KR101159699B1 - 항미생물제 및 항미생물성 조성물 - Google Patents

항미생물제 및 항미생물성 조성물 Download PDF

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Abstract

p-하이드록시벤즈알데히드, 5, 7, 4'-트리하이드록시-3', 5'-디메톡시플라본, 3-하이드록시피리딘, 및 바닐린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 유효성분으로 하는 항미생물제 및 이를 함유하는 항미생물성 조성물.

Description

항미생물제 및 항미생물성 조성물{ANTIMICROBIAL AGENT AND ANTIMICROBIAL COMPOSITION}
본 발명은 항미생물제 및 항미생물성 조성물에 관한 것이다.
조릿대 엑기스는 예전부터 항균성을 가지는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 창상 감염증의 원인균이 되는 세균인 황색 포도구균(Staphylococcus aureus), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 대장균(Escherichia coli)에 대한 항균 효과(WO 00/067707, 일본 특허공개 2003-201247)나, 위궤양의 원인균이 되는 파이로리균(Helicobacter pylori)에 대한 항균 효과가 보고되어 있다.
얼룩 조릿대는 벼과 조릿대속의 식물로, 일반적으로 산에서 자라는 조릿대를 얼룩 조릿대라고 하는데, 겨울이 되면 엽록이 하얗게 바랜 것을 총칭하여 말한다. 얼룩 조릿대와 조릿대는 다른 것으로, 얼룩 조릿대의 학명은 Sasa albo marginato Makino et Shibata이다. 현재는 거의 일본 전역에서 재배되고 있지만, 이것은 인위적으로 퍼진 것이다.
오래 전부터 얼룩 조릿대는 동양 의학의 '한방약'으로서 알려져 있는 인도의 김네마 실베스타, 중국의 구아바, 한국의 구기자와 어깨를 나란히 할 정도로 그 효능은 상당히 폭넓다. 일본에서도 위장병, 당뇨병, 고혈압 등의 전통적인 민간약(시바타 et al., 일본 약학회지, 98, 1436(1978); S, Okabe, K. Takeuchi, K. Takagi, M. Shibata, Jpn. J. Pharmacol., 25, 608(1975); 시바타 et al., 생약학 잡지, 34, 274(1980))으로서 이용되어 왔다. 또한, 조릿대 경단이나 치바키(대나무 잎으로 싼 떡) 등의 식품 포장재나 보건 강장제로서 이용되어 왔다.
전후, 동물 실험에 의해 얼룩 조릿대에 쥐의 간암에 대한 억제 활동이 있다는 것이 발견되어, 암 억제 활성의 면에서 몇 가지 약리학적 연구(M. Shibata, K. Kubo, M. Onoda, Folia Pharmacol. Jpn, 72, 531-541(1976))가 이루어져 왔다. 또한, 얼룩 조릿대가 갖는 우수한 방부 효과(N. V. Chuyen, T. Kurata, H. Kato, J. Antibact. Antifung, Agents, 11, 69-75(1983)), 항균 효과(N. V. Chuyen, H. Kato, Agric. Biol. Chem., 46, 2795-2801(1982)3-1128(2004))에 대해서도 연구가 이루어져 왔다. 그러나, 그 대부분은 기체 크로마토그래피에 의한 유기산의 분석에 지나지 않으며, 항균 효과의 본체의 단리 정제에 대한 보고예는 적다.
쿠마린산 및 그 유도체가 대장균, 황색 포도구균, 녹농균에 대한 항균성을 가지는 것도 알려져 있다(일본 특허공개 2004-359626).
또한, 얼룩 조릿대 엑기스에는 쿠마린산, 페룰린산, 카페인산, 바닐린 등의 페닐프로파노이드, 3-하이드록시피리딘 등이 포함되고, 이들 혼합물이 대장균, 황색 포도구균, 녹농균에 대한 항균성을 갖는 것도 알려져 있다(일본 특허공개 2006-36731).
본 발명자들은 얼룩 조릿대의 항균 효과의 본체를 해명하고, 그 항균 유효 성분을 특정하기 위하여, 얼룩 조릿대 잎의 열수 추출물을 각종 용매로 분획하였다. 다음으로 실리카겔 크로마토그래피로 분획한 후에, TLC에 의한 분취나 고속 액체 크로마토그래프 장치의 분취용 ODS컬럼을 이용하여 단리 정제를 수행하고, 또한, 각종 스펙트럼을 이용하여 단리한 화합물의 구조를 결정함과 동시에 13종류의 균에 대하여 항균 시험을 수행하였다. 그 결과, 상기 p-하이드록시벤즈알데히드, 5, 7, 4'-트리하이드록시-3', 5'-디메톡시플라본(이하, '트리신'이라고도 한다) 및 3-하이드록시피리딘, 트랜스-p-쿠마린산(트랜스-p-하이드록시 계피산), 바닐린이 각종 미생물에 대하여 특이적으로 항미생물 활성을 나타내는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 항미생물제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 이 항미생물제를 함유하는 항미생물성 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 이하에 나타내는 항미생물제 및 이를 함유하는 항미생물성 조성물을 제공하는 것이다.
