재 (생물자원) 전쟁 중으로, 인체조직, 식물종자 및 미생물, 세포, 유전자 등 각종 신약개발과 식량개량 등을 위한 생물자원의 보존과 해독이 중요한 국가자산으로 부상되고 있다. 이에 연구소재 확보가 곧 국가경쟁력인 시대에 생명과학과 관련된 분야의 연구에 필수 자료로 활용되고 있는 세포주 (Cell Line)를 개발하고 수집, 보존, 분양하는 세포주 은행의 구축이 필요한 실정이다. 따라서, 이러한 식물 세포 은행을 구축함에 연구소재의 공급을 원활하게 할 수 있으며 식물 세포주를 이용한 연구기간을 단축하게 할 것으로 기대된다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 벼의 분열지연중심부 유래 세포주의 분리

1-1: 식물 재료의 준비

벼 종자의 껍질을 제거하고, 본래의 상태에서 70% 에탄올로 1분간 표면 살균 후, 2% 하이포아염소산나트륨 용액에 1시간 침지시키고, 멸균수로 1~2회 세척하였다. 이를 다시 멸균수로 30분간 충분히 세척한 다음 물기를 완전히 제거하였다.

건조 종자를 N6 배지(CHU MEDIUM, Chu C.C., Proc. Symp. Plant Tissue Cult., Peking, 43, 1978)에 파종하여 5일간 25℃에서 배양하여 발아시켰으며, 상기 N6배지의 조성은 표 1과 같다.

<표 1>

조성		농도
Macroelements	CaCl₂·2H₂O	1.13mM	125.33mg/L
	KH₂PO₄	2.94mM	400.00mg/L
	KNO₃	27.99mM	2830.00mg/L
	MgSO₄·7H₂O	0.75mM	90.27mg/L
	(NH₄)₂SO₄	3.50mM	463.00mg/L
조성		농도
Microelements	FeNaEDTA	0.10mM	36.70mg/l
	H₃BO₃	25.88μM	1.60mg/l
	KI	4.81μM	0.80mg/L
	MnSO₄·4H₂O	19.70μM	3.33mg/L
	ZnSO₄·7H₂O	5.22μM	1.50mg/L
조성		농도
Vitamins	Glycine	26.64μM	2.00mg/L
	Thiamine-HCl	2.96μM	1.00mg/L
	Pyridoxine-HCl	2.43μM	0.50mg/L
	Nicotinic acid	4.06μM	0.50mg/L

그 후, 약 5 내지 6일간 발아시킨 식물체로부터 분열지연중심부 함유 뿌리 조직을 채취하였다. 뿌리 끝에서 근관을 제거하고 절단면으로부터 1mm 부위를 절편체로 수득하였다.

1-2: 분열지연중심부 유래 세포주 유도 및 분리

(1) 실시예 1-1에서 수득한 절편체를 2 mg/L, 3 mg/L 및 4 mg/L의 2,4-D가 포함된 각각의 N6 배지와 다른 유형의 옥신 계열 호르몬인 IAA(Indole-3-acetic acid), IBA(Indole-3-butyric acid), NAA(1-naphthaleneacetic acid), CPA(p-chlorophenoxyacetic acid), 피클로람 (Picloram, 4-amino-3,5,6-trichloropicolinic acid)이 동일 농도로 포함된 N6 배지에 접종하였다.

그 결과, 2,4-D를 포함한 배지의 경우 접종 30일째, 세포주 유도가 관찰되었다. 2,4-D가 포함된 배지는 농도와 비례하여 분열지연중심부 유래 세포의 유도율이 높아지지 않았고, 2mg/L 및 그 이상의 농도에서 유도율이 비슷하였다. 이에 2mg/L 의 이상의 농도에서 배양하는 것이 바람직한 것으로 나타났다. 다만, 추가적으로 1mg/L, 4mg/L, 5mg/L, 6mg/L 및 7mg/L에 대하여 실험을 진행한 결과 2~7mg/L의 농도에서 배양하는 것이 더욱 바람직한 것으로 나타났다.

반면, 도 2에 나타난 바와 같이, 2,4-D를 제외한 다른 옥신류의 경우, 접종 후 세포가 유도되지 않고 절편체에서 부정근이 발생하였다. 도 2에서, A는 2,4-D를 포함하여 배양시킨 것이고, B는 CPA, C는 IAA, D는 IBA, E는 NAA, F는 피클로람을 포함하여 배양시킨 것이다.

