WO2020122360A1 - 트리신 함량이 증가된 고장초 효소 처리 추출물의 제조방법 및 이로 제조된 미백, 주름 개선, 항염증, 항알러지, 보습용 조성물 - Google Patents

트리신 함량이 증가된 고장초 효소 처리 추출물의 제조방법 및 이로 제조된 미백, 주름 개선, 항염증, 항알러지, 보습용 조성물 Download PDF

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문주명
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Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing an extract of hypertonic herb enzyme with increased trisine content and to a whitening, wrinkle improvement, anti-inflammatory, anti-allergic and moisturizing cosmetic composition or health functional food composition.
  • Zizania latifolia Turcz. is a perennial plant belonging to the family Asteraceae, and is called the Joule or Joule. It is known to be effective against diseases such as hypertension, paralysis, constipation, obesity, and arteriosclerosis. In the private sector, it is effective to drink or drink the juice by adding hypertonic herbs to pesticide poisoning, chemical poisoning, food poisoning, etc. In addition, recently, healthy foods and liquid teas using high-growth herbs have been developed (Korean Patent Publication No. 10-2010-0104334, Korean Patent Publication No. 10-2009-0127970).
  • the active substances contained in the hypertonic herb are trisine glycosides or glycosides of derivatives, and these are bound by high hydrophilic sugar molecules, which may result in low intestinal cell membrane lipid permeability and low absorption in the body.
  • the carbon skeleton itself, except for the sugar molecule has high hydrophobicity, it has high solubility in the intestinal membrane lipid, and thus, the permeation of the intestinal membrane is easy. Therefore, high activity can be expected by increasing the absorption rate in the intestine by converting the glycosides of trisine glycosides and derivatives, which may have a low intestinal absorption, into trisine.
  • the sugar decomposition process of the substance glycosides is mostly carried out through high temperature treatment with acid or fermentation and enzyme treatment.
  • the fermentation process has a disadvantage in that it is difficult to meet the standards because the condition of the microorganism, the growth conditions, etc. must be kept constant, and the variation of the active ingredient content of the extract may be increased due to the change of the enzyme secreted according to the condition of the microorganism.
  • the acid and high-temperature treatment process has the advantage of converting the glycoside material to the non-glycoside relatively easily, but it is difficult to secure the stability of the material in terms of chemistry due to the use of harsh conditions, and thus it is possible to secure reproducibility. .
  • the enzyme treatment process is relatively simple compared to the previously proposed process, and the material stability and process are relatively simple, so it has good merits for commercialization. It is believed that this will help to stably induce non-glycoside active ingredients as it can reduce the stability of the material.
  • the present inventors sought a method for effectively converting triglycerides present in hypertonic plants to non-glycosylated forms with increased bioavailability and increased efficacy in whitening, wrinkle improvement, anti-inflammatory, anti-allergy and moisturizing. As a result, it was confirmed that the enzymatic reaction using various enzymes in various ways rather than simply converting non-glycosides by a single enzyme is more effective in converting trisine glycosides into a non-glycoside form, thereby completing the present invention.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a hypercapsicum herb extract capable of maximizing the content of trisine.
  • Another object of the present invention is to provide a cosmetic composition having a variety of functional enhancement is maximized trisine content.
  • Another object of the present invention is to provide a health functional food composition with a variety of improved functionality by maximizing the content of trisine.
  • the present invention is (1) adding water to the hypertonic plant and immersing in hot water; (2) In the step (1), after immersion in hot water, the cooled immersion product contains alpha-amylase, beta-galactosidase, xylanase, and lactase.
  • ⁇ -Glucosidase beta-glucosidase
  • the present invention includes the hyper-enzyme-enzyme-treated extract prepared by the preparation method as an active ingredient, and the hyper-enzyme-enzyme-treated extract contains 0.01% to 90% by weight of trisine. It provides a cosmetic composition to be.
  • the present invention comprises the hyper-enzyme-enzyme-treated extract prepared by the preparation method as an active ingredient, and the hyper-enzyme-enzyme-treated extract contains 0.01% to 90% by weight of trisine. It provides a health functional food composition characterized by.
  • the present invention relates to a method for preparing an enzyme-processed extract of native herb and a composition comprising an enzyme-processed extract of native herb, wherein the manufacturing method according to the present invention includes mixing or complex processing steps of various enzymes, thereby producing a malfunction
  • the yield and trisine content of the super-enzyme-treated extract are maximized, and the hyper-enzyme-enzyme-treated extract prepared in this way has a high bioavailability and increased skin whitening, moisturizing, anti-inflammatory, anti-allergic, and wrinkle-improving activity. Or it may be useful as a health functional food composition.
  • FIG. 1 is a process diagram schematically showing a method of manufacturing an enzyme-treated extract of a hypertonic herb according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a graph showing the yield of hypertonic ethanol and enzyme-treated extract according to the present invention (* p ⁇ 0.05 versus EtOH, ** p ⁇ 0.01 versus EtOH, *** p ⁇ 0.001 versus EtOH).
  • Figure 3 is a graph showing the results of trisine content analysis of the hypertonic ethanol and enzyme-treated extract according to the present invention (* p ⁇ 0.05 versus EtOH, ** p ⁇ 0.01 versus EtOH, *** p ⁇ 0.001 versus EtOH).
  • Figure 4 is a trisine analysis chromatogram of the hypertonic ethanol and enzyme-treated extract.
  • 5 is a graph showing the total amount of trisine considering the yield of ethanol and enzymatically treated extract (* p ⁇ 0.05 versus EtOH, ** p ⁇ 0.01 versus EtOH, *** p ⁇ 0.001 versus EtOH).
  • Figure 6 is a result confirming the anti-inflammatory efficacy of the hypertonic ethanol and enzyme treatment extract (# p ⁇ 0.01 versus LPS, * p ⁇ 0.05 versus EtOH, ** p ⁇ 0.01 versus EtOH).
  • Figure 10 is a result confirming the wrinkle improvement efficacy of ethanol and enzymatic treatment extract of the native herb (# p ⁇ 0.05 versus UV, * p ⁇ 0.05 versus EtOH, ** p ⁇ 0.01 versus EtOH).
  • Figure 12 is a result confirming the anti-allergic efficacy of ethanol and enzyme-treated extract perilla (# p ⁇ 0.001 versus DNP-HAS, * p ⁇ 0.05 versus EtOH).
  • 15 is a graph showing the change in weight of the experimental group in the animal experiment.
  • 16 is a graph showing the moisture content of the skin surface of the experimental group in the animal test.
  • 17 is a graph showing the results of the serum test of the experimental group in the animal test.
  • 18 is a view showing the results of visual observation of the back surface of the experimental group in the animal test.
  • 21 is a photograph showing the results of Mason's Trichrome staining of the experimental group in the animal test.
  • 23 is a graph comparing the yields of ethanol extract of oligosaccharides and the extract of oligosaccharides treated with oligosaccharides in which extraction conditions are established.
  • 24 is a graph comparing the content of tricin in the hypertonic ethanol extract with the extraction conditions established and the hyper-enzyme enzyme-treated extract.
  • Figure 25 is a graph comparing the anti-inflammatory efficacy of ethanol extract of hypertrichweed and extract of hypertrichosis enzyme treatment with established extraction conditions (** p ⁇ 0.01 versus LPS, *** p ⁇ 0.001 versus LPS).
  • 26 is a graph comparing the whitening efficacy of ethanol extract of oligosaccharides and the extract of medicinal oligosaccharides with extract conditions established (*** p ⁇ 0.001 versus CON).
  • FIG. 27 is a graph comparing the wrinkle improvement efficacy of the hypertonic ethanol extract with the extract conditions established, and the hypertonic enzyme treatment extract (* p ⁇ 0.05 versus UV, *** p ⁇ 0.001 versus UV).
  • Figure 28 is a graph comparing the anti-allergic efficacy of ethanol extract of oligosaccharides and the extract of medicinal oligosaccharides with extract conditions established (*** p ⁇ 0.001 versus DNP-HAS).
  • the active substances contained in the hypercapsicum herb extract are the glycosides of trisine glycosides or derivatives, and these are bound by high hydrophilic sugar molecules, so the solubility in intestinal cell membrane lipids is low, so the absorption rate in the body is likely to be low.
  • the inventors of the present invention decompose sugars of trisine glycosides and derivative glycosides to increase bioavailability and convert to non-glycosylated ones that are more active than glycosides of trisine glycosides and derivatives, thereby anti-inflammatory, skin whitening, and wrinkles. Methods of improving, anti-allergic, and moisturizing efficacy were studied.
  • the extract of the hypertonic herb extracted with the manufacturing method disclosed in the present invention has an increased trisine content, thereby increasing anti-inflammatory, skin whitening, anti-allergic, wrinkle improvement, and moisturizing efficacy.
  • the yield was also increased by approximately 2 times from 11% to 20.8%, and commercial mass production was possible, thus developing a high-enzyme enzyme-treated extract with high value for use as a cosmetic raw material and functional food.
  • the reason why various efficacy is increased is because of the trisine glycosides and derivatives trisine-7-O- ⁇ -D-glucopyranose (Tricin-7-O- ⁇ -D-glucopyranose) contained in the hypertonic herb extract.
  • Trisine derivatives trisine-4'-O-(threo- ⁇ -guaiacylglyceryl) ether 7-o- ⁇ -D-glucopyranose (Tricin-4'-O-(threo- ⁇ -guaiacylglyceryl) ) ether 7-o- ⁇ -D-glucopyranose), trisine-4'-O-(erythro- ⁇ -guaiacylglyceryl) ether 7-o- ⁇ -D-glucopyranose (Tricin-4' -O-(erythro- ⁇ -guaiacylglyceryl) ether 7-o- ⁇ -D-glucopyranose), trisine-4'-O-(threo- ⁇ -guaiacylglyceryl) ether 7''-O- ⁇ - D-glucopyranose (Tricin-4'-O-(threo- ⁇ -guaiacylglyceryl) ether 7"-o- ⁇ -D-glucopyranose
  • the present invention (1) adding water to the hypertonic plant and immersing in hot water; (2) In the step (1), after immersion in hot water, the cooled immersion product, alpha-amylase ( ⁇ -Amylase) [EC 3.2.1.1], beta-galactosidase ( ⁇ -Galactosidase) [EC 3.2.1.23 ], Xylanase [EC 3.2.1.8], Lactase [EC 3.2.1.108], Lipase [EC 3.1.1.3], Tanase [EC 3.1.1.20], Cellulase [EC 3.2.1.4], hemicellulase [EC 232-799-9], pectinase [EC 3.2.1.15] and beta-glucosidase ( ⁇ -Glucosidase) [EC 3.2.1.21] by treating and reacting one or more enzymes selected from the group consisting of filtering to obtain an enzyme-treated extract; (3) filtering the remaining residue from the step (2) and extracting it with any one solvent selected from the group consist
  • hot water immersion is added to 1 to 100 parts by weight of water with respect to 1 part by weight of malignant grass, can be made for 5 minutes to 100 hours at 20 °C to 130 °C, more preferably Is, 1 to 50 parts by weight of water with respect to 1 part by weight of hypertonic herb can be made for 30 minutes to 100 hours at 50 to 120 °C, most preferably, 5 to 30 parts by weight of water in hypertonic herb , It may be made for 30 minutes to 4 hours at 70 °C to 120 °C.
  • cooling may be performed at 10°C to 90°C, and preferably at 20°C to 45°C.
  • the enzyme in the step (2), can be treated with 0.1 to 80 parts by weight compared to 100 parts by weight of the immersion, and if the enzyme is processed too little outside the numerical range, the amount of enzyme is too small and the hyperthermia is immersed It is difficult to separate and convert the trisine present in water smoothly from the precursor. On the contrary, if too much treatment is performed, substances other than the trisine precursor, which are not involved in activity, are extracted together at a high content, and the content of trisine is relatively low. Extracts with reduced efficacy can be produced, and are commercially undesirable as they can affect the cost of the manufacturing process.
  • the enzyme may be treated and reacted at 10°C to 90°C for 5 minutes to 120 hours, preferably at 20°C to 80°C for 5 minutes to 120 hours, more preferably The enzyme can be reacted at 30°C to 60°C for 5 minutes to 48 hours, most preferably at 20°C to 45°C for 8 hours to 24 hours, and the reaction time of the appropriate enzyme is inversely proportional to the amount of the enzyme added. Therefore, the more the amount of enzyme added, the shorter the reaction time.
  • the reaction time after the enzyme treatment is less than the numerical range, the time for the enzyme treatment is too short, so that the conversion rate from the trisine precursor present in the hyperthermia immersion to trisine decreases, and conversely, the enzyme treatment reaction time is If it exceeds the numerical range, it is not preferable because it may affect the manufacturing process cost commercially.
  • the complexes of the enzymes may be used in combination of one or more complexes of purified single enzymes or commercialized complexes.
  • a commercialized enzyme select from commercial enzymes plantase TL, rapidase C80 MAX, biscozyme L, sumizime SPC, sumizime AC, pectinex Ultra SP-L, pectinex Ultra pulp and viscoflow MG It may be one or more, but is not limited thereto.
  • step (2) three enzymes of beta-glucosidase, cellulase, and hemicellulase can be simultaneously processed, and in particular, when three types of enzymes are used in combination. , The content and yield of various trisine was the highest, and its functionality was also remarkably excellent, which is preferable.
  • the enzyme in step (2), may convert the flavonoid glycoside contained in the hypertonic plant to a flavonoid non-glycoside.
  • Glycosides of trisine glycosides and derivatives are glycosides in which the binding of the sugar is R-O- ⁇ -D-glucopyranose, and glucose is bound to the structure of the trisine and derivative by beta binding.
  • the most representative enzyme that decomposes glucose bound with beta is a beta-glucosidase enzyme. To utilize this, an enzyme reaction was conducted with reference to the present invention, but as a result, an increase in trisine content was hardly observed and whitening and wrinkles No significant changes were observed in the improvement, inflammation improvement, allergy improvement, and efficacy of moisturizing.
  • beta-glucosidase enzyme which is well known as an enzyme that breaks down beta bonds
  • anthocyanins are a family of anthocyanidins. It is thought that the reaction does not occur as shown in Chemical Formula 2 due to the substrate specificity, because the molecular structure differs markedly from the series of trisine as shown in the following Chemical Formula 1 and the position where the sugar is attached is also different.
  • 1 to 100 parts by weight of water or alcohol aqueous solution with respect to 1 part by weight of the residue as a solvent can be extracted for 10 minutes to 100 hours at 20 °C to 130 °C, preferably 20 °C to It can be extracted at 100°C for 2 to 12 hours, or it can be extracted at 50°C to 100°C for 30 minutes to 10 hours with 1 to 30 parts by weight of water or alcohol aqueous solution as a solvent.
  • the extraction temperature is less than the above range, the extraction yield of trisine and active ingredients in activity is lowered, and if the extraction temperature exceeds the above range, the active ingredients are destroyed, or a substance that is not involved in activity is included in a high content. It is not preferable because an extract with reduced efficacy can be prepared.
  • the alcohol may be an aqueous ethanol solution of 5 to 95% by weight, preferably an aqueous solution of ethanol of 20 to 80% by weight, more preferably an aqueous solution of ethanol of 50 to 70% by weight, most preferably It may be a 70% by weight aqueous ethanol solution.
  • the extraction can be performed for 6 hours at 80 °C using 70% ethanol as a solvent, and when extracted under these extraction conditions, the content of trisine, yield to functionality This is preferable because it is maximized.
  • the mixture may be concentrated in step (4) to obtain a concentrate, or the concentrate may be dried to obtain an extract in powder form.
  • a pre-treatment step of irradiating ultrasonic waves or microwaves may be further performed before extraction of step (3), and ultrasonic waves and microwaves may be used in combination.
  • ultrasonic waves and microwaves may be used in combination.
  • the ultrasound may be irradiated at 15 to 25 kHz and 500 to 800 watts for 2 to 30 minutes, and the microwave may be irradiated at 2000 to 3000 MHz and 50 to 400 watts for 5 to 60 seconds. If the energy and the irradiation time are less than the above range, the effect by irradiation is negligible, and if it exceeds the above range, the extraction rate of substances not involved in activity increases, which is undesirable.