1. p-하이드록시벤즈알데히드, 5, 7, 4'-트리하이드록시-3', 5'-디메톡시플라본, 3-하이드록시피리딘 및 바닐린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 유효성분으로 하는 항미생물제.
2. 상기 미생물이 스트렙토코커스(Streptococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 대장균(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 예르시니아(Yersinia), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 바실러스(Bacillus) 및 칸디다(Candida)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 상기 1에 기재된 항미생물제.
3. p-하이드록시벤즈알데히드 및 5, 7, 4'-트리하이드록시-3', 5'-디메톡시플라본으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 유효성분으로 하는 항미생물제.
4. 상기 미생물이 스트렙토코커스(Streptococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 대장균(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 예르시니아(Yersinia), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 바실러스(Bacillus) 및 칸디다(Candida)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 상기 3에 기재된 항미생물제.
5. 3-하이드록시피리딘을 유효성분으로 함유하고, 상기 미생물이 폐렴구균(Sterptococcus pneumoniae), 화농성 연쇄구균(Sterptococcus pyogenes), 황색 포도구균(Staphylococcus aureus), 예르시니아(Yersinia enterocolitica), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 및 칸디다(Candida sp.)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 상기 1에 기재된 항미생물제.
6. p-하이드록시벤즈알데히드를 유효성분으로 함유하고, 상기 미생물이 폐렴구균(Sterptococcus pneumoniae), 화농성 연쇄구균(Sterptococcus pyogenes), 황색 포도구균(Staphylococcus aureus), 대장균(Escherichia coli), 살모넬라균(Salmonella sp.), 예르시니아(Yersinia enterocolitica), 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 세레우스균(Bacillus cereus), 고초균(Bacillus subtilis) 및 칸디다(Candida sp.)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 상기 1에 기재된 항미생물제.
7. 바닐린을 유효성분으로 함유하고, 상기 미생물이 폐렴구균(Sterptococcus pneumoniae), 화농성 연쇄구균(Sterptococcus pyogenes), 황색 포도구균(Staphylococcus aureus), 대장균(Escherichia coli), 살모넬라균(Salmonella sp.), 예르시니아(Yersinia enterocolitica), 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus), 세레우스균(Bacillus cereus), 고초균(Bacillus subtilis) 및 칸디다(Candida sp.)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 상기 1에 기재된 항미생물제.
8. 5, 7, 4'-트리하이드록시-3', 5'-디메톡시플라본을 유효성분으로 함유하고, 상기 미생물이 살모넬라균(Salmonella sp.) 및 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 상기 1에 기재된 항미생물제.
9. 상기 1 내지 8 중 어느 한 항에 기재된 항미생물제를 함유하는 항미생물성 조성물.
본 발명에 있어서 '미생물'이라 함은 세균, 방선균, 시아노박테리아, 고세균, 균류, 효모, 조류(藻類), 바이러스 등, 특히 인간을 포함한 동식물에 대하여 바람직하지 못한 영향을 미치는 것을 의미하는 것으로 한다.