따라서, 분열지연중심부 유래 세포주는 2,4-D를 사용하는 경우 특이적으로 유도됨을 확인할 수 있었다.

(2) 도 1A에 나타난 바와 같이, 2,4-D를 포함한 배지에서 배양 시 분열지연중심부 이외의 뿌리 조직과 분열지연중심부 유래 세포주는 형태적인 차이가 관찰되었다. 즉, 뿌리 조직 유래 세포주에서는 이질적이고 국소적인 분화가 관찰되지만, 분열지연중심부 유래 세포주는 동질적이었으며 국소적인 분화는 관찰되지 않았다. 육안상 관찰하였을 때, 분열지연중심부 이외의 뿌리 조직 유래 세포주의 경우 노란빛을 띠고 있음에 반하여, 분열지연중심부 유래 세포주는 흰색을 띠고 있으며, 점액물질에 둘러싸여 있는 것으로 나타났다. 이에 이러한 형태적 차이를 토대로, 분화가 관찰되지 않고 흰색을 띄는 조직, 즉 분열지연중심부 유래 세포주를 3~6주 후에 분리하여 내었다. 도 1A에서 적색 원 부분이 분열지연중심부 유래 세포주이다.

(3) 도 3은 분열지연중심부 유래 세포주를 분리하여 낸 후의 사진으로, 분열지연중심부 이외의 뿌리조직에서 유래된 세포주(a)와 분열지연중심부 유래 세포주(b)를 형태적으로 관찰한 사진이다. 도 3에 나타난 바와 같이, 뿌리 조직 유래 세포주에서는 이질적이고 국소적인 분화가 관찰되었으나, 분열지연중심부 유래 세포주는 동질적이었으며 국소적인 분화가 관찰되지 않았다.

(4) 한편, 약 3~6주가 지나도록 분리하지 않고, 분열지연중심부 유래 세포주가 분열지연중심부 이외 뿌리조직 유래 세포주와 혼합되어 있는 경우에는 점액성분의 변성이 일어났는데, 이러한 변성은 타조직 유래 세포주의 페놀 화합물로 인한 것으로 판단된다. 페놀성분의 합성은 분화조직에서 활발히 이루어지기 때문이다.

실시예 2. 옥수수의 분열지연중심부 유래 세포주의 분리

실시예 1-1과 동일한 방법으로 옥수수 종자를 발아시키고, 발아시킨 식물체의 뿌리로부터 분열지연중심부 함유한 절편체를 수득하였다. 그 후, 상기 실시예 1-2와 동일한 방법으로 2,4-D, CPA, IAA, IBA, NAA, 및 피클로람을 각각 포함하는 배지에서 절편체를 배양하여 분열지연중심부 유래 세포주가 유도되는지 관찰하였다.

그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 옥수수의 분열지연중심부 함유 절편체를 배양한 경우, 벼의 분열지연중심부 함유 뿌리 절편체를 유도한 경우와 동일하게 2,4-D를 포함한 배지의 경우 세포주 유도가 관찰되었으나, 2,4-D를 제외한 다른 옥 신류의 경우, 접종 후 세포가 유도되지 않고 절편체에서 부정근이 발생하였다. 도 4에서, A는 2,4-D를 포함하여 배양시킨 것이고, B는 CPA, C는 IAA, D는 IBA, E는 NAA, F는 피클로람을 포함하여 배양시킨 것이다.

따라서, 벼 이외의 분열지연중심부를 함유하는 식물에서도 2,4-D 특이적으로 분열지연중심부 유래 세포주를 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 벼의 분열지연중심부 유래 세포주의 특성 관찰

3-1: 장기간 배양 시 형태학적 변화 관찰

상기 실시예 1에서 분리한 분열지연중심부 유래 세포주를 실시예 1-2의 세포주 유도 단계와 동일한 조성의 배양 배지, 즉, 2mg/L의 2,4-D가 포함된 N6배지에 접종하여 증식시켰다. 그리고 증식 4주 및 16주 후에, 증식한 각 분열지연중심부 세포를 관찰하였다. 또한, 대조군으로 분열지연중심부 이외 뿌리 조직 유래 세포주 역시 동일한 방법으로 증식시킨 후, 세포의 형태학적 변화를 관찰하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 뿌리 조직 유래 세포주에서 배양 4주(A) 및 배양 16주 경과 후(A 제외한 사진들) 형태적 변이를 관찰하였다. 배양 16주 경과 후에는 세포괴 내에 여러 개의 국소적인 분화가 관찰되었으며, 특히 부정근 발달이 현저하게 확인할 수 있었다.

