WO2009139581A2 - 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항노화용 조성물 - Google Patents

주목의 형성층 또는 전형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항노화용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2009139581A2
WO2009139581A2 PCT/KR2009/002553 KR2009002553W WO2009139581A2 WO 2009139581 A2 WO2009139581 A2 WO 2009139581A2 KR 2009002553 W KR2009002553 W KR 2009002553W WO 2009139581 A2 WO2009139581 A2 WO 2009139581A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cambium
procambium
extract
cell line
derived
Prior art date
Application number
PCT/KR2009/002553
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2009139581A3 (ko
Inventor
이대희
이은경
소은미
진영우
Original Assignee
주식회사 운화바이오텍
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 운화바이오텍 filed Critical 주식회사 운화바이오텍
Priority to CN2009801275441A priority Critical patent/CN102099046B/zh
Priority to AU2009247069A priority patent/AU2009247069B2/en
Priority to BRPI0908676A priority patent/BRPI0908676A2/pt
Priority to US12/992,810 priority patent/US9585923B2/en
Priority to JP2011509412A priority patent/JP5572790B2/ja
Priority to RU2010150940/15A priority patent/RU2520606C2/ru
Priority to CA2731207A priority patent/CA2731207A1/en
Priority to EP09746760A priority patent/EP2311474A4/en
Publication of WO2009139581A2 publication Critical patent/WO2009139581A2/ko
Publication of WO2009139581A3 publication Critical patent/WO2009139581A3/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/13—Coniferophyta (gymnosperms)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9728—Fungi, e.g. yeasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9755—Gymnosperms [Coniferophyta]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/18—Antioxidants, e.g. antiradicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/02—Preparations for care of the skin for chemically bleaching or whitening the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to an antioxidant, anti-inflammatory or anti-aging composition containing any one or more of the cambium- or procambium-derived cell line, its extract, its lysate and its culture.
  • Aging is a functional, structural, and biochemical process that occurs continuously from birth to death, and occurs throughout the cells and tissues that make up the human body. It shows metabolic rate, increased disease, and decreased adaptability. This is a phenomenon that leads to the death of the whole body.
  • Theories explaining the aging process and causes are largely genetic (Chung. HY et al ., Kor. J. Gerontol. , 2: 1, 1992) and wasted theory (Chung. HY et al., Kor. J. Gerontol. , 2: 1, 1992).
  • Consumption theory explains that the constituent cells of an organism deteriorate with time (wear & tear theory) or by accumulation of harmful substances, in particular human metabolism, radiation exposure, viruses and heavy metals.
  • the free radical theory that the free radicals generated through air pollution and the like form a highly toxic substance, not only promotes aging but also causes various diseases related to aging.
  • Free radicals collectively refer to a material having an electron that is not paired with the outermost electron orbit, and its structure is very unstable and highly reactive due to its nature of obtaining and stabilizing electrons.
  • free radicals derived from oxygen are called free radicals, and they react with proteins, lipids, and carbohydrates to induce lipid peroxidation, DNA damage, and oxidation of proteins, resulting in damage to intracellular structures, resulting in cell death.
  • it is involved in the inflammatory process as a cause of vascular aging and increases homocysteine in arteriosclerosis, Alzheimer's, and blood.
  • ROS reactive oxygen species
  • ROS generated in the cell's mitochondria during aging is a target for oxidative damage (Lesnefsky, EJ & Hoppel, CL Arch. Biochem. Biophys . 420, 287, 2003).
  • This free radical theory is the oxygen radical in the cell.
  • These oxidative stresses induce senescence. It is reported to play an important role (Chen Q. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA May 9; 92 (10): 4337, 1995; Packer L.
  • Aged cells undergoing replicative senescence can produce higher levels of ROS than young cells and produce toxic byproducts during normal metabolic processes such as superoxide, hydrogen peroxide, hygisol radicals, etc. do.
  • Experiments on older individuals and older test animals indicate that tissues accumulate oxidative damage to their DNA, proteins and lipids (Chen, Ann. NY Acad. Sci. , 908: 111, 2000).
  • ROS is an experimental model for in vitro aging and cell-to-aging in human fibroblasts and has been used to define the molecular changes associated with aging of human cells (HAYFLICK L. & MOORHEAD PS, Exp. Cell Res., 25 : 585, 1961).
  • La commonly called free radicals are reactive oxygen species is the most stable form of the oxygen singlet oxygen (3O 2) is a superoxide ion singlet oxygen that is generated is reduced in oxidation-reduction process (Superoxide anion; O 2-) and hydrogen peroxide (H 2 O 2 ), free radicals in unpaired states such as hydroxy radicals (OH), which cause diseases by damaging factors of the immune system such as proteins, DNA, enzymes and T cells (Regnstrom et al., Lancet. , 16: 1183, 1992; Gey et al., Am. Ac. J. Cin. Nutr ., 53: 326, 1991).
  • antioxidant enzymes such as superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase, which are enzyme-protective antioxidants, and vitamins which are natural antioxidants E, vitamin C, carotenoids, glutathione, and synthetic antioxidant butylhydroxyanisole (BHA) dibutylhydroxytoluene (3,5- (t-Butyl)-
  • BHA butylhydroxyanisole
  • antioxidant enzymes decrease their protection against free radicals as they age, while synthetic antioxidants are safer and more potent as their mutagenicity and toxicity are noted.
  • Inflammation is a local response to the wound to initiate pathogen invasion or removal of damaged tissue. Despite the positive role of inflammation, it has become one of the most common pathogenesis mechanisms for human disease.
  • NO nitric oxide
  • Inflammatory reactions are associated with various mediators and immune cells of local blood vessels and body fluids when infected with tissues (cells) or external infectious agents (bacteria, fungi, viruses, and various types of allergens). It has a series of complex physiological reactions, including substance secretion, fluid infiltration, cell migration, and tissue destruction, as well as external symptoms such as erythema, edema, fever, and pain. In normal cases, the inflammatory response removes external infectious agents and regenerates damaged tissues to restore the function of life.However, if the inflammatory response is excessive or persistent due to the absence of antigens or internal substances, the mucosal damage is promoted. Some lead to diseases such as cancer. Therefore, there has also been a need for the development of natural anti-inflammatory agents that can prevent excessive and persistent inflammatory reactions without side effects.
  • the present inventors have made efforts to minimize the side effects of the existing antioxidants and anti-inflammatory agents, and to develop a natural-derived composition having excellent antioxidant and anti-inflammatory activity.
  • the cell lines and extracts derived from the cambium or procambium of the yeast are aged. And it confirmed that it has the outstanding inhibitory effect on inflammation, and completed this invention.
  • composition for anti-oxidation, anti-inflammatory or anti-aging which is derived from the cambium or procambium of interest, and contains any one or more of a cell line, its extract, its lysate and its culture having the following characteristics: to provide:
  • the present invention also provides an anti-aging cosmetic composition containing any one or more of the cell line, its extract, its lysate and its culture.
  • the present invention also provides a cosmetic composition for whitening containing any one or more of the cell line, its extract, its lysate and its culture.
  • the present invention also provides an antioxidant functional food containing any one or more of the cell line, its extract, its lysate and its culture.
  • the present invention also provides an anti-aging functional food containing any one or more of the cell line, its extract, its lysate and its culture.
  • FIG. 1 is a photograph showing the induction process of the cell line according to the present invention, the appearance after separation of the layers of the procambium and the cambium, and a comparison between the dedifferentiated cells and the cells derived from the procambium and the cambium of interest.
  • Figure 2 is a process for extracting the effective material step by step from the cell line according to the present invention.
  • Figure 3 is a graph and DCFH fluorescence photographs comparing the amount of ROS showing the antioxidant activity of the cell line extract according to the present invention when inducing aging treatment with skin fibroblasts (HDF) with H 2 O 2 (p-WE: Typical layer distilled water extract, C-WE: cambium distilled water extract).
  • Figure 4 is a photograph showing the suppression of ERK expression of the cell line extract according to the present invention when inducing aging by treatment with skin fibroblasts (HDF) with H 2 O 2 (p-WE: typical distilled water extract, C-WE : Cambium distilled water extract).
  • FIG. 5 is a photograph showing the induction of MnSOD expression of the cell line extract according to the present invention when inducing aging by treatment with skin fibroblasts (HDF) with H 2 O 2 (P-WE: typical layer distilled water extract).
  • HDF skin fibroblasts
  • P-WE typical layer distilled water extract
  • Figure 6 is a photograph showing the inhibition of IL-1 ⁇ expression of the cell line extract according to the present invention when inducing inflammation by treating LPS to skin fibroblasts (HDF) (P-ME: typical layer methanol extract, C-WE: Cambium extract).
  • HDF skin fibroblasts
  • FIG. 7 is a photograph showing the suppression of MMP-9 expression of the cell line extract according to the present invention when inducing inflammation by treating LPS to skin fibroblasts (HDF) (P-ME: typical layer methanol extract).
  • FIG. 8 is a photograph showing the inhibition of MMP-2 expression of the cell line extract according to the present invention when LPS is treated to skin fibroblasts (HDF) (P-ME: typical layer methanol extract).
  • FIG. 9 is a photograph showing the inhibition of ICAM-1 expression of a cell line extract according to the present invention when LPS is treated to skin fibroblasts (HDF) (P-ME: typical layer methanol extract).
  • FIG 10 is a graph showing the results of measuring fibroblast viability when the cell line extract (DMSO extract of the cambium-derived cell line) according to the present invention was treated.
  • FIG. 11 is a graph showing the effect of removing the active oxygen species generated by ultraviolet irradiation of the cell line extract and the culture medium according to the present invention.
  • FIG. 12 is a graph showing the MMP-1 production inhibitory effect of the cell line extract and the culture medium according to the present invention when inducing MMP-1 by UV irradiation.
  • Figure 13 is a graph showing the melanin production inhibitory effect of the cell line extract and the culture medium according to the B-16 melanoma cell line.
  • the vascular "forming layer” is a side branch meristem located on the side of the plant, and the hypertrophy of the plant occurs by the action of the forming layer, and as a result, a large plant having an annual ring of 11,000 years or more can exist.
  • the vascular forming layer is derived from the procambium and is progressively differentiated, while maintaining mitotic continuity.
  • Such a formation layer and a typical formation layer were expected to obtain the same effect by using the formation layer and the typical formation layer structure in the present invention as the first phase cleavage structure.
  • cracked material refers to a cell lysate obtained by crushing a cell by a chemical method or a physical method using a detergent or the like
  • extract of a cell line is a material obtained by dissolving the cell in a solvent and using distillation or evaporation. Can be concentrated.
  • the "culture medium” of the cell line means a cell culture solution remaining after culturing the cells, excluding the cells.
  • innately undifferentiated refers to maintaining a pre-differentiation state, rather than being present in an undifferentiated state through a dedifferentiation process.
  • the present invention relates to a composition for antioxidant, anti-inflammatory or anti-aging containing any one or more of a cambium- or procambium-derived cell line of interest, its extract, its lysate and its culture.
  • the cambium- or procambium-derived cell line of interest is (a) innately undifferentiated; (b) faster growth and stable culture compared to tissue-derived cell lines other than the cambium or procambium of interest; And (c) morphological features having a plurality of vacuoles.
  • the cell line additionally (a) is in a single cell state in suspension culture; And (b) has a low sensitivity to shear stress in a bioreactor compared to tissue-derived cell lines other than the cambium or procambium of interest.
  • the cell line may be characterized in that obtained by the separation method comprising the following steps:
  • the cell line is 3 to 5% by weight of raw sugar or sugar; And methyl jasmonate, fungal extract, bacterial extract, yeast extract, chitosan, glucomanan, glucan, phenylalanine, benzoic acid, salicylic acid ), Arachonic acid, STS, mevalonalonate N-benzolyglycine, ABA, SNP, IPP, BHT, CCC, ethephon, hipuic acid, ammonium ceric nitrate, Substances selected from the group consisting of AgNO 3 , vanadyl sulfate, p-aminobenzoic acid, brassinosteroids, sodium alginate, sodium acetate (sodium acteate) It may be characterized in that it is further cultured in a medium containing. At this time, the methyl jasmonate (methyl jasmonate) may be added in a content of 10 ⁇ 100 ⁇ M.
  • the extract may be characterized in that it is extracted using a solvent selected from the group consisting of distilled water, alcohol, acetone, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) and a mixed solvent thereof.
  • a solvent selected from the group consisting of distilled water, alcohol, acetone, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) and a mixed solvent thereof.
  • the cell line extract is treated with skin fibroblasts with H 2 O 2 to inhibit the generation of reactive oxygen species and the expression of p-ERK1 / 2 and confirm that the expression of MnSOD is induced.
  • the antioxidant activity of the cell line extract was confirmed.
  • the cell line extract was treated with dermal fibroblasts along with LPS to inhibit ICAM-1, MMP9, MMP2 and IL-1 ⁇ , thereby confirming the anti-inflammatory activity of the cell line extract according to the present invention. . That is, the cell line extracts were treated before aging and inflammation were induced to block these signals in cells.
  • the cell line extract and cell line culture medium according to the present invention has the effect of removing the active oxygen species generated by ultraviolet irradiation.
  • the cell line extract has antioxidant, anti-inflammatory and anti-aging activity. It has been confirmed that the cell line itself or a composition containing the lysate according to the present invention exhibits antioxidant activity and anti-inflammatory activity, thereby preventing aging and preventing and improving skin inflammation. It will be self-evident to those who have.
  • Antioxidant, anti-inflammatory or anti-aging compositions containing any one or more of the cell line, its extract, its lysate and its culture according to the present invention as an active ingredient, each of them alone or one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or It may be provided in a pharmaceutical composition including a diluent, wherein the cell line or extract of the cell line is in an appropriate pharmaceutically effective amount depending on the disease and its severity, the patient's age, weight, health condition, sex, route of administration and duration of treatment It may be included in a pharmaceutical composition.
  • pharmaceutically acceptable refers to a composition that is physiologically acceptable and that, when administered to a human, typically does not cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorders, dizziness, or the like.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition may further include fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives.
  • Pharmaceutical compositions of the invention can also be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • the formulations may be in the form of powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, sterile powders.
  • the cell line extract and the culture medium according to the present invention is a type I collagenase (matrix) to a superior degree compared to the yew tree extract and RA (Retionic acid) known to be excellent anti-aging effect metalloproteinase-1, MMP-1) has been shown to show the inhibitory effect
  • cell line according to the present invention the extract, the lysate or composition containing the culture medium has the effect of inhibiting the degradation of collagen, thus preventing skin aging and wrinkles It was shown that there is an improvement effect, very useful as an anti-aging cosmetic composition. Therefore, in another aspect, the present invention relates to an anti-aging cosmetic composition containing any one or more of the cambium- or procambium-derived cell line, its extract, its lysate and its culture as an active ingredient.
  • the present invention relates to a cosmetic composition for whitening containing any one or more of cell lines derived from the cambium or procambium of interest, extracts thereof, lysates and cultures thereof.
  • the term "functional cosmetics” means cosmetics that have improved the functionality of general cosmetics by adding any one or more of the cell line, its extracts, its lysate, and its culture solution according to the present invention to general cosmetics.
  • functional cosmetics can be provided using an anti-aging cosmetic composition containing the cell line of the present invention or an extract thereof.
  • the components included in the cosmetic composition of the present invention include components conventionally used in cosmetic compositions in addition to extracts as active ingredients, and include, for example, conventional auxiliaries such as solvents, stabilizers, solubilizers, emulsifiers, vitamins, pigments and perfumes, and And a carrier.
  • auxiliaries such as solvents, stabilizers, solubilizers, emulsifiers, vitamins, pigments and perfumes, and And a carrier.
  • the cosmetic composition of the present invention may be prepared in any formulation commonly prepared in the art, but preferably, lotion, nutrition lotion, nutrition cream, massage cream, nutrition essence, pack, makeup base, foundation, body oil , Hair oil, shampoo, rinse is characterized in that it is prepared in a formulation selected from the group consisting of.
  • any one or more of the cell line of the present invention, its extract, its lysate and its culture solution contains an antioxidant effect, thereby eliminating free radicals in the skin and protecting the intracellular antioxidant system. It can exert the effect of preventing and delaying the skin aging caused by oxidation by the action of free radicals, etc., it can prevent skin aging and improve wrinkles by inhibiting the production of MMP-1.
  • the present invention relates to an antioxidant functional food containing any one or more of the cambium- or procambium-derived cell line of interest, its extract, its lysate and its culture as an active ingredient.
  • the present invention relates to an anti-aging functional food containing any one or more of the cambium- or procambium-derived cell line of interest, its extract, its lysate and its culture as an active ingredient.
  • the term "functional food” means that the functionality of the food is improved by adding the cell line or the extract of the cell line according to the present invention to a general food.
  • the following examples confirmed the antioxidant, anti-inflammatory and anti-aging effects and the whitening effect of the extract of the cambium- or procambium-derived cell line of the yeast and its culture, but similar results can be obtained using the cell line itself. It will be obvious to those with ordinary knowledge in the industry.
  • the exfoliated tissues consist of the neck, the typical or cambium, the dead quarter, the cortex, and the epidermis.
  • amorphous callus began to be induced by dedifferentiation from the layer consisting of dead skin, cortex and epidermis.
  • the neck did not divide and the separation between the typical layer and the layer of the formation layer (natural) was made naturally.
  • FIG. 1 shows the separation of the Asms procambium, after removal of the neck and cultured, the top represents the four-part, cortex, epidermal tissue, the bottom represents the procambium.
