CN114685694A - 一种茭白中性多糖及其制备方法 - Google Patents

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吴舒烨
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张真庆
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Abstract

本发明公开了一种茭白中性多糖及其制备方法，其制备工艺包括下述步骤：茭白切片、烘干、粉碎后，经乙醇提取去除脂质杂质后，利用纯水加热回流提取，得茭白水提液；将所得茭白粗多糖，加入淀粉酶除去淀粉，经膜过滤浓缩后，加入乙醇沉淀；离心，取沉淀，复溶后，去除蛋白，得到茭白粗多糖；茭白粗多糖溶解后，上样到弱阴离子交换树脂柱，吸附去去除酸性多糖，收集不保留的中性多糖，经浓缩、透析、离心、冷冻干燥得精制茭白中性多糖。所制备的茭白中性多糖具有明确的结构和多种潜在应用价值，可用于功能食品开发，以及用作化妆品和医药辅料。

Description

一种茭白中性多糖及其制备方法
技术领域
本发明属于中药和保健品技术领域，涉及一种茭白中性多糖及其制备方法。
背景技术
茭白(Zizania latifolia)，古称菰，为禾本科菰属(Zizania Linnaeus)多年生水生宿根草本植物，喜沼泽多湿环境，原产于中国和东南亚。我国茭白品种资源丰富，主要分布在淮河流域以南，是我国仅次于莲藕的第二大水生蔬菜。除了作为蔬菜食用之外，传统方剂和现代医学认为茭白还有一定的保健和药用功能，例如可以止渴、开胃、预防高血压和动脉硬化等。茭白营养丰富，富含多种矿物质和维生素，目前国内茭白品种众多，品质差异也较大，不同茭白品种在木质素、可溶性蛋白、游离氨基酸、糖类物质等综合品质上存在显著性差异。茭白肉质茎内含有丰富的膳食纤维，能有效防治肠道疾病，目前国内对茭白的研究相对不足，茭白应用范围虽广，但单开发程度却比较低。在日本，茭白早已被开发成各种保健食品和化妆品。对茭白的化学成分进行深层次挖掘的意义较大，目前对茭白的化学成分研究多集中于小分子黄酮类化合物上，对茭白多糖的研究如结构相对较少。品种的多样性和制备提纯工艺的差异性，造成多糖制备种类的差异性，所含单糖的结构、组成及含量不同，可能会导致多糖空间结构差异，从而导致生物活性不同。多糖由于组成糖单元种类繁多，糖单元之间的连接方式复杂，结构作为功能活性的基础，深入阐释多糖结构，能为进一步的结构活性关系研究提供明确的支撑，进而为天然多糖深入开发和结构改造，提供理论支撑。因此，需要加大对茭白多糖的研究，区分提取和纯化步骤，并测定多糖的单糖组成及其结构表征，为后续探究生物活性与机制打下基础。
现代药理学研究表明发现，茭白多糖表现出良好的自由基清除，抗氧化和免疫调节等功效。纵观目前茭白多糖的研究现状，发现存在单个多糖成分与结构解析较少、相关化合物的提取和含量测定研究不足、大部分活性作用机制与结构的关系尚不明确等需要解决的问题。因此，为了进一步开发茭白多糖的药用价值，需要对茭白化学组分、多糖制备工艺、单一组分结构、药理作用及其关系进行深入系统研究。
因此，有必要研发一种茭白中性多糖及其制备方法。
发明内容
本发明目的是提供一种茭白中性多糖及其制备方法，解决上述问题。
本发明的技术方案是：
一种茭白中性多糖，所述茭白中性多糖的分子量为103kDa、所述茭白中性多糖中的单糖为葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖，所述葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖的摩尔比为76.68：10.22：7.48：5.61，所述茭白中性多糖的主链以→3)-β-D-Glcp-(1→和→4)-β-D-Glcp-(1→为连接，主链葡萄糖残基摩尔比为25.44：54.45，支链以→4,6)-β-D-Glcp-(1→和→3,6)-β-D-Glcp-(1→为连接，支链葡萄糖残基摩尔比为1.40：1.70，末端为β-D-Glcp-(1→，所述茭白中性多糖的结构式为：