  • the impurities can be removed using a conventional filtration method or device, for example, by using a centrifugal separation method or using a filter or a micro filter to remove impurities.
  • the removed extract can be obtained.
  • the filter body may be 1 to 200 ⁇ m
  • the micro filter may be a 0.2 to 0.8 ⁇ m filter, but is not limited thereto.
  • the above-described high-grade enzyme extract may be prepared in a powder state that has undergone additional processes such as distillation under reduced pressure, lyophilization, or spray drying, or may be prepared by a continuous process method using an enzyme immobilization method. According to the above method, it is possible to provide an extract of a hypertonic herb enzyme having a solid content of 20% by weight or more.
  • the extract thus prepared can be filtered or concentrated or dried to remove the solvent, and then filtered, concentrated and dried.
  • a filter paper may be used or a vacuum filter may be used.
  • Concentration may be performed under a reduced pressure concentrator, drying may include hot air drying, spray drying, low temperature drying, and freeze drying, but is not limited to the specified methods.
  • the hypertonic enzyme-treated extract prepared by the above preparation method may contain 0.01% to 90% by weight of trisine, as a composition for whitening, wrinkle improvement, inflammation improvement, allergy improvement and moisturizing Can be utilized.
  • the trisine may be represented by the following ⁇ Formula 3>:
  • Tricin-7-O- ⁇ -D-glucopyranose (Tricin-7-O- ⁇ -D-glucopyranose) (2 in Formula 4)
  • Salcolin B (4 of Formula 4)
  • Trisine-4'-O-(threo- ⁇ -guaiacylglyceryl) ether 7-O- ⁇ -D-glucopyranose (Tricin-4'-O-(threo- ⁇ -guaiacylglyceryl) ether 7-O- ⁇ -D-glucopyranose) (5 in Formula 4)
  • Tricin-4'-O-(erythro- ⁇ -guaiacylglyceryl) ether 7-O- ⁇ -D-glucopyranose (Tricin-4'-O-(erythro- ⁇ -guaiacylglyceryl) ether 7-O- ⁇ -D-glucopyranose) (6 in Formula 4)
  • Salcolin D (10 in Formula 4)
  • the present invention provides a cosmetic composition characterized in that it contains an extract of the hypertonic enzyme processed by the preparation method as an active ingredient, and the extract of the hypertrophic enzyme contains 0.01% to 90% by weight of trisine. do.
  • the cosmetic composition may be used for whitening, wrinkle improvement, inflammation improvement, allergy improvement or moisturizing, and contains a high content of trisine, thereby providing excellent whitening, wrinkle improvement, inflammation improvement, allergy improvement and moisturizing effect. Can be represented.
  • the term'cosmetics' refers to substances that can be cosmetic or quasi-drugs.
  • Cosmetics are products used in the human body to clean and beautify the human body to add attractiveness and change the appearance brightly, or to maintain or promote the health of the skin and hair.
  • functional cosmetics are products that help whitening the skin, help improve the wrinkles of the skin, or help protect the skin from UV rays, including those prescribed by Ordinance of the Ministry of Health, Welfare and Family Affairs.
  • Quasi-drug refers to drugs based on classification criteria separately set by the Ministry of Health and Welfare for items that have a slight effect on the human body rather than drugs used to treat or prevent disease.
  • quasi-drugs include toothpaste, functional soap, and functional shampoo.
  • the cosmetic composition of the present invention is a cosmetic soap (essence, cream, etc.) for skin whitening, anti-aging, wrinkle improvement or skin elasticity enhancement, or a functional soap or cleansing foam for skin whitening, anti-aging, wrinkle improvement or skin elasticity enhancement, It can be used as a quasi-drug product such as cleansing cream and cleansing water.
  • the perilla plant extract may be contained in an amount of 0.001 to 100% by weight based on the total weight of the composition, but is not limited thereto.
  • the cosmetic composition may be blended with the above ingredients and other ingredients that are usually blended into a cosmetic composition as needed.
  • Other ingredients that may be added include fats and oils, moisturizers, emollients, surfactants, organic and inorganic pigments, organic powders, ultraviolet absorbers, preservatives, fungicides, antioxidants, plant extracts, pH adjusters, alcohols, pigments, fragrances , Blood circulation accelerator, coolant, restriction agent, purified water, sunscreen, and the like.
  • the components included in the cosmetic composition may further include components commonly used in cosmetic compositions in addition to the above compounds, for example, conventional adjuvants such as stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and fragrances, carriers, and Moisturizers may be included.
  • conventional adjuvants such as stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and fragrances, carriers, and Moisturizers may be included.
  • the cosmetic composition may be prepared in any formulation conventionally prepared in the industry, for example, emulsion, suspension, cream, lotion, essence, pack, gel, powder, lipstick, makeup base, foundation, lotion, Ointment, patch, essence, cleansing foam, cleansing cream, cleansing water, body lotion, body cream, body oil, body essence, shampoo, rinse, body cleaner, soap and may be a formulation selected from the spray.
  • the manufacturing method of these formulations can be prepared according to the conventional cosmetic formulation manufacturing method.
  • the present invention includes the hyper-enzyme-enzyme-treated extract prepared by the preparation method as an active ingredient, and the hyper-enzyme-enzyme-treated extract contains 0.01% to 90% by weight of trisine.
  • the health functional food composition may be used for whitening, wrinkle improvement, inflammation improvement, allergy improvement or moisturizing, and contains high content of trisine, so it has excellent whitening, wrinkle improvement, inflammation improvement, allergy improvement and moisturization It can have an effect.
  • the term "health functional food” refers to food manufactured and processed using ingredients or ingredients having useful functionality for the human body according to Act No. 6727 on the Health Functional Food, and the term “functional” refers to the human body. It means to ingest for the purpose of obtaining useful effects for health purposes such as adjusting nutrients or physiological effects on the structure and function of.
  • the health functional food composition may include a conventional food additive, and whether or not it is suitable as a "food additive” is applied to the relevant item according to the general rules and general test methods of food additives approved by the Food and Drug Administration, unless otherwise specified. It is judged according to related standards and standards.
  • Items described in the "Food Additives Revolution” include, for example, chemical compounds such as ketones, glycine, potassium citrate, nicotinic acid, and cinnamonic acid, natural additives such as chromosomes, licorice extract, crystalline cellulose, high-color pigments, and guar gum, L -Mixed preparations such as sodium glutamate, noodles-added alkalis, preservatives, and tar colorants.
  • chemical compounds such as ketones, glycine, potassium citrate, nicotinic acid, and cinnamonic acid
  • natural additives such as chromosomes, licorice extract, crystalline cellulose, high-color pigments, and guar gum
  • L -Mixed preparations such as sodium glutamate, noodles-added alkalis, preservatives, and tar colorants.
  • composition of the present invention can be variously used in food and beverage for skin whitening, moisturizing, anti-allergy, wrinkle improvement, for example, various foods, beverages, chewing gum, tea, vitamin complexes, health functional supplements, food additives It can be used in, and can be used in the form of powder, granule, tablet, capsule, pill or beverage, and can be any food form other than those described above.
  • the formulation of the food composition of the present invention is prepared according to a conventional method, and dried with a carrier and then encapsulated or other tablets, granules, powders, beverages, porridges, etc. can be formulated in the form, and all food forms other than those described above It is possible to manufacture.
  • the food composition of the present invention may contain an active ingredient in an amount of 0.001 to 100 parts by weight based on 100 parts by weight of the composition.
  • the content of the active ingredient is not limited to this, and may be appropriately adjusted, and may be used in an amount above the range.
  • Concentration and drying of the hypertonic ethanol extract was carried out to obtain an ethanol extract powder of hypertonic herb, and the weight of the extract solids according to the ratio of ethanol concentration was measured and the effect of inhibiting trisine content and NO production was confirmed.
  • the content of trisine was confirmed as follows: HPLC (Agilent 1260) was used as an analyzer, and analytical column was used for Discovery C18, C-18, 5 ⁇ m, 250 ⁇ 4.6 mm (SUPELCO).
  • HPLC Agilent 1260
  • analytical column was used for Discovery C18, C-18, 5 ⁇ m, 250 ⁇ 4.6 mm (SUPELCO).
  • 2 mg of tricine standard product was weighed, and 20 mL was added by adding methanol for HPLC as a standard stock solution, and the standard stock solution was used to measure the linearity at a concentration of 1, 3, 5, 10, and 20 ppm. Standards were prepared.
  • test solution 100 mg of the hypercapitalis extract prepared in Preliminary Experiments 1 and 2 was weighed, placed in a 50 mL volumetric flask, and half of methanol was added to perform sonication. After the treatment was completed, the marks were aligned and vortexed, followed by filtration through a 0.45 ⁇ m membrane filter to prepare a test solution.
  • the production of NO was confirmed by the NO assay, and the specific procedure was as follows:
  • the macrophage cell line RAW264.7 was pre-sold by the Korea Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea) and 10% FBS and 1% antibiotic (penicillin/streptomycin). ) was added to the DMEM medium (Welgene, Gyeongsan, Korea) to which it was passaged 2-3 times in a 37°C incubator with 5% CO 2 .
  • RAW264.7 cells were dispensed to 1 X 10 6 cells/well in a 96-well plate and pre-incubated for 20 to 24 hours in a 5% CO 2 incubator, and each extract sample was processed to incubate for 24 hours.
  • 10 ⁇ L of 1 mg/mL lipopolysaccharide (Sigma-Aldrich, USA) was injected into each well to induce inflammation of the macrophage cell line RAW264.7 cells.
  • the yield was confirmed that the highest 70% ethanol extract. Trisine was not found in 10% ethanol extract, and the highest content was 70% ethanol extract. As a result of the NO production, the effect of inhibiting NO production of 70% ethanol extract was the best at 100 and 250 ⁇ g/ml, and 50% ethanol extract at 500 ⁇ g/ml showed better results. By collecting the above results, a 70% ethanol solvent showing high activity at a low concentration while having high yield and trisine content was determined as an optimal extraction solvent.
  • the extraction yield and the trisine content of 80°C were higher than those extracted at 60°C.
  • the extract at 80° C. was high at 100, 250, and 500 ⁇ g/ml.
  • Beta-glucosidase, pectinase, cellulase, hemicellulase 4 enzymes were mixed and treated by mixing two or more enzymes to prepare an enzyme-treated extract. After weighing 100 g of malnutrition, 20 times of weight of purified water was added to extract hot water at 80° C. for 1 hour. Various ratios of enzymes were mixed and added at the ratios specified below with respect to the amount of raw malt grass input, followed by enzymatic treatment according to the conditions set forth in ⁇ Table 6>, followed by primary filtration to obtain the first malt herb extracts.
  • the input amount of each enzyme is a comparison with the input amount of the hypertonic herb.
  • the trisine content of the hypertonic herb extracts prepared in the preliminary experiments 2 to 4 was comparatively analyzed.
  • HPLC Alent 1260
  • an analytical column was used for Discovery C18, C-18, 5 ⁇ m, 250 ⁇ 4.6 mm (SUPELCO).
  • test solution 100 mg of the hypercapsicum vinegar extracts prepared in the preliminary experiments 1 and 2 were weighed, placed in a 50 mL volumetric flask, and half of methanol was added to perform sonication. After the treatment was completed, the marks were aligned and vortexed, followed by filtration through a 0.45 ⁇ m membrane filter to prepare a test solution.
  • Figure 4 shows a chromatogram of the trisine chromatogram of the ethanol extract and the mixed enzyme treatment extract of hypercapsular beta-glucosidase, cellulase, and hemicellulase. It can be seen that the trisine content increases when the enzyme is treated. It can be seen that the peak of the trisine glycosides of is decreased compared to the ethanol extract. This is a part that can be indirectly confirmed that the content of trisine increases due to the reduction of trisine glycosides and derivatives.
  • the anti-inflammatory effect of the hypercapsicum extract prepared in the preliminary experiments 2 to 4 was confirmed.
  • the macrophage cell line RAW264.7 is pre-sold from the Korea Cell Line Bank (KCLB, Seoul, Korea) and 5% CO using DMEM medium (Welgene, Gyeongsan, Korea) containing 10% FBS and 1% antibiotic (penicillin/streptomycin). After incubation 2-3 times in a 37°C incubator where 2 is present, it was used.
  • RAW264.7 cells were divided into 96-well plates to 1 X 10 6 cells/well and pre-incubated for 20 to 24 hours in a 5% CO 2 incubator. After processing each extract sample, incubating for 24 hours, PBS 10 ⁇ L of MTT (5 mg/mL) solution dissolved in each well was added to each well and reacted for 4 hours in an incubator. Then, the supernatant was removed, and 100 ⁇ L of DMSO was added to each well to dissolve the resulting formazan crystal, and absorbance was measured by an ELISA reader at a wavelength of 550 nm. The degree of formazan production measured in this way was expressed as a percentage (%) compared to the normal cell value.
  • a NO assay was performed to measure the anti-inflammatory effect of high-growth herb extract and tricine using RAW264.7.
  • RAW264.7 cells were divided into 96-well plates at 1 X 10 6 cells/well, pre-incubated in a 5% CO 2 incubator for 20 to 24 hours, and each extract sample was processed to incubate for 24 hours.
  • 10 ⁇ L of 1 mg/mL lipopolysaccharide (Sigma-Aldrich, USA) was injected into each well to induce inflammation of the macrophage cell line RAW264.7 cells.
  • RAW264.7 cells without lipopolysaccharide were used as a positive control, and L ⁇ -nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME, Sigma-Aldrich, USA) acting as an NO inhibitor was used as a negative control. The added cells were used.
  • mice-derived melanin cell line B16-F0 cells were distributed from the American Type Culture Collection (ATCC, USA), and DMEM medium (ATCC, ATCC 30-2002, USA) containing 10% FBS and 1% antibiotic (penicillin/streptomycin) ) was used after incubation 2-3 times in a 37°C incubator with 5% CO 2 .
  • ATCC American Type Culture Collection
  • DMEM medium ATCC, ATCC 30-2002, USA
  • antibiotic penicillin/streptomycin
  • an MTT assay was performed to measure cell viability for a sample of B16-F0 cells.
  • B16-F0 cells were dispensed to 5 X 10 5 cells/well in a 24-well plate and pre-incubated in a 5% CO 2 incubator for 20 to 24 hours. Each extract sample was processed and incubated for 48 hours, followed by PBS. 100 ⁇ L of the dissolved MTT (5 mg/mL) solution was added to each well and reacted for 4 hours in an incubator. Thereafter, the supernatant was removed, and 500 ⁇ L of DMSO was added to each well to dissolve the resulting formazan crystal, and absorbance was measured with an ELISA reader at a wavelength of 550 nm. The measured degree of formazan production was expressed as a percentage (%) compared to the normal cell value.
  • the melanin production inhibitory ability of the high-growth herb extract and tricin was measured in the melanin cell line B16-F0 derived from the mouse.
  • B16-F0 cells were dispensed to 5 X 10 5 cells/well in a 6-well plate and pre-incubated in a 5% CO 2 incubator for 20 to 24 hours, and then treated with each extract sample and incubated for 48 hours.
  • 1 ⁇ M ⁇ -Melanocyte stimulating hormone (Sigma-Aldrich, USA) and 100 ⁇ M 3-isobutyl-1-methylxanthine (3-Isobutyl-1) are used to accelerate melanin production along with sample processing.
  • -methylxanthine Sigma-Aldrich, USA
  • human-derived CCD-986sk fibroblast cells were distributed from the Korea Culture Tissue Collection (KCTC, Korea), and human dermal fibroblasts (HDF) were distributed from Serine Bio. And from CCD-986sk fibroblasts 10% FBS and 1% antibiotics (penicillin / streptomycin) was added to a culture medium IMDM 37 °C incubator to (ATCC, ATCC 30-2005, USA) is 5% CO 2 exist using the second It was used after passage cultivation three times, and HDF was used after passage cultivation 2-3 times using HDF special medium (cell bio, Korea) containing 10% FBS and 1% antibiotic (penicillin/streptomycin).
  • CCD-986sk cells and HDF samples were dispensed in a 96-well plate to be 1 X 10 5 cells/well, pre-incubated in a 5% CO 2 incubator for 20 to 24 hours, and then treated with each extract sample for 24 hours. After incubation, 10 ⁇ L of MTT (5 mg/mL) solution dissolved in PBS was added to each well and reacted for 4 hours in an incubator.