  • A represents a sedimentation layer separation, the top represents a four-part, cortical and epidermal tissue, the middle represents a formation layer, and the bottom represents a neck.
  • Arrow heads indicate the separation between the typical and stratified layers and the dead, cortical and epidermal tissue.
  • B is a cell line derived from a quadrilateral, cortical and epidermal-containing tissue that proliferates at an irregular shape due to division between cells
  • C is in the form of a plate with uniform division between cells.
  • D represents the neck where cell division does not occur. After separation, the white and soft parts with good growth rate were passaged every 21 days with the same fresh medium as the induced medium.
  • Auxins such as NAA and IAA were added to the culture medium at a concentration of 1 to 3 mg / L, preferably at a concentration of 2 mg / L. Cultivation was carried out in a dark room controlled at 25 ⁇ 1 °C.
  • the embryo and leaf sections of interest were sterilized and cultured in the medium of Table 1, and as a result, the embryo and leaf sections were dedifferentiated. It was observed that callus forms. Callus induced from embryonic and leaf explants was irregular due to differences in the rate of division between cells, such as tetrahedral tissue, and showed unstable growth rate and easily browned. Callus derived from browned and agglomerated rice and leaf fragments eventually became dull by the phenolic compounds they secreted, and eventually became necrotic. That is, after six months, callus derived from embryos and needles was difficult to maintain and culture. On the other hand, the procambium and cambium-derived cells were stably maintained without change in cell growth rate, growth pattern, and degree of aggregation during long-term culture for more than 20 months, thereby enabling mass culture.
  • the procambium and cambium-derived cell lines were placed in a flask containing the liquid medium of Table 2 below and incubated in a rotary shaker at 100 rpm at 25 ⁇ 1 ° C. under dark conditions.
  • the subculture period was fixed at 2 weeks so that the cultured cells could always maintain high vitality in the algebraic state.
  • pear and leaf-derived callus was also cultured in the medium 2 of ⁇ Table 2> and compared with the cell lines derived from the procambium and cambium according to the invention.
  • the embryos and leaf-derived callus and the procambium and cambium-derived cells were cultured in a 3L airlift bioreactor (Seongwon Cytec, Korea). It was.
  • the medium used was the liquid medium of Table 2, and kept constant at 25 ⁇ 1 ° C in dark conditions.
  • the doubling time of the embryo-needles-derived culture was 12 days in the flask, but increased to 21 days in the reactor.
  • the cell viability was rapidly reduced due to the sensitivity to shear due to the rigidity of the culture and the cell wall, while the doubling time of the typical and cambium-derived cell cultures was 4-5 days between the flask and the reactor.
  • Example 2 After cell culture in suspension for 14 days as in Example 1 (4) in a medium in which 3 ⁇ 5% by weight (g / L) of raw sugar and 100 ⁇ M of methyl jasmonate were added to sterile water for 10 days, the cells was collected and the following experiment was performed.
  • Example 3 Human diploid fibroblast (HDF) cell culture
  • HDF cells were isolated and cultured from fetal penis foreskin.
  • Cell culture medium was 10% of fetal calf serum (FBS, Hyclone, Logan, Utah, USA) inactivated by heating at 56 ° C for 30 minutes in DMEM (Invitroge Gibco life tech. Vienna, Austriea) medium, penicillin (100unit / Ml), streptomycin (100 ⁇ g / ml) and 300 ⁇ g / ml-glutamine were added.
  • DMEM Invitroge Gibco life tech. Vienna, Austriea
  • penicillin 100unit / Ml
  • streptomycin 100 ⁇ g / ml
  • 300 ⁇ g / ml-glutamine were added.
  • Cells were cultured in a 37 ° C., 95% humidity, 5% CO 2 incubator using the above culture medium, usually passaged at intervals of 3-4 days just before the cells were fused to each other.
  • the following young cells were divided into 21-49
  • HDF cells were treated with 200 ⁇ M of H 2 O 2 and distilled water extract of the cell line obtained in Example 2 at 10 to 100 ⁇ g / ml. Preferably, 50 ⁇ g / ml was treated to observe the degree of change in cell morphology.
  • HDF cells After 24 hours of treatment with H 2 O 2 , HDF cells generate free radicals (ROS) due to oxidative stress. Since DCFDA, which is non-fluorescent, is oxidized by active oxygen to become a DCF showing strong fluorescence, it can be measured. In this example, FACS CAlibur (Becton Dickinson Analytic Flow Cytometer, USA) was used for the measurement.
  • ROS reactive oxygen species
  • Example 2 After 11 days of H 2 O 2 200uM and cell line distilled water extract obtained in Example 2 to the HDF cells, the cells were recovered to extract proteins. Protein amount was confirmed by Bradford method. That is, after HDF cells were recovered, intracellular proteins were extracted and quantified.
  • the amount of p-ERK1 / 2 was performed by western blotting. That is, the quantified protein was mixed with bromophenol blue stain and electrophoresed on 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). After electrophoresis, the protein was transferred to a polyvinyridine fluoride membrane (Milliposa), and a tris buffered saline (TBS) -tween solution containing 0.5% skim milk (10 mM Tris.HCl, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20) was used. , pH 7.5) to block nonspecific reactions.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • the rabbit antibody (Upstate) to ERK was reacted with a solution diluted at 1/600 for 3 hours at room temperature, and then reacted with an anti-rabbit IgG antibody as a secondary antibody.
  • the membrane was washed four times with TBS (Tris buffered saline) -tween solution, reacted with ECL (enhanced chemiluminescence) detection reagent for 1 minute, and then exposed to X-ray film at room temperature.
  • TBS Tris buffered saline
  • ECL enhanced chemiluminescence
  • the amount of MnSOD was performed by western blotting. That is, the quantified protein was mixed with bromophenol blue stain and electrophoresed on 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). After electrophoresis, the protein was transferred to a polyvinyridine fluoride membrane (Milliposa), and a tris buffered saline (TBS) -tween solution containing 0.5% skim milk (10 mM Tris.HCl, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20) was used. , pH 7.5) to block nonspecific reactions.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • mice antibody Upstate
  • MnSOD Mouse anti-mouse antibody
  • TBS Tris buffered saline
  • ECL enhanced chemiluminescence
  • Example 6 Determination of anti-inflammatory activity of cambium- or procambium-derived cell line extracts-ICAM-1, MMP-9, MMP-2 and IL-1 ⁇ -inhibiting ability induced by LPS
  • LPS Lipopolysacharide: Escherichia coli strain B5: 025, Sigma, St. Louis, MO
  • E. Coli toxin is a nuclear factor- ⁇ B (NF) in the nucleus of cells such as macrophage, fibroblast, dendritic cells, and lymphocytes.
  • NF nuclear factor- ⁇ B
  • -kB is activated to promote the secretion of various inflammatory cytokines (cytokine).
  • cytokine cytokine
  • IL-1 ⁇ a product of inflammatory stimulatory signaling
  • the HDK cells were treated with the cell line extract obtained in Example 2 and LPS, and the experiment was performed to determine whether the cell line extract according to the present invention inhibits the expression of IL-1 ⁇ .
  • HDF cells were treated with 10 ⁇ g / ml LPS and 10-100 ⁇ g / ml methanol extract in the extract of the cell line obtained in Example 2. At this time, it is 50 microgram / ml which is a preferable process amount. After treatment with methanol extract, the cells were recovered after 3, 6 and 24 hours to extract proteins. Protein amount was confirmed by Bradford method. That is, after HDF cells were recovered, intracellular proteins were extracted and quantified.
  • the amount of IL-1 ⁇ was carried out by western blotting. Quantified proteins were mixed with bromophenol blue stain and electrophoresed on 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). After electrophoresis, the protein was transferred to a polyvinyridine fluoride membrane (Milliposa), and a tris buffered saline (TBS) -tween solution containing 0.5% skim milk (10 mM Tris.HCl, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20) was used. , pH 7.5) to block nonspecific reactions.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • the antibody (Upstate) of the mouse against IL-1 ⁇ was reacted with a solution diluted to 1/600 for 3 hours at room temperature, and then reacted with an anti-cow mice IgG antibody as a secondary antibody.
  • the membrane was washed four times with TBS (Tris buffered saline) -tween solution, reacted with ECL (enhanced chemiluminescence) detection reagent for 1 minute, and then exposed to X-ray film at room temperature.
  • TBS Tris buffered saline
  • ECL enhanced chemiluminescence
  • MMP-9 a product of inflammatory stimulus signaling
  • the HDK cells were treated with the cell line extract obtained in Example 2 and LPS, and the experiment was performed to determine whether the cell line extract according to the present invention inhibits the expression of MMP-9.
  • HDF cells were treated with 10 ⁇ g / ml LPS and 10-100 ⁇ g / ml methanol extract in the extract obtained in Example 2. At this time, it is 50 microgram / ml which is a preferable process amount. After treatment with methanol extract, after 6 hours the cells were recovered to extract the protein. Protein amount was confirmed by Bradford method. That is, after HDF cells were recovered, intracellular proteins were extracted and quantified.
  • the amount of MMP-9 was performed by western blotting. That is, the quantified protein was mixed with bromophenol blue stain and electrophoresed on 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). After electrophoresis, the protein was transferred to a polyvinyridine fluoride membrane (Milliposa), and a tris buffered saline (TBS) -tween solution containing 0.5% skim milk (10 mM Tris.HCl, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20) was used. , pH 7.5) to block nonspecific reactions.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • the antibody (Upstate) of MMP-9 was reacted with a solution diluted to 1/600 for 3 hours at room temperature, and then reacted with an anti-mouse IgG antibody as a secondary antibody.
  • the membrane was washed four times with TBS (Tris buffered saline) -tween solution, reacted with ECL (enhanced chemiluminescence) detection reagent for 1 minute, and then exposed to X-ray film at room temperature.
  • TBS Tris buffered saline
  • ECL enhanced chemiluminescence
  • HDF cells were treated with 10 ⁇ g / ml LPS and 10-100 ⁇ g / ml methanol extract in the cell line extract obtained in Example 2. At this time, it is 50 microgram / ml which is a preferable process amount. After treatment with methanol extract, the cells were recovered after 3, 6 and 24 hours to extract proteins. Protein amount was confirmed by Bradford method. That is, after HDF cells were recovered, intracellular proteins were extracted and quantified.
  • the amount of MMP-2 was performed by western blotting. That is, the quantified protein was mixed with bromophenol blue stain and electrophoresed on 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). After electrophoresis, the protein was transferred to a polyvinyridine fluoride membrane (Milliposa), and a tris buffered saline (TBS) -tween solution containing 0.5% skim milk (10 mM Tris.HCl, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20) was used. , pH 7.5) to block nonspecific reactions.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • the antibody (Upstate) of the mouse against MMP-2 was reacted with a solution diluted to 1/600 for 3 hours at room temperature, and then reacted with an anti-mouse IgG antibody as a secondary antibody.
  • the membrane was washed four times with TBS (Tris buffered saline) -tween solution, reacted with ECL (enhanced chemiluminescence) detection reagent for 1 minute, and then exposed to X-ray film at room temperature.
  • TBS Tris buffered saline
  • ECL enhanced chemiluminescence
  • HDF cells were treated with the cell line methanol extract obtained in Example 2 and LPS, and an experiment was performed to determine whether the cell line extract according to the present invention inhibits the expression of ICAM-1.
  • HDF cells were treated with 10 ⁇ g / ml LPS and 10-100 ⁇ g / ml methanol extract in the extract of the cell line obtained in Example 2. At this time, it is 50 microgram / ml which is a preferable process amount. Methanol extracts were treated, cultured for 1, 3, 6, 12 and 24 hours, and then cells were recovered to extract proteins. Protein amount was confirmed by Bradford method. That is, after HDF cells were recovered, intracellular proteins were extracted and quantified.
  • the amount of ICAM-1 was performed by western blotting. That is, the quantified protein was mixed with bromophenol blue stain and electrophoresed on 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). After electrophoresis, the protein was transferred to a polyvinyridine fluoride membrane (Milliposa), and a tris buffered saline (TBS) -tween solution containing 0.5% skim milk (10 mM Tris.HCl, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20) was used. , pH 7.5) to block nonspecific reactions.
  • SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis
  • the antibody (Upstate) of the mouse against ICAM-1 was reacted with a solution diluted at 1/600 for 3 hours at room temperature, and then reacted with an anti-mouse IgG antibody as a secondary antibody.
  • the membrane was washed four times with TBS (Tris buffered saline) -tween solution, reacted with ECL (enhanced chemiluminescence) detection reagent for 1 minute, and then exposed to X-ray film at room temperature.
  • TBS Tris buffered saline
  • ECL enhanced chemiluminescence
  • ICAM-1 is a representative protein of the cell adhesion substance expressed on the surface of endothelial cells. Normally, ICAM-1 is expressed at a very low level, but is expressed in cytokine inflammatory mediators such as TNF- ⁇ , interone- ⁇ , and interleukin-1 ⁇ . When stimulated by it, the expression level is rapidly increased to attach inflammatory cells such as monocytes or lymphocytes that move in the bloodstream, and it is known that the inflammatory cells play a role in migration to inflammatory tissues [Wegner CD et al, Science , 247 (1941): 456, 1990; Dustin, ML et al, J.
  • ICAM-1 acts early in the inflammatory cell's migration and focus to the site of inflammation and is important for amplifying the inflammatory response. It works. Therefore, the expression of such ICAM-1 was suppressed by the treatment of the cell line according to the present invention, the composition according to the present invention was found to have the effect of inhibiting and preventing inflammation.
  • NHDF Normal human dermal fibroblasts
  • DMSO extract of the cambium-derived cell line of interest was measured not to reduce the survival rate of the cells in the experimental range, it was shown that the survival rate slightly decreased in 10% of the culture solution.
  • the cell activity is 80% or less, it is determined that there is cytotoxicity, the cell line extract and the culture medium according to the present invention in the experimental range was found to have no cytotoxicity.
  • Example 8 Confirm the effect of removing the reactive oxygen species generated by ultraviolet irradiation
  • the human keratinocyte line (HaCaT: German Cancer Research Institute, Heidelberg, Germany) was cultured in DMEM medium added with 10% FBS. Inoculate 3 ⁇ 10 4 / (96 wells) and incubate for 12 hours to attach, and as a sample, DMSO extract of the cambium-forming and procambium-derived cell lines of Example 2 at concentrations of 1, 10, 25 and 50 ppm, The culture solution of Example 2 was added to FMEM-free DMEM medium at concentrations of 0.1 and 1% by volume and treated for 3 hours. At this time, NAC (N-acetyl-cysteine) was treated with 10 mM as a positive control, DMSO extract of yew tree was treated with a concentration of 1, 10, 25 and 50 ppm as a further control.
  • HaCaT German Cancer Research Institute, Heidelberg, Germany
  • the treatment of the cell line DMSO extract and the culture medium according to the present invention was confirmed that there is an effect of removing the active oxygen species induced by ultraviolet light (in the case of cell line extract derived from the procambium
  • the yew tree extract, a control group was 44% (1ppm), 55% (10ppm), 48% (25ppm) when the rate of decrease of the measured value when the sample was added was compared to the measured value of the untreated group (0 ppm added group) under UV treatment.
  • Example 9 Confirmation of the inhibitory effect of collagenase (MMP-1) production induced by ultraviolet irradiation
  • fibroblasts (MCTT, Korea) were inoculated with 2 ⁇ 10 4 / (24 wells), incubated for 12 hours, and then attached for 12 hours in FMEM-free DMEM medium. Washed with DPBS buffer and irradiated with 365 nm 100 mJ / cm 2 .
  • DMSO extract of the cambium-forming and procambium-derived cell lines of Example 2 at a concentration of 50 and 25 ppm, and the culture medium of Example 2 at a concentration of 1 and 0.1% were sampled for 24 hours in each FBS-free DMEM medium. Treated.
  • the cell line extract and cell line culture medium according to the present invention is excellent in inhibiting the MMP-1 production (in the case of the cell line extract, the measurement value of the extract of the procambium-derived cell line and the cambium-derived cell line extract).
  • MMP-1 inhibitory effect was shown to be very good as compared to the control of yew tree extract and RA, which is known to be excellent in anti-aging effect, and thus appeared to be particularly useful as an anti-aging cosmetic composition.
  • Murine melanoma (B-16 F1) (Korea Cell Line Bank, Korea) was inoculated with DMEM medium containing 10% FBS in a 6-well plate at 1 ⁇ 10 5 per well, and then at 5% CO 2 at 37 ° C. Cells were incubated until about 80% adhered to the well bottom. The medium was removed, and the sample of the cambium and procambium-derived cell line DMSO extract of Example 2 was added at 1 and 10 ppm as a sample and the culture medium of Example 2 was replaced with a medium diluted to concentrations of 0.05, 0.1 and 1%. After 5% CO 2 , it was incubated for a certain time at 37 °C.
  • the cell line extract and the culture medium according to the present invention was confirmed that the production of melanin was inhibited (in the case of the cell line extract, the average value of the measured value of the cell line extract and the cambium-derived cell line extract ).
  • the melanin production inhibitory effect similar to the Kojic acid known as the whitening effect was obtained.
  • the cell line extract and the culture medium according to the present invention were found to be very useful as a cosmetic composition for whitening. .
  • 100 mg of the cell line extract prepared in Example 2 was prepared according to a conventional tablet preparation method by mixing 100 mg of corn starch, 100 mg of lactose and 2 mg of magnesium stearate.
  • 500 mg of the cell line extract prepared in Example 2 was filled into soft gelatin capsules to prepare capsules.
  • 100 ml of syrup was prepared according to the conventional method of preparing a liquid formulation in the content of 1 g of the cell line prepared in Example 1, 10 g of isomerized sugar, 5 g of mannitol, and an appropriate amount of purified water.
  • 200 mg of the cell line extract prepared in Example 2 was heat-dissolved in 200 mg of physiological saline containing polyoxyethylene hydrogenated castro oil to prepare an injection containing the mixed extract at a concentration of 0.1%.
  • emulsion was prepared in a conventional manner according to the amount of the perfume and the composition of purified water (to be added to 100mg total).
  • Cell line extract prepared in Example 2 5.0 mg, 1,3-butylene glycol 7.0 mg, glycerin 1.0 mg, D- panthenol 0.1 mg, magnesium aluminum silicate 0.4 mg, stearic acid 2.0 mg, polysorbate 60 1.5 mg, Lipophilic glyceryl stearate 2.0 mg, sorbitan sesquioleate 1.5 mg, mineral oil 4.0 mg, cetearyl alcohol 3.0 mg, squalane 3.8 mg, carlic / capric triglyceride 2.8 mg, dimethicone 0.4 mg, xanthan Cream was prepared according to the conventional method according to the composition of the test amount, triethanolamine amount, tocopheryl acetate amount, small amount of preservative, combination perfume amount, purified water (to be added to 100mg total).
  • the composition according to the present invention has the effect of minimizing the side effects of the existing antioxidants and anti-inflammatory agents, reducing the free radicals in the cell by participating in metabolism in the cell, and reducing and inducing signals associated with aging, It is useful for preventing and delaying aging.
  • the composition according to the present invention has an effect of inhibiting the production of melanin and is also useful as a cosmetic composition for whitening.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Birds (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cosmetics (AREA)