본 발명의 항미생물제는 각종 미생물, 특히 스트렙토코커스(Streptococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 대장균(Escherichia), 살모넬라(Salmonella), 예르시니아(Yersinia), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas), 바실러스(Bacillus), 칸디다(Candida) 등, 더욱 구체적으로는 폐렴구균(Sterptococcus pneumoniae), 화농성 연쇄구균(Sterptococcus pyogenes), 장구균(Enterococcus faecalis), 황색 포도구균(Staphylococcus aureus), 대장균(Escherichia coli), 살모넬라균(Salmonella sp.), 예르시니아(Yersinia enterocolitica), 장염 비브리오(Vibrio parahaemolyticus), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 세레우스균(Bacillus cereus), 고초균(Bacillus subtilis), 칸디다(Candida sp.)에 대하여 높은 항미생물 활성을 갖는다.
본 발명자들은 얼룩 조릿대의 항균 효과의 본체를 해명하고, 그 항균 유효 성분을 특정하기 위하여, 얼룩 조릿대 잎의 열수 추출물을 각종 용매로 분획하였다. 다음으로 실리카겔 크로마토그래피로 분획한 후에, TLC에 의한 분취나 고속 액체 크로마토그래프 장치의 분취용 ODS컬럼을 이용하여 단리 정제를 수행하고, 또한, 각종 스펙트럼을 이용하여 단리한 화합물의 구조를 결정함과 동시에 13종류의 균에 대하여 항균 시험을 수행하였다. 그 결과, 상기 p-하이드록시벤즈알데히드, 5, 7, 4'-트리하이드록시-3', 5'-디메톡시플라본(이하, '트리신'이라고도 한다) 및 3-하이드록시피리딘, 트랜스-p-쿠마린산(트랜스-p-하이드록시 계피산), 바닐린이 각종 미생물에 대하여 특이적으로 항미생물 활성을 나타내는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
실험 재료는 일본 호오도 가부시키가이샤로부터 입수한 얼룩 조릿대 잎의 열수 추출물(Sasa albo-marginato)(상품명 TWEBS)을 이용하였다. 이 열수 추출물(이하, Sa라 한다) 10g을 에바포레이터로 용매 제거시킨 결과 고형분으로서 6.2g을 얻었다. 이로부터 원료인 얼룩 조릿대 잎의 열수 추출물은 38%의 수분을 함유하고 있는 것을 확인하였다.
이 열수 추출물을 이용하여 각종 용매로 분획를 수행하였다. 즉, 열수 추출물(Sa)을 초산에틸에 의한 추출 조작을 수행하여 얻어진 초산 에틸층을 용매 제거하여 초산 에틸 가용 획분(이하 Sa-1이라 한다)으로 하였다. 수층은 다시 n-부탄올로 추출 조작을 수행하여 동일한 처리로 n-부탄올 가용 획분과 수층을 각각 얻었다. 이 처리에 의해 얻은 초산 에틸 가용 획분(Sa-1), n-부탄올 가용 획분, 수층 및 원료인 열수 추출물(Sa)의 Staphylococcus aureus(황색 포도구균)에 대한 항균 시험을 수행하였다. 항균 시험에는 cup법이라는 방식을 이용하였다. cup법이라 함은, 먼저 균 배지 중심에 직경 7.32㎜의 컵을 두고 그 컵에 시료 용액을 적하함으로써 컵을 중심으로 시험 용액이 동심원상으로 퍼진다. 항균 작용이 있는 경우에는 균의 번식을 저지함을 나타내는 저지원이 형성된다. 즉, 항균 작용과 저지원의 크기에는 정(正)의 상관관계가 있기 때문에, 그 저지원의 크기로 항균 효과의 강약을 판정하는 방법이다. 각 분획 성분의 Staphylococcus aureus에 대한 항균 시험의 결과를 표 1에 나타낸다.
시험구 저지원 직경(㎜) 판정
블랭크 7.32 -
원료(Sa) 12.81 ++++
초산 에틸 가용 획분(Sa-1) 12.23 ++++
n-부탄올 가용 획분 8.37 +
수층 9.64 ++
판정의 표기는 항균 효과: ++++ 상당히 강함, ++ 있음, + 약간 있음, - 없음, 여기에서, 블랭크 7.32㎜는 컵의 직경이다.
항균 시험의 결과, 초산 에틸 가용 획분이 얼룩 조릿대 열수 추출물의 원액과 거의 동일한 항균 활성을 나타내었다. 한편, n-부탄올 가용 획분, 수층 획분의 항균 활성은 미미한 것이었다.
상기 항균 시험의 결과로부터 초산 에틸 가용 획분에 항균 활성이 국한되어 있다는 것을 확인하였으므로, 얼룩 조릿대 잎의 열수 추출물(Sa) 2.3㎏을 초산 에틸로 추출 조작을 수행하였다. 얻어진 초산 에틸층을 용매 제거하여 초산 에틸 가용 획분(Sa-1) 78g을 얻었다.
얻어진 Sa-1의 Staphylococcus aureus에 대한 항균 활성을 확인한 결과, 활성을 나타내었다.
Staphylococcus aureus