  • the procollagen and the MMP family are factors that are discharged to the outside of the cell culture medium, and the cell culture solution reacted with the sample is collected and used. That is, in order to measure the ability of progeny enzyme treatment (standard sample) and procollagen synthesis to tricine, a procollagen type I C-peptide EIA kit from Takara was used, and PIP The quantitative curve was measured using and the collagen synthesis amount per sample was calculated. In addition, by measuring the inhibitory ability of metalloproteinase-1 (MMP-1), MMP-2, MMP-3, MMP-9, and MMP-13, factors affecting wrinkles, hypertonic enzyme treatment (Standard sample) and trisine wrinkle improvement effect was evaluated. The inhibitory capacity of MMP-1, 2, 3, 9, 13 was measured using Abcam products.
  • the wrinkle improvement efficacy of the extract treated with beta-glucosidase, pectinase, cellulase, and hemicellulase is better than that of the hypertonic ethanol extract at a concentration of 500 ⁇ g/ml for each sample.
  • the wrinkle improvement efficacy of the extract treated with beta-glucosidase, pectinase, cellulase, and hemicellulase is better than that of the hypertonic ethanol extract at a concentration of 500 ⁇ g/ml for each sample.
  • RBL-2H3 cells a rat basophilic leukemia cell line
  • MEM Micromaize BRL, NY, USA
  • penicillin/streptomycin a culture medium at 37°C and 5% CO.
  • RBL-2H3 cells were dispensed at 2 x 10 5 cells per well in 24-well plates and stimulated with anti-DNP IgE (450 ng/mL) overnight at 37°C. Thereafter, the cells were washed with Siraganian buffer and 160 ⁇ L of incubation buffer was added, followed by incubation at 37° C. for 20 minutes, and then 20 ⁇ L of the extract sample was treated with cells for 10 minutes and antigen (DNP-BSA, 10 ⁇ g/mL) ) 20 ⁇ L was added to stimulate cells to form granules at 37° C.
  • DNP-BSA antigen
  • IL-4 and TNF- ⁇ are cytokines released outside the cells, and the same experimental method was used to collect the cell culture solution. IL-4 and TNF- ⁇ were measured using the Abcam and R&D systems kit by ELISA. It was measured according to the manual.
  • Beta glucosidase, cellulase, and hemicellulase enzymes which are commercially available at a weight of 1.0 w/w% by weight, are added to the enzyme, followed by enzymatic treatment at 35° C. for 24 hours, followed by primary filtration for primary hypertonic enzyme. A treatment extract was obtained.
  • the ethanol extraction process is a method of extracting hypertonic ethanol, which is mentioned in various papers or patents, and has set the optimum conditions through preliminary experiment 1.
  • the hypercapsule extract contained a large amount of trisine. Accordingly, the following experiment was performed to identify the trisine in the enzyme extract of the hypertonic herb, and to investigate the separation and structure of the substance to reveal the actual trisine.
  • the trisine material separation method was as follows: 1) 5 kg of dried hypertonic enzyme-treated extract powder was extracted at 45 L in 80% methanol. 2) Fraction of 3L of EtOAc and 3L of n-BuOH 3L was performed on the concentrate of 1). 3) The EtOAc fraction of 2) was named ZLE, the n-BuOH fraction was ZLB, and the remaining extract after fractionation was named ZLW. 4) The ZLE extract was subjected to a fractionation of CHCl 3 : MeOH 50:1 to 1:1 in each solvent condition using a column column filled with silica gel to obtain fractions from ZLE-1 to ZLE-13.
  • ZLE-8 was subjected to each fraction using prep-LC, and the separated fractions were named ZLE-8-1 to ZLE-8-14.
  • the fraction of ZLE-8-4 in the fraction of 5) was subjected to material separation under the following conditions using prep-LC.
  • Mobile phase A: water and 0.1% formic acid
  • the experiment was conducted in the same manner as described in the anti-inflammatory efficacy test method in the preliminary experiment 7.
  • the experiment was conducted in the same manner as the whitening efficacy test method in the preliminary experiment 8.
  • the experiment was conducted in the same way as the wrinkle improvement efficacy test method in the preliminary experiment 10.
  • the yield of the extract extracted with a mixed enzyme of beta glucosidase, cellulase, and hemicellulase was 21.37%, which was more than doubled compared to 10.96% of the existing native ethanol extract, It was confirmed that the commercial utilization value was higher.
  • Trisine content analysis of the extracts prepared in Example 1 and Comparative Example 1 was performed. At this time, the experiment was conducted in the same manner as the trisine content analysis method in the preliminary experiment 6.
  • the trisine content of the hypercapsicum extract treated with a mixed enzyme of beta-glucosidase, cellulase, and hemicellulase is about 2.6 from 1.27 mg/g to 3.31 mg/g of the hypercapsicum ethanol extract. It was confirmed that the fold increased.
  • beta-glucosidase, cellulase, hemicellulase mixed enzyme treatment of the hypertonic herb extract NO production amount of 26.3 ⁇ M (Eye ethanol extract) to 17.89 ⁇ M further reduced by 8.41 ⁇ M could confirm.
  • the melanin production rate of the hypercapsicum vinegar extract treated with a mixed enzyme of beta-glucosidase, cellulase, and hemicellulase is further reduced by 20.334 percentage points from 68.323% of the native ethanol extract to 47.989 %.
  • a mixed enzyme of beta-glucosidase, cellulase, and hemicellulase is further reduced by 20.334 percentage points from 68.323% of the native ethanol extract to 47.989 %.
  • the collagen synthesis amount of the hypercapsule extract treated with the mixed enzyme of beta-glucosidase, cellulase, and hemicellulase was 2401.4996 ng from 7402.1097 ng/ml to 9803.6093 ng/ml of the hypercapsule ethanol extract It was confirmed that /ml was further increased.
  • Anti-allergy efficacy evaluation of the extracts prepared in Example 1 and Comparative Example 1 was performed. The experiment was conducted in the same manner as the anti-allergic efficacy test method in the preliminary experiment 10.
  • the ⁇ -hexosaminidase release rate of the hypercapsule extract treated with the mixed enzyme of beta-glucosidase, cellulase, and hemicellulase was 11.57% from 19.02% to 7.45% of the hypercapsule ethanol extract. It was confirmed that the points were further reduced.
  • the SKH-1 hairless mouse system used in this experiment a 6-week-old model (female), was imported and distributed from Orient Bio (Seongnam, Gyeonggi-do, Korea) and sold and sold to Dongnam Chemical Research Institute Animal Company (animal facility registration certificate: After undergoing quarantine and purifying for a week in No. 412), a specific breeding environment (temperature (26.25 ⁇ 0.59) °C), relative humidity (50.07 ⁇ 3.48)%, lighting time 12 hours (07:00 ⁇ ) 19:00)). At this time, each group was divided into 7 groups and tested.
  • the wrinkle-inducing group other than the normal group (N group) was irradiated with UVB irradiation step by step for 10 weeks, and the UVB irradiation group was prepared by the method of Preliminary Experiment 5 of Group C (control group) of the present invention.
  • the group administered orally with the extract of hypercapsule mixed enzyme-treated extract 50 mg/kg, 150 mg/kg, and 300 mg/kg per body weight, respectively, Z50 group, Z150 group, Z300 group, and trisine, a hypertonic indicator material, were 0.3 mg/kg.
  • the group administered orally was designated as T group and retinoic acid 0.05% and skin application group as R group.
  • the ultraviolet irradiation device (East-West Science, UV-1000) emits ultraviolet rays with a sunlamp that emits UVB in the cabinet, and the light source is 302 nm, and is irradiated at a height of 0.3 mW/cm 2 of UVB intensity. .
  • the dose of UV radiation was measured by a UV-radiometer, and after the mouse was enclosed in a cage for UV irradiation, three times a week for every other day on the back, for a total of 10 weeks [0 weeks: 60 mJ/m 2 (1 MED), 1 Note: 120 mJ/m 2 (2 MED), 2-3 weeks: 180 mJ/m 2 (3 MED), 4-5 weeks: 240 mJ/m 2 (4 MED) 5 weeks to 10 weeks: 240 mJ/ m 2 (4 MED)].
  • the experimental animals after the breeding period were fasted for 15 hours, anesthetized with CO 2 and opened, and then collected in the abdominal aorta using a 1 mL syringe.
  • the serum aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) of the serum were examined.
  • the specific experimental method was as follows:
  • the blood collected from the abdominal aorta was left at room temperature for about 30 minutes, and then centrifuged at 3,000 rpm for 15 minutes to obtain serum and used for serum biochemical analysis.
  • the separated blood supernatant was serum biochemical (Rochu Ltd., Basel, Switzerland) AST and ALT were analyzed.
  • the skin and organs were extracted, washed in physiological saline, and then removed with water, and used for tissue staining and Western blot experiments.
  • the H&E staining experiment was conducted as follows.
  • the cut skin tissue was placed in 10% formalin to fix the tissue, washed with water, sequentially dehydrated with 60% to 100% alcohol, embedded in paraffin, and made into a block. This was made using a rotary microtome (rotary microtome) to make a tissue section to a thickness of 5 ⁇ m, stained with hematoxylin & eosin, and observed with an optical microscope (Nikon Co., Tokyo, Japan).
  • the Masson's trichrome experiment was conducted as follows.
  • the cut skin tissue is fixed in a 10% neutral formalin solution at room temperature for 24 hours, and then washed, dehydrated, transparent and permeated in the usual way, embedded with paraffin, sectioned with a thickness of 4 ⁇ m, and soaked in a Bouin solution overnight at room temperature.
  • mason trichrome staining the amount and morphology of collagen fibers in the dermal layer were observed with an optical microscope.
  • the Western blot experiment of skin tissue was performed as follows. For protein analysis, 20 mg of skin tissue was placed in 200 ⁇ L of cell lysis buffer, and then the tissue was crushed using a homogenizer, followed by centrifugation at 800 rpm for 10 sec to use only the supernatant. After ice incubation for 24 hours, centrifugation was performed at 14,000 rpm, 4°C, and 20 min. Subsequently, the protein was quantified using the Bradford assay, and separated by size using SDS-PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis).
  • a blocking buffer 5% skim milk, 1X TBST buffer
  • 1X TBST buffer 5% skim milk
  • the primary antibodies were treated with collagen 1A, MMP-1, and MMP-13 (SantaCruz, USA) and reacted at 4°C overnight, 10 min with 1 ⁇ TBST buffer , Washed 3 times.
  • group C was thick in wrinkles, narrow in intervals, and deep in wrinkles, and Z50 and Z150 groups administered with 50 mg/kg, 150 mg/kg of Jasperaceae extract for 14 weeks It was confirmed that the wrinkles were less formed or the wrinkles were thinner and thinner than the silver group C.
  • the P group with skin retinoic acid 0.05% applied and the T group with 2 mg/kg of trisine wrinkles were less formed compared to the C group until the 8th week of UVB irradiation, but reached the 10th week of UVB irradiation.
  • the wrinkles became thicker and the number of wrinkles increased.
  • thick wrinkles were observed in the SILFLO microscopic observation as in the results of the back surface observation in the 300 mg/kg hypertonic extract group (Z300 group).
  • group C had a very thick epithelial cell layer of the epidermis by UVB treatment for 10 weeks (marked with an arrow), drying of both the epidermal and dermal layers was induced, and the elastic fiber layer was denatured. there was.
  • the epithelial cell layer was significantly reduced in the Z50 group and the Z150 group treated with 50 mg/kg, 150 mg/kg of malignant grass for 14 weeks, compared to the C group.
  • the elastic fibers in the dermis layer were dense compared to the C group. This is the result consistent with the morphological observations of the skin surface with the back surface and SILFLO. It can be seen that administration of the hypercapsicum extract of a certain concentration has a positive effect on the epidermal layer and epithelial cells.
  • the expression level of MMP-13 also decreased to p ⁇ 0.05 significance in both Z50 and Z150 groups.
  • the expression levels of MMP-1 and 13 were significantly increased than in the C group, and it was confirmed that retinoic acid was applied three times a week, and thus, it could not be influenced by the collagen synthesis and degrading enzyme mechanism.

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Abstract

본 발명은 고장초 효소 처리 추출물의 제조방법 및 이로 제조된 조성물에 관한 것으로, 상기 제조방법으로 제조된 고장초 효소 처리 추출물은 트리신을 고함량 함유하고 있으므로, 미백용, 주름 개선용, 항염증용, 항알러지용, 보습용 화장료 조성물 내지는 건강기능 식품 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

트리신 함량이 증가된 고장초 효소 처리 추출물의 제조방법 및 이로 제조된 미백, 주름 개선, 항염증, 항알러지, 보습용 조성물
본 발명은 트리신 함량이 증가된 고장초 효소 처리 추출물의 제조 방법 및 이로 제조된 미백, 주름개선, 항염증, 항알러지 및 보습용 화장료 조성물 또는 건강기능 식품 조성물에 관한 것이다.
고장초(Zizania latifolia Turcz.)는 벼과에 속하는 여러해살이 풀로 줄 또는 줄풀이라고 불린다. 고혈압, 중풍, 변비, 비만, 동맥경화 등 질병에 효과가 있다고 알려져 있으며, 민간에서는 농약중독이나 화학약품 중독, 식중독 등에 고장초를 달여 마신다거나 그 즙을 마시면 효과가 있다고 한다. 또한 최근에는 고장초를 이용한 건강식품 및 액상 차 등이 개발되고 있다(한국공개특허 10-2010-0104334호, 한국공개특허 10-2009-0127970호).
고장초에 함유되어 있는 활성물질들은 트리신 배당체 또는 유도체의 배당체들로 이들은 친수성이 높은 당 분자가 결합되어 있어 장 세포막 지질 투과율이 낮아 체내흡수율이 낮게 나타날 수 있다. 하지만 당 분자를 제외한 탄소골격 자체는 소수성이 높기 때문에 장 세포막 지질에서 용해도가 높아 장 세포막 투과가 용이하다. 그래서 장내 흡수율이 낮아질 가능성이 있는 트리신 배당체 및 유도체의 배당체들을 트리신으로 전환하여 채내 흡수율을 증가시키면 높은 활성을 기대할 수 있다.
또한, 다양한 플라보노이드 배당체의 경우 비배당체로 전환하면 목적으로 하는 활성이 더욱 증가한다는 문헌의 내용도 있어 트리신 및 유도체 또한 배당체를 비배당체로 전환하면 미백, 주름개선, 항염증, 항알러지 및 보습 기능에 있어 더욱 증대되는 효과를 나타낼 수 있다.
하지만 효능을 나타내는 유효성분을 추출하는 방법에 있어 메탄올, 에탄올 등의 추출용매를 사용한 상온 추출 또는 진탕 추출 등의 단순 추출은 생체이용률이 높은 비배당체 유효성분의 함량이 낮아 유효성분의 효능이 적게 나타날 우려가 있다.
한편, 건강기능식품의 제조공정에서 물질 배당체의 당 분해 공정은 산과 고온처리 또는 발효 및 효소처리를 통하여 수행하는 경우가 대부분이다. 하지만 발효공정은 미생물의 상태, 생육조건 등을 일정하게 유지하여야 하고 특히 미생물의 상태에 따라 분비되는 효소의 변화로 인하여 추출물의 유효성분 함량의 편차가 커질 수 있기 때문에 기준을 맞추기 어려운 단점이 있다. 또한, 산과 고온처리 공정은 배당체 물질을 비교적 쉽게 비배당체로 전환할 수 있는 장점을 가지고 있지만 가혹조건을 이용하기 때문에 화학적 측면에서 물질의 안정성을 확보하기에 어려우며 이에 의한 재현성의 확보가 어려울 가능성이 있다.
한편, 효소처리 공정은 앞서 제시하였던 공정에 비하여 물질 안정성과 공정이 비교적 간단하여 상업화에 좋은 장점을 가지고 있기 때문에 미생물이 분비하는 효소를 활용하여 효소처리 공정을 확립하면 최종 추출물 유효성분의 함량 편차를 줄이면서 물질의 안정성 또한 확보가 가능하므로 비배당체 유효성분을 안정적으로 유도하는데 도움이 될 것으로 사료된다.