Abstract

본 발명은 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 항산화, 항염증 또는 항노화용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 기존 항산화제와 항염증제의 부작용을 최소화하며, 세포 내의 대사작용에 관여하여 세포 내 활성산소를 감소시키고, 노화와 관련된 신호들을 감소 및 유도시키는 효과가 있으므로, 노화의 방지 및 지연에 유용하다. 아울러, 본 발명에 따른 조성물은 멜라닌 생성을 억제하는 효과가 있어 미백용 화장료 조성물로서도 유용하다.

Description

주목의 형성층 또는 전형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항노화용 조성물
본 발명은 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 항산화, 항염증 또는 항노화용 조성물에 관한 것이다.
노화란 인간이 태어나서 사망할 때까지 지속적으로 일어나는 기능적, 구조적, 생화학적 과정으로 인체를 구성하고 있는 세포와 신체조직 전체에 일어나며, 대사속도의 저하, 질병증가, 적응력 저하 등을 나타내어 궁극적으로는 세포와 신체 전체의 사망에 이르게 되는 현상이다. 노화 과정 및 원인을 설명하는 학설은 크게 유전자설(Chung.H.Y. et al., Kor. J. Gerontol., 2:1, 1992)과 소모설(Chung.H.Y. et al., Kor. J. Gerontol., 2:1, 1992)로 나뉜다. 이중 소모설은 생물체의 구성세포가 시간의 경과에 따라 기능이 저하된다고 설명하거나(wear & tear theory), 유해물질의 축적에 의한 것으로 설명하는데, 특히 그 중 인체 대사과정, 방사능 노출, 바이러스, 중금속 및 대기오염 등을 통해 생성되는 자유 라디칼들이 독성이 강한 물질을 형성함으로써 노화를 촉진할 뿐 아니라 노화와 관련된 각종 질병을 일으킨다는 자유 라디칼 이론(free radical theory)이 가장 유력한 학설로 받아들여지고 있다.
자유 라디칼은 최외곽 전자궤도에 짝짓지 않은 전자를 하나 가지는 물질을 총칭하는데, 그 구조가 매우 불안정하여 전자를 얻어 안정화하려는 성질로 인해 반응성이 매우 높다. 특히 산소에서 유래되는 자유 라디칼을 활성산소라 칭하며, 이들은 단백질, 지질, 탄수화물 등과 반응하여 지질과산화, DNA손상, 단백질의 산화등을 유발하여 세포내 구조물에 손상을 야기하며 결과적으로 세포의 사멸을 초래하게 되며 특히 혈관노화의 원인으로 염증과정에 관여함으로써 동맥경화, 알츠하이머, 혈중에 호모시스테인을 증가시킨다.
산소와 관련된 인체 내 독성물질을 활성산소종(ROS: reactive oxygen species)이라고 하는데 이러한 ROS의 종류로는 수퍼옥사이드(superoxide), 히드록실(hydroxyl), 페록실(peroxyl), 알콕실(alkoxyl), 히드로페록실(hydroperoxyl)과 같은 프리라디칼(유리기, free radical)과 히드로젠페록사이드(hydrogenperoxide), 히포클로로스 산(hypochlorous acid), 오존(ozone), 일중항 산소(singlet oxygen), 페록시니트라이트(peroxinitrite) 등과 같은 비(非)프리 라디칼(비유리기, non free radial)이 있다. 이 중에서 산소 독성 중 가장 많이 연구되어 왔고 중요한 역할을 하는 것은 수퍼옥사이드로 프리 라디칼(superoxide free radical, 활성 산소 또는 유해산소)이라고 알려져 있다(Fridovich L., Science, 201:175,1978).
노화가 진행되는 동안 세포의 미토콘드리아에 발생된 ROS는 산화 데미지를 나타내는 타겟이 된다(Lesnefsky, E.J. & Hoppel, C.L. Arch. Biochem.Biophys.420, 287, 2003) 세포 내 산소 라디칼인 이 자유 라디컬 이론은 노화와 연관되어진 산화적 스트레스와 이로 인한 노화-관련 질병에 많은 상관 관계가 있다는 보고들이 나타나고 있으며(Finkel, T. & Holbrook, N.J., Science 408;239, 2000) 이들 Oxidative stress는 senescence를 유도하는데 중요한 역할에 관여한다고 보고되어 있다 (Chen Q. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. May 9;92(10):4337, 1995; Packer L. & Fuehr K., Nature, 267(5610):423, 1977) 이러한 산화적 스트레스는 증가하는 활성산소종의 레벨과 감소된 antioxidant reserve에 의한 macromolecules의 산화에 의해 세포에 영향을 준 손상을 설명하기 위해 사용된 용어이다 (Thomas C. & Squier, Experimental Gerontology, 36;1539, 2001).
복제적인 노화(Replicative senescence)가 진행되는 노화된 세포는 젊은 세포보다 더 높은 레벨의 ROS를 생산할수 있고, 수퍼옥사이드, 하이드로겐 퍼옥사이드, 하이도록실 라디칼 등과 같은 정상 대사과정 중에 독성 부산물들을 생산하게 된다. 나이 든 개인이나, 늙은 실험 동물에 대한 실험 결과에 의하면 조직들은 그들의 DNA, 단백질 및 지방(lipid)에 산화적 데미지를 축적한다 (Chen, Ann. N. Y. Acad. Sci., 908:111, 2000). ROS와 특히 하이도록실 라디칼은 DNA를 공격하고 8-oxo-2'-deixyguanosine 과 다른 강력한 mutagenic abducts의 형성을 야기하며 각 종마다 ROS의 비율은 life-span과 관련되어 있고 이것은 노화의 비율과 다양한 노화와 관련된 질병에 대한 정의를 내리는데 결정적 요인이 되는 것을 의미한다 (Finkel & Holbrook, Nature, 408(6809): 239, 2000).
"젊은 배양 세포에서 복제능은 점차 분열 횟수가 진행될수록 감소하게 되고 결국 증식하기 위한 능력을 잃고 성장상태가 끝나게 되는 doubling limited가 주어지게 된다."고 1961년 Hayflick과 Moorhead에 의해 처음으로 제시되면서, ROS는 인간 피브로블라스트에서 in vitro 노화와 세포대 노화를 위한 실험모델로서 인간세포의 노화와 관련된 분자적 변화를 정의하는데 사용되어지고 있다(HAYFLICK L. ＆ MOORHEAD P.S., Exp. Cell Res., 25:585, 1961).
인간을 포함한 모든 호기성 생물체는 산소를 이용한 에너지 대사 과정에서 항상 발생하는 활성산소의 상해에 대하여 근본적으로는 자기방어 기구를 구비하고 지만, 조직의 방어능을 초월한 활성산소의 생성은 최근 성인병이라 불려지는 관절염, 순환기 장애 뿐만 아니라 치매 등과 같은 여러 질환의 원인이 되고 있다(Halliwell et al., Drugs, 42:569, 1991; Fukuzawa et al., J. Act. oxyg. Free Rad., 1:55, 1990).
흔히 유해산소라 불려지는 활성산소는 가장 안정한 형태의 산소인 중항산소(3O2)가 산화, 환원과정에서 환원되어 생성되는 일중항산소인 슈퍼옥사이드 이온(Superoxide anion; O2-)과 과산화수소(H2O2), 하이드록시라디칼(·OH)과 같은짝짓지 않은 상태의 자유 라디칼로서, 이들은 단백질, DNA, 효소 및 T세포와 같은 면역계통의 인자를 손상시켜 질환을 일으킨다(Regnstrom et al., Lancet., 16:1183, 1992; Gey et al., Am. Ac. J. Cin. Nutr., 53:326, 1991).
이러한 이유로 항산화제의 개발 연구가 활발히 진행되어 효소계열인 예방적 항산화제인 슈퍼옥사이드 디스무테이즈(Superoxide dismutase), 카탈레이즈 (Catalase), 글루타티온페록시데이즈(Glutathioneperoxidase) 등과 같은 항산화효소와 천연항산화제인 비타민 E, 비타민 C, 카로테노이드(Carotenoid), 글루타티온(Glutathione) 및 합성항산화제인 부틸히드록시아니졸 (t-Butyl-4-hydroxyanisole; BHA) 디부틸히드록시톨루엔 (3,5-(t-Butyl)-4-hydroxytoluene; BHT) 등 많은 항산화제가 알려져 있으나, 항산화효소는 나이가 들어서 늙어감에 따라 활성산소에 대한 방어능력이 감소되며, 합성 항산화제 경우 그의 변이원성 및 독성이 지적되면서 보다 안전하고 효력이 강한 천연 항산화제의 개발이 절실히 요청되고 있는 실정이다(Hatano et al., Natural Medicines, 49:359, 1995; Masaki et al., Biol. Pharm. Bull, 18:162, 1995).
한편, 염증(inflammation)은 병원체의 침입 또는 손상된 조직 제거를 개시하기 위해 상처부위에 대해 나타나는 지역적인 반응이다. 염증의 긍정적인 역할에도 불구하고 인간질병을 위한 가장 일반적인 발병 메커니즘의 하나가 되었다. 활성화된 백혈구(monocytes) 및 대식세포에 의한 산화질소(NO)의 생성이 강력한 염증 반응을 개시하고, 세균 병원체에 대한 초기 면역반응에서 가장 중요한 부분이 된다 (Bogdan C., Nat. Immunol., 2:907, 2001).
염증 반응은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등 외적 증상을 나타낸다. 정상인 경우 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등의 질환을 이끈다. 따라서, 부작용 없이 과도하고 지속적인 염증 반응을 예방할 수 있는 천연 항염증제의 개발 또한 요구되었다.
이에 본 발명자들은 기존 항산화제 및 항염증제의 부작용을 최소화하고, 항산화 활성 및 항염증 활성이 우수한 천연물 유래 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주(cell line) 및 그 추출물이 노화 및 염증에 대해 뛰어난 억제 효과를 가진다는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 기존 항산화제 및 항염증제의 부작용을 최소화한 항산화 및 항염증 활성과 노화방지 및 지연효과를 나타내는 천연물 유래 조성물을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 주목의 형성층 또는 전형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 항산화, 항염증 또는 항노화용 조성물을 제공한다:
(a) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임;
(b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨; 및
(c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.
본 발명은 또한, 상기 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 노화방지용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 항산화 기능성 식품을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 노화방지용 기능성 식품을 제공한다.
본 발명의 다른 특징 및 구현예는 다음의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 더욱 명백해 질 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 세포주의 유도과정, 전형성층 및 형성층의 층의 분리 후 모습 및 탈분화된 세포와 주목의 전형성층 및 형성층 유래 세포 간 비교를 나타내는 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 세포주로부터 단계별로 유효물질을 추출하는 공정도이다.
도 3은 피부 섬유아세포(HDF)에 H2O2로 처리하여 노화를 유도할 때, 본 발명에 따른 세포주 추출물의 항산화 활성을 나타내는 ROS 량을 비교 그래프와 DCFH 형광 촬영 사진이다 (p-WE: 전형성층 증류수 추출물, C-WE: 형성층 증류수 추출물).
도 4는 피부 섬유아세포(HDF)에 H2O2로 처리하여 노화를 유도할 때, 본 발명에 따른 세포주 추출물의 ERK 발현 억제능을 나타내는 사진이다 (p-WE: 전형성층 증류수 추출물, C-WE: 형성층 증류수 추출물).
도 5는 피부 섬유아세포(HDF)에 H2O2로 처리하여 노화를 유도할 때, 본 발명에 따른 세포주 추출물의 MnSOD 발현 유도능을 나타내는 사진이다 (P-WE: 전형성층 증류수 추출물).
도 6은 피부 섬유아세포(HDF)에 LPS를 처리하여 염증을 유도할 때, 본 발명에 따른 세포주 추출물의 IL-1β 발현 억제능을 나타내는 사진이다 (P-ME: 전형성층 메탄올 추출물, C-WE: 형성층 메탄올 추출물).
도 7은 피부 섬유아세포(HDF)에 LPS를 처리하여 염증을 유도할 때, 본 발명에 따른 세포주 추출물의 MMP-9 발현 억제능을 나타내는 사진이다 (P-ME: 전형성층 메탄올 추출물).
도 8은 피부 섬유아세포(HDF)에 LPS를 처리하여 염증을 유도할 때, 본 발명에 따른 세포주 추출물의 MMP-2 발현 억제능을 나타내는 사진이다 (P-ME: 전형성층 메탄올 추출물).
도 9는 피부 섬유아세포(HDF)에 LPS를 처리하여 염증을 유도할 때, 본 발명에 따른 세포주 추출물의 ICAM-1 발현 억제능을 나타내는 사진이다 (P-ME: 전형성층 메탄올 추출물).
도 10은 본 발명에 따른 세포주 추출물 (주목의 형성층 유래 세포주의 DMSO 추출물)의 처리 시 섬유아세포 생존율을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 배양액의 자외선 조사에 의해 발생되는 활성산소종 제거 효과를 나타내는 그래프이다.
도 12는 자외선 조사하여 MMP-1를 유도할 때, 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 배양액의 MMP-1 생성억제효과를 나타내는 그래프이다.
도 13은 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 배양액의 B-16 melanoma 세포주에서 멜라닌 생성 억제효과를 나타내는 그래프이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본원에서, 유관속 "형성층"은 식물체의 측부에 위치하는 측재분열조직으로 형성층의 활동에 의해 식물의 비대생장이 일어나며, 그 결과 11,000년 이상의 연륜을 가진 거대 식물체가 존재할 수 있게 된다. 발생학적으로 유관속 형성층은 전형성층으로부터 기원되므로 분열조직적 연속성을 유지하면서 점진적으로 분화된 동일 분열조직이다. 이러한 형성층과 전형성층은 1기 분열조직으로서, 본 발명에 있어서 형성층 및 전형성층 조직을 사용하여 동일한 효과를 얻을 것으로 기대되었다.
본원에서 "파쇄물"이란 세포를 detergent 등을 이용한 화학적 방법 또는 물리적 방법 등으로 파쇄하여 얻은 세포 용해물을 의미하며, 세포주의 "추출물"이란 세포를 용매에 녹여 분리한 물질로, 증류 또는 증발을 이용하여 농축될 수 있다. 또한, 세포주의 "배양액"이란 세포를 배양시킨 다음, 세포를 제외하고 남은 세포 배양용액을 의미한다.
본원에서 "선천적인 미분화 상태(innately undifferentiated)"란 탈분화 과정을 거쳐 미분화 상태로 존재하는 것이 아닌, 본래부터 분화 전 상태를 유지하는 것을 말한다.
본 발명은 일 관점에서, 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 항산화, 항염증 또는 항노화용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주는 (a) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임; (b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨; 및 (c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타내는 것을 특징으로 한다. 아울러, 상기 세포주는 추가적으로 (a) 현탁배양 시 단세포 상태로 존재함; 및 (b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 얻어진 것임을 특징으로 할 수 있다:
(a) 주목의 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 수득하는 단계;