반면, 도 6에 나타낸 바와 같이, 분열지연중심부 유래 세포주를 배양하였을 때는 배양 4주(A) 및 16주(B) 경과 후에도 형태적 변이가 발생되지 않았다.

따라서, 분열지연중심부 이외의 뿌리 조직 유래 세포주는 시간 경과에 따라 급격한 형태적 변이를 보이나 분열지연중심부 유래 세포주는 형태적인 안정성을 보임을 확인할 수 있었다. 상기와 같이, 본 발명에 따른 분열지연중심부 유래 세포주는 단세포 기원의 세포주로 장기간 배양 시 안정적으로 변이 없이 유지되는바, 수율이 높고 물질 생산 능력이 안정된 세포주를 선발하는 데 있어 매우 바람직하다.

한편, 분리된 분열지연중심부 유래 세포주는 형태학적으로 큰 핵을 갖고 있었는데, 도 7A와 같이 세포주 자체의 크기가 약 10~20㎛인데, 핵의 크기는 약 2~4㎛로 나타났다. 이에 반하여 뿌리 조직 유래 세포주는 도 7B에 나타난 바와 같이, 핵의 크기가 분열지연중심부 유래 세포주에 비하여 매우 작은 것으로 나타났다.

3-2: 현탁배양 시 세포 응집 여부 관찰

식물 세포는 미생물 세포와는 달리 단세포로 배양되지 않고 세포괴 형태로 배양되어지며, 적게는 몇 개에서 많게는 수백 개로 배양된다. 이러한 세포 응집은 세포괴의 내부와 외부 사이의 환경적인 차이를 유발하게 되고, 이는 곧 세포증식과 유용물질 생산에 변이를 가져오게 된다. 따라서, 분열지연중심부 유래 세포주와 분열지연중심부 이외 뿌리 조직 유래 세포주의 현탁 배양 시 세포 응집 여부를 관찰하였다.

그 결과, 도 8 및 도 9에 나타난 바와 같이, 분열지연중심부 이외 뿌리 조직 유래 세포주는 수백 개의 세포들이 모여 괴형태로 배양되나, 분열지연중심부 세포주는 단세포로 배양됨을 확인할 수 있었다. 도 8은 분열지연중심부 이외 뿌리 조직 유래 세포주(a)와 분열지연중심부 유래 세포주(b)의 세포 수준을 보여주는 사진이고, 도 9은 분열지연중심부 이외 뿌리 조직 유래 세포주와 분열지연중심부 유래 세포주의 응집율을 보여주는 그래프이다.

3-3: 동결보존시 생존율 실험

세포주의 동결보존 기술은 원료를 안정적인 공급하고 실질적인 마스터 세포 은행(master cell bank)을 구축하는데 필수적인 방법이다. 동결보존 기술은 동물세포에서는 보편적으로 널리 사용되지만, 식물 세포의 경우 동결보존 후 생존율이 낮아 적용 범위가 한정된 것으로 알려져 있다. 이에, 다음과 같이, 본 발명의 분열지연중심부로부터 수득한 세포의 동결보존 생존율을 테스트하였다.

실시예 3-2의 분열지연중심부 유래 세포주를 접종하여 6일에서 7일간 배양한 현탁 배양물을 실온에서 0.16 M의 만니톨(mannitol)이 첨가된 배지에 3일간 예비 배양한 후, 4 ℃에서 3시간 동안 저온처리하였다. 저온 처리된 세포를 수거한 다음, 40% 에틸렌 글리콜(ethylene glycol/sigma, USA)과 30% 소르비톨(sorbitol/DUCHEFA, The Netherlands)이 포함된 배지가 있는 cryobial(Duran, USA)에 옮겨 4℃에서 3분간 배양하였다. 그 후, 동결보존제를 처리한 배양 세포를 액체 질소에 침지하여 냉동시켰다. 이후, 해빙을 위해 액체 질소에 10분 이상 유지시킨 배양 세포를 꺼내 40℃ 수조에 넣고 1~2분간 두었다. 세포 재생장을 위해 세포를 포함하는 여과물을 0.5M 솔비톨이 첨가된 배지상에 적용하고, 30분 동안 실온에서 안정화시켰다. 그 다음, 0.1 M 소르비톨이 포함된 배지에 24시간, 솔비톨 미 포함 배지에서 24시간, 다시 솔비톨 미포함 배지에서 24시간 동안 배양한 다음, 세포 생존율을 관찰하였다.