Figure BDA0003628117690000021
本发明的另一种技术方案是：
一种茭白中性多糖的制备方法，该方法包括：
(1)提取：将茭白切片，在温度为60℃的条件下烘干6～8h，粉碎过200目筛后，获得茭白粉末，所述茭白粉末经乙醇提取去除脂质杂质后，获得提纯粉末，利用纯水加热回流提取，得到茭白水提液；
(2)初步纯化：在所述茭白水提液中加入淀粉酶，除去淀粉，获得茭白多糖溶液，经超滤膜过滤浓缩去除小分子物质后，加入乙醇沉淀；在转速为3500rpm的条件下离心15min，取沉淀，加去离子水搅拌充分溶解后，去除蛋白，得到茭白粗多糖；
(3)精制：将所述茭白粗多糖溶解后，上样到弱阴离子交换树脂柱，吸附去除酸性多糖，收集水洗脱的中性多糖，经减压浓缩、透析、在转速为4500rpm的条件下离心15min、冷冻干燥得到精制茭白中性多糖。
进一步的，在步骤(1)中，所述茭白粉末经乙醇提取去除脂质杂质的具体过程为：在所述茭白粉末中加入浓度为75％～95％的乙醇，在温度为65℃的条件下回流提取1.5h，其中，所述茭白粉末与所述乙醇的重量体积比为1g：10mL。
进一步的，在步骤(1)中，所述利用纯水加热回流提取的具体过程为：所述提纯粉末与所述纯水按料液重量体积比为1g：20mL的比例混合，在温度为100℃的条件下提取时间3h，重复三次。
进一步的，在步骤(2)中，所述在所述茭白水提液中加入淀粉酶除去淀粉的具体过程为：在所述茭白水提液中加入去离子水，在温度为80℃的条件下以400～600rpm的转速搅拌，直至完全溶解，加入耐高温淀粉酶，在温度为85℃的条件下搅拌2h，获得茭白多糖溶液，其中，所述茭白水提液中多糖与所述耐高温淀粉酶的重量体积比为1g：1mL～1g：1.2mL。
进一步的，在步骤(2)中，所述加入乙醇沉淀的具体过程为：在所述茭白多糖溶液中加入无水乙醇，直至溶液中乙醇的体积分数为75％。
进一步的，在步骤(2)中，所述去除蛋白的具体过程为：在所述茭白多糖溶液中加入Sevage试剂，离心取上层水溶液，重复步骤多次，其中，所述茭白多糖溶液与所述Sevage试剂的料液体积比为1：5。
进一步的，在步骤(3)中，所述弱阴离子交换树脂柱中的弱离子交换树脂为琼脂糖、葡聚糖、聚甲基丙酰胺基质中的任意一种，表面键合相为二乙基氨基乙基。
进一步的，在步骤(3)中，所述透析的截留分子量＞3.5kDa。
本发明提供了一种茭白中性多糖及其制备方法，从茭白中提取并纯化得到单一组分纯多糖，并通过结构鉴定得出其结构单元和基本组成，为茭白多糖的深度开发及其药理作用研究提供参考，该方法工艺操作简单、成本低、温和，采用该方法制备的茭白中性多糖纯度高、化学组分清晰、多糖结构明确，该茭白中性多糖具有明确的结构和多种潜在应用价值，可用于功能食品开发，以及用作化妆品和医药辅料。
附图说明
图1为实施例1中茭白中性多糖的紫外光谱图；
图2为实施例1中茭白中性多糖的单糖组成分析图；
图3为实施例1中茭白中性多糖的扫描电镜图；
图4为实施例1中茭白中性多糖的一维核磁共振波谱图(1H-NMR，13C-NMR)；
图5为实施例1中茭白中性多糖的二维核磁共振波谱图(1H-1H COSY图，1H-1HTOCSY图，1H-13C HSQC图，1H-13C HMBC图，1H-1H ROESY图)。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种茭白中性多糖的制备工艺，所制备的茭白中性多糖，分子量为103kDa、单糖组成摩尔比为葡萄糖：半乳糖：木糖：阿拉伯糖＝76.68：10.22：7.48：5.61组成，主链以→3)-β-D-Glcp-(1→和→4)-β-D-Glcp-(1→为连接、主链葡萄糖残基摩尔比为25.44:54.45、支链以→4,6)-β-D-Glcp-(1→和→3,6)-β-D-Glcp-(1→连接，支链葡萄糖残基摩尔比为1.40:1.70、末端为β-D-Glcp-(1→。茭白中性多糖结构为：