본 발명자는 고장초에 존재하는 트리신의 배당체들을 미백, 주름개선, 항염증, 항알러지 및 보습에 더 높은 효능을 나타내고 생체이용률이 증가된 비배당체 형태로 효과적으로 전환시킬 수 있는 방법을 모색하였으며, 그 결과 단순히 단일 효소에 의한 비배당체 전환보다 특정 효소를 다양하게 혼합하여 이용한 효소 반응이, 트리신 배당체를 비배당체 형태로 전환하는데 더 효과적임을 확인하며, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 트리신의 함량을 극대화할 수 있는 고장초 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 트리신의 함량이 극대화되어 다양한 기능성이 향상된 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 트리신의 함량이 극대화되어 다양한 기능성이 향상된 건강기능 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 고장초에 물을 첨가하고 열수 침지하는 단계; (2) 상기 단계 (1)에서 열수 침지 후 냉각한 침지물에, 알파-아밀리아제(α-Amylase), 베타-갈락토시다아제(β-Galactosidase), 자일라나아제(Xylanase), 락타아제(Lactase), 리파아제(Lipase), 탄나아제(Tannase), 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(Hemicellulase), 펙티나아제(pectinase) 및 베타-글루코시다아제(β-Glucosidase)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효소를 처리하여 반응시킨 뒤 여과하여 효소 처리 추출물을 얻는 단계; (3) 상기 단계 (2)에서 여과하고 남은 잔사에 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 및 이들의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출하여 2차 추출물을 얻는 단계; 및 (4) 상기 단계 (2)의 효소 처리 추출물과 상기 단계 (3)의 2차 추출물을 혼합한 후 농축 또는 건조하는 단계를 포함하는 고장초 효소 처리 추출물의 제조방법을 제공한다.
상기 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 고장초 효소 처리 추출물을 유효성분으로 포함하고, 상기 고장초 효소 처리 추출물은 0.01 중량% 내지 90 중량%의 트리신을 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.
상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 고장초 효소 처리 추출물을 유효성분으로 포함하고, 상기 고장초 효소 처리 추출물은 0.01 중량% 내지 90 중량%의 트리신을 함유하는 것을 특징으로 하는 건강기능 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 고장초 효소 처리 추출물 제조방법 및 이로 제조된 고장초 효소 처리 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 제조방법은 다양한 효소의 혼합 내지 복합 처리 단계를 포함하므로, 이로 제조된 고장초 효소 처리 추출물은 수율 및 트리신 함량이 극대화되는 바, 이와 같은 방법으로 제조된 고장초 효소 처리 추출물은 높은 생체이용률과 피부 미백, 보습, 항염증, 항알러지, 주름개선 활성이 증대된 화장료 조성물 또는 건강기능 식품 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 고장초 효소 처리 추출물의 제조방법을 모식적으로 나타낸 공정도이다.
도 2는 본 발명에 따른 고장초 에탄올 및 효소 처리 추출물의 수율을 나타낸 그래프이다(* p < 0.05 versus EtOH, ** p < 0.01 versus EtOH, *** p < 0.001 versus EtOH).
도 3은 본 발명에 따른 고장초 에탄올 및 효소 처리 추출물의 트리신 함량 분석 결과를 나타낸 그래프이다(* p < 0.05 versus EtOH, ** p < 0.01 versus EtOH, *** p < 0.001 versus EtOH).
도 4는 고장초 에탄올 및 효소 처리 추출물의 트리신 분석 크로마토그램이다.
도 5는 고장초 에탄올 및 효소 처리 추출물의 수율을 감안한 트리신 총량을 나타낸 그래프이다(* p < 0.05 versus EtOH, ** p < 0.01 versus EtOH, *** p < 0.001 versus EtOH).
도 6은 고장초 에탄올 및 효소 처리 추출물의 항염증 효능을 확인한 결과이다(# p < 0.01 versus LPS, * p < 0.05 versus EtOH, ** p < 0.01 versus EtOH).
도 7은 트리신의 농도에 따른 항염증 효능을 확인한 결과이다(* p < 0.05 versus LPS, ** p < 0.01 versus LPS, *** p < 0.001 versus LPS).
도 8은 고장초 에탄올 및 효소 처리 추출물의 미백 효능을 확인한 결과이다(# p < 0.01 versus CON, * p < 0.05 versus EtOH, ** p < 0.01 versus EtOH, *** p < 0.001 versus EtOH).
도 9는 트리신의 농도에 따른 미백 효능을 확인한 결과이다(* p < 0.05 versus CON, ** p < 0.01 versus CON, *** p < 0.001 versus CON).
도 10은 고장초 에탄올 및 효소 처리 추출물의 주름 개선 효능을 확인한 결과이다(# p < 0.05 versus UV, * p < 0.05 versus EtOH, ** p < 0.01 versus EtOH).
도 11은 트리신의 농도에 따른 주름개선 효능을 확인한 결과이다(* p < 0.05 versus CON, ** p < 0.01 versus CON, *** p < 0.001 versus CON).
도 12는 고장초 에탄올 및 효소 처리 추출물의 항알러지 효능을 확인한 결과이다(# p < 0.001 versus DNP-HAS, * p < 0.05 versus EtOH).
도 13은 트리신의 농도에 따른 항알러지 효능을 확인한 결과이다(*** p < 0.001 versus DNP-HSA).
도 14는 동물 실험 디자인을 나타낸 것이다.
도 15는 동물 실험에서 실험군의 체중 변화를 나타낸 그래프이다.
도 16은 동물 시험에서 실험군의 피부 표면 수분도를 나타낸 그래프이다.
도 17은 동물 시험에서 실험군의 혈청 검사 결과를 나타낸 그래프이다.
도 18은 동물 시험에서 실험군의 등표면 육안 관찰 결과를 나타낸 그림이다.
도 19는 동물 시험에서 실험군을 SILFLO 현미경에서 관찰한 사진이다.
도 20은 동물 시험에서 실험군을 대상으로 수행한 H&E 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 21은 동물 시험에서 실험군의 메이슨 트리크롬(Masson's Trichrome) 염색 결과를 나타낸 사진이다.
도 22는 동물 시험에서 실험군의 UVB 조사 시 피부 조직의 단백질 발현을 확인한 결과이다.
도 23은 추출 조건이 확립된 고장초 에탄올 추출물과 고장초 효소 처리 추출물의 수율을 비교한 그래프이다.
도 24는 추출 조건이 확립된 고장초 에탄올 추출물과 고장초 효소 처리 추출물의 트리신의 함량을 비교한 그래프이다.
도 25는 추출 조건이 확립된 고장초 에탄올 추출물과 고장초 효소 처리 추출물의 항염증 효능을 비교한 그래프이다(** p < 0.01 versus LPS, *** p < 0.001 versus LPS).
도 26은 추출 조건이 확립된 고장초 에탄올 추출물과 고장초 효소 처리 추출물의 미백 효능을 비교한 그래프이다(*** p < 0.001 versus CON).
도 27은 추출 조건이 확립된 고장초 에탄올 추출물과 고장초 효소 처리 추출물의 주름 개선 효능을 비교한 그래프이다(* p < 0.05 versus UV, *** p < 0.001 versus UV).
도 28은 추출 조건이 확립된 고장초 에탄올 추출물과 고장초 효소 처리 추출물의 항알러지 효능을 비교한 그래프이다(*** p < 0.001 versus DNP-HAS).
고장초 추출물에 포함되어 있는 활성물질들은 트리신 배당체 또는 유도체의 배당체들로 이들은 친수성이 높은 당 분자가 결합되어 있어 장 세포막 지질에 대한 용해도가 낮아 체내흡수율이 적을 가능성이 크다. 이러한 문제점을 극복하기 위해 본 발명의 발명자들은 트리신 배당체 및 유도체 배당체의 당을 분해하여 생체이용률을 증가시키고 트리신 배당체 및 유도체의 배당체보다 활성이 뛰어난 비배당체로 전환함으로써 항염증, 피부미백, 주름개선, 항알러지, 보습 효능이 증가되는 방법을 연구하였다.
이에 따라, 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에서 개시하는 제조방법으로 추출한 고장초 추출물은 트리신 함량이 증가하였고, 이로 인해 항염증, 피부 미백, 항알러지, 주름 개선, 보습 효능이 증가되었으며, 부가적으로 수율도 11%에서 약 2배 증가한 20.8%로서, 상업적 대량생산이 가능하여 화장품 원료 및 기능성 식품으로 활용할 가치가 높은 고장초 효소처리 추출물을 개발하였다. 다양한 효능이 증가되는 이유는, 고장초 추출물이 함유하고 있는 트리신 배당체 및 유도체인 트리신-7-O-β-D-글루코피라노오즈(Tricin-7-O-β-D-glucopyranose)와 트리신 유도체들인 트리신-4'-O-(트레오-β-구아이아실글리세릴)에테르 7-o-β-D-글루코피라노오즈(Tricin-4'-O-(threo-β-guaiacylglyceryl) ether 7-o-β-D-glucopyranose), 트리신-4'-O-(에리트로- β-구아이아실글리세릴)에테르 7-o-β-D-글루코피라노오즈(Tricin-4'-O-(erythro-β-guaiacylglyceryl) ether 7-o-β-D-glucopyranose), 트리신-4'-O-(트레오-β-구아이아실글리세릴)에테르 7''-O-β-D-글루코피라노오즈(Tricin-4'-O-(threo-β-guaiacylglyceryl) ether 7"-o-β-D-glucopyranose), 트리신-4'-O-(에리트로-β-구아이아실글리세릴)에테르 7''-o-β-D-글루코피라노오즈(Tricin-4'-O-(erythro-β-guaiacylglyceryl) ether 7"-o-β-D-glucopyranose) 및 살콜린 A(Salcolin A), 살콜린 B(Salcolin B), 살콜린 C(Salcolin C), 살콜린 D(Salcolin D) 등의 전구체들이 효소반응을 통해 높은 활성을 나타내는 트리신으로 전환된 것으로 추정된다. 본 발명에 따른 고장초 효소 처리 추출물의 제조방법은 도 1에 도식화하여 나타내었다.
이에, 본 발명은 (1) 고장초에 물을 첨가하고 열수 침지하는 단계; (2) 상기 단계 (1)에서 열수 침지 후 냉각한 침지물에, 알파-아밀리아제(α-Amylase) [EC 3.2.1.1], 베타-갈락토시다아제(β-Galactosidase) [EC 3.2.1.23], 자일라나아제(Xylanase) [EC 3.2.1.8], 락타아제(Lactase) [EC 3.2.1.108], 리파아제(Lipase) [EC 3.1.1.3], 탄나아제(Tannase) [EC 3.1.1.20], 셀룰라아제(cellulase) [EC 3.2.1.4], 헤미셀룰라아제(Hemicellulase) [EC 232-799-9], 펙티나아제(pectinase) [EC 3.2.1.15] 및 베타-글루코시다아제(β-Glucosidase) [EC 3.2.1.21]로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효소를 처리하여 반응시킨 뒤 여과하여 효소 처리 추출물을 얻는 단계; (3) 상기 단계 (2)에서 여과하고 남은 잔사에 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 및 이들의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출하여 2차 추출물을 얻는 단계; 및 (4) 상기 단계 (2)의 효소 처리 추출물과 상기 단계 (3)의 2차 추출물을 혼합한 후 농축 또는 건조하는 단계를 포함하는 고장초 효소 처리 추출물의 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 단계 (1)에서, 열수 침지는 고장초 1 중량부에 대하여 1 내지 100 중량부의 물을 첨가하고, 20℃ 내지 130℃에서 5분 내지 100시간 동안 이루어질 수 있고, 보다 바람직하게는, 고장초 1 중량부에 대하여 1 내지 50 중량부의 물을 첨가하고 50 내지 120℃에서 30분 내지 100시간 동안 이루어질 수 있으며, 가장 바람직하게는, 고장초에 5 내지 30 중량부의 물을 첨가하고, 70℃ 내지 120℃에서 30분 내지 4시간 동안 이루어질 수 있다.
상기 단계 (2)에서, 냉각은 10℃ 내지 90℃에서 이루어질 수 있고, 바람직하게는, 20℃ 내지 45℃에서 이루어질 수 있다.
또한, 상기 단계 (2)에서, 상기 침지물 100 중량부 대비 0.1 내지 80 중량부의 효소를 처리할 수 있는 바, 효소가 상기 수치 범위를 벗어나 너무 적게 처리되면 효소 양이 너무 적어 상기 고장초 열수 침지물에 존재하는 트리신을 전구체로부터 원활하게 분리 및 전환해내기 어려우며, 반대로 너무 많이 처리되면, 트리신 전구체 이외의, 활성에 관여하지 않는 물질이 높은 함량으로 함께 추출되어 트리신의 함량이 상대적으로 낮아지고 효능이 저하된 추출물이 제조될 수 있으며, 상업적으로도 제조공정 비용에 영향을 줄 수 있으므로 바람직하지 않다.
이때, 상기 단계 (2)에서, 효소를 처리하고 10℃ 내지 90℃에서 5분 내지 120시간 동안 반응시킬 수 있고, 바람직하게는 20℃ 내지 80℃에서 5분 내지 120시간 동안, 보다 바람직하게는 30℃ 내지 60℃에서 5분 내지 48시간 동안, 가장 바람직하게는 20℃ 내지 45℃에서 8시간 내지 24시간 동안 효소를 반응시킬 수 있는 바, 상기 적정 효소의 반응시간은 효소의 첨가량에 대하여 반비례하므로, 효소의 첨가량이 많을수록 반응시간은 단축될 수 있다.
다만, 상기 효소 처리 후 반응 시간이 상기 수치 범위 미만일 경우에는 효소 처리되는 시간이 너무 짧아 고장초 열수 침지물에 존재하는 트리신 전구체로부터 트리신으로의 전환률이 낮아지고, 반대로 효소 처리 반응 시간이 상기 수치 범위를 초과하는 경우에는, 상업적으로 제조공정비용에 영향을 줄 수 있으므로 바람직하지 않다.
본 발명의 목적을 달성하기 위해 상기 효소들의 복합체는 정제된 단일효소의 복합 또는 상업화된 복합효소를 1개 이상 복합하여 사용할 수 도 있다. 상업화된 효소의 예로서, 상용 효소인 플란타아제 TL, 라피다아제 C80 MAX, 비스코자임 L, 스미자임 SPC, 스미자임 AC, 펙티넥스 Ultra SP-L, 펙티넥스 Ultra pulp 및 비스코플로우 MG 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 단계 (2)에서, 베타-글루코시다아제, 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제의 3가지 효소를 동시에 처리할 수 있는 바, 특히 이와 같이 3종의 효소를 혼합하여 사용하는 경우, 각종 트리신의 함량 및 수율이 가장 높았고, 그 기능성 또한 현저히 우수하였으므로 바람직하다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 단계 (2)에서, 효소는 고장초에 포함되어 있는 플라보노이드 배당체를 플라보노이드 비배당체로 전환할 수 있다.
트리신 배당체 및 유도체의 배당체들은 당의 결합이 모두 R-O-β-D-glucopyranose로 트린신 및 유도체의 구조에 포도당이 베타의 결합으로 결합한 배당체들이다. 베타 결합을 한 포도당을 분해하는 가장 대표적인 효소로는 베타글루코시다아제 효소가 있으며 이를 활용하기 위해 본 발명에 참고하여 효소반응을 진행하였으나, 그 결과 트리신 함량의 증가가 거의 나타나지 않았으며 미백, 주름개선, 염증 개선, 알러지 개선 및 보습의 효능에서도 큰 변화가 관찰되지 않았다. 이는 기존에 베타 결합을 분해하는 효소로 잘 알려진 베타글루코시다아제 효소는 일반적으로 과일의 최종 숙성 단계에서 안토시아닌에 결합한 당 분자의 분해에 관여하는 것으로 알려져 있는데, 안토시아닌은 안토시아니딘의 계열로 플라본 계열의 트리신과는 분자구조가 하기 화학식 1에 개시된 바와 같이 확연한 차이가 있고 당이 붙은 위치도 달라 기질 특이성으로 인하여 화학식 2와 같이 반응이 일어나지 않는 것으로 사료된다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2019011352-appb-I000001
[화학식 2]
Figure PCTKR2019011352-appb-I000002
이와 같이 유사한 구조를 포함하고 있더라도 기질 특이성으로 인해 처리되는 효소의 활성 유무가 달라지는 것처럼 베타글루코시다아제 효소의 활성 사이트에 트리신의 구조가 구조 특이적으로 맞지 않아 트리신 배당체의 당 분해를 원활하게 진행하지 못한 것으로 사료된다.