(b) 상기 수득된 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 배양하여 형성층 또는 전형성층으로부터 증식되는 형성층 또는 전형성층의 층(cambium or procambium layer)과 상기 형성층 또는 전형성층 이외의 부분으로부터 무정형으로 증식되는 캘러스 층을 유도하는 단계; 및
(c) 상기 캘러스 층으로부터 형성층 또는 전형성층의 층(cambium layer)을 분리하여 형성층 또는 전형성층 유래 세포주를 수득하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 세포주는 3~5중량%의 원당 또는 설탕; 및 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 진균류 추출물, 세균류 추출물, 효모(yeast) 추출물, 키토산, 글루코마난(glucomanan), 글루칸(glucan), 페닐알라닌(phenylalanine), 벤조산(benzoic acid), 살리실산(salicylic acid), 아라키돈산(arachonic acid), STS, mevalonalonate N-benzolyglycine, ABA, SNP, IPP, BHT, CCC, 에테폰(ethephon), 히푸익산(hippuic acid), 암모니움 세릭 니트레이트(amminoium ceric nitrate), AgNO3, 바나딜 설페이트(vanadyl sulfate), p-아미노벤조익산(p-aminobenzoic acid), 브라시노스테로이드(brassinosteroids), 소디움 알지네이트(sodium alginate), 소디움 아세테이트(sodium acteate)로 구성되는 군에서 선택된 물질;을 포함하는 배지에서 추가로 배양된 것임을 특징으로 할 수 있다. 이때, 상기 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate)는 10~100μM의 함량으로 첨가될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 알코올, 아세톤, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출된 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서는 상기 세포주 추출물을 H2O2와 함께 피부섬유아세포에 처리하여, 활성산소종의 생성 및 p-ERK1/2의 발현을 억제하고, MnSOD의 발현을 유도하는 것을 확인하여, 본 발명에 따른 세포주 추출물의 항산화 활성을 확인하였다. 또한, 본 발명에서는 상기 세포주 추출물을 LPS와 함께 피부섬유아세포에 처리하여, ICAM-1, MMP9, MMP2 및 IL-1β를 억제함을 확인하여, 본 발명에 따른 세포주 추출물의 항염증 활성을 확인하였다. 즉, 상기 세포주 추출물은 노화와 염증이 유도되기 전 처리되어 세포 내 이들 신호를 블로킹함을 확인하였다.
아울러, 본 발명의 다른 실시예에서는 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 세포주 배양액이 자외선 조사에 의하여 발생하는 활성산소종을 제거하는 효과가 있음을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서는 상기 세포주를 함유하는 조성물이 항산화 활성, 항염증 활성 및 항노화 활성을 나타냄을 제시하는 구체적인 실시예가 없다 하더라도, 상기에서 살펴본 바와 같이 그 세포주 추출물이 항산화, 항염증 및 항노화 활성을 가지는 것을 확인한바, 본 발명에 따른 세포주 자체나 그 파쇄물을 함유한 조성물의 경우에도 항산화 활성 및 항염증 활성을 나타내어 노화를 예방하고 피부염증을 예방 및 개선할 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다고 할 것이다.
본 발명에 따른 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항노화용 조성물은 이들을 각각 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학 조성물로 제공될 수 있으며, 상기 세포주 또는 세포주의 추출물은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료 기간 등에 따라 적절한 약학적으로 유효한 양으로 약학 조성물에 포함될 수 있다.
상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리톤, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사 용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
한편, 본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 배양액이 주목나무 추출물 및 노화방지 효과가 우수하다고 알려진 RA(Retionic acid)와 대비하여서도 더 우수한 정도로 타입Ⅰ콜라게나아제(matrix metalloproteinase-1, MMP-1) 생성 억제 효과를 보임을 확인한바, 본 발명에 따른 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 또는 그 배양액을 포함하는 조성물이 콜라겐의 분해를 억제하는 효과가 있으므로 피부노화방지 및 주름개선효과가 있는 것으로 나타난바, 노화방지용 화장료 조성물로서 매우 유용함을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 노화방지용 화장료 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 세포주 배양액이 Murine melanoma 세포주에서 멜라닌 생성을 억제하는 효과를 가짐을 확인하여, 미백용 화장료 조성물로서도 매우 유용함을 확인하였다. 따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 주목의 형성층 또는 전형성층에서 유래 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본원에서 '기능성 화장품'이란, 일반 화장품에 본 발명에 따른 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 첨가함으로써 일반 화장품의 기능성을 향상시킨 화장품을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 세포주 또는 그 추출물 등을 함유하는 노화방지용 화장료 조성물을 이용하여 기능성 화장품을 제공할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 용매, 안정화제, 용해화제, 유화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으나, 바람직하게는, 화장수, 영양로션, 영양크림, 맛사지크림, 영양에센스, 팩, 메이컵베이스, 파운데이션, 바디오일, 헤어오일, 샴프, 린스로 구성된 군에서 선택된 제형으로 제조되는 것을 특징으로 한다.
이러한 화장료 조성물의 제형 예에 상관없이 본 발명의 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하여 항산화 효과를 가지며, 이에 피부에 발생한 자유라디칼을 소거하고 세포내 항산화계 보호효과가 있어 자유라디칼 등의 작용에 의한 산화에 의하여 발생하는 피부 노화의 예방 및 지연 효과를 발휘할 수 있으며, MMP-1 생성 억제를 통하여 피부노화를 방지하고 주름을 개선할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항산화 기능성 식품에 관한 것이다.
아울러, 본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 노화방지용 기능성 식품에 관한 것이다.
본원에서 '기능성 식품'이란, 일반 식품에 본 발명에 따른 세포주 또는 세포주의 추출물을 첨가함으로써 식품의 기능성을 향상시킨 것을 의미한다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 추출물 및 그 배양액의 항산화, 항염증 및 항노화 효과 및 미백 효과를 확인하였으나, 그 세포주 자체를 사용해서도 유사한 결과를 얻을 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
실시예 1: 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 제조
(1) 식물재료의 준비
주목의 잔가지 및 줄기를 각각 채취한 후, 즉시 항산화제 100㎎/L 아스코르브산(L-ascorbic acid, DUCHEFA, The Netherlands) 용액에 침적하여 운송·보관하였다.
그 후, 1% 베노밀(benomyl, Dongbu Hannong Chemical, Korea), 1% 다코닐(daconil, Dongbu Hannong Chemical, Korea), 1% 스트렙토마이신(sterptomycin sulphate, DUCHEFA, The Netherlands), 0.1% 세포탁심(cefotaxime sodium DUCHEFA, The Netherlands)의 혼합용액에 24시간 전처리 후 페놀 화합물(phenolic compound)과 잔존 화학물질을 제거하기 위하여 수돗물(tap water)로 30분간 세척하였다. 그리고, 70% 에탄올(ethanol, DC Chemical, Korea)에 1분, 30% 과산화수소(hydrogen peroxide, LG Chemical, Korea) 15분, 1% CLOROX 용액에 15분, 3% CLOROX용액에 5분 표면 살균 후 3~4회 세척하였다.
(2) 잔가지 및 줄기로부터 전형성 및 형성층 조직 분리
상기 살균과정을 거친 잔가지 및 줄기의 바깥조직들을 세로방향으로 잡아당기면 쉽게 벗겨졌다. 벗겨진 조직들은 목부, 전형성층 또는 형성층, 사부, 피층, 표피로 구성되는데, 벗겨진 조직들의 가장 안쪽조직 즉, 목부가 배지면에 닿도록 배양하였다.
(3) 주목의 전형성층 및 형성층 유래 세포주 유도단계
초기 배양 4~7일째 전형성층 및 형성층으로부터 세포 분열이 육안상으로 관찰되고, 배양 15일 이후에 사부·피층 및 표피로 이루어진 층으로부터 탈분화에 의한 무정형의 캘러스가 유도되기 시작하였다. 그러나 배양기간 내내 목부는 세포분열이 일어나지 않아 전형성층 및 형성층의 층(layer)과의 분리가 자연스럽게 이루어졌다. 배양 30일 경과 후 전형성층 및 형성층의 층(layer)과 사부를 포함한 윗층, 즉 무정형의 캘러스층으로 분리되기 시작했고(도 1의 (a)A 및 (b)A), 두 층이 자연스럽게 분리될 때까지 기다렸다가 완벽한 분리가 이루어지면 각기 다른 페트리디쉬(petridish)에 분리 배양하였다(도 1의 (a)B~C, (b)B~D). 도 1의 (a)에서 Asms 전형성층 분리를 나타내며, 목부를 제거 후 배양하여 top은 사부·피층·표피 포함조직, bottom은 전형성층을 나타낸다. 도 1의 (b)에서 A는 형성층 분리를 나타내며, top은 사부·피층·표피 포함조직을, middle은 형성층을 나타내고, Bottom은 목부를 나타낸다. Arrow head는 전형성층 및 형성층의 층과 사부·피층·표피 포함조직 간의 분리를 표시한다. 또한, 도 1의 (a)와 (b)에서 B는 세포들간의 분열 차이로 부정형으로 증식되는 사부·피층·표피 포함조직 유래 세포주를, C는 세포들간의 분열이 균일하여 일정한 판의 형태로 증식되는 전형성층 및 형성층 유래 세포주를, (b)에서 D는 세포분열이 일어나지 않는 목부를 나타낸다. 분리 후, 생장률이 좋은 희고 무른 부분을 유도배지와 동일한 새로운 배지로 매 21일째 계대하였다.
한편, 전형성층 및 형성층 유래 세포주만을 유도하기 위해 사용한 배지는 <표 1>과 같다.
표 1
Figure PCTKR2009002553-appb-T000001
배지에 생장 조절제로서 NAA, IAA와 같은 옥신(Auxin)류를 1~3mg/L의 농도로 첨가하였는데, 바람직하게는 2mg/L의 농도로 첨가한다. 배양은 25±1℃로 조절된 암실에서 실시되었다.
한편, 비교를 위하여 주목의 배(embryo)와 잎(needle) 절편체를 소독한 후 상기 <표 1>의 배지에서 배양하였으며, 그 결과, 배(embryo)와 잎(needle) 절편체는 탈분화에 의해 캘러스가 형성함을 관찰할 수 있었다. 배 및 잎 절편체에서 유도된 캘러스는 사부포함조직과 같이 여러 세포들 간의 분열 속도에 차이로 부정형을 이루었고, 생장률이 불안전하며 쉽게 갈변되는 경향을 보였다. 갈변 및 응집되어진 벼 및 잎 절편체에서 유도된 캘러스는 종국에는 자신이 분비하는 페놀 화합물에 의해 생장이 둔해지다가 종국에는 괴사하였다. 즉, 6개월 후부터 배(embryo)와 잎(needle)으로부터 유도된 캘러스들은 유지 및 배양이 어려웠다. 반면, 전형성층 및 형성층 유래 세포는 20개월 이상 장기 배양시 세포의 생장률, 생장 패턴, 응집 정도에 변이 없이 안정적으로 유지되어 대량 배양이 가능했다.
(4) 분리된 세포주의 증식단계 및 특성관찰
상기 전형성층 및 형성층 유래 세포주를 하기 <표 2>의 액상배지가 함유된 플라스크에 넣어 암조건에서 25±1℃에서 100rpm의 회전 교반기(shaker)에서 배양하였다. 계대배양 주기는 2주일로 고정함으로써 배양세포가 항상 대수생장기 상태에서 높은 활력을 유지할 수 있도록 하였다.
표 2
Figure PCTKR2009002553-appb-T000002
한편, 배 및 잎 유래 캘러스(callus)도 상기 <표 2>의 배지 2에서 배양하여 본 발명에 따른 전형성층 및 형성층 유래 세포주와 비교하였다.
세포 응집정도(biological microscope CX31, Olympus, Japan)를 살펴 볼 때, <표 3>과 같이 본 발명에 따른 세포주는 현탁배양 시 90%이상의 단세포 상태로 존재함을 확인할 수 있었으며, 도 1의 (c)에 나타난 바와 같이, 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 관찰할 수 있었으며, 미분화상태임을 확인할 수 있었다. 도 1의 (c)의 주목의 전형성층 유래 세포에서 화살표로 표시된 부분이 액포를 나타낸다.
표 3
Figure PCTKR2009002553-appb-T000003
한편, 대량 배양 가능성을 살펴보기 위하여, 3L의 내용적을 갖는 공기 부양식 생물반응기(airlift bioreactor, 성원사이텍, Korea)에서 배(embryo)·잎(needle) 유래 캘러스와 전형성층 및 형성층 유래 세포를 배양하였다. 배지는 표 2의 액상배지를 사용하였고, 암조건에서 25±1°C로 일정하게 유지하였다. 이 경우, 배(embryo·잎(needles) 유래 배양물의 배가시간(doubling time)은 플라스크에서는 12일인데 반해 반응기(reactor)에서는 21일로 길어졌다. 이것은 반응기 내에서의 생장고리 생성과 배양중의 식물 배양체 응집성과 세포벽이 단단하여 전단에 대한 민감성으로 세포 생존율(cell viability)이 급격히 감소한 것이 원인인 것으로 판단되었다. 한편, 전형성층 및 형성층 유래 세포 배양물의 배가시간은 4-5일로 플라스크와 반응기 사이에 차이가 없거나 오히려 단축되었다(표 4). 전형성층 및 형성층 유래 세포 배양물은 생물반응기 내의 생장고리 면적을 아주 작게 형성하고, 배양기에 간단한 자극을 주어 배지를 움직여주면 내벽의 링(ring)이 간단하게 해소되었다. 또한 응집이 작고, 많은 액포(vacuole)를 가지고 있어 전단에 대한 민감성이 약하여 세포 생존율(cell viability)의 감소를 가져오지 않았다.
표 4
Figure PCTKR2009002553-appb-T000004
(5) 당 및 메틸 자스모네이트의 처리
상기 실시예 1의 (4)와 같이 14일간 현탁배양한 세포주를 멸균수에 원당 3~5중량%(g/L) 및 메틸 자스모네이트 100μM를 첨가한 배지에서 10일간 암배양한 후, 세포를 수거하여 다음의 실험을 수행하였다.
실시예 2: 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 추출물 제조
(1) DMSO(dimethyl sulfoxide) 추출물의 제조
(i) 배양액을 제거시킨 상기 세포주 500g에 500ml의 DMSO를 가하여 50℃에서 6시간 교반시키면서 용해시켰다.
(ii) 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리시켜 상층액을 취함으로써 DMSO 가용성물질을 얻었다.
(iii) 상기에서 얻은 DMSO 가용성물질을 회전진공농축기를 이용하여 농축하였다.
(iv) 농축시료를 동결건조기를 이용하여 건조시키고 DMSO 추출물을 얻었다.
(2) 증류수 추출물, 메탄올 추출물 및 아세톤 추출물의 제조
