JP4098824B2 - グリコーゲンを物理化学的に製造する方法およびこの方法で得られるグリコーゲン - Google Patents
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岩波生物学辞典第4版、第354頁、岩波書店(東京)1996年3月21日発行 Yosiaki Takataら、J.Mar.Biotech.,6.pp208−213(1998)
この組成物は、[α]D+197゜の比旋光度、ならびに1H NMRスペクトルにおける5.37ppmおよび4.95〜5.33ppmのアノメリックプロトンピークで特徴付けられるグリコーゲンを含み得る。
小粒子状(2〜3mmφ)の田七人参91kg、クエン酸9kgおよび水550Lを加圧装置付きタンクに入れ、90〜96℃で1時間加熱した後、1.1kgf/cm2の加圧状態にして1時間保持した。得られた反応液を、NA500濾紙を装着した加圧濾過装置で濾過して抽出液を分取した。続いて、タンク内の田七人参の抽出残渣に、45重量%エタノール溶液700Lを加え、65℃、2時間加熱還流を行った。得られた反応液を、NA500濾紙を装着した加圧濾過装置で濾過してエタノール抽出液を分取した。このようにして得られたクエン酸抽出液とエタノール抽出液とを合わせ、濃縮し、そして得られた濃縮液からスプレードライ法により65.76kgのエキス末(フリーズドライ粉末)を得た。このようにして得られたエキス末中に存在する成分を分析した。表1はグリコーゲンの測定結果を示す。
実施例2で求めた1.1〜1.2kgf/cm2、35分間の加圧条件下において、クエン酸濃度を変化させてグリコーゲン生成率を比較した。クエン酸濃度を原料に対して5、6、7、8および9%と変化させたことを除いては、実施例2と同様の処理を行った。その結果を表2に示す。表2に示されるように、9%のクエン酸添加量において、41.4%というグリコーゲン生成率の最高値が示された。
さらに、植物起源の原料について、本発明の抽出法によるグリコーゲン量の生成増加を確認するために、各種糖類を原料として用い、実施例2と同様の方法により処理してグリコーゲン量を測定した。表3に結果を示す。
バレイショデンプンにクエン酸を添加した試料と、添加しなかった試料を調製した。両試料は、白沈不溶物が存在する白濁水溶液として得られた。両試料を、1.1kfg/cm2、35分間の加圧処理すると、クエン酸添加試料は不溶物のないサラサラした液体となったが、クエン酸を添加しなかった試料は透明になったが不溶物がなお残存していた。そこで、クエン酸を添加しなかった試料では残存する不溶物を遠心分離により除去して透明な試料液を得た。
トウモロコシデンプンについてもバレイショデンプンと同様に、クエン酸を添加した試料と、クエン酸を添加しなかった試料とを調製した。加圧反応後は、両試料ともゲル状となり、溶液部と沈殿物との分離ができなかったので、両試料に、直接エタノールを45%となるように注加し、1時間加温した。その結果、クエン酸を添加した試料では、サラサラの不溶物が得られ、濾過によってこれを分離除去して溶液部を得た。クエン酸を添加しなかった試料では、連続布状の不溶物が生じた。これを、ガラス棒に巻き付けて除去し澄明な溶液部を得た。それぞれの溶液部を、一定量まで濃縮した後、フリーズドライによってエキス末を得た。得られたエキス末中のグリコーゲンを定量した。その結果、クエン酸を添加しなかった場合、エキス末中にはグリコーゲンは全く認められなかったのに対し、クエン酸添加の場合、12.02%のグリコーゲンが認められた。
表3に示されるように、可溶性デンプンについては、本発明の抽出法により0.82%のグリコーゲンが生成した。
セルロース、プルランおよびデキストランについては、本発明の抽出法により0.65%、36.78%および71.26%のグリコーゲンが生成した。デキストランの場合、加圧処理後と、45%のエタノール溶液添加後の加熱処理との両反応後の溶液が2層に分離したので、上層部および下層部の溶液をそれぞれ分離した後濃縮して凍結乾燥粉末を得た。上層部および下層部の凍結乾燥粉末中には、それぞれ32.60%および38.66%、合計71.26%のグリコーゲンが存在した。
一方、3糖類のラフィノース、2糖類のマルトース、トレハロースおよびスクロース、ならびに単糖類のグルコースを用いた場合、ラフィノースとマルトースでは本発明の抽出法によりそれぞれ0.39%および0.28%のグリコーゲンが認められたが、トレハロース、スクロース、およびグルコースを原料として用いた場合、グリコーゲンは測定されなかった。