상기 단계 (3)에서, 상기 잔사 1 중량부에 대하여 1 내지 100 중량부의 물 또는 알코올 수용액을 용매로 하여 20℃ 내지 130℃에서 10분 내지 100시간 동안 추출할 수 있고, 바람직하게는 20℃ 내지 100℃에서 2시간 내지 12시간 동안 추출할 수 있으며, 또는, 상기 잔사 1 중량부에 대하여 1 내지 30 중량부의 물 또는 알코올 수용액을 용매로 하여 50℃ 내지 100℃에서 30분 내지 10시간 동안 추출할 수 있는 바, 상기 추출 온도가 상기 범위 미만이면 활성에 트리신 및 유효성분들의 추출 수율이 낮아지며, 추출 온도가 상기 범위를 초과하면 유효성분들이 파괴되거나, 활성에 관여하지 않는 물질이 높은 함량으로 함께 추출되어 효능이 저하된 추출물이 제조될 수 있으므로 바람직하지 않다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 알코올은 5 내지 95 중량%의 에탄올 수용액, 바람직하게는 20 내지 80 중량%의 에탄올 수용액, 보다 바람직하게는 50 내지 70 중량%의 에탄올 수용액일 수 있고, 가장 바람직하게는 70 중량%의 에탄올 수용액일 수 있다.
즉, 가장 바람직하게는, 상기 단계 (3)에서, 추출은 70% 에탄올을 용매로 하여, 80℃에서 6시간 동안 수행될 수 있는 바, 이러한 추출 조건에서 추출될 때 트리신의 함량, 수율 내지 기능성이 모두 극대화되므로 바람직하다.
또한, 상기 단계 (4)에서 혼합물을 농축하여 농축액을 얻거나, 농축액을 건조하여 분말 형태의 추출물을 얻을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 단계 (3)의 추출 전에 초음파 또는 마이크로파를 조사하는 전처리 단계를 더 수행할 수 있으며, 초음파와 마이크로파를 병용하여 조사할 수도 있다. 상기 고장초 효소처리 추출물에 초음파 또는/및 마이크로파를 조사하는 경우, 그렇지 않은 경우에 비하여 염증 개선, 피부 미백, 주름 개선, 알러지 개선, 보습의 기능성이 향상된 추출물을 얻을 수 있어 바람직하다.
상기 초음파는 15 내지 25 kHz 및 500 내지 800 와트로 2 내지 30분간 조사될 수 있으며, 상기 마이크로파는 2000 내지 3000 MHz 및 50 내지 400 와트로 5 내지 60초간 조사될 수 있는 바, 초음파 또는 마이크로파의 조사 에너지 및 조사 시간이 상기 범위 미만이면 조사에 의한 효과가 미미하며, 상기 범위를 초과하면 활성에 관여하지 않는 물질의 추출률이 증가하여 바람직하지 않다.
한편, 상기 고장초 효소처리 추출물을 대상으로, 통상의 여과 방법 또는 장치를 이용하여 불순물을 제거할 수 있으며, 예를 들어, 원심분리 방법을 이용하거나 여과체 또는 마이크로 필터를 이용하여 여과하여 불순물이 제거된 추출물을 얻을 수 있다. 이때, 상기 여과체는 1 내지 200 μm, 마이크로 필터는 0.2 내지 0.8 μm 필터일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기의 고장초 효소처리 추출물은 감압 증류, 동결건조 또는 분무건조 등과 같은 추가적인 과정을 거친 분말 상태로 제조될 수도 있고, 효소 고정화 방식에 의한 연속공정 방식에 의해 제조될 수도 있다. 상기 방법에 의하면, 고형분의 수율이 20 중량% 이상인 고장초 효소처리 추출물을 제공할 수 있다.
이렇게 제조된 추출물은 이후 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 예컨대, 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 농축은 감압 농축기, 건조는 열풍건조, 분무건조, 저온건조, 동결건조법 등을 수행할 수 있으나, 명시한 방법으로 제한되는 것은 아니다.
전술한 바와 같이, 상기 제조방법으로 제조된 상기 고장초 효소 처리 추출물은 0.01 중량% 내지 90 중량%의 트리신을 포함하고 있을 수 있는 바, 미백, 주름 개선, 염증 개선, 알러지 개선 및 보습용 조성물로 활용될 수 있다.
본 발명에서 상기 트리신은 하기 <화학식 3>으로 표시되는 것일 수 있다:
[화학식 3]
Figure PCTKR2019011352-appb-I000003
또한, 상기 트리신의 전구체로서, 효소 처리 후 트리신 함량 증가에 영향을 미치는 물질들은 다음과 같으며, 이들의 화학식을 하기 <화학식 4>에 나타내었다:
1. 트리신(화학식 4의 1)
2. 트리신-7-O-β-D-글루코피라노오즈(Tricin-7-O-β-D-glucopyranose)(화학식 4의 2)
3. 살콜린 A(Salcolin A)(화학식 4의 3)
4. 살콜린 B(Salcolin B)(화학식 4의 4)
5. 트리신-4'-O-(트레오-β-구아이아실글리세릴)에테르 7-O-β-D-글루코피라노오즈(Tricin-4'-O-(threo-β-guaiacylglyceryl) ether 7-O-β-D-glucopyranose)(화학식 4의 5)
6. 트리신-4'-O-(에리트로-β-구아이아실글리세릴)에테르 7-O-β-D-글루코피라노오즈(Tricin-4'-O-(erythro-β-guaiacylglyceryl) ether 7-O-β-D-glucopyranose)(화학식 4의 6)
7. 트리신-4'-O-(트레오-β-구아이아실글리세릴)에세트 7''-O-β-D-글루코피라노오즈(Tricin-4'-O-(threo-β-guaiacylglyceryl) ether 7''-O-β-D-glucopyranose)(화학식 4의 7)
8. 트리신-4'-O-(에리트로-β-구아이아실글리세릴)에테르 7''-O-β-D-글루코피라노오즈(Tricin-4'-O-(erythro-β-guaiacylglyceryl) ether 7''-O-β-D-glucopyranose)(화학식 4의 8)
9. 살콜린 C(Salcolin C)(화학식 4의 9)
10. 살콜린 D(Salcolin D)(화학식 4의 10)
[화학식 4]
Figure PCTKR2019011352-appb-I000004
따라서, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 고장초 효소 처리 추출물을 유효성분으로 포함하고, 상기 고장초 효소 처리 추출물은 0.01 중량% 내지 90 중량%의 트리신을 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물을 제공한다.
상기 화장료 조성물은 용도가 미백용, 주름 개선용, 염증 개선용, 알러지 개선용 또는 보습용일 수 있는 바, 고함량의 트리신을 함유하고 있으므로 우수한 미백, 주름 개선, 염증 개선, 알러지 개선 및 보습 효과를 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 '화장료'란 화장품 또는 의약외품이 될 수 있는 물질을 말한다. 화장품이란 인체를 청결·미화하여 매력을 더하고 용모를 밝게 변화시키거나 피부·모발의 건강을 유지 또는 증진하기 위하여 인체에 사용되는 물품으로서 인체에 대한 작용이 경미한 것을 지칭한다. 또한, 기능성 화장품이란 피부의 미백에 도움을 주거나, 피부의 주름개선에 도움을 주거나, 자외선으로부터 피부를 보호하는 데에 도움을 주는 제품으로, 보건복지가족부령이 정한 것을 포함하며, 피부를 개선하는 모든 것을 통칭한다. 의약외품은 질병을 치료하거나 예방하기 위해 쓰는 의약품보다는 인체에 대한 작용이 경미한 물품에 대해 보건복지부가 따로 정한 분류 기준에 의한 약품을 지칭한다. 약사법에 따르면 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람·동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 섬유·고무 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염병을 막기 위한 살균·살충제 등이 포함된다. 의약외품의 대표적인 예로는 치약, 기능성 비누, 기능성 샴푸 등이 있다.
즉, 본 발명의 화장료 조성물은 피부 미백, 노화 방지, 주름 개선 또는 피부 탄력 증진을 위한 화장품(에센스, 크림 등) 또는 피부 미백, 노화 방지, 주름 개선 또는 피부 탄력 증진을 위한 기능성 비누 또는 클렌징폼, 클렌징크림, 클렌징워터 등의 의약외품으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 고장초 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 100 중량%로 함유될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 화장료 조성물은 상기 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분과 배합될 수 있다. 이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로써는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알코올, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수, 자외선 차단제, 등을 들 수 있다.
상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 상기 화합물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 담체 및 보습제를 포함할 수 있다.
또한, 상기 화장료 조성물은 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 유액, 현탁액, 크림, 화장수, 에센스, 팩, 젤, 파우더, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 로션, 연고, 패취, 미용액, 클렌징폼, 클렌징크림, 클렌징워터, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 샴푸, 린스, 바디세정제, 비누 및 분무제에서 선택된 제형인 것일 수 있다. 이들 제형의 제조방법은 통상의 화장료 제형의 제조방법에 따라 제조될 수 있다.
더불어, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 고장초 효소 처리 추출물을 유효성분으로 포함하고, 상기 고장초 효소 처리 추출물은 0.01 중량% 내지 90 중량%의 트리신을 함유하는 것을 특징으로 하는 건강기능 식품 조성물을 제공한다.
상기 건강기능 식품 조성물은 용도가 미백용, 주름 개선용, 염증 개선용, 알러지 개선용 또는 보습용일 수 있는 바, 고함량의 트리신을 함유하고 있으므로 우수한 미백, 주름 개선, 염증 개선, 알러지 개선 및 보습 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에서 "건강기능 식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
상기 건강기능 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안정청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품 첨가물 공전"에 기재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 조성물은 피부 미백, 보습, 항알러지, 주름의 개선을 위한 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있으며, 예컨대, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성 보조 식품, 식품 첨가제 등에 사용될 수 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 환 또는 음료인 형태로 사용할 수 있고, 상기 기재한 것 외에도 모든 식품 형태일 수 있다.
본 발명의 식품 조성물의 제형은 통상의 방법에 따라 제조하며, 담체와 함께 건조한 후 캡슐화하거나 기타 정제, 과립, 분말, 음료, 죽 등의 형태로 제형화할 수 있으며, 상기 기재한 것 외에도 모든 식품 형태로 제조 가능하다.
본 발명의 식품 조성물은 조성물 100 중량부에 대하여 유효성분을 0.001 내지 100 중량부로 포함할 수 있다. 그러나 유효성분의 함량은 이에 제한되지 않으며, 적절히 조정될 수 있고, 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이며 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐이므로 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[예비실험]
<예비실험 1> 고장초 에탄올 추출공정 최적화
1.1) 시판되는 고장초 50 g을 칭량한 후, 20배수 중량의 10, 30, 50, 70, 90 w/w% 발효주정을 투입하여 80℃에서 6시간 동안 추출을 진행하고 여과하여 고장초 에탄올 추출액을 얻었다.
상기 고장초 에탄올 추출액을 농축 및 건조를 진행하여 고장초 에탄올 추출분말을 얻었고, 에탄올 농도 비율에 따른 추출물 고형분의 중량을 측정하고 트리신 함량 및 NO 생성 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, 트리신의 함량은 다음과 같이 확인하였다: 분석기기로 HPLC(Agilent 1260)를 사용하였으며 분석 컬럼은 Discovery　C18, C-18, 5μm, 250 x 4.6 mm (SUPELCO)를 사용하였다. 표준품의 조제 시에는 트리신 표준품 2 mg을 칭량하고 HPLC용 메탄올을 가하여 20 mL로 한 것을 표준원액으로 하였고, 표준원액을 활용하여 1, 3, 5, 10, 20 ppm의 농도로 직선성 구간의 표준품을 제조하였다.
시험용액의 조제 시에는 예비실험 1 및 2에서 제조한 고장초 추출물을 100 mg 칭량하여 50 mL 부피플라스크에 넣고 메탄올을 절반 넣어 초음파 처리(sonification)를 30분간 수행하였다. 처리 완료 후, 표선을 맞추고 볼텍싱한 후 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 하였다.
이때 분석 방법은 하기 <표 1>에 나타난 바와 같았다.
Figure PCTKR2019011352-appb-T000001
NO의 생성은 NO 어세이를 통해 확인하였는데, 구체적인 과정은 다음과 같았다: 대식 세포주 RAW264.7은 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양 받아 10% FBS와 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)를 첨가한 DMEM 배지(Welgene, Gyeongsan, Korea)를 이용하여 5% CO2가 존재하는 37℃ 인큐베이터에서 2～3회 계대 배양한 후 사용하였다.
RAW264.7 세포를 96-웰 플레이트에 1 X 106 cells/well이 되게 분주하여 5% CO2 인큐베이터에서 20~24시간 동안 예비 배양하였고, 각 추출물 시료를 처리하여 24 시간 배양하였다. 여기서 대식 세포주 RAW264.7 세포의 염증을 유발하기 위하여 1 mg/mL 농도의 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; Sigma-Aldrich, USA) 10 μL를 각 웰에 주입하였다. 그 후, 상등액 100 μL를 96-웰 플레이트에 옮겨 2.5% 인산, 1% 설파닐아마이드, 0.1% N-(1-나프틸)에틸렌디아민이 포함된 그리스 시약(griess reagent with 2.5% phosphoric acid, 1% sulfanilamide, 0.1% N-(1-Naphtyl) ethylenediamine) 100 μL를 각 웰에 넣어 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 540 nm 파장에서 ELISA 리더기로 광학밀도(optical density; O.D)를 측정하였다. 이때, 측정한 O.D는 리포폴리사카라이드를 가한 세포에서의 O.D 값과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.
그 결과를 하기 <표 2>에 나타내었다.
추출 용매 추출물 고형분(g) Tricin 함량(mg/g) NO production
(μg/ml) Inhibition(%)
10% EtOH 추출 6.45 - 100 2.56
250 32.78
500 46.20
30% EtOH 추출 6.46 0.6068 100 32.90
250 39.48
500 58.30
50% EtOH 추출 6.73 0.7709 100 20.78
250 49.18
500 87.89
70% EtOH 추출 6.80 1.2738 100 57.67
250 65.54
500 81.76
90% EtOH 추출 4.84 0.9109 100 35.05
250 56.77
500 86.61
상기 표 2를 참조하면, 수율은 70% 에탄올 추출물이 가장 높은 것을 확인할 수 있었다. 트리신은 10% 에탄올 추출물에서는 나타나지 않았으며 가장 함량이 높은 것은 70% 에탄올 추출물이었다. NO 생성량 확인 결과는 100, 250 μg/ml에서는 70% 에탄올 추출물의 NO 생성 억제 효과가 가장 우수하였고, 500 μg/ml에서는 50% 에탄올 추출물이 더 좋은 결과를 나타내었다. 상기 결과를 취합하여 수율과 트리신 함량이 높으면서도 저농도에서 높은 활성을 나타낸 70% 에탄올 용매를 최적의 추출용매로 결정하였다.
1.2) 추출시간의 변화에 따른 효과를 확인하기 위하여, 고장초 50 g을 칭량한 후, 20배수 중량의 70 w/w% 발효주정을 투입하여 80℃에서 2, 4, 6, 8시간 동안 추출을 진행하고 여과하여 고장초 에탄올 추출액을 얻었다.
상기 고장초 에탄올 추출액을 농축 및 건조를 진행하여 고장초 에탄올 추출분말을 얻었고, 상기와 같이 트리신의 함량 및 NO 생성 억제량을 확인하여, 하기 <표 3>에 결과를 나타내었다.