Figure BDA0003628117690000051
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
步骤1：提取。
将市售茭白去皮，切片，晾晒并烘干，粉碎，过200目筛，收取细粉。取1000g细粉，加入75％乙醇10L，65℃回流提取1.5h，过滤取滤渣；重复回流提取一次，以除去小分子糖类、脂类等杂质。
回流结束后，将醇不溶性固体粉末于65℃烘箱内烘干，备用。
取烘干的醇不溶性固体粉末500g，按照1：20的料液比加入10L去离子水，100℃沸水提取3小时，离心(4500rpm 15min，下同)分离液体和固体粉末；重复提取3次。
合并3次提取所得的滤液，将滤液过滤，以除去不溶性颗粒物，4℃冰箱保存。
步骤2：初步纯化。
超滤浓缩。采用膜截留分子量规格为10kDa的超滤膜，在保证压力不超过超滤组件最大压力0.1MPa情形下，以最大流速进行超滤截留浓缩。待样本体积浓缩至原液体积的1/10左右时，向浓缩液中加入10倍体积的去离子水再次进行超滤；重复以上操作2次，尽可能完全去除茭白水提液中的小分子物质，最终浓缩至1L左右。
醇沉得粗多糖。将无水乙醇加入到上述的1L左右的浓缩液中醇沉干燥，边加边搅拌，调节最终的醇浓度为75％，4℃冰箱过夜沉淀，离心(3500rpm15min)，取沉淀，60℃烘箱中烘干，即得茭白粗多糖。
将粗多糖5.8g，溶于500mL去离子水中，加热到80℃，搅拌使其充分溶解，加入耐高温淀粉酶6mL(约180U)除淀粉，于85℃条件下维持2h。选用0.1mol/L碘液测试直至除淀粉完成。
用1M盐酸调节溶液pH为4-5之间，离心，取上清液，用1M氢氧化钠溶液将溶液pH调至中性，旋蒸浓缩至200mL左右。
向上述溶液中加入40mL Sevage试剂(氯仿：正丁醇＝5：1)以除蛋白，分液漏斗内充分摇匀10min，离心，取上层水溶液，弃蛋白层和有机试剂层，重复以上步骤4次，旋蒸浓缩，彻底除去有机溶剂。
加入少量去离子水溶解后，装于截留分子量为3.5kDa的透析袋内，连续透析三天。
步骤3：精制。采用苏州汇通色谱分离纯化有限公司层析柱，DEAE-纤维素(2.6×30cm)纯化。
多糖样本制成50mg/mL的样本溶液，涡旋使得充分溶解后，离心(10000rpm，15min)，取上清5mL并过0.22μm水系滤膜后进样，中压制备液相流速8mL/min，收集水洗脱液，即为茭白中性多糖。
减压浓缩，3.5kDa透析袋透析，离心、冷冻干燥样本，冻干后样本称重，阴凉干燥处保存。
经测定，茭白中性多糖的蛋白含量0.6％，总糖含量90.65％。
对实施例1中所得的产品分别进行紫外分析、单糖组成分析、扫描电镜形态分析、红外分析、甲基化测试、核磁共振分析。
(1)紫外分析
取样本2mg，加入4mL去离子水，涡旋制成0.5mg/mL的样本溶液，以去离子水为空白对照，采用紫外分光光度计于190-700nm波长范围内进行全波长扫描，观察样本的吸收情况。请参阅图1，图1为实施例1中茭白中性多糖的紫外光谱图。如图1所示，其在280和260nm处不存在吸收，表示此茭白中性多糖基本不存在蛋白和核酸类杂质。
(2)单糖组成分析
配制2M三氟乙酸(TFA)，在离心管中加入适量的超纯水，准确称量2.28gTFA，将溶液转至10mL容量瓶内进行定容。称量茭白中性多糖样本10mg溶解于1mL超纯水中，加入等体积配好的2M TFA溶液使样本终浓度为5mg/mL，TFA浓度为1M，转移样本至棕色降解瓶中，用保鲜膜封口，置于预热到100℃的鼓风干燥箱内，降解10h。