실시예 1에서 제조된 세포주로부터 다음과 같이 단계별로 유효물질을 추출하였다 (도 2).
(i) 배양액을 제거시킨 상기 세포주 500g에 500ml의 증류수를 가하여 50℃에서 6시간 교반시키면서 용해시켰다.
(ii) 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리시켜 상층액을 취함으로써 증류수 가용성물질을 얻었다.
(iii) 상기 증류수 가용성 물질을 얻은 후, 남은 증류수 불용성물질에 500ml의 메탄올(methanol)을 첨가시켜 실온에서 6시간 교반하여 용해시켰다.
(iv) 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리 시켜 상층액을 취함으로써 메탄올 가용성물질을 얻었다.
(v) 상기 메탄올 가용성물질을 얻은 후, 남은 메탄올 불용성물질에 500ml의 아세톤(acetone)을 첨가시켜 실온에서 6시간 교반하여 용해시켰다.
(vi) 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리 시켜 상층액을 취함으로써 아세톤 가용성물질을 얻었다.
(vii) 상기에서 얻은 증류수, methanol, acetone 가용성물질을 회전진공농축기를 이용하여 농축하였다.
(viii) 농축시료를 동결건조기를 이용하여 건조시키고 세포배양액, 메탄올, 아세톤에 녹여 증류수 추출물, 메탄올 추출물, 아세톤 추출물을 얻었다.
실시예 3: 피부섬유아 (HDF, Human diploid fibroblast) 세포 배양
HDF 세포는 태아의 음경포피로부터 분리 배양하였다. 세포 배양액은 DMEM (Invitroge Gibco life tech. Vienna, Austriea) 배지에 56℃에서 30분간 가열하여 비활성화시킨 우태아 혈청(FBS, Hyclone, Logan, Utah, USA)을 10%, 페니실린(penicillin) (100unit/㎖)과 스트레토마이신(streptomycin) (100㎍/㎖) 및 300 ㎍/㎖-glutamine을 첨가하여 조제하였다. 세포는 위의 배양액을 사용하여 37℃, 95% 습도, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였고, 통상적으로 세포가 서로 융합되기 직전인 3~4일 간격으로 계대배양을 하였으며, 계대배양에 따라 20계대 이하의 어린 (Young) 세포, 21-49계대의 middle 세포와 50계대 이상의 노화세포로 구분하였다. 이와 같이 배양한 HDF 세포는 하기 실시예 4 내지 6의 실험에 사용하였다.
실시예 4: 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주 추출물의 항산화 활성 측정 (1) - H 2 O 2 에 의해 유도되는 활성산소종 측정
본 발명에 따른 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 항산화 활성을 측정하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. 즉, 상기 피부섬유아 세포(HDF cell)에 실시예 2에서 수득한 추출물 중 증류수 추출물을 이용하여, 노화를 일으키고 활성산소종을 유도하는 H2O2를 처리하였을 때, 노화와 활성산소종을 저해하는지 확인하기 위하여, 활성산소종 (ROS: reactive oxygen species)을 측정하는 실험을 수행하였다.
세포내 활성 산소의 측정은 활성산소에 민감한 DCFDA(2’,7’-dichlorofluorescin diacetate, Fluka Cat 35847 Molecular Probes, USA) 형광 dye를 사용하여 Facscan analysis를 이용하여 분석하였다. 각각의 PD에 따른 HDF 세포를 100mm plate 에 키운 후 5uM 농도의 DCFDA 를 dark 상태로 처리하여 30분간 37℃에서 반응시킨 후 PBS로2회 세척후 trypsin-EDTA 처리로 세포를 회수하였다. 이후 900rpm에서 4분간 원심분리하여 세포를 모은 후 각각 세포 10,000개당 활성산소를 측정하였다 (도 3의 (a), (b)).
5x105 의 세포를 6 well plate에 분주 후 각 실험에 따라 H2O2를 단독으로 처리하거나 실시예 2에서 수득한 추출물을 함께 처리하였다. 실시예2에서 수득한 추출물 중 증류수 추출물을 10~100㎍/㎖ 처리하였는데, 바람직하게는 증류수 추출물 50㎍/㎖ 처리한 후 HBSS (Hank's balanced salt solution)로 2~3회 세척하고, 재차 HBSS에 30분 정도 안정화시켰다. 10uM의 DCFDA (Molecular Probes USA)를 처리 후 Dark상태로 37℃에서 1시간 염색하고, HBSS로 3번 세척 후 형광 현미경으로 관찰하였다 (도 3의 (c)).
HDF 세포에 H2O2 200uM과 실시예 2에서 수득한 세포주의 증류수 추출물을 10~100㎍/㎖로 처리하였는데, 바람직하게는 50㎍/㎖을 처리하여 세포의 형태의 변화 정도를 관찰하였다.
H2O2를 세포에 처리하고 24시간이 경과하면, HDF 세포는 산화적 스트레스에 의해 활성산소(ROS)를 발생하게 된다. 비형광성인, DCFDA는 활성산소에 의해 산화되어 강한 형광을 나타내는 DCF가 되므로, 이를 측정할 수 있다. 본 실시예에서는 측정을 위하여 FACS CAlibur (Becton Dickinson Analytic Flow Cytometer, USA)를사용하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 주목의 형성층 유래 세포주 추출물 및 주목의 전형성층 유래 세포주 추출물 모두 활성산소종(ROS)의 생성이 억제되는 것으로 나타났다 (P-WE: 전형성층 증류수 추출물, C-WE: 형성층 증류수 추출물). 즉, 두 세포주 추출물 모두 활성산소종의 생성을 억제하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주 추출물의 항산화 활성 측정 (2) - H 2 O 2 에 의해 유도되는 p-ERK1/2 억제능 측정 및 MnSOD 유도능 측정
5-1. 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주 추출물의 p-ERK1/2의 발현억제효과
생체 내에서 활성산소에 의해 p-ERK1/2의 증가되는 것으로 알려져 있는바, HDK 세포에 실시예 2에서 수득한 세포주 추출물과 H2O2를 처리하여, 본 발명에 따른 세포주 추출물이 p-ERK1/2 발현을 억제하는지 측정하는 실험을 수행하였다.
HDF 세포에 H2O2 200uM과 실시예 2에서 수득한 세포주 증류수 추출물을 투여한 11일 후, 세포를 회수하여 단백질을 추출하였다. 단백질 양의 확인은 Bradford법으로 실시하였다. 즉, HDF 세포를 회수한 후, 세포 내 단백질을 추출하여 정량하였다.
p-ERK1/2의 양은 웨스턴 블러팅으로 실시하였다. 즉, 정량된 단백질은 브롬페놀 블루(bromophenol blue) 염색액과 섞은 후 10％ SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 전기영동하였다. 전기영동 후 폴리비닐리딘 플로라이드 막(밀리포아사)에 단백질을 전이시키고, 0.5％ 탈지유가 포함된 TBS(Tris buffered saline)-tween 용액 (10 mM Tris. HCl, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5)에 담궈 비특이적인 반응을 차단하였다.
이후 ERK에 대한 토끼의 항체(Upstate)를 1/600으로 희석한 용액과 상온에서 3시간 동안 반응시킨 다음, 2차 항체로서 항 토끼 IgG 항체를 이용하여 반응시켰다. 반응이 끝난 막을 TBS(Tris buffered saline)-tween 용액으로 4회 세척하고 ECL(enhanced chemiluminescence) 검출시약과 1분간 반응시킨 후 상온에서 X-선 필름에 감광시켰다.
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이, H2O2만 처리한 대조군보다 본 발명에 따른 세포주 추출물을 함께 처리한 실험군에서 p-ERK1/2 발현이 감소되었음을 확인할 수 있었다.
5-2. 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주 추출물의 MnSOD의 발현유도효과
생체 내에서 활성산소에 의해 MnSOD가 증가되는 것으로 알려져 있는바, HDK 세포에 실시예 2에서 수득한 세포주 추출물과 H2O2를 처리하여, 본 발명에 따른 세포주 추출물이 MnSOD 발현을 유도하는지 측정하는 실험을 수행하였다.
HDF 세포에 H2O2 200uM과 실시예 2에서 수득한 세포주 증류수 추출물을 투여하고 3, 7, 11일 후 세포를 회수하여 단백질을 추출하였다. 단백질 양의 확인은 Bradford법으로 실시하였다. 즉, HDF 세포를 회수한 후, 세포 내 단백질을 추출하여 정량하였다.
MnSOD의 양은 웨스턴 블러팅으로 실시하였다. 즉, 정량된 단백질은 브롬페놀 블루(bromophenol blue) 염색액과 섞은 후 10％ SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 전기영동하였다. 전기영동 후 폴리비닐리딘 플로라이드 막(밀리포아사)에 단백질을 전이시키고, 0.5％ 탈지유가 포함된 TBS(Tris buffered saline)-tween 용액 (10 mM Tris. HCl, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5)에 담궈 비특이적인 반응을 차단하였다.
이후 MnSOD에 대한 마우스의 항체(Upstate)를 1/600으로 희석한 용액과 상온에서 3시간 동안 반응시킨 다음, 2차 항체로서 항 마우스 IgG 항체를 이용하여 반응시켰다. 반응이 끝난 막을 TBS(Tris buffered saline)-tween 용액으로 4회 세척하고 ECL(enhanced chemiluminescence) 검출시약과 1분간 반응시킨 후 상온에서 X-선 필름에 감광시켰다.
그 결과, 도 5에서 나타난 바와 같이, H2O2만 처리한 대조군보다 본 발명에 따른 세포주 추출물을 함께 처리한 실험군에서 MnSOD의 신호가 증가되었음을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주 추출물의 항염증 활성 측정 - LPS에 의해 유도되는 ICAM-1, MMP-9 ,MMP-2 및 IL-1β 억제능
LPS (Lipopolysacharide: Escherichia coli strain B5:025, Sigma, St. Louis, MO)란, E. Coli 독소에서 추출된 것으로, macrophage, fibroblast, dendritic cell, lymphocyte 등의 세포의 핵에서 nuclear factor-κB (NF-κB)의 활성화를 유도하여 각종 염증성 사이토카인(cytokine)의 분비를 촉진하게 된다. 이를 세포에 처리하는 경우, IL-1β, ICAM-1, MMP-9 및 MMP-2를 유도하게 되어 염증을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 이에 수득한 형성층 및 전형성층 유래 세포주 추출물을 이용하여 이들 단백질의 신호를 억제하는지 여부를 확인하였다.
6-1. 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 추출물의 IL-1β의 발현억제효과
LPS를 세포에 처리하는 경우, 염증자극의 신호전달에 의한 생성물인 IL-1β가 증가되는 것으로 알려져 있다. 이에 HDK 세포에 실시예 2에서 수득한 세포주 추출물과 LPS를 처리하여, 본 발명에 따른 세포주 추출물이 IL-1β의 발현을 억제하는지 측정하는 실험을 수행하였다.
HDF 세포에 LPS 10㎍/㎖과 실시예 2에서 수득한 세포주의 추출물 중 메탄올 추출물을 10~100㎍/㎖ 처리하였다. 이때, 바람직한 처리 양인 50㎍/㎖이다. 메탄올 추출물을 처리한 후, 3, 6, 24시간 후 세포를 회수하여 단백질을 추출하였다. 단백질 양의 확인은 Bradford법으로 실시하였다. 즉, HDF 세포를 회수한 후, 세포 내 단백질을 추출하여 정량하였다.
IL-1β의 양은 웨스턴 블러팅으로 실시하였다. 정량된 단백질은 브롬페놀 블루(bromophenol blue) 염색액과 섞은 후 10％ SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 전기영동하였다. 전기영동 후 폴리비닐리딘 플로라이드 막(밀리포아사)에 단백질을 전이시키고, 0.5％ 탈지유가 포함된 TBS(Tris buffered saline)-tween 용액 (10 mM Tris. HCl, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5)에 담궈 비특이적인 반응을 차단하였다.
이후 IL-1β에 대한 마우스의 항체(Upstate)를 1/600으로 희석한 용액과 상온에서 3시간 동안 반응시킨 다음, 2차 항체로서 항 마우수 IgG 항체를 이용하여 반응시켰다. 반응이 끝난 막을 TBS(Tris buffered saline)-tween 용액으로 4회 세척하고 ECL(enhanced chemiluminescence) 검출시약과 1분간 반응시킨 후 상온에서 X-선 필름에 감광시켰다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, LPS만 처리한 대조군보다 본 발명에 따른 세포주 추출물을 함께 처리한 실험군에서 IL-1β의 신호가 감소되었음을 확인할 수 있었다.
6-2. 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 추출물의 MMP-9의 발현억제효과
LPS를 세포에 처리하는 경우, 염증 자극의 신호전달에 의한 생성물인 MMP-9가 증가되는 것으로 알려져 있다.
이에 HDK 세포에 실시예 2에서 수득한 세포주 추출물과 LPS를 처리하여, 본 발명에 따른 세포주 추출물이 MMP-9의 발현을 억제하는지 측정하는 실험을 수행하였다.
HDF 세포에 LPS 10㎍/㎖과 실시예 2에서 수득한 추출물 중 메탄올 추출물을 10~100㎍/㎖ 처리하였다. 이때, 바람직한 처리 양인 50㎍/㎖이다. 메탄올 추출물을 처리한 후, 6시간 후 세포를 회수하여 단백질을 추출하였다. 단백질 양의 확인은 Bradford법으로 실시하였다. 즉, HDF 세포를 회수한 후, 세포 내 단백질을 추출하여 정량하였다.
MMP-9의 양은 웨스턴 블러팅으로 실시하였다. 즉, 정량된 단백질은 브롬페놀 블루(bromophenol blue) 염색액과 섞은 후 10％ SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 전기영동하였다. 전기영동 후 폴리비닐리딘 플로라이드 막(밀리포아사)에 단백질을 전이시키고, 0.5％ 탈지유가 포함된 TBS(Tris buffered saline)-tween 용액 (10 mM Tris. HCl, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20, pH 7.5)에 담궈 비특이적인 반응을 차단하였다.
이후 MMP-9에 대한 마우스의 항체(Upstate)를 1/600으로 희석한 용액과 상온에서 3시간 동안 반응시킨 다음, 2차 항체로서 항 마우스 IgG 항체를 이용하여 반응시켰다. 반응이 끝난 막을 TBS(Tris buffered saline)-tween 용액으로 4회 세척하고 ECL(enhanced chemiluminescence) 검출시약과 1분간 반응시킨 후 상온에서 X-선 필름에 감광시켰다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, LPS만 처리한 대조군보다 본 발명에 따른 세포주 추출물을 함께 처리한 실험군에서 MMP-9의 신호가 감소되었음을 확인할 수 있었다.
6-3. 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 추출물의 MMP-2의 발현억제효과
LPS를 세포에 처리하는 경우, 염증 자극의 신호전달에 의한 생성물인 MMP-2가 증가되는 것으로 알려져 있다. 이에 HDK 세포에 실시예 2에서 수득한 세포주 추출물과 LPS를 처리하여, 본 발명에 따른 세포주 추출물이 MMP-2의 발현을 억제하는지 측정하는 실험을 수행하였다.
HDF 세포에 LPS 10㎍/㎖과 실시예 2에서 수득한 세포주 추출물 중 메탄올 추출물을 10~100㎍/㎖ 처리하였다. 이때, 바람직한 처리 양인 50㎍/㎖이다. 메탄올 추출물을 처리한 후, 3, 6, 24시간 후 세포를 회수하여 단백질을 추출하였다. 단백질 양의 확인은 Bradford법으로 실시하였다. 즉, HDF 세포를 회수한 후, 세포 내 단백질을 추출하여 정량하였다.