추출 시간 추출물 고형분(g) Tricin 함량(mg/g) NO production
(μg/ml) Inhibition(%)
2시간 6.02 0.3016 100 23.71
250 37.58
500 49.43
4시간 6.49 0.6624 100 23.37
250 38.32
500 71.74
6시간 6.80 1.2738 100 57.67
250 65.54
500 81.76
8시간 6.95 0.9282 100 32.57
250 56.45
500 79.73
상기 표 3을 참조하면, 8시간 추출 시의 수율이 가장 높게 조사 되었지만, 트리신 함량은 6시간 추출에서 가장 높게 측정 되었다. NO 생성 억제 효과에서는 6시간 추출 시 모든 농도에서 높게 나타났다.
상기 결과를 취합하면, 수율은 8시간이 높았지만 6시간과의 차이가 미미하였으므로 트리신 함량이 더욱 높으며 모든 농도에서 높은 활성을 나타낸 6시간 추출을 최적의 추출시간으로 결정하였다.
1.3) 온도에 따른 효과를 확인하기 위하여, 고장초 50 g을 칭량한 후, 20배수 중량의 70 w/w% 발효 주정을 투입하여 60, 80℃에서 6시간 동안 추출을 진행하고 여과하여 고장초 에탄올 추출액을 얻었다. 상기 고장초 에탄올 추출액을 농축 및 건조를 진행하여 고장초 에탄올 추출분말을 얻었다. 이후, 상기와 같은 방법으로 추출물 고형분, 트리심 함량 및 NO 생성 억제 효과를 확인하고, 그 결과를 하기 <표 4>에 나타내었다.
추출 온도 추출물 고형분(g) Tricin 함량(mg/g) NO production
(μg/ml) Inhibition(%)
60℃ 6.14 0.4136 100 40.45
250 60.06
500 74.20
80℃ 6.80 1.2738 100 57.67
250 65.54
500 81.76
상기 <표 4>를 참조하면, 80℃ 추출 수율 및 트리신 함량이 60℃에서 추출한 것보다 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한, NO 생성 억제 효과를 확인한 결과, 100, 250, 500 μg/ml 모두에서 80℃ 추출물이 높게 측정되었다. 이러한 결과를 취합하여 수율과 트리신 함량이 높으며 모든 농도에서 높은 활성을 나타낸 80℃ 추출을 최적의 추출온도로 결정하였다.
상기의 추출 용매, 추출 시간, 추출 온도의 모든 결과를 취합하여, 최종 추출 공정은 70% 에탄올, 6시간, 80℃로 결정하였다.
<예비실험 2> 고장초 에탄올 추출물의 제조
고장초 1 kg을 칭량한 후, 20배수 중량의 70 w/w% 발효주정을 투입하여 80℃에서 6시간 동안 추출을 진행한 다음, 여과하여 고장초 에탄올 추출액을 얻었다. 상기 고장초 에탄올 추출액을 농축 및 건조를 진행하여 고장초 에탄올 추출분말을 얻었다.
<예비실험 3> 고장초 효소처리 추출물의 효소 선정 실험
고장초 100 g을 칭량한 후, 20배수 중량의 정제수를 투입하여 80℃에서 1시간 동안 추출하였다. 여기에 펙티나아제(pectinase), 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase), 탄나아제(tannase), α-아밀라아제(Alpha-Amylase), β-글루코시다아제(β-glucosidase)를 하기 <표 5>에 개시된 바와 같은 조건으로 효소처리 후, 1차 여과하여 1차 고장초 효소처리 추출액을 얻었다. 각 조건은 해당 효소의 최적의 조건으로 설정하였다.
온도(℃) pH 투입량 처리시간(hr)
펙티나아제 25 4.0 0.75ml(%) 24시간
셀룰라아제 37 5.0 1g(%) 24시간
헤미셀룰라아제 40 4.5 1g(%)
탄나아제 40 4.5 1g(%)
α-아밀라아제 60 6.5 1.5ml(%)
β-글루코시다아제 40 4.5 1g(%)
1차 여과 후, 남은 잔사에 10 배수의 70 w/w% 발효주정을 투입하여 80℃에서 4시간 에탄올 추출을 진행하고 2차 여과하여 2차 고장초 에탄올 추출액을 얻었다. 상기 1차 고장초 효소처리 추출액과 2차 고장초 에탄올 추출액을 혼합하여 농축 및 건조를 진행하여, 최종적으로 고장초 효소처리 추출분말을 얻었다.
<예비실험 4> 고장초 혼합효소처리 추출물의 제조
베타글루코시다아제, 펙티나아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제 4종의 효소에서 2종 이상의 효소를 혼합하여 처리한 후 효소처리 추출물을 제조하였다. 고장초 100 g을 칭량한 후, 20배수 중량의 정제수를 투입하여 80℃에서 1시간 동안 열수 추출하였다. 다양한 비율의 효소를 고장초 원물 투입량 대비 아래 명시되어 있는 비율로 혼합하여 첨가하고, 하기 <표 6>에 개시된 조건대로 효소처리 후, 1차 여과하여 1차 고장초 효소처리 추출액을 얻었다.
1) 펙티나아제 0.5 중량% : 셀룰라아제 0.5 중량%
2) 펙티나아제 0.5 중량% : 헤미셀룰라아제 0.5 중량%
3) 셀룰라아제 0.5 중량% : 헤미셀룰라아제 0.5 중량%
4) 펙티나아제 0.33 중량% : 셀룰라아제 0.33 중량% : 헤미셀룰라아제 0.33 중량%
5) 베타글루코시다아제 0.33 중량% : 셀룰라아제 0.33 중량% : 헤미셀룰라아제 0.33 중량%
이때 각 효소의 투입량은 고장초 원물 투입량에 대한 대비량이다.
온도(℃) pH 투입량 처리시간(hr)
1) 혼합효소 30 4.5 0.5%:0.5% 24
2) 혼합효소 35 4.5 0.5%:0.5% 24
3) 혼합효소 40 4.5 0.5%:0.5% 24
4) 혼합효소 35 4.5 0.33%:0.33%:0.33% 24
5) 혼합효소 40 4.5 0.33%:0.33%:0.33% 24
상기 1차 필터 후 남은 잔사에 중량의 10배수의 70 w/w% 발효주정을 투입하여 80℃에서 4시간 에탄올 추출을 진행하고 2차 여과하여 2차 고장초 에탄올 추출액을 얻었다. 상기 1차 고장초 효소처리 추출액과 2차 고장초 에탄올 추출액을 혼합하여 농축 및 건조를 진행하여, 최종적으로 고장초 효소처리 추출분말을 얻었다.
<예비실험 5> 고장초 추출물의 수율 및 트리신 함량 확인
상기 예비실험 2 내지 4에서 제조한 고장초 추출물의 트리신 함량을 비교분석하였다. 분석기기로는 HPLC(Agilent 1260)를 사용하였으며 분석 컬럼은 Discovery　C18, C-18, 5μm, 250 x 4.6 mm (SUPELCO)를 사용하였다.
표준품의 조제 시에는 트리신 표준품 2 mg을 칭량하고 HPLC용 메탄올을 가하여 20 mL로 한 것을 표준원액으로 하였고, 표준원액을 활용하여 1, 3, 5, 10, 20 ppm의 농도로 직선성 구간의 표준품을 제조하였다.
시험용액의 조제 시에는 상기 예비실험 1 및 2에서 제조한 고장초 추출물을 100 mg 칭량하여 50 mL 부피플라스크에 넣고 메탄올을 절반 넣어 초음파 처리(sonification)를 30분간 수행하였다. 처리 완료 후, 표선을 맞추고 볼텍싱한 후 0.45 μm 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 하였다.
이때 분석 방법은 상기 <표 1>에 나타난 바와 같았다.
그 결과, 도 2에 개시된 바와 같이, 각각의 효소처리 추출물의 수율이 에탄올 추출물에 비해 더 높아지는 것을 확인하였다.
또한, 도 3에 개시된 바와 같이, 고장초 에탄올 추출물보다 베타글루코시다아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제를 혼합으로 처리한 추출물의 트리신 함량이 더 높은 함량을 갖는 것을 확인하였다.
한편, 도 4는 에탄올 추출물의 트리신 크로마토그램과 고장초 베타글루코시다아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제의 혼합효소처리 추출물의 크로마토그램을 나타낸 것으로 혼합효소 처리 시 트리신 함량이 증가함을 알 수 있으며 앞부분의 트리신 배당체들의 peak가 에탄올 추출물에 비해 감소함을 확인할 수 있다. 이는 트리신 배당체 및 유도체들의 감소로 트리신의 함량이 증가함을 간접적으로 확인할 수 있는 부분이다.
상기 결과를 토대로, 고장초 에탄올 및 효소 처리 추출물의 수율을 감안한 트리신 총량을 도 5에 그래프로 나타내었다.
<예비실험 6> 고장초 추출물의 항염증 효능 확인
상기 예비실험 2 내지 4에서 제조한 고장초 추출물의 항염증효능을 확인하였다. 대식 세포주 RAW264.7은 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양 받아 10% FBS와 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)를 첨가한 DMEM 배지(Welgene, Gyeongsan, Korea)를 이용하여 5% CO2가 존재하는 37℃ 인큐베이터에서 2～3회 계대 배양한 후 사용하였다.
이후, RAW264.7의 시료에 대한 세포 생존율을 측정하기 위해 MTT 어세이를 실시하였다. RAW264.7 세포를 96-웰 플레이트에 1 X 106 cells/well이 되게 분주하여 5% CO2 인큐베이터에서 20~24시간 동안 예비 배양하였고, 각 추출물 시료를 처리하여 다시 24 시간 배양한 후, PBS에 녹인 MTT(5 mg/mL) 용액 10 μL를 각 웰에 넣고 인큐베이터에서 4시간 동안 반응시켰다. 그 후, 상등액을 제거하고, 각 웰에 100 μL의 DMSO를 첨가하여 생성된 포르마잔 크리스탈을 용해시켜 550 nm 파장에서 ELISA 리더기로 흡광도를 측정하였다. 이렇게 측정한 포르마잔 생성 정도는 정상적인 세포의 값과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.
두 번째로, RAW264.7을 이용한 고장초 추출물 및 트리신의 항염증 효과를 측정하기 위해 NO 어세이를 실시하였다. 먼저 RAW264.7 세포를 96-웰 플레이트에 1 X 106 cells/well이 되게 분주하여 5% CO2 인큐베이터에서 20~24시간 동안 예비 배양 하였고, 각 추출물 시료를 처리하여 24 시간 배양하였다. 여기서 대식 세포주 RAW264.7 세포의 염증을 유발하기 위하여 1 mg/mL 농도의 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; Sigma-Aldrich, USA) 10 μL를 각 웰에 주입하였다. 그 후, 상등액 100 μL를 96-웰 플레이트에 옮겨 2.5% 인산, 1% 설파닐아마이드, 0.1% N-(1-나프틸)에틸렌디아민이 포함된 그리스 시약(griess reagent with 2.5% phosphoric acid, 1% sulfanilamide, 0.1% N-(1-Naphtyl) ethylenediamine) 100 μL를 각 웰에 넣어 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 540 nm 파장에서 ELISA 리더기로 광학밀도(optical density; O.D)를 측정하였다. 이때, 측정한 O.D는 리포폴리사카라이드를 가한 세포에서의 O.D 값과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.
양성 대조군으로는 리포폴리사카라이드를 가하지 않은 RAW264.7 세포를 사용하였으며, 음성 대조군으로는 NO 억제제로 작용하는 Lω-나이트로-L-아르기닌 메틸 에스터(L-NAME, Sigma-Aldrich, USA)를 가한 세포를 이용하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 시료 처리 농도 500 μg/ml에서 고장초 에탄올 추출물보다 베타글루코시다아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제를 혼합으로 처리한 추출물의 항염증 효능이 더 뛰어난 것을 확인하였다.
<예비실험 7> 고장초 추출물의 미백 효능 확인
상기 예비실험 2 내지 4에서 제조한 고장초 추출물의 미백효능을 확인하였다. 먼저 쥐 유래 멜라닌 세포주 B16-F0 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, USA)으로부터 분양 받았으며, 10% FBS와 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)를 첨가한 DMEM 배지(ATCC, ATCC 30-2002, USA)를 이용하여 5% CO2가 존재하는 37℃ 인큐베이터에서 2～3회 계대 배양한 후 사용하였다.
이후, B16-F0 세포의 시료에 대한 세포 생존율을 측정하기 위해 MTT 어세이를 실시하였다. B16-F0 세포를 24-웰 플레이트에 5 X 105 cells/well이 되게 분주하여 5% CO2 인큐베이터에서 20~24시간 동안 예비 배양하였고, 각 추출물 시료를 처리하여 48 시간 배양한 후, PBS에 녹인 MTT(5 mg/mL) 용액 100 μL를 각 웰에 넣고 인큐베이터에서 4시간 동안 반응시켰다. 그 후, 상등액을 제거하고, 각 웰에 500 μL의 DMSO를 첨가하여 생성된 포르마잔 크리스탈을 용해시켜 550 nm 파장에서 ELISA 리더기로 흡광도를 측정하였다. 측정한 포르마잔 생성 정도는 정상적인 세포의 값과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.
두 번째로, 쥐 유래 멜라닌 세포주 B16-F0에서 고장초 추출물 및 트리신의 멜라닌 생성 억제능을 측정하였다. B16-F0 세포를 6-웰 플레이트에 5 X 105 cells/well이 되게 분주하여 5% CO2 인큐베이터에서 20~24시간 동안 예비 배양하였고, 이후 각 추출물 시료를 처리하여 48 시간 배양하였다. 이때 시료 처리와 함께 멜라닌 생성을 촉진시키기 위하여 1 μM α-멜라닌세포자극호르몬(α-Melanocyte stimulating hormone; Sigma-Aldrich, USA)과 100 μM 3-이소뷰틸-1-메틸잔틴(3-Isobutyl-1-methylxanthine; Sigma-Aldrich, USA)를 혼합시킨 DMEM 배지를 사용하였다. 배양 완료 후, 상등액을 제거하고 따듯한 PBS 용액을 각 웰 당 1,000 μL씩 첨가한 후 10분간 37℃에서 배양하였다.
배양된 세포를 대상으로 6-웰 플레이트 표면에 붙어 있는 멜라노마 세포들을 떼어내고 1.5 mL 튜브에 분주한 후 4℃로 유지된 원심분리기를 이용하여 13,000 rpm, 10 분간 원심분리 하였다. 원심분리 후, 상등액을 조심스럽게 제거하고 용해 용액(lysis solution; 1.0 N NaOH : Dimethyl sulfoxide = 9 : 1) 150 μL를 넣어 멜라닌을 녹였다. 오븐에서 60℃ 조건 하에 1시간 반응시킨 후, 96-웰 플레이트에 각 웰 당 100 μL씩 분주하여 ELISA 리더기(405 nm)로 O.D를 측정하였다. 대조군으로는 시료와 반응시키지 않은 멜라노마 세포에서의 O.D를 사용하였다. 또한, 음성 대조군로는 티로시나아제 생성 억제를 통한 멜라닌 억제능을 가지는 250 uM 알부틴(arbutin; Sigma-Aldrich, USA)를 사용하였다.
그 결과, 도 8에 개시된 바와 같이, 시료 처리 농도 500 μg/ml에서 고장초 에탄올 추출물보다 베타글루코시다아제, 펙티나아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제를 혼합으로 처리한 추출물의 미백 효능이 더 뛰어난 것을 확인하였다.
<예비실험 8> 고장초 추출물의 주름개선 효능 확인
상기 예비실험 2 내지 4에서 제조한 고장초 추출물의 주름개선효능을 확인하였다. 먼저 인간 유래 CCD-986sk 섬유아세포(fibroblast cell)는 Korea Culture Tissue Collection(KCTC, Korea)으로부터 분양 받았으며, 인간 진피 섬유아세포(Human dermal fibroblast; HDF)는 서린바이오에서 분양받았다. 그리고 CCD-986sk 섬유아세포는 10% FBS와 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)를 첨가한 IMDM 배지(ATCC, ATCC 30-2005, USA)를 이용하여 5% CO2가 존재하는 37℃ 인큐베이터에서 2～3회 계대 배양한 후 사용하였으며, HDF는 10% FBS와 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)를 첨가한 HDF 특수 배지(세포바이오, Korea)를 이용하여 2~3회 계대 배양 후 사용하였다.