그 결과, 도 10 및 도 11에 나타난 바와 같이, 뿌리 조직 유래 세포주는 10% 미만의 생존율을 보였으나, 본 발명의 분열지연중심부 유래 세포주는 약 85% 이상의 생존율을 보였다. 도 10은 동결보존 후 이반 블루(Evan's Blue) 염색을 통해 분열지연중심부 이외 뿌리 조직 유래 세포주(a)와 분열지연중심부 유래 세포주(b)의 생존율 관찰한 사진이고, 도 11은 이를 보여주는 그래프이다.

따라서, 통상의 식물세포는 동결시 생존율이 낮아 동결보존의 방법으로 세포주를 보관할 수 없었던 것과 달리, 본 발명의 분열지연중심부로부터 수득한 세포주는 동결보존이 가능한 것을 확인할 수 있었다. 이에 분열지연중심부 유래 세포주는 장기보존에 바람직한 형태임을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1의 A는 벼의 분열지연중심부 함유 뿌리조직을 배양시켜 세포주를 유도시킨 후, 분열지연중심부 유래 세포주를 분리하기 전의 광학현미경사진이고, B는 분리 후, 유도된 분열지연중심부 유래 세포주를 분리해 내어 4주간 배양한 사진이다.

도 2는 벼의 2,4-D(A), CPA(B), IAA(C), IBA(D), NAA(E) 및 피클로람(F)을 각각 포함하여 분열지연중심부 함유 뿌리조직을 배양시킨 결과물의 광학현미경사진이다.

도 3은 벼의 분열지연중심부 이외의 뿌리조직에서 유래된 세포주(a)와 분열지연중심부 유래 세포주(b)를 형태적으로 관찰한 광학현미경사진이다.

도 4는 옥수수의 2,4-D(A), CPA(B), IAA(C), IBA(D), NAA(E) 및 피클로람(F)을 각각 포함하여 분열지연중심부 함유 뿌리조직을 배양시킨 결과물의 광학현미경사진이다.

도 5는 배양기간에 따른 분열지연중심부 이외 뿌리조직 유래 세포주의 형태적 변이를 나타낸 것이다.

도 6은 배양기간에 따른 분열지연중심부 유래 세포주의 형태적 안정화를 나타낸 것이다.

도 7에서 A는 분열지연중심부 유래 세포주의 광학현미경사진(400배 확대)이고, B는 뿌리 조직 유래 세포주의 광학현미경 사진(400배 확대)이다.

도 8은 분열지연중심부 이외 뿌리조직 유래 세포주(a)와 분열지연중심부 유래 세포주(b)를 비교 관찰한 광학현미경사진이다.

도 9는 분열지연중심부 이외 뿌리 조직 유래 세포주와 분열지연중심부 유래 세포주의 응집율을 보여주는 그래프이다.

도 10은 분열지연중심부 이외 뿌리조직 유래 세포주(a)와 분열지연중심부 유래 세포주(b)의 동결보존 후 생존율을 비교 관찰한 광학현미경사진이다.

도 11은 분열지연중심부 이외 뿌리조직 유래 세포주와 분열지연중심부 유래 세포주의 동결보존 후 생존율을 보여주는 그래프이다.

Claims

식물의 분열지연중심부 함유 뿌리조직을 배양한 다음, 분화가 관찰되지 않는 흰색조직을 회수하는 것을 특징으로 하는, 다음과 같은 특성을 나타내는 분열지연중심부 유래 세포주의 분리방법:

(a) 현탁배양 시 단세포로 존재함;

(b) 상기 식물의 분열지연중심부 이외 조직 유래의 세포주에 비하여 큰 핵을 가지는 형태학적 특징을 나타냄;

(c) 점액물질로 둘러싸여 있음;

(d) 장기간 배양에서 형태적인 변이 없이 안정적으로 유지됨; 및

(e) 동결보존 시 상기 식물의 분열지연중심부 이외 조직 유래의 세포주에 비하여 높은 생존율을 나타냄.
제1항에 있어서, 상기 식물의 분열지연중심부 함유 뿌리조직은 무균 처리된 식물종자를 발아시켜 수득한 것이거나, 식물체의 일부로부터 유도된 캘러스로부터 분화된 뿌리조직임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양은 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid)를 포함한 배지에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
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제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법에 의해 분리된 식물의 분열지연중심부 유래 세포주를 동결하는 것을 특징으로 하는 식물 세포주의 보존방법.