MMP-2의 양은 웨스턴 블러팅으로 실시하였다. 즉, 정량된 단백질은 브롬페놀 블루(bromophenol blue) 염색액과 섞은 후 10％ SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 전기영동하였다. 전기영동 후 폴리비닐리딘 플로라이드 막(밀리포아사)에 단백질을 전이시키고, 0.5％ 탈지유가 포함된 TBS(Tris buffered saline)-tween 용액 (10 mM Tris. HCl, 100 mM NaCl, 0.1％ Tween 20, pH 7.5)에 담궈 비특이적인 반응을 차단하였다.
이후 MMP-2에 대한 마우스의 항체(Upstate)를 1/600으로 희석한 용액과 상온에서 3시간 동안 반응시킨 다음, 2차 항체로서 항 마우스 IgG 항체를 이용하여 반응시켰다. 반응이 끝난 막을 TBS(Tris buffered saline)-tween 용액으로 4회 세척하고 ECL(enhanced chemiluminescence) 검출시약과 1분간 반응시킨 후 상온에서 X-선 필름에 감광시켰다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, LPS만 처리한 대조군보다 본 발명에 따른 세포주 추출물을 함께 처리한 실험군에서 MMP-2의 신호가 감소되었음을 확인할 수 있었다.
6-4. 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 추출물의 ICAM-1의 발현억제효과
HDF 세포에 실시예 2에서 수득한 세포주 메탄올 추출물과 LPS를 처리하여, 본 발명에 따른 세포주 추출물이 ICAM-1의 발현을 억제하는지 측정하는 실험을 수행하였다.
HDF 세포에 LPS 10㎍/㎖과 실시예 2에서 수득한 세포주의 추출물 중 메탄올 추출물을 10~100㎍/㎖ 처리하였다. 이때, 바람직한 처리 양인 50㎍/㎖이다. 메탄올 추출물을 처리하고, 1, 3, 6, 12 및 24시간 배양한 후 세포를 회수하여 단백질을 추출하였다. 단백질 양의 확인은 Bradford법으로 실시하였다. 즉, HDF 세포를 회수한 후, 세포 내 단백질을 추출하여 정량하였다.
ICAM-1의 양은 웨스턴 블러팅으로 실시하였다. 즉, 정량된 단백질은 브롬페놀 블루(bromophenol blue) 염색액과 섞은 후 10％ SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 전기영동하였다. 전기영동 후 폴리비닐리딘 플로라이드 막(밀리포아사)에 단백질을 전이시키고, 0.5％ 탈지유가 포함된 TBS(Tris buffered saline)-tween 용액 (10 mM Tris. HCl, 100 mM NaCl, 0.1％ Tween 20, pH 7.5)에 담궈 비특이적인 반응을 차단하였다.
이후 ICAM-1에 대한 마우스의 항체(Upstate)를 1/600으로 희석한 용액과 상온에서 3시간 동안 반응시킨 다음, 2차 항체로서 항 마우스 IgG 항체를 이용하여 반응시켰다. 반응이 끝난 막을 TBS(Tris buffered saline)-tween 용액으로 4회 세척하고 ECL(enhanced chemiluminescence) 검출시약과 1분간 반응시킨 후 상온에서 X-선 필름에 감광시켰다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, LPS만 처리한 대조군보다 본 발명에 따른 세포주 추출물을 함께 처리한 실험군에서 ICAM-1의 신호가 감소되었음을 확인할 수 있었다.
ICAM-1은 내피세포(endothelial cells) 표면에서 발현되는 세포부착물질군의 대표적인 단백질으로, 정상적인 경우 매우 낮은 수준으로 발현되나, TNF-α, 인테페론-γ, 인터루킨-1β 등 싸이토카인류 염증매개물질에 의하여 자극을 받으면, 발현량이 급속히 증가되어 혈류 중 이동하는 단핵구나 임파구 등 염증세포를 부착하고 염증세포가 염증발생 조직으로 이동하는데 역할을 한다고 알려진 것으로 [Wegner C. D. et al, Science, 247(1941):456, 1990; Dustin, M. L. et al, J. Immunol., 137(1):245, 1986], ICAM-1의 발현은 염증세포가 염증발생 부위로 이동 및 집속하는 초기에 작용을 하며 염증반응의 증폭작용에 중요한 작용을 한다. 따라서, 본 발명에 따른 세포주의 처리에 의하여 이러한 ICAM-1의 발현이 억제되는 것으로 나타난 바, 본 발명에 따른 조성물은 염증을 억제 및 예방하는 효과가 있음을 알 수 있었다.
실시예 7: 세포 독성 실험
본 발명에 따른 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 독성여부를 확인하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.
인간 섬유아세포는 (Normal human dermal fibroblast, NHDF)는 MCTT사 (한국)에서 구입하였으며 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지(Welgene, 한국)에서 배양하였다. 섬유아세포를 1×104/(96 well)를 접종하고 12시간 배양한 후, 실시예 2에서 수득한 주목의 형성층 유래 세포주의 DMSO 추출물을 1ppm, 10ppm 및 100ppm의 농도로 및 실시예 2에서 세포주를 제거하고 수득한 배양액을 1, 5 및 10 부피％의 농도로 FBS 무첨가 DMEM배지에 24시간 처리하였다. 이때, 대조군(N)은 시료를 처리하지 않았다. 섬유아세포의 생존율은 WST-1 용액 10％를 포함한 FBS 무첨가 DMEM에서 2시간 배양한 후 450 nm의 흡광도로 측정하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 주목의 형성층 유래 세포주의 DMSO 추출물은 실험범위에서 세포의 생존율을 감소시키지 않는 것으로 측정되었으며, 배양액의 경우 10％에서 생존율이 약간 감소하는 것으로 나타났다. 세포활성도가 80％ 이하인 경우에 세포독성이 있다고 판단하는바, 실험범위에서 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 배양액은 세포독성이 없는 것으로 나타났다.
실시예 8: 자외선 조사에 의하여 발생하는 활성산소종 제거 효과 확인
본 발명에 따른 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 항산화 활성 및 항노화 활성을 측정하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.
먼저 인간 각질형성세포주(HaCaT: German Cancer Research Institute, Heidelberg, Germany)는 10％ FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 배양하였다. 3×104/(96 well)를 접종하고 12시간 배양하여 부착하고, 시료로 실시예 2의 주목의 형성층 및 전형성층 유래 세포주의 DMSO 추출물을 1, 10, 25 및 50 ppm의 농도로, 그리고 실시예 2의 배양액을 0.1 및 1부피%의 농도로 FBS 무첨가 DMEM배지에 첨가하여 3시간 처리하였다. 이때, 양성대조군으로서 NAC (N-acetyl-cysteine)을 10mM 처리하였으며, 추가 대조군으로서 주목나무의 DMSO 추출물을 1, 10, 25 및 50 ppm의 농도로 처리하였다.
그 다음, HBSS 버퍼로 세척하고 DCF-DA 50μM (HBSS)을 37℃에서 20분간 배양하였다. 다시 HBSS 버퍼로 2회 세척하고 HBSS 30 ul를 첨가하여 365 nm 200 mJ/cm2를 조사하였다. 37℃에서 2시간 배양 후 형광도 (excitation, 485 nm; emission, 535nm, Infinite M-200, Tecan)를 측정하고, WST-1 용액을 이용하여 생존율을 측정하여 보정하였다. 시료의 활성산소종 제거 효과는 자외선 조사를 하지 않는 군의 형광도를 100으로 하여 자외선 조사군과 비교하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 세포주의 DMSO 추출물 및 배양액을 처리한 경우 자외선에 의하여 유도된 활성산소종을 제거하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다(세포주 추출물의 경우 전형성층 유래 세포주 추출물 및 형성층 유래 세포주 추출물의 측정값의 평균값으로 기재함). 특히 대조군인 주목나무 추출물의 경우 자외선 처리 시 시료 미처리군(0ppm 첨가군)의 측정값 대비 시료 첨가시 측정값의 감소율을 산정하였을 때 44% (1ppm), 55%(10ppm), 48%(25ppm) 및 56%(50ppm)과 같이 감소한 것에 비하여, 본 발명에 따른 세포주 추출물의 경우 자외선 처리 시 시료 미처리군(0ppm 첨가군)의 측정값 대비 시료 첨가시 측정값의 감소율을 살펴보았을 때, 62％(1ppm), 70％(10ppm), 73％(25ppm), 70％(50ppm)과 같이 더 현저한 감소값을 보여 본 발명에 따른 세포주의 경우 주목나무에 비하여 훨씬 강력한 항산화 효과를 가짐을 확인할 수 있었다.
실시예 9: 자외선 조사에 의하여 유도되는 콜라겐분해효소 (MMP-1) 생성 억제효과 확인
본 발명에 따른 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 노화방지 활성을 측정하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.
먼저 섬유아세포(MCTT사, 한국)를 2×104/(24 well)로 접종하고 12시간 배양하여 부착 후 FBS 무첨가 DMEM 배지에서 12시간 starvation하였다. DPBS 버퍼로 세척하고 365 nm 100 mJ/cm2를 조사하였다. 그리고, 시료로 실시예 2의 주목의 형성층 및 전형성층 유래 세포주의 DMSO 추출물을 50 및 25ppm의 농도로, 그리고 실시예 2의 배양액을 1 및 0.1％의 농도로 FBS 무첨가 DMEM배지에서 농도별로 24시간 처리하였다. 이때, 양성대조군으로서 RA(Retinoic acid)을 1μM 처리하였으며, 추가 대조군으로서 주목나무 추출물을 50 및 25ppm의 농도로 처리하였다. 그 후, 배지를 회수하여 원심분리하고 상징액 중의 MMP-1의 양을 ELISA (Amersham) 방법으로 정량하였다. WST-1 용액을 이용하여 생존율을 측정하여 보정하였다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 세포주 배양액의 경우 MMP-1 생성 억제효과가 우수한 것으로 확인되었다(세포주 추출물의 경우 전형성층 유래 세포주 추출물 및 형성층 유래 세포주 추출물의 측정값의 평균값으로 기재함). 특히 대조군인 주목나무 추출물 및 노화방지 효과가 우수한 것으로 알려진 RA와 대비하여서도 MMP-1 억제효과가 매우 우수한 것으로 나타나 노화방지용 화장료 조성물로서 특히 유용한 것으로 나타났다.
실시예 10: 세포 내 멜라닌 생성 (melanogenesis) 억제 효과
본 발명에 따른 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주의 미백 활성을 측정하기 위하여 다음의 실험을 수행하였다.
먼저 Murine melanoma (B-16 F1)(한국세포주은행, 한국)는 10％ FBS가 함유된 DMEM 배지로 6-well plate에 well당 1×105 개로 접종한 후, 5％ CO2, 37℃하에서 세포가 well 바닥에 약 80% 부착될 때까지 배양하였다. 배지를 제거하고, 시료로서 실시예 2의 주목의 형성층 및 전형성층 유래 세포주 DMSO 추출물이 1 및 10 ppm으로 첨가되고 실시예 2의 배양액이 0.05, 0.1 및 1％의 농도로 희석된 배지로 교체한 후 5％ CO2, 37℃하에서 일정시간 배양하였다. 이때, 양성대조군으로서 Kojic acid를 1mM 처리하였으며, 음성대조군(도 13의 대조군)은 시료미첨가군으로 하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 세척하고, 이것을 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. 세포 펠렛(pellet)은 10％ DMSO가 함유된 1M NaOH 100 ul를 넣어 세포 내 멜라닌을 얻었다. 이 액을 마이크로플레이트 리더(microplate reader: Tecan Infinite M200, Austria)로 490nm에서 흡광도를 측정하여 일정단백질 당 멜라닌 양을 구하였다. 단백질 정량은 Bradford 방법을 사용하였다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 배양액의 경우 멜라닌의 생성이 억제된 것을 확인할 수 있었다(세포주 추출물의 경우 전형성층 유래 세포주 추출물 및 형성층 유래 세포주 추출물의 측정값의 평균값으로 기재함). 특히 세포주 추출물 1ppm 처리 시와 배양액을 처리한 경우에는 미백 효과로 알려진 Kojic acid와 거의 유사한 멜라닌 생성 억제 효과를 얻을 수 있었는바, 본 발명에 따른 세포주 추출물 및 배양액이 미백용 화장 조성물로서 매우 유용한 것으로 나타났다.
실시예 11: 약학제제 제조예
제제예 1. 정제의 제조
실시예 2에서 제조된 세포주 추출물 100㎎을 옥수수 전분 100㎎, 유당 100㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2㎎을 혼합하여 통상의 정제제조방법에 따라 제조하였다.
제제예 2. 캡슐제의 제조
실시예 2에서 제조된 세포주 추출물 500㎎을 연질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 3. 시럽제의 제조
실시예 1에서 제조된 세포주 1g, 이성화당 10g, 만니톨 5g, 적량의 정제수의 함량으로 통상적인 액제제의 제조방법에 따라 100㎖의 시럽제를 제조하였다.
제제예 4. 주사제의 제조
실시예 2에서 제조된 세포주 추출물 200㎎을 폴리옥시에틸렌 수소화 카스트로 오일을 함유하는 생리 식염수 200㎎에 가열 용해시켜 혼합 추출물을 0.1%의 농도로 함유하는 주사제를 제조하였다.
실시예 12: 기능성 식품의 제조: 기능성 음료의 제조
제조예 1.
실시예 1에서 제조한 세포주 200㎎을 96㎖의 물에 용해시킨 후 보조제로서 비타민 C 500㎎, 교미제로서 구연산, 올리고당을 각각 1g 가하고, 보존재로서 나트륨벤조에이트 0.05g을 가한 후 정제수를 가하여 전량을 100㎖로 만들어 기능성 음료를 제조하였다.
제조예 2.
실시예 2에서 제조한 세포주 추출물 200㎎을 96㎖의 물에 용해시킨 후 보조제로서 비타민 C 500㎎, 교미제로서 구연산, 올리고당을 각각 1g 가하고, 보존재로서 나트륨벤조에이트 0.05g을 가한 후 정제수를 가하여 전량을 100㎖로 만들어 기능성 음료를 제조하였다.
실시예 13: 기능성 화장품의 제조
제조예 1. 유액의 제조
실시예 2에서 제조한 세포주 추출물 6.2mg, 1,3-부틸렌 글리콜 6.5mg, 글리세린 1.2mg, D-판테놀 0.2mg, 에탄올 3.0mg, 카보머 0.1mg, 스테아릭애씨드 1.5mg, 폴리소르베이트 60 0.7mg, 친유성 글리세릴스테아레이트 0.6mg, 소르비탄세스퀴올리에이트 0.3mg, 세테아릴 알코올 0.6mg, 스쿠알란 3.5mg, 카르릭릭/카프릭트리글리세라이드 3mg, 디메치콘 0.4mg, 방부제 소량, 조합향료 적량, 정제수 (총 100mg이 되도록 첨가)의 조성에 따라 통상의 방법으로 유액을 제조하였다.
제조예 2. 크림의 제조
실시예 2에서 제조한 세포주 추출물 5.0mg, 1,3-부틸렌 글리콜 7.0mg, 글리세린 1.0mg, D-판테놀 0.1mg, 마그네슘알루미늄실리케이트 0.4mg, 스테아릭애씨드 2.0mg, 폴리소르베이트 60 1.5mg, 친유성 글리세릴스테아레이트 2.0mg, 소르비탄세스퀴올리에이트 1.5mg, 미네랄 오일 4.0mg, 세테아릴 알코올 3.0mg, 스쿠알란 3.8mg, 카르릭릭/카프릭트리글리세라이드 2.8mg, 디메치콘 0.4mg, 산탄 검 적량, 트리에탄올아민 적량, 토코페릴아세테이트 적량, 방부제 소량, 조합향료 적량, 정제수 (총 100mg이 되도록 첨가)의 조성에 따라 통상의 방법으로 크림을 제조하였다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 기존 항산화제와 항염증제의 부작용을 최소화하며, 세포 내의 대사작용에 관여하여 세포 내 활성산소를 감소시키고, 노화와 관련된 신호들을 감소 및 유도시키는 효과가 있으므로, 노화의 방지 및 지연에 유용하다. 아울러, 본 발명에 따른 조성물은 멜라닌 생성을 억제하는 효과가 있어 미백용 화장료 조성물로서도 유용하다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (17)