이후, CCD-986sk 세포와 HDF의 시료에 대한 세포 생존율을 측정하기 위해 MTT 어세이를 실시하였다. 구체적으로, CCD-986sk 세포와 HDF를 96-웰 플레이트에 1 X 105 cells/well이 되게 분주하여 5% CO2 인큐베이터에서 20~24시간 동안 예비 배양한 뒤, 각 추출물 시료를 처리하여 24시간 배양한 후, PBS에 녹인 MTT(5 mg/mL) 용액 10 μL를 각 웰에 넣고 인큐베이터에서 4시간 동안 반응시켰다. 그 후 상등액을 제거하고, 각 웰에 100 μL의 DMSO를 첨가하여 생성된 포르마잔 크리스탈을 용해시켜 550 nm 파장에서 ELISA 리더기로 흡광도를 측정하였다. 측정한 포르마잔 생성 정도는 정상적인 세포의 값과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.
두 번째로, 프로콜라겐과 MMP 패밀리(MMP-1, 2, 3, 9, 13)는 세포 배양액 외부로 배출되는 인자로서, 시료와 반응한 세포 배양액을 수거하여 사용하였다. 즉, 고장초 효소처리(표준시료)와 트리신에 대한 프로콜라겐 합성능을 측정하기 위하여 Takara 제품의 프로콜라겐 타입 I C-펩티드 EIA 키트(Procollagen type I C-peptide EIA kit)를 사용하였으며, PIP를 사용하여 정량 곡선을 측정하고 시료별 콜라겐 합성량을 계산하였다. 또한, 주름에 영향을 주는 인자인 메탈로프로테이나아제-1(metalloproteinase-1; MMP-1), MMP-2, MMP-3, MMP-9, MMP-13의 억제능을 측정함으로써 고장초 효소처리(표준시료) 및 트리신의 주름개선 효과를 평가하였다. MMP-1, 2, 3, 9, 13의 억제능은 Abcam 회사의 제품을 사용하여 측정하였다.
그 결과, 도 10에 개시된 바와 같이, 각 시료 처리농도 500 μg/ml에서 고장초 에탄올 추출물보다 베타글루코시다아제, 펙티나아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제를 혼합으로 처리한 추출물의 주름개선 효능이 더 뛰어난 것을 확인하였다.
<예비실험 9> 고장초 추출물의 항알러지 효능 확인
상기 예비실험 2 내지 4에서 제조한 고장초 추출물의 항알러지효능을 확인하였다. 먼저 랫 호염기구성 백혈병 세포주인 RBL-2H3 세포를 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 구입하였다. RBL-2H3 세포는 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 MEM(Gibco BRL, NY, USA) 배지에서, 37℃, 5% CO 조건의 배양기에서 배양시켰다.
먼저, 시료의 세포독성을 확인하기 위해, 침투한 포르마잔(formazan) 염료를 MTT로 환원시키는 활성 미토콘드리아를 분석하는 MTT 분석을 수행하여 세포생존능을 확인하였다. RBL-2H3 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 3 × 104 세포로 분주하고 그 다음 날 37℃ 조건에서 고장초 추출물을 처리하였다. 48시간 후, 각 웰에 MTT(5 mg/mL) 100 μL을 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 그 후 100 μL의 DMSO를 각 웰에 첨가하여 세포를 용해시켰다. 플레이트를 실온에서 5분간 유지시키고 멀티웰 분광광도계(multiwell spectrophotometer; Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.
두 번째로, RBL-2H3 세포에서 추출물의 β-헥소사미니다아제(hexosaminidase) 방출 억제 효과를 확인하였다. RBL-2H3 세포를 24-웰 플레이트에 웰 당 2 × 105 세포로 분주하고 항-DNP IgE(450 ng/mL)로 37℃에서 하룻밤 동안 자극시켰다. 그 후 세포를 Siraganian 버퍼로 세척하고 인큐베이트 버퍼 160 μL을 첨가하여 37℃에서 20분 동안 인큐베이트한 후, 추출물 시료 20 μL를 10분 동안 세포에 처리하고 항원(DNP-BSA, 10 μg/mL) 20 μL를 첨가하여 37℃에서 10분 동안 세포가 과립을 형성하도록 자극하였다. 그 후, 얼음 수조에 10분 동안 담가 반응을 중단시켰다. 상층액 25 μL를 96-웰 플레이트로 옮기고 기질(1 mM p-nitrophenyl-Nacetyl-β-D-glucosaminide)이 녹아있는 0.1 M 시트르산염(citrate) 버퍼(pH 4.5) 25 μL를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 후 정지액(0.1 M Na2CO3/NaHCO3, pH 10.0) 200 μL를 첨가하여 반응을 중단시키고 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
세 번째로, IL-4와 TNF-α는 세포 외부로 방출되는 사이토카인으로써 동일한 실험 방법 후 세포 배양액을 수거하여 사용하였으며, IL-4와 TNF-α 측정은 ELISA 기법으로써 Abcam과 R&D systems 키트를 사용하여 매뉴얼대로 측정하였다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 처리농도 500 μg/ml에서 고장초 에탄올 추출물보다 베타글루코시다아제, 펙티나아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제를 혼합으로 처리한 추출물의 항알러지 효능이 더 뛰어난 것을 확인하였다.
[실시예]
<실시예 1> 고장초 혼합효소처리 추출물의 제조
고장초 1 kg을 칭량한 후, 20배수 중량의 정제수를 투입하여 80℃에서 1시간 동안 열수추출 하였다. 여기에 고장초 중량의 1.0 w/w% 무게의 시중에 판매중인 베타글루코시다아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제 효소를 첨가하고, 35℃에서 24시간 효소처리한 다음, 1차 여과하여 1차 고장초 효소처리 추출액을 얻었다.
상기 1차 여과 후 남은 잔사에 10배수의 70 w/w% 발효주정을 투입하여 80℃에서 4시간 에탄올 추출을 진행하고 2차 여과하여 2차 고장초 에탄올 추출액을 얻었다. 상기 1차 고장초 효소처리 추출액과 2차 고장초 에탄올 추출액을 혼합하여 농축 및 건조를 진행하여, 최종적으로 고장초 효소처리 추출분말을 얻었다. 상기 효소처리 추출공정은 예비실험 3 내지 10의 과정을 거쳐 본 발명자들이 실험을 통하여 최적의 조건을 설정한 것이다.
[비교예]
<비교예 1> 고장초 에탄올 추출물의 제조
고장초 1 kg을 칭량한 후, 20배수 중량의 70 w/w% 발효주정을 투입하여 80℃에서 6시간 동안 추출을 진행하고 여과하여 고장초 에탄올 추출액을 얻었다. 상기 고장초 에탄올 추출액을 농축 및 건조를 진행하여 고장초 에탄올 추출분말을 얻었다.
상기 에탄올 추출공정은 여러 논문이나 특허에 언급되어 있는 고장초 에탄올 추출방법으로서, 예비실험 1을 통해 최적의 조건을 설정한 것이다.
[시험예]
<시험예 1> 물질 분리 및 트리신 확인
HPLC 분석에 의하면 고장초 효소처리 추출물은 다량의 트리신을 함유하고 있는 것으로 파악되었다. 이에, 고장초 효소처리 추출물 내에 트리신이 함유되어 있는지를 확인하고자 물질의 분리 및 구조를 규명하여 실제 트리신이 함유되어 있음을 밝히기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
트리신 물질 분리 방법은 하기와 같았다: 1) 건조된 고장초 효소처리 추출분말 5 kg을 80% 메탄올 45 L에 상온 추출하였다. 2) 상기 1)의 농축액을 대상으로 EtOAc 3L 3회, n-BuOH 3L 3회의 분획을 진행하였다. 3) 상기 2)의 EtOAc 분획물을 ZLE, n-BuOH 분획물을 ZLB, 분획 후 남은 추출물을 ZLW로 명명하였다. 4) ZLE 추출물을 실리카 겔이 충진 된 순상 컬럼을 활용하여 CHCl3 : MeOH 50:1부터 1:1까지 각각의 용매조건으로 분획을 실시하여 ZLE-1부터 ZLE-13까지의 분획물을 얻었다. 5) 4)의 분획물에서 ZLE-8을 prep-LC를 활용하여 각각의 분획을 실시하였으며 분리된 분획물을 ZLE-8-1부터 ZLE-8-14로 명명하였다. 6) 상기 5)의 분획물에서 ZLE-8-4의 분획물을 prep-LC를 활용하여 다음과 같은 조건으로 물질 분리를 진행하였다.
이동상 = A: 물과 0.1% 포름산
B: 아세토니트릴과 0.1% 포름산
농도 구배 = B 10 %에서 B 35 %까지 0.5 %/min
B 35 %에서 B 60 %까지 0.6 %/min
7) 상기 6)의 조건으로 각각의 단일물질을 획득하였으며 구조분석 결과 트리신임이 확인되었다.
<시험예 2> 트리신의 항염증 효능 확인
상기 예비실험 7 에서의 항염증효능 실험방법에 개시된 바와 동일 동일한 방법으로 실험을 진행하였다.
그 결과, 도 7에 개시된 바와 같이, 트리신 단일물질의 농도에 따른 NO 생성은 농도 의존적으로 감소함을 확인할 수 있었으며 이는 고장초 효소처리 추출물에서 트리신의 함량에 따른 효능 변화임을 시사한다.
<시험예 3> 트리신의 미백 효능 확인
상기 예비실험 8에서의 미백 효능 실험방법과 동일한 방법으로 실험을 진행하였다.
그 결과, 도 9에 개시된 바와 같이, 트리신 단일 물질의 농도에 따른 멜라닌 생성량이 농도 의존적으로 감소함을 확인할 수 있었으며, 이는 고장초 효소처리 추출물에서 트리신의 함유에 따른 효능 변화임을 시사한다.
<시험예 4> 트리신의 주름개선 효능 확인
상기 예비실험 9에서의 주름개선 효능 실험방법과 동일한 방법으로 실험을 진행하였다.
그 결과, 도 11에 개시된 바와 같이, 트리신 단일물질의 농도에 따른 콜라겐 생성이 농도 의존적으로 증가함을 확인할 수 있었으며 이는 고장초 효소처리 추출물에서 트리신의 함량에 따른 효능 변화임을 시사한다.
<시험예 5> 트리신의 항알러지 효능 확인
상기 예비실험 10에서의 주름개선 효능 실험방법과 동일한 방법으로 실험을 진행하였다.
그 결과, 도 13에 개시된 바와 같이, 트리신 단일물질의 농도에 따른 β-헥소사미니아다아제 방출율을 확인한 결과, 농도 의존적으로 감소함을 확인할 수 있었으며 이는 고장초 효소처리 추출물에서 트리신의 함량에 따른 효능 변화임을 시사한다.
<시험예 6> 고장초 에탄올 추출물과 효소처리 추출물의 수율 및 트리신 함량 비교
상기 실시예 1과 비교예 1에서 제조된 추출물들의 수율을 비교한 결과를 도 23에 나타내었다.
추출물 수율 비교 결과, 도 23에 나타난 바와 같이, 베타글루코시다아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제의 혼합효소로 추출한 추출물의 수율은 21.37%로 기존 고장초 에탄올 추출물의 10.96%에 비해 2배 이상 증가하였기 때문에, 상업적 활용가치가 더 높아졌음을 확인할 수 있었다.
상기 실시예 1과 비교예 1에서 제조된 추출물들의 트리신의 함량 분석을 진행하였다. 이때, 상기 예비실험 6에서의 트리신 함량 분석법과 동일한 방법으로 실험을 진행하였다.
그 결과, 도 24에 나타난 바와 같이, 베타글루코시다아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제의 혼합효소를 처리한 고장초 추출물의 트리신 함량은 고장초 에탄올 추출물의 1.27 mg/g에서 3.31 mg/g으로 약 2.6배 증가함을 확인할 수 있었다.
이상의 결과들을 고장초 원재료 대비 트리신 회수율 측면에서 비교했을 때, 주정 단순 추출물의 경우 트리신 회수율은 139.2mg/kg 이었으며 복합효소 처리시 트리신 회수율은 707.3mg/kg으로 5.08배 증가되는 것을 확인하였다.
<시험예 7> 고장초 에탄올 추출물과 효소처리 추출물의 항염증 효능 확인
상기 실시예 1과 비교예 1에서 제조된 추출물들의 항염증 효능평가를 진행하였다. 이때, 상기 예비실험 7에서의 항염증 효능 실험방법과 동일한 방법으로 실험을 진행하였다.
그 결과, 도 25에 나타난 바와 같이, 베타글루코시다아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제의 혼합효소를 처리한 고장초 추출물의 NO 생성량은 26.3 μM(고장초 에탄올 추출물)에서 17.89 μM로 8.41 μM만큼 더 감소함을 확인할 수 있었다.
<시험예 8> 고장초 에탄올 추출물과 효소처리 추출물의 미백 효능 확인
상기 실시예 1과 비교예 1에서 제조된 추출물들의 미백 효능평가를 진행하였다. 상기 예비실험 8에서의 미백 효능 실험방법과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 26에 나타난 바와 같이, 베타글루코시다아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제의 혼합효소를 처리한 고장초 추출물의 멜라닌 생성률은 고장초 에탄올 추출물의 68.323 %에서 47.989 %로 20.334 % 포인트가 더 감소함을 확인할 수 있었다.
<시험예 9> 고장초 에탄올 추출물과 효소처리 추출물의 주름개선 효능 확인
상기 실시예 1과 비교예 1에서 제조된 추출물들의 주름개선 효능평가를 진행하였다. 상기 예비실험 9에서의 주름개선 효능 실험방법과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 27에 나타난 바와 같이, 베타글루코시다아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제의 혼합효소를 처리한 고장초 추출물의 콜라겐 합성량은 고장초 에탄올 추출물의 7402.1097 ng/ml에서 9803.6093 ng/ml로 2401.4996 ng/ml이 더 증가함을 확인할 수 있었다.
<시험예 10> 고장초 에탄올 추출물과 효소처리 추출물의 항알러지 효능 확인
상기 실시예 1과 비교예 1에서 제조된 추출물들의 항알러지 효능평가를 진행하였다. 상기 예비실험 10에서의 항알러지 효능 실험방법과 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.
그 결과, 도 28에 개시된 바와 같이, 베타글루코시다아제, 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제의 혼합효소를 처리한 고장초 추출물의 β-헥소사미니다아제 방출률은 고장초 에탄올 추출물의 19.02 %에서 7.45 %로 11.57 % 포인트가 더 감소함을 확인할 수 있었다.
<시험예 11> 고장초 혼합효소처리 추출물의 동물실험을 통한 주름개선 및 보습 효능 확인
1. 실험 방법
상기 실시예 1에서 제조한 고장초 효소처리 추출물에 대해 동물실험을 통하여 주름개선 및 보습효능을 확인하였다. 실험을 위해 생화학 분석 장비(Roche Ltd, Basel, Switzerland), 글래스 테플론 균질기(glass teflon homogenizer; Chang shin scientific Co., Korea), 마이크로플레이트 리더기(Bio-TEK, USA), 단백질 정량 장비(Chemi-Doc; BIORAD, USA), 원심분리기(Hanil FLETA5, Korea), 워터 배쓰(water bath; Thermo minder taitec, Japan), 디프 프리저(deep freezer; Sanyo, Japan)를 사용하였다. 또 글래스 테플론 균질기(대한과학, Korea), UV-분광광도계(Shimadzu UV-1201, Japan), 고속 원심분리기(High centrifuge; Hanil HMR-1610V, Korea), 의약용 냉동고(Medical freezer; Sanyo, Japan), 마이크로플레이트 리더기(Bio-TEK), 단백질 정량 장비(Chemi-Doc; BIORAD)를 사용하였다.
본 실험에 사용한 SKH-1 헤어리스 마우스(hairless mouse)계, 6주령 모델 (암컷)을 오리엔트바이오(경기도 성남, 한국)로부터 수입, 분양받아 (주)동남의화학연구원 동물사(동물시설등록증: 제 412호)에서 일주일간 검역과 순화사육을 거친 뒤, 건강한 동물을 대상으로 특정 사육환경(온도(26.25 ± 0.59)℃, 상대습도 (50.07 ± 3.48)%, 조명시간 12시간(07:00～19:00))을 설정하여 실시하였다. 이때, 각 군당 9마리씩 총 7군으로 나누어 실험하였다.