每瓶取适量体积的降解液，减压浓缩除去多余的TFA，定容，稀释到100ppm浓度后，微孔滤膜过滤后进行分析。
对降解产物中的单糖组成，采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测器(HPAEC-PAD)进行分析，用不同单糖标准品的保留时间进行比对，色谱柱：CarbopacPA1(4.6×250mm,Dionex,ThermoFisher,USA)，并且可以通过外标法对不同的单糖进行定量分析。色谱条件：前10分钟内，100％A相等度洗脱，后30min，B相从0％升到100％进行梯度洗脱；柱温：30℃；进样体积：20μL；流速：1mL/min。请参阅图2，图2为实施例1中茭白中性多糖的单糖组成分析图。如图2所示，此茭白多糖为中性糖组分，以葡萄糖为主要单糖，含有极少量的岩藻糖，鼠李糖，阿拉伯糖，半乳糖和木糖，部分单糖摩尔比为葡萄糖：半乳糖：木糖：阿拉伯糖＝76.68：10.22：7.4：5.61。
(3)分子量测定
称量多糖组分10mg，溶解于1mL超纯水中，12000rpm离心取上清液过0.22μm微孔滤膜后，采用体积排阻色谱串联十八角度激光散射仪-示差折光检测器(GPC-MALLS-RI)进行分析。色谱条件：色谱柱：TSK-G4000PWxl色谱柱(7.5×300mm，日本TOSOH公司)；流动相：80％80mM醋酸铵+20％甲醇等度洗脱；流速：0.1mL/min；进样量：10μL；dn/dc(mL/g)＝0.1380；柱温：35℃。实验表明，此茭白中性多糖，数均分子量为28.3kDa，重均分子量为103kDa。
(4)扫描电镜分析
按照EVO 18扫描电镜的仪器说明要求拍摄样本的扫描电镜图，操作步骤简述如下：在金属导电盘山贴上具有粘性的双面导电胶带，取适量冻干样本粉末平铺于导电胶带上，详细记录样本所在位置的编号，于真空条件下对样品表面进行喷金操作，制样完毕后，将样本放入电镜仪器后，待真空度达到3×10-3以下后，进行样本图像拍摄。请参阅图3，图3为实施例1中茭白中性多糖的扫描电镜图。如图3所示，此茭白中性多糖冻干样本，组分之间连接紧密，存在明显的片状结构。
(5)红外分析
使用VERTEX 70红外光谱仪，采用衰减全反射(Attenuated Total Reflectance，ATR)的方法测定样本红外光谱图，操作步骤简述如下：打开红外光谱仪，连接好操作软件后，设置好仪器相关参数：光栅直径6mm，分辨率4cm-1，采集范围600-4000cm-1，用无水乙醇擦拭完ATR晶体表面，待乙醇挥发完全后，先扫描空白背景，然后扫描样品，记录样本红外光谱图。
实施例1中制得的茭白中性多糖在3337cm-1处存在大而宽的强吸收峰，此为糖单元环上-OH的伸缩振动峰，多糖作为多羟基化合物，在3500cm-1附近会有一个宽广的吸收峰；在2928cm-1处也存在吸收峰，此处的吸收峰归属于-CH的伸缩振动；在1148cm-1存在吸收峰，此为糖环上C-O-C的弯曲振动吸收峰，吸收峰1021cm-1和961cm-1属于C-O和C-H伸缩振动及C-O弯曲振动峰，899cm-1属于β-吡喃糖环上糖苷键C-H的变形振动吸收峰，表明此多糖是主要含有β糖苷键连接的聚糖。
(6)甲基化测试
称取糖样本，参与甲基化反应，后酸碱水解，进行GC-MS检测。测试条件为：毛细管柱HP-5，程序升温50-250℃，10℃/min，进样口温度为260℃，N2流苏1mL/min。测定甲基化产物。请参阅表1，表1为实施例1中甲基化产物GC-MS分析表，如表1所示，此茭白中性多糖中，存在大量葡萄糖糖残基，总比例高达93％，可能是种高度分支的葡聚糖，主要为1,4-Glc，1,3-Glc，1,4,6-Glc，1,3,6-Glc，1,6-Glc及t-Glc六种类型的葡萄糖残基，其中1,4-Glc，1,3-Glc的比例也比较高，分别为54.5％和25％，说明此多糖可能主要通过1,4和1,3糖苷键相连形成多糖链，含量相对少的1,4,6-Glc，1,3,6-Glc组成支链。