  1. 주목의 형성층 또는 전형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 항산화, 항염증 또는 항노화용 조성물:
    (a) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임;
    (b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨; 및
    (c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포주는 추가로 다음의 특징으로 가지는 것을 특징으로 하는 조성물:
    (a) 현탁배양 시 단세포 상태로 존재함; 및
    (b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 얻어진 것임을 특징으로 하는 조성물:
    (a) 주목의 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 수득하는 단계;
    (b) 상기 수득된 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 배양하여 형성층 또는 전형성층으로부터 증식되는 형성층 또는 전형성층의 층(cambium or procambium layer)과 상기 형성층 또는 전형성층 이외의 부분으로부터 무정형으로 증식되는 캘러스 층을 유도하는 단계; 및
    (c) 상기 캘러스 층으로부터 형성층 또는 전형성층의 층(cambium layer)을 분리하여 형성층 또는 전형성층 유래 세포주를 수득하는 단계.
  4. 제3항에 있어서, 상기 세포주는 3~5중량%의 원당 또는 설탕; 및 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 진균류 추출물, 세균류 추출물, 효모(yeast) 추출물, 키토산, 글루코마난(glucomanan), 글루칸(glucan), 페닐알라닌(phenylalanine), 벤조산(benzoic acid), 살리실산(salicylic acid), 아라키돈산(arachonic acid), STS, mevalonalonate N-benzolyglycine, ABA, SNP, IPP, BHT, CCC, 에테폰(ethephon), 히푸익산(hippuic acid), 암모니움 세릭 니트레이트(amminoium ceric nitrate), AgNO3, 바나딜 설페이트(vanadyl sulfate), p-아미노벤조익산(p-aminobenzoic acid), 브라시노스테로이드(brassinosteroids), 소디움 알지네이트(sodium alginate), 소디움 아세테이트(sodium acteate)로 구성되는 군에서 선택된 물질;을 포함하는 배지에서 추가로 배양된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 알코올, 아세톤, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 조성물.
  6. 주목의 형성층 또는 전형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 노화방지용 화장료 조성물:
    (a) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임;
    (b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨; 및
    (c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.
  7. 제6항에 있어서, 상기 세포주는 추가로 다음의 특징으로 가지는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물:
    (a) 현탁배양 시 단세포 상태로 존재함; 및
    (b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 조성물은 MMP-1 생성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 얻어진 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물:
    (a) 주목의 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 수득하는 단계;
    (b) 상기 수득된 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 배양하여 형성층 또는 전형성층으로부터 증식되는 형성층 또는 전형성층의 층(cambium or procambium layer)과 상기 형성층 또는 전형성층 이외의 부분으로부터 무정형으로 증식되는 캘러스 층을 유도하는 단계; 및
    (c) 상기 캘러스 층으로부터 형성층 또는 전형성층의 층(cambium layer)을 분리하여 형성층 또는 전형성층 유래 세포주를 수득하는 단계.
  10. 제9항에 있어서, 상기 세포주는 3~5중량％의 원당 또는 설탕; 및 메틸 자스모네이트(methyl jasmonate), 진균류 추출물, 세균류 추출물, 효모(yeast) 추출물, 키토산, 글루코마난(glucomanan), 글루칸(glucan), 페닐알라닌(phenylalanine), 벤조산(benzoic acid), 살리실산(salicylic acid), 아라키돈산(arachonic acid), STS, mevalonalonate N-benzolyglycine, ABA, SNP, IPP, BHT, CCC, 에테폰(ethephon), 히푸익산(hippuic acid), 암모니움 세릭 니트레이트(amminoium ceric nitrate), AgNO3, 바나딜 설페이트(vanadyl sulfate), p-아미노벤조익산(p-aminobenzoic acid), 브라시노스테로이드(brassinosteroids), 소디움 알지네이트(sodium alginate), 소디움 아세테이트(sodium acteate)로 구성되는 군에서 선택된 물질;을 포함하는 배지에서 추가로 배양된 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  11. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 알코올, 아세톤, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  12. 주목의 형성층 또는 전형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 미백용 화장료 조성물:
    (a) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임;
    (b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨; 및
    (c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.
  13. 제12항에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 알코올, 아세톤, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  14. 주목의 형성층 또는 전형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 항산화 기능성 식품:
    (a) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임;
    (b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨; 및
    (c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.
  15. 제14항에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 알코올, 아세톤, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 기능성 식품.
  16. 주목의 형성층 또는 전형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 추출물, 그 파쇄물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 노화방지용 기능성 식품:
    (a) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임;
    (b) 주목의 형성층 또는 전형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨; 및
    (c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.
  17. 제16항에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 알코올, 아세톤, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출한 것임을 특징으로 하는 기능성 식품.
PCT/KR2009/002553 2005-10-31 2009-05-14 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항노화용 조성물 WO2009139581A2 (ko)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2009801275441A CN102099046B (zh) 2008-05-14 2009-05-14 含有来自紫杉形成层或原形成层的细胞系作为活性成分的抗氧化、抗炎或抗衰老组合物
AU2009247069A AU2009247069B2 (en) 2008-05-14 2009-05-14 Antioxidant, anti-inflammatory, or anti-aging composition containing a plant stem cell line derived from Taxus cambium or procambium as an active ingredient
BRPI0908676A BRPI0908676A2 (pt) 2008-05-14 2009-05-14 composição antioxidante, anti-inflamatória ou anti- envelhecimento, composição cosmética e alimento funcional, contendo linhagens de células derivadas de câmbio ou procâmbio de taxus
US12/992,810 US9585923B2 (en) 2005-10-31 2009-05-14 Antioxidant, anti-inflammatory or anti-aging composition containing taxus cambium- or procambium-derived cell line as active ingredient
JP2011509412A JP5572790B2 (ja) 2008-05-14 2009-05-14 イチイ属の形成層または前形成層由来植物幹細胞株を有効性分として含有する抗酸化、抗炎症または抗老化用組成物
RU2010150940/15A RU2520606C2 (ru) 2008-05-14 2009-05-14 Косметическая композиция, содержащая культивированные клетки из камбия или прокамбия тисса(taxus)
CA2731207A CA2731207A1 (en) 2008-05-14 2009-05-14 Antioxidant, anti-inflammatory or anti-aging composition containing taxus cambium- or procambium-derived cell line as active ingredient
EP09746760A EP2311474A4 (en) 2008-05-14 2009-05-14 OXIDATING, INFLAMMATORY OR AGING-INHIBITORY COMPOSITION WITH A VEGETABLE STRAIN CELL LINE FROM TAXUS CAMBIUM OR PROCAMBIUM AS AN ACTIVE SUBSTANCE