도 14에 나타난 바와 같이, 정상군(N군)을 제외한 나머지 주름 유도군은 UVB 조사를 10주간 단계별 조사하였으며, UVB 조사군은 C군(대조군), 본 발명의 예비실험 5의 방법으로 제조한 고장초 혼합효소 처리 추출물 시료를 체중당 50 mg/kg, 150 mg/kg, 300 mg/kg 경구 투여한 군은 각각 Z50군, Z150군, Z300군, 고장초 지표물질인 트리신을 0.3 mg/kg 경구 투여한 군은 T군 및 레티노산 0.05%, 피부도포군을 R군으로 명명하였다. 이때 시료의 경구 투여 내지 피부 도포는 14주간 수행되었고, R군에서는 Brahim Chaqour 방법을 참고하여 레티노산0.05%를 50 ul씩 일주일에 3회 피부에 도포하였다. 사료는 실험동물용 고형사료(샘타코 BIOKOREA, 한국)를 사용하였으며 음수는 자유 섭취시켰다. 해부 전 15시간 동안에는 물만 주고 절식하였다. 이때 효소활성의 일중변동을 고려하여 실험동물을 일정시간(오전 10:00-12:00) 내에 처치하였다. 본 연구는 (주)동남의화학연구원 동물실험위원회(SEMI, Institutional Animal Care and Use committee)의 방침 및 법규에 따라 진행되었다.(윤리승인번호: SEMI-16-13)
자외선 조사장치(동서과학, UV-1000)는 캐비넷 내에 UVB를 방출하는 태양등(Sunlamp)으로 자외선을 방출하였으며, 광원은 302 nm로, UVB 강도가 0.3 mW/cm2가 되는 높이에서 조사되도록 하였다. 자외선 조사량은 UV-방사계로 측정하였으며, 마우스를 자외선 조사용 케이지에 가둔 후, 등 부위에 격일간격으로 1주일에 3회, 총 10주간[0주: 60 mJ/m2 (1 M.E.D), 1주: 120 mJ/m2 (2 M.E.D), 2~3주: 180 mJ/m2 (3 M.E.D), 4~5주: 240 mJ/m2 (4 M.E.D) 5주~10주: 240 mJ/m2 (4 M.E.D)] 조사하였다.
가장 먼저는, 각 동물들의 체중을 측정하여 체중 변화를 관찰하였다.
피부 주름 양상 관찰을 위하여, 실험동물을 5주~14주째 디지털 카메라로 등 표면을 사진 촬영을 한 후, SILFLO(Flexico developments LTD. Tokyo, Japan) 실리콘 고무 인상재(silcone rubber impression material)로 개체의 동일 등 부위 피부 주름의 모형(replica)을 제작하여 현미경으로 촬영한 후 주름의 양상을 실험 군별로 비교 관찰하였다. 또한, 피부 주름과 밀접한 관련이 있는 보습효능도 확인하기 위해 피부표면 수분도를 체크하였다.
보다 구체적으로, 사육기간이 종료된 실험동물은 15시간 절식시켰고, CO2로 마취시켜 개복한 후 1 mL 주사기를 이용하여 복부대동맥에서 채혈하였다. 이때 얻은 혈청의 아스파테이트 아미노전이효소(Aspartate aminotransferase; AST) 및 알라닌 아미노전이효소(Alanine aminotransferase; ALT)를 검사하였다. 구체적인 실험 방법은 다음과 같았다:
복부대동맥에서 채혈한 혈액을 약 30분간 실온에서 방치시킨 후 3,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 혈청을 얻어 혈청생화학분석에 사용하였고, 분리된 혈액 상층액은 혈청생화학기(Rochu Ltd., Basel, Switzerland)로 AST 및 ALT를 분석하였다.
피부 및 장기는 적출하여 생리 식염수에 세척한 후 여지로 수분을 제거하고 조직염색 및 웨스턴블롯 실험에 사용하였다. 또한, H&E 염색 실험을 다음과 같이 진행하였다. 절취한 피부조직을 10% 포르말린에 넣어 조직을 고정한 후 수세하고 60%에서 100% 알코올로 순차적으로 탈수하여 파라핀에 포매하고 블록을 만들었다. 이것을 회전 조직박절기(rotary microtome)를 사용하여 5 μm의 두께로 조직절편을 만들어 헤마톡실린&에오신으로 염색한 뒤, 광학현미경 (Nikon Co., Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
다음으로, 메이슨 트리크롬(Masson's trichrome) 실험을 다음과 같이 진행하였다. 절취한 피부 조직을 실온에서 10% 중성포르말린 용액에 24시간 고정한 후 통상적인 방법으로 수세, 탈수, 투명, 침투 과정을 거친 다음 파라핀으로 포매하고 4 μm 두께로 절편을 만들어 실온에서 Bouin 용액에 하룻밤 담그고 메이슨 트리크롬 염색 후 진피층 내 교원섬유(collagen fiber)의 양과 형태를 광학 현미경으로 관찰하였다.
이후 피부 조직의 웨스턴 블롯 실험을 다음과 같이 진행하였다. 단백질 분석을 위해 피부 조직 20 mg을 세포 용혈 버퍼(cell lysis buffer) 200 μL에 넣은 후 균질기를 이용하여 조직을 파쇄한 후 800 rpm, 10 sec 원심분리하여 상층액만 사용하였다. 24시간 아이스 인큐베이션한 뒤 14,000 rpm, 4℃, 20 min 원심분리하였다. 이후, 브래드포드 어세이를 이용하여 단백질을 정량하엿고, SDS-PAGE(폴리아크릴아마이드 겔 전기영동; Polyacrylamide Gel Electrophoresis)를 이용하여 크기 별로 분리하였다. Semi-dry transfer system(Bio-Rad, USA)를 이용하여 PVDF(폴리비닐리덴 플루오라이드) 멤브레인에 이동시킨 후, 5% 탈지유를 함유한 블로킹 버퍼(5% 탈지유, 1X TBST 버퍼)를 1시간 동안 처리하였다. 이후 1X TBST 버퍼로 10 분, 3회 세척 후, 1차 항체인 콜라겐 1A, MMP-1, MMP-13(SantaCruz, USA)을 처리한 후 4℃에서 밤새 반응시켜, 1× TBST 버퍼로 10 min, 3회 세척하였다. 웨스턴 블롯 디텍션 키트(Western Blot detection kit; Abfrontier, WEST SAVE GOLD, Korea)를 이용하여 멤브레인과 반응시킨 후 Chemi-Doc(BIORAD XRS system, USA) 장비를 이용하여 발현 정도를 관찰하였으며, β-액틴(SantaCruz, USA)으로 보정하여 비교하였다.
상기 실험들의 결과는 통계 처리하여 평균치와 표준편차를 계산하였으며, 각 군의 유의성 검정은 Statview program에서 분산 분석 t-검정(Anova t-tes)을 이용하여 통계분석하였다.
2. 실험 결과
먼저 각 실험 군에 고장초 추출물 및 트리신을 14주간 경구투여한 후 UVB 조사 장치로 10주간 주름을 유도한 SKH-1 마우스의 체중 변화를 도 15에 나타내었다. 그 결과, 실험기간 동안 N군, C군, 나머지 시료 처리 군에서 체중 변화는 모두 정상 범위로 나타났다.
피부표면 수분도 체크 결과, 도 16에 나타난 바와 같이, C군은 피부표면의 수분이 확연하게 감소하는 반면에, 14주간 시료를 투여한 P군, Z50군, Z150군, Z300군, T군의 경우는 피부표면의 수분을 유지하고 있음을 확인하였다.
혈청의 AST 및 ALT 검사 결과, 도 17에 나타난 바와 같이, 14주간 시료 투여에도 불구하고 군간 유의차가 발생하지 않았으며 모두 정상범위로 확인되었다.
등표면 육안 관찰 결과, 도 18에 나타난 바와 같이, C군은 피부표면이 건조해지며, 홍반반응을 거쳐 차츰 피부표면에 잔주름이 굵은 주름으로 그 수가 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 반면에, 10주간 고장초 50 mg/kg, 150 mg/kg 투여한 Z50, Z150군의 등 표면은 UVB 조사에도 불구하고 홍반현상 및 각질 형성이 C군보다 현저히 줄었으며, 주름의 수가 적게 생성되거나 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
SILFLO 현미경 관찰 결과, 도 19에 나타난 바와 같이, C군은 주름의 두께가 굵고 간격이 좁고 주름이 깊게 형성되었고, 14주간 고장초 추출물 50 mg/kg, 150 mg/kg을 투여한 Z50, Z150군은 C군 대비하여 상대적으로 주름이 덜 형성되거나, 주름의 두께가 얇고 선이 가는 것을 확인할 수 있었다. 한편, 레티노산 0.05%를 피부 도포한 P군과 트리신 2 mg/kg을 투여한 T군의 경우, UVB 조사 8주차까지 C군 대비하여 상대적으로 주름이 덜 형성되었으나, UVB 조사 10주차에 이르러 R군은 주름이 굵어졌으며 주름의 수도 많아지는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 고장초 추출물 300 mg/kg 투여군(Z300군)에서는 앞서 등 표면 관찰결과와 같이 SILFLO 현미경 관찰에서도 굵은 주름이 관찰되었다.
이를 고려해 볼 때, UVB 10주 조사에도 불구하고 고장초 50 mg/kg, 150 mg/kg 시료 투여는 SKH-1 헤어리스 마우스 표피 각질형성세포에 효과적으로 작용하여 피부 주름 형성 예방에 도움이 될 것으로 사료된다.
H&E 염색 결과, 도 20에 나타난 바와 같이, C군은 10주간 UVB 처리로 표피의 상피세포 층이 매우 두꺼워졌으며(화살표 표시), 표피 및 진피층 모두 건조가 유도되었고, 탄력 섬유층이 변성된 것을 확인할 수 있었다. 이에 비해 14주간 고장초 50 mg/kg, 150 mg/kg 처리한 Z50군, Z150군은 C군에 비해 상피세포층이 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다. 아울러 진피층 내 탄력 섬유가 C군과 대비하여 조밀해진 모습을 확인할 수 있었다. 이는 앞서 등표면 및 SILFLO로 피부 표면의 형태학적 관찰결과와 일치하는 결과로, 일정 농도의 고장초 추출물 투여는 표피층 및 상피세포에 긍정적인 영향을 미치는 것을 알 수 있다.
메이슨 트리크롬 염색 결과, 도 21에 나타난 바와 같이, N군의 진피층에서 아닐린 블루에 강하게 염색된 교원섬유가 관찰되었으나, UVB를 10주간 조사한 C군의 교원섬유는 아닐린 블루에 미약하게 염색되었다. 한편, UVB를 조사하면서 14주간 고장초 추출물을 투여한 결과 고장초 추출물 투여군에서, 특히 Z50군의 진피 층에서 C군에 비하여 아닐린 블루에 강하게 염색된 교원섬유가 관찰되었다. 이는 14주간 고장초 추출물 투여(고장초 50 mg/kg, 150 mg/kg 투여)로 장기간 과량의 UVB 조사에도 불구하고 피부 조직 내 콜라겐층을 유지시켰으며, 피부 주름 형성을 효과적으로 차단하여 교원질 섬유구조 형태를 조밀하게 유지시켰기 때문이다.
UVB 조사 피부 조직의 단백질 발현 확인 결과, 도 22에 나타난 바와 같이, UVB 조사에도 불구하고 고장초 추출물 투여군에서는 콜라겐 1A의 발현량이 C군 대비 모두 증가한 것을 확인할 수 있었다. 특히 고장초 추출물 150 mg/kg을 투여한 Z150군은 p<0.001 유의수준으로 콜라겐 1A 발현량이 증가함을 확인할 수 있었다. 또한, 콜라겐을 분해하는 효소로 알려진 MMP-1, MMP-13의 단백질 발현을 확인한 결과, UVB를 조사한 C군에서 MMP-1, MMP-13의 발현량이 증가하였으나 MMP-1의 발현량은 Z50군에서 p<0.05 유의수준으로 감소하였으며, MMP-13의 발현량 또한 Z50군, Z150군에서 모두 p<0.05 유의 수준으로 감소하였다. 한편, R군은 C군보다 MMP-1, 13의 발현량이 현저히 증가해 레티노산을 일주일 3번 바르는 것으로 콜라겐 합성 및 분해효소 기전에 영향을 미치지 못하는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과를 종합하여 볼 때, 과량의 자외선 조사로 콜라겐 분해효소인 MMP-1, MMP-13 단백질 발현이 증가하고 콜라겐 합성 효소인 콜라겐 1A 발현이 감소한 것이, 14주간의 고장초 추출물(Z50군, Z150군) 처리로 인하여 콜라겐 1A의 발현양은 증가하고, MMP-1, MMP-13의 발현을 감소시켜 피부 주름 형성억제에 도움을 주는 것을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims (13)

  1. (1) 고장초에 물을 첨가하고 열수 침지하는 단계;
    (2) 상기 단계 (1)에서 열수 침지 후 냉각한 침지물에, 알파-아밀리아제(α-Amylase), 베타-갈락토시다아제(β-Galactosidase), 자일라나아제(Xylanase), 락타아제(Lactase), 리파아제(Lipase), 탄나아제(Tannase), 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(Hemicellulase), 펙티나아제(pectinase) 및 베타-글루코시다아제(β-Glucosidase)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 효소를 처리하여 반응시킨 뒤 여과하여 효소 처리 추출물을 얻는 단계;
    (3) 상기 단계 (2)에서 여과하고 남은 잔사에 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 및 이들의 혼합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 용매로 추출하여 2차 추출물을 얻는 단계; 및
    (4) 상기 단계 (2)의 효소 처리 추출물과 상기 단계 (3)의 2차 추출물을 혼합한 후 농축 또는 건조하는 단계를 포함하는 고장초 효소 처리 추출물의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (1)에서, 열수 침지는 고장초 1 중량부에 대하여 1 내지 100 중량부의 물을 첨가하고, 20℃ 내지 130℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 고장초 효소 처리 추출물의 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (2)에서, 상기 침지물 100 중량부 대비 0.1 내지 80 중량부의 효소를 처리하는 것을 특징으로 하는 고장초 효소 처리 추출물의 제조방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (2)에서, 효소를 처리하고 10℃ 내지 90℃에서 5분 내지 120시간 동안 반응시키는 것을 특징으로 하는 고장초 효소 처리 추출물의 제조방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (2)에서, 베타-글루코시다아제, 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제의 3가지 효소를 동시에 처리하는 것을 특징으로 하는 고장초 효소 처리 추출물의 제조방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (2)에서, 효소는 고장초에 포함되어 있는 플라보노이드 배당체를 플라보노이드 비배당체로 전환하는 것을 특징으로 하는 고장초 효소 처리 추출물의 제조방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (3)에서, 상기 잔사 1 중량부에 대하여 1 내지 100 중량부의 물 또는 알코올 수용액을 용매로 하여 20℃ 내지 130℃에서 10분 내지 100시간 동안 추출하는 것을 특징으로 하는 고장초 효소 처리 추출물의 제조방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (4)에서, 혼합물을 농축하여 농축액을 얻거나, 농축액을 건조하여 분말 형태의 추출물을 얻는 것을 특징으로 하는 고장초 효소 처리 추출물의 제조방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 고장초 효소 처리 추출물은 0.01 중량% 내지 90 중량%의 트리신을 포함하는 것을 특징으로 하는 고장초 효소 처리 추출물의 제조방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 제조방법으로 제조된 고장초 효소 처리 추출물을 유효성분으로 포함하고, 상기 고장초 효소 처리 추출물은 0.01 중량% 내지 90 중량%의 트리신을 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용도가 미백용, 주름 개선용, 염증 개선용, 알러지 개선용 또는 보습용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
  12. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 제조방법으로 제조된 고장초 효소 처리 추출물을 유효성분으로 포함하고, 상기 고장초 효소 처리 추출물은 0.01 중량% 내지 90 중량%의 트리신을 함유하는 것을 특징으로 하는 건강기능 식품 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 건강기능 식품 조성물은 용도가 미백용, 주름 개선용, 염증 개선용, 알러지 개선용 또는 보습용인 것을 특징으로 하는 건강기능 식품 조성물.
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