Figure BDA0003628117690000091
表1
(7)核磁共振分析
称取样本20mg，用95％D2O配制成5％浓度的溶液，搅拌过夜使其充分溶解，冷冻干燥，然后用99％D2O溶解冻干样本，于298K和323K温度下，进行一维，二维核磁共振实验，1H谱分析时外磁场频率为600MHz，扫描次数16次，TSP定标零点，13C谱分析时，外磁场频率为150MHz，扫描次数10240次，二维核磁同核相关谱：1H-1H相关谱(1H-1H COSY，1H-1H TOCSY，1H-1H ROESY，1H-1H NOESY)，请参阅图4，图4为实施例1中茭白中性多糖的一维核磁共振波谱图(1H-NMR，13C-NMR)。如图4所示，依据糖化学位移特性，表示此多糖含β构型的吡喃葡萄糖残基，具体碳氢归属请参阅表2，表2为茭白中性多糖核磁共振氢谱和碳谱的化学位移归属表，如表2所示，编号残基中碳氢化学位移归属标识在图4中；二维核磁异核相关谱：1H-13C相关谱(1H-13C HSQC，1H-13C HMBC，1H-13C HSQC-TOCSY)，进一步对结构进行解析，帮助表2的整合。请参阅图5，图5为实施例1中茭白中性多糖的二维核磁共振波谱图(1H-1H COSY图，1H-1H TOCSY图，1H-13C HSQC图，1H-13C HMBC图，1H-1H ROESY图)。如图5所示，茭白中性多糖中的葡聚糖属于β-构型的葡聚糖，葡萄糖残基主要有5种类型，分别为→3)-β-D-Glcp-(1→，→3,6)-β-D-Glcp-(1→，→4)-β-D-Glcp-(1→，→4,6)-β-D-Glcp-(1→，β-D-Glcp-(1→，与甲基化结果具有较好的一致性，根据甲基化给出的相关糖残基的比例关系，最终推测糖链结构。
Figure BDA0003628117690000101
Figure BDA0003628117690000111
表2
综合对茭白中性多糖的紫外光谱、单糖组成、分子量、甲基化分析及核磁共振测定及分析结果，推测此多糖的特征为：
1)茭白中性多糖，单糖组成及摩尔比为：葡萄糖：半乳糖：木糖：阿拉伯糖＝76.68：10.22：7.48：5.61；
2)茭白中性多糖主链以→3)-β-D-Glcp-(1→和→4)-β-D-Glcp-(1→为连接，主链葡萄糖残基摩尔比为25.44:54.45；支链以→4,6)-β-D-Glcp-(1→和→3,6)-β-D-Glcp-(1→连接，支链葡萄糖残基摩尔比为1.40：1.70；末端为β-D-Glcp-(1→。
实施例2
步骤1：提取。乙醇提取回流采用95％乙醇。
步骤2：初步纯化。膜过滤，超滤膜截留分子量规格为3kDa。
步骤3：精制。采用苏州汇通色谱分离纯化有限公司层析柱，DEAE Sepharose FF树脂填料纯化。
其他实验步骤同实施例1。
实施例3
步骤1：提取。乙醇提取回流采用75％乙醇。
步骤2：初步纯化。膜过滤，超滤膜截留分子量规格为3kDa。
步骤3：精制。采用苏州汇通色谱分离纯化有限公司层析柱，DEAE Sephadex A-25树脂填料纯化。
其他实验步骤同实施例1。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.一种茭白中性多糖，其特征在于：所述茭白中性多糖的分子量为103kDa、所述茭白中性多糖中的单糖为葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖，所述葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖的摩尔比为76.68：10.22：7.48：5.61，所述茭白中性多糖的主链以→3)-β-D-Glcp-(1→和→4)-β-D-Glcp-(1→为连接，主链葡萄糖残基摩尔比为25.44：54.45，支链以→4,6)-β-D-Glcp-(1→和→3,6)-β-D-Glcp-(1→为连接，支链葡萄糖残基摩尔比为1.40：1.70，末端为β-D-Glcp-(1→，所述茭白中性多糖的结构式为：
Figure FDA0003628117680000011
2.一种茭白中性多糖的制备方法，其特征在于，包括步骤：
(1)提取：将茭白切片，在温度为60℃的条件下烘干6～8h，粉碎过200目筛后，获得茭白粉末，所述茭白粉末经乙醇提取去除脂质杂质后，获得提纯粉末，利用纯水加热回流提取，得到茭白水提液；
(2)初步纯化：在所述茭白水提液中加入淀粉酶，除去淀粉，获得茭白多糖溶液，经超滤膜过滤浓缩去除小分子物质后，加入乙醇沉淀；在转速为3500rpm的条件下离心15min，取沉淀，加去离子水搅拌充分溶解后，去除蛋白，得到茭白粗多糖；
(3)精制：将所述茭白粗多糖溶解后，上样到弱阴离子交换树脂柱，吸附去除酸性多糖，收集水洗脱的中性多糖，经减压浓缩、透析、在转速为4500rpm的条件下离心15min、冷冻干燥得到精制茭白中性多糖。
3.根据权利要求2所述的一种茭白中性多糖的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述茭白粉末经乙醇提取去除脂质杂质的具体过程为：在所述茭白粉末中加入浓度为75％～95％的乙醇，在温度为65℃的条件下回流提取1.5h，其中，所述茭白粉末与所述乙醇的重量体积比为1g：10mL。
4.根据权利要求2所述的一种茭白中性多糖的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述利用纯水加热回流提取的具体过程为：所述提纯粉末与所述纯水按料液重量体积比为1g：20mL的比例混合，在温度为100℃的条件下提取时间3h，重复三次。
5.根据权利要求2所述的一种茭白中性多糖的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述在所述茭白水提液中加入淀粉酶除去淀粉的具体过程为：在所述茭白水提液中加入去离子水，在温度为80℃的条件下以400～600rpm的转速搅拌，直至完全溶解，加入耐高温淀粉酶，在温度为85℃的条件下搅拌2h，获得茭白多糖溶液，其中，所述茭白水提液中多糖与所述耐高温淀粉酶的重量体积比为1g：1mL～1g：1.2mL。
6.根据权利要求5所述的一种茭白中性多糖的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述加入乙醇沉淀的具体过程为：在所述茭白多糖溶液中加入无水乙醇，直至溶液中乙醇的体积分数为75％。
7.根据权利要求2所述的一种茭白中性多糖的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述去除蛋白的具体过程为：在所述茭白多糖溶液中加入Sevage试剂，离心取上层水溶液，重复步骤多次，其中，所述茭白多糖溶液与所述Sevage试剂的料液体积比为1：5。
8.根据权利要求2所述的一种茭白中性多糖的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述弱阴离子交换树脂柱中的弱离子交换树脂为琼脂糖、葡聚糖、聚甲基丙酰胺基质中的任意一种，表面键合相为二乙基氨基乙基。
9.根据权利要求2所述的一种茭白中性多糖的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述透析的截留分子量＞3.5kDa。
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