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20080044227 2008-05-14
KR10-2008-0044227 2008-05-14

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2009139581A2 true WO2009139581A2 (ko) 2009-11-19
WO2009139581A3 WO2009139581A3 (ko) 2010-01-07

Family

ID=41319164

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2009/002553 WO2009139581A2 (ko) 2005-10-31 2009-05-14 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항노화용 조성물

Country Status (10)

Country Link
US (1) US9585923B2 (ko)
EP (1) EP2311474A4 (ko)
JP (1) JP5572790B2 (ko)
KR (1) KR101100867B1 (ko)
CN (1) CN102099046B (ko)
AU (1) AU2009247069B2 (ko)
BR (1) BRPI0908676A2 (ko)
CA (1) CA2731207A1 (ko)
RU (1) RU2520606C2 (ko)
WO (1) WO2009139581A2 (ko)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8017397B2 (en) 2005-10-31 2011-09-13 Unhwa Corporation Isolated population of plant single cells and method of preparing same
US8053238B2 (en) 2005-10-31 2011-11-08 Unhwa Corporation Isolated population of plant single cells and method of preparing the same
US8247230B2 (en) 2007-09-21 2012-08-21 Unhwa Corporation Plant stem cell line derived from cambium of herbaceous plant with storage root and method for isolating the same
KR20150076475A (ko) 2013-12-27 2015-07-07 코웨이 주식회사 탈분화 식물 프로토플라스트 내에 활성 물질이 인입된 구조체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물
CN109908038A (zh) * 2019-04-18 2019-06-21 吉林新海生物科技开发有限公司 一种祛斑喷雾剂及其应用
WO2020023678A1 (en) * 2018-07-24 2020-01-30 Rinati Skin Llc Method of making conditioned media and factors included therein

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101179171B1 (ko) 2008-08-14 2012-09-03 주식회사 운화 산삼 또는 인삼을 포함한 인삼류의 형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 간질환의 예방 또는 치료용 조성물
US20110217273A1 (en) 2008-09-30 2011-09-08 Unhwa Corporation Composition for Preventing or Treating AIDS Containing Plant Stem Cell Line Derived from Cambium of Panax Ginseng Including Wild Ginseng or Ginseng as Active Ingredient
RU2520625C2 (ru) * 2008-11-06 2014-06-27 Унхва Корпорейшн Композиция для профилактики или лечения злокачественных новообразований, содержащая в качестве активного ингредиента линию стволовых растительных клеток, полученных из камбия panax ginseng, включая дикий женьшень или женьшень
JP2012527889A (ja) * 2009-05-26 2012-11-12 株式会社ウンファ イチョウ科の形成層由来植物幹細胞及びその分離方法
ES2731647T3 (es) 2012-01-05 2019-11-18 Oreal Uso cosmético de células vegetales desdiferenciadas
FR3007982B1 (fr) 2013-07-05 2015-08-21 Oreal Stabilisation des cellules dedifferenciees de rose.
KR102263764B1 (ko) * 2014-08-13 2021-06-09 주식회사 엘지생활건강 세팔로만닌 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 피부 미백 또는 항염증용 화장료 또는 약학 조성물
CN110291988A (zh) * 2019-07-24 2019-10-01 江苏赛清科技有限公司 一种红豆杉形成层细胞分离及培养方法
FR3105259B1 (fr) 2019-12-19 2022-03-11 Oreal Cellules végétales dédifférenciées non élicitées deLavandula angustifolia, ses extraits et ses utilisations cosmétiques
CN117017846B (zh) * 2023-10-09 2023-12-12 广东粤港澳大湾区黄埔材料研究院 一种皮肤修复组合物及其制备方法和应用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4795742A (en) * 1985-09-24 1989-01-03 Yaguang Liu Therapeutic composition from plant extracts
US5019504A (en) * 1989-03-23 1991-05-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Production of taxol or taxol-like compounds in cell culture
US5413928A (en) * 1991-06-21 1995-05-09 Worcester Polytechnic Institute Process for extracting enhanced amounts of plant secondary metabolites with limited loss of plant viability
US5407816A (en) * 1992-02-20 1995-04-18 Phyton Catalytic, Inc. Enhanced production of taxol and taxanes by cell cultures of taxus species
US5850032A (en) * 1992-04-01 1998-12-15 Union Camp Corporation Method for production of plant biological products in precocious neomorphic embryoids
KR20090005241A (ko) * 1996-05-24 2009-01-12 디에프비 바이오테크 인코포레이티드 탁수스종의 세포 배양에 의한 탁산의 생산 증진 방법
US6515016B2 (en) * 1996-12-02 2003-02-04 Angiotech Pharmaceuticals, Inc. Composition and methods of paclitaxel for treating psoriasis
US6495579B1 (en) * 1996-12-02 2002-12-17 Angiotech Pharmaceuticals, Inc. Method for treating multiple sclerosis
JP2000143288A (ja) * 1998-11-09 2000-05-23 Nippon Sheet Glass Co Ltd 着色膜被覆ガラス物品
WO2002026343A2 (en) * 2000-09-29 2002-04-04 Regents Of The University Of Minnesota Process for extracting compounds from plants
KR100472171B1 (ko) * 2001-07-11 2005-03-07 엔프라니 주식회사 주목 추출물의 제조방법 및 이로부터 얻은 주목 주출물을함유한 피부노화예방용 화장료 조성물
US7691461B1 (en) * 2002-04-01 2010-04-06 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Hybrid stent and method of making
KR100508379B1 (ko) 2002-12-10 2005-08-17 엔프라니 주식회사 주목(朱木) 과육(果肉)으로부터 유래된 폴리사카라이드의제조방법 및 이들을 함유하는 화장료 조성물
KR100825038B1 (ko) * 2002-12-27 2008-04-24 주식회사한국신약 박태기나무 추출물을 함유하는 항산화용 및 피부 노화억제용 기능성 식품
ES2719093T3 (es) * 2005-08-31 2019-07-08 Abraxis Bioscience Llc Composiciones de fármacos poco solubles en agua con mayor estabilidad y métodos para su preparación
WO2007052876A1 (en) * 2005-10-31 2007-05-10 Unhwa Stability of secondary metabolite mass production through syncronized plant cell cultures
CN101077062B (zh) * 2006-05-26 2011-08-24 郑州师范高等专科学校 红头兰(Tuberolabium quisumbingii)的组织培养方法
KR20080011847A (ko) 2006-08-01 2008-02-11 배창순 천연 항균제 및 그 제조 방법
US8240530B2 (en) 2006-09-29 2012-08-14 Hand Held Products, Inc. Electronic accessory carrier
AU2008202078B2 (en) * 2007-10-10 2012-05-31 Wellkey Holdings Limited Stability of secondary metabolite mass production through synchronized plant cell cultures
CN101692924A (zh) * 2009-10-22 2010-04-14 莫宜安 一种天然紫杉保健饮料及其制备方法

Non-Patent Citations (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOGDAN C., NAT. IMMUNOL., vol. 2, 2001, pages 907
CHEN Q. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. U S. A., vol. 92, no. 10, 1995, pages 4337
CHEN, ANN. N Y ACAD. SCI., vol. 908, 2000, pages 111
CHUNG.H.Y. ET AL., KOR. J GERONTOL., vol. 2, 1992, pages 1
DUSTIN, M. L., J IMMUNOL., vol. 137, no. 1, 1986, pages 245
FINKEL, T.; HOLBROOK, N.J., SCIENCE, vol. 408, 2000, pages 239
FINKEL; HOLBROOK, NATURE, vol. 408, no. 6809, 2000, pages 239
FRIDOVICH L., SCIENCE, vol. 201, 1978, pages 175
FUKUZAWA ET AL., J ACT. OXYG. FREE RAD., vol. 1, 1990, pages 55
GEY ET AL., AM. AC. J CIN. NUTR., vol. 53, 1991, pages 326
HALLIWELL ET AL., DRUGS, vol. 42, 1991, pages 569
HATANO ET AL., NATURAL MEDICINES, vol. 49, 1995, pages 359
HAYFLICK L.; MOORHEAD P.S., EXP. CELL RES., vol. 25, 1961, pages 585
LESNEFSKY, E.J.; HOPPEL, C.L., ARCH. BIOCHEM.BIOPHYS., vol. 420, 2003, pages 287
MASAKI ET AL., BIOL. PHARM. BULL, vol. 18, 1995, pages 162
PACKER L.; FUEHR K., NATURE, vol. 267, no. 5610, 1977, pages 423
REGNSTROM ET AL., LANCET., vol. 16, 1992, pages 1183
See also references of EP2311474A4
THOMAS C.; SQUIER, EXPERIMENTAL GERONTOLOGY, vol. 36, 2001, pages 1539
WEGNER C. D., SCIENCE, vol. 247, no. 1941, 1990, pages 456

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8017397B2 (en) 2005-10-31 2011-09-13 Unhwa Corporation Isolated population of plant single cells and method of preparing same
US8053238B2 (en) 2005-10-31 2011-11-08 Unhwa Corporation Isolated population of plant single cells and method of preparing the same
US8329471B2 (en) 2005-10-31 2012-12-11 Unhwa Corporation Isolated population of plant single cells and method of preparing same
US8247230B2 (en) 2007-09-21 2012-08-21 Unhwa Corporation Plant stem cell line derived from cambium of herbaceous plant with storage root and method for isolating the same
KR20150076475A (ko) 2013-12-27 2015-07-07 코웨이 주식회사 탈분화 식물 프로토플라스트 내에 활성 물질이 인입된 구조체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 화장료 조성물
WO2020023678A1 (en) * 2018-07-24 2020-01-30 Rinati Skin Llc Method of making conditioned media and factors included therein
US11473117B2 (en) 2018-07-24 2022-10-18 Rinati Skin, Llc System and method for the production, formulation and use of conditioned media, cultured cells and the factors included therein
CN109908038A (zh) * 2019-04-18 2019-06-21 吉林新海生物科技开发有限公司 一种祛斑喷雾剂及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
AU2009247069B2 (en) 2013-03-14
US20110117039A1 (en) 2011-05-19
WO2009139581A3 (ko) 2010-01-07
EP2311474A2 (en) 2011-04-20
JP5572790B2 (ja) 2014-08-20
CA2731207A1 (en) 2009-11-19
RU2520606C2 (ru) 2014-06-27
JP2011520874A (ja) 2011-07-21
KR20090118877A (ko) 2009-11-18
KR101100867B1 (ko) 2012-01-02
AU2009247069A1 (en) 2009-11-19
CN102099046A (zh) 2011-06-15
EP2311474A4 (en) 2012-08-08
US9585923B2 (en) 2017-03-07
CN102099046B (zh) 2012-12-05
RU2010150940A (ru) 2012-06-20
BRPI0908676A2 (pt) 2019-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2009139581A2 (ko) 주목의 형성층 또는 전형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 항노화용 조성물
WO2009151302A9 (ko) 산삼 또는 인삼을 포함한 인삼류의 형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 노화방지 또는 항산화용 조성물
WO2022065774A1 (ko) 식물 유래 세포 외 소포체를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 및 이의 제조방법
WO2010095911A2 (ko) 산삼 또는 인삼을 포함한 인삼류의 형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 면역증강용 조성물
WO2015056982A1 (ko) 만능 줄기세포의 유도 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 만능줄기세포
WO2020218781A1 (ko) 불멸화 줄기세포 유래 엑소좀 풍부 배양액 및 장미꽃봉오리 추출물을 유효성분으로 포함하는 기능성 조성물
WO2020122360A1 (ko) 트리신 함량이 증가된 고장초 효소 처리 추출물의 제조방법 및 이로 제조된 미백, 주름 개선, 항염증, 항알러지, 보습용 조성물
WO2020076101A1 (ko) 시지지움 포르모슘 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백, 항균 또는 항아토피 조성물
WO2016032249A1 (ko) 모새나무 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 신경염증 또는 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2010038991A2 (ko) 산삼 또는 인삼을 포함한 인삼류의 형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 후천성 면역결핍증의 예방 또는 치료용 조성물
WO2014163298A1 (ko) 강력한 피부 보호효과를 나타내는 노니 잔사 추출물을 분리하는 추출방법 및 이를 함유한 피부노화 치료 및 예방 및 피부 보호용 조성물
WO2022085858A1 (ko) 황칠 추출물을 포함하는 미백 또는 주름 개선용 조성물
WO2020251253A1 (ko) 비만 예방 또는 치료용 바이탈 멜론 및 이의 추출물
WO2018139809A1 (ko) 진세노사이드 함량이 증진된 인삼꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물
WO2020138834A1 (ko) 조팝나무 추출물을 포함하는 피부질환 예방 또는 치료용 조성물
WO2018097388A1 (ko) 대추씨 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백, 주름개선, 항산화 및 자외선차단을 위한 조성물
WO2013024960A1 (ko) 멀꿀 추출물을 포함하는 의약 조성물
WO2021080388A1 (ko) 커큐미노이드계 화합물, 및 감초 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 복합체를 포함하는 돼지 유행성 설사 바이러스 감염의 예방 또는 치료용 조성물
WO2020204479A1 (ko) 포도잎 추출물 및 병풀 추출물을 포함하는 정맥순환 장애 개선용 조성물
WO2015072667A1 (ko) 퇴행성 뇌신경질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2019225942A1 (ko) 견사단백질을 갖는 익힌 누에가공물을 포함하는 기억력 개선용 조성물 또는, 알츠하이머 치매 예방 및 치료용 조성물
WO2014014177A1 (ko) 황칠나무 추출물 또는 상기 추출물 유래의 화합물을 유효성분으로 포함하는 전립선 비대증의 예방 및 치료용 조성물
WO2019151547A1 (ko) 침향 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
WO2023008981A1 (ko) 항바이러스 조성물 및 이의 이용
WO2023182757A1 (ko) 뇌졸중의 예방 및 치료용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200980127544.1

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 09746760

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A2

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2731207

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009746760

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2009247069

Country of ref document: AU

Ref document number: 2011509412

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 4644/KOLNP/2010

Country of ref document: IN

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2009247069

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20090514

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010150940

Country of ref document: RU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 12992810

Country of ref document: US

ENP Entry into the national phase

Ref document number: PI0908676

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20101112