カキエキス50%、実施例2と同様の条件で得た田七人参エキス末28.9%およびラブリワックス3%を混合篩過した後、乳糖20%、第三リン酸カルシウム1%およびショ糖脂肪酸エステル2.0%を加えて良く混合した。これを打錠したのち、シェラックコーティングしてポリシングを行って、錠剤型の食用組成物を試作した。
実施例2と同様の条件で得た田七人参エキス末62.5%と、マルチトール12.2%とを予備配合したのち、プルラン0.5%を加えて予備顆粒(水分1〜2%含有)とした。この予備顆粒に、発酵ウコン16.8%とラブリワックス8%とを加え、その都度良く混合した後、さらに本配合をおこなって打錠化した。この錠剤を、イーストラップおよびグリセリンでコーティングして錠剤型の食用組成物を試作した。
ビタミンE10.0重量%、マルトース6.6重量%、およびリン酸カルシウム1.6重量%相当量を混合機によって混合して予備配合末を作成し、これを、実施例2と同様の条件で得た田七人参エキス末20.9重量%、でんぷん10重量%および乳糖−粉末セルロース45重量%とをよく混合して篩過した。これを混合機に投入し、さらにショ糖脂肪酸エステル5重量%、リン酸カルシウム0.9重量%および乳糖−粉末セルロース5重量%を入れて混合した。この粉末を、打錠機で打錠後シェラックコーティングしてポリシングを行って、錠剤型の食用組成物を試作した。
実施例2と同様の条件で得た田七人参エキス末48.99重量%、ビタミンC8.6重量%、ビタミンB6塩酸塩0.12重量%、蔗糖エステル5重量%および結晶セルロース6.04重量%を混合し、これに、31.25重量%還元麦芽糖水溶液を配合して打錠化した後、シェラック10重量%エタノール溶液を錠剤に対して7〜8%となる液量で添加し、これを噴霧してシェラックコーティングを行って食用組成物を試作した。
1.バレイショデンプンおよびデキストランからの精製グリコーゲンの調製
実施例5のi)のようにして得た、バレイショデンプン由来のグリコーゲン含有粉末20gを、精製水200mLに溶かすと完全に溶解した。この無色の溶液を95℃で20分間加熱した後室温で放冷し、次いで、5℃で1.5時間冷却した。溶液中僅かに白濁が認められたので、8,500rpm、6分間遠心分離を行ってこの白濁物質を除去した。得られた上清を5℃に冷却した後、5%になるようにトリクロロ酢酸を加え、5℃で1夜放置した。次いで、遠心分離(8,500rpm、6分間)で沈殿を除去し、得られた上清を3倍容のメタノールに注加して生じる沈殿を遠心分離(8,500rpm、10分間)で集めた。得られた沈殿を、メタノールおよびエーテルで順次洗浄した。この沈殿物を、真空乾燥器中、室温下で2時間乾燥して粗グリコーゲンを得た。
実施例1のようにして得た、田七人参から得たグリコーゲン含有粉末30gを、精製水300mLに溶かすと不溶物が生じたので、遠心分離(8,500rpm、6分間、10℃)によってこの不溶性物質を取り除き褐色の上清液を得た。この上清液を、95℃で20分加熱し、室温で放冷した後、5℃で1.5時間冷却した。ここで、溶液の濁度が増加したので、8,500rpm、6分間遠心分離を行って濁り成分を除去し上清液を得た。この上清液を5℃に冷却して、これに5%になるようにトリクロロ酢酸を加えて5℃で1夜放置した。次いで、遠心分離(8,500rpm、6分間)により沈殿を除去し、得られた上清液を3倍容のメタノールに注加した。ここで生じた淡褐色の沈殿を遠心分離で集めた。得られた沈殿をメタノールで洗浄した後、ジメチルスルホキド(DMSO)約200mLに溶解し、遠心分離(6,500rpm、10分、10℃)で不溶性物質を除去した後、得られた上清液に3倍容のエタノールを添加して再沈殿させた。このエタノール再沈殿による精製をさらに2度繰り返した。次に、DMSOの代わりに精製水を用いて同様の再沈殿による精製を2回繰り返した。得られた乳白色の沈殿を室温下で真空乾燥して24.7gの乾燥粉末を得た。この乾燥粉末20gを精製水140mLに溶かし、iso-アミルアルコール36mLとクロロホルム108mLとの混液を加えて穏やかに10時間振盪した。この溶液を静置した後に生じる水層を分取し、遠心分離(7,500rpm、30分、10℃)した。この除タンパク操作を、iso−アミルアルコール36mLとクロロホルム108mLの混液を加えて2回繰り返した後、帯黄白色溶液をセロハンチューブに入れ、1.4〜1.5Lの精製水に対して5℃下で3日間透析した。この間、1日ごとに精製水を新しく入れ換えた。得られた透析内液を凍結乾燥して精製グリコーゲン13.4gを得た(グリコーゲン含量69.0%;グリコーゲン収率11.9%)。この精製品は、赤紫色のヨード反応を呈した。
1.分子量
実施例10で得られた精製グリコーゲンの分子量をゲル濾過法によって測定した。
デンプン、デキストランおよび田七人参から得られた精製グリコーゲンをそれぞれ、3.16mg、3.32mgおよび3.33mgを秤量した。各々の精製グリコーゲンを1mLの精製水に溶解し、そのうち50μLをHPLC分析に供した。
HPLC分析条件は以下の通りである。
HPLC装置:紫外分光光度計検出器SPD-6A付きLC-7A(島津製作所製)。
カラム:Shodex Asahipak CS-620(50cm×7.6mmI.D.)(昭和電工製)
移動相:純水
移動相流速:0.8mL/分
検出波長:UV280nm
1.3.結果
標準物質としてプルランとグルコースオリゴマーを用いて作成した校正曲線を使って、HPLC分析における保持時間から各々の試料に含まれるグリコーゲンの分子量を測定した。各分析におけるHPLC分析のクロマトグラムの1例を図2に示す。図2の(a)は、デキストラン由来の精製グリコーゲン、図2の(b)は、田七人参由来の精製グリコーゲン、そして図2の(c)は、グリコーゲン由来の精製グリコーゲンのクロマトグラムをそれぞれ示す。なお、図2(a)(b)(c)のそれぞれにおいて、同じ試料について、左のクロマトグラムは紫外線分光光度計検出器による測定結果を、そして右のクロマトグラムは示査屈折計検出器による測定結果を示す。図2に示されるように、各試料は、異なる分子量をもつ複数分子種から構成されていることが明らかとなった。それらの分子量と全体に対する割合を表5に示す。
実施例10で得られた精製グリコーゲンの各0.1gを精密に量り、精製水を加えて20mLとした。各試料溶液について、層長200mmの測定管に入れて旋光度計(エルマ社製)を使用して比旋光度を測定した。
実施例10と同様にして得られた精製グリコーゲンを、1HNMR測定により特徴付けた。グリコーゲンはグルコースにより構成されるホモ多糖であり、グルコース由来のアノメリックプロトンのシグナルを指標として、グリコーゲンであると同定される。1HNMR測定は、以下のように行った。
デンプンおよびデキストラン由来の精製グリコーゲン溶液:それぞれ、11mg/0.65mLD2O溶液を調製した。グリコーゲン試薬(和光純薬製:標準物質)および田七人参由来の精製グリコーゲン:それぞれ10mg/0.65mL D2O溶液を調製した。
Varian社のUNITY INOVA 600型装置を以下の条件で用いた。
観測周波数 599.6MHz;温度 45℃;観測幅 6KHz;パルス幅 30°;パルス繰り返し時間 7秒。
(1)標準物質
グリコーゲン試薬(和光純薬製)では、5.39ppm付近と4.98ppm付近にアノメリックプロトンピークが観測された。アノメリックプロトンピークの一例を図3Aの(b)に示す。
図3Aの(a)に示すように、実施例10の2で得られた田七人参抽出エキス末からの精製グリコーゲンは、図3Aの(b)に示すグリコーゲン標準品(和光純薬)と同様に、5.38ppmのα1-4結合、4.96ppmのα1-6結合のアノメリックプロトンのピークを有し、グリコーゲンであることが確認された。田七人参抽出エキス末からの精製グリコーゲンと標準品との間で5.38ppmと4.96ppmのアノメリックプロトンの各シグナル高さ比を比較すると、田七人参抽出エキス末の精製グリコーゲンでは約10:1(70.9/7.1)、そして標準品では約20:1(80.2/4.4)であり、この差は、田七人参抽出エキス末からの精製グリコーゲンと標準品とでは、糖鎖構造における分岐度など、微細構造が異なっていることが示唆され、微細構造と抗腫瘍活性との関連性を示す、Yosiaki Takataら、J.Mar.Biotech.,6.pp208−213(1998)の報告を考慮すれば、この微細構造の差異が、田七人参の抗腫瘍活性に関連すると考えられた。また、不純物であると推定されるピークは、田七人参精製グリコーゲンでは、1.2ppmおよび2.7ppmに存在するのみであるのに対し、1〜3.3ppmに不純物であると推定されるピークが存在する標準品に比べ、その精製度が高いことが示された。α1−6結合は約10%であった。
デンプン由来の精製グリコーゲンでは、5.37ppm、5.33ppmおよび4.95ppmにアノメリックプロトンピークが観測され(図3Bの(d))、上記のグリコーゲン試薬のアノメリックプロトンピークと良く一致した。
デキストラン由来の精製グリコーゲンでは、主として4.97ppmにアノメリックプロトンピークが観測された(図3Bの(c))。このピークはα1-6結合に起因する。デキストランは、α1-6結合主体のグルコースホモ多糖であるため、α1-4結合に起因する5.3ppm付近のピークは小さいが、デキストラン由来のグリコーゲンでは、このピークは、さらに一層小さくなっていた。
実施例13と同様にして得られた各種糖質原料から得られた精製グリコーゲンの水溶液にジアスターゼを添加して精製グリコーゲンを酵素分解した。得られた各々の分解液を、シリカゲルプレートにスポットして、イソプロパノールと精製水(16:4)の混液を展開溶媒としてTLC分析を行った。展開終了後プレートを取り出し、室温乾燥して希硫酸溶液を噴霧して115℃で約3分加温した。
上記実施例10の2.に記載のようにして得た田七人参由来の精製グリコーゲンを、マウス腹腔内に投与し、インビボにおける肝機能改善機能を試験した。
インビボ試験は、ICR誘導雄マウス(MDS Pharm Services社製、体重22±2g)を用いて行った。
精製グリコーゲン、シリマリン(登録商標)(シグマ社製)を被験試料として用いた。シリマリンは、肝機能改善機能を示すポジティブコントロールである。グリコーゲンおよびシリマリンは、2%Tween80(登録商標)(和光純薬製)を含む0.9%食塩水中、所定の濃度となるように溶解して用いた。
精製グリコーゲンは、マウス1匹あたり300mg/kgまたは400mg/kg(グリコーゲン群)、コントロールとして、2%Tween80を含む0.9%食塩水を10mL/kg(コントロール群)、ポジティブコントロールのシリマリンは、100mg/kg(シリマリン群)をそれぞれ腹腔内に投与した。
1群あたり各5匹のICR誘導雄マウス(22±2g)を使用した。各マウスに、50%オリーブ油に溶かした四塩化炭素溶液(0.1mL/Kg)を1回注射して肝障害を誘導した。被験試料は、四塩化炭素投与の30分前、投与後4時間および8時間に300mg/kgまたは400mg/kgをそれぞれ腹腔内投与した。最後の投与の24時間後にマウスを屠殺して血液を採取し、血清GPT(SGPT)とGOT(SGOT)レベルを、常法に従い(それぞれGPT測定キットおよびGOT測定キット(和光純薬製)を用いる)、オートアナライザーにより分光光度法(紫外線法)で測定した。
表6に測定結果を示す。
被験試料として、上記実施例1に記載のようにして得た田七人参抽出エキス末を用いたことを除いて、実施例12と同じ方法で肝機能改善試験を行った。
Claims (8)
- グリコーゲンを製造する方法であって、デンプン、プルランまたはデキストランからなる群から選択される糖質原料を、酸性条件下で加熱・加圧する工程を包含する、方法。
- 前記加熱する工程が、有機酸存在下で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記有機酸が、クエン酸である、請求項2に記載の方法。
- 前記加熱する工程が、前記糖質原料に対する重量が約10%のクエン酸存在下で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記加熱する工程が、加圧下で行われる、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法によって製造されるグリコーゲンを含む組成物であって、320,000の分子量をもつグリコーゲン、および3,000の分子量をもつグリコーゲンを含み、該3,000の分子量をもつグリコーゲンを主成分として含み、[α] D +197゜の比旋光度、ならびに 1 H NMRスペクトルにおける5.37ppmおよび4.95〜5.33ppmのアノメリックプロトンピークで特徴付けられる、組成物。
- 請求項1に記載の方法によって製造されるグリコーゲンを含む組成物であって、280,000の分子量をもつグリコーゲン、および9,000の分子量をもつグリコーゲンを含み、[α] D +178゜の比旋光度、ならびに 1 H NMRスペクトルにおける4.97ppmおよび5.22〜5.33ppmのアノメリックプロトンピークで特徴付けられる、組成物。
- 請求項6または7に記載の組成物を含む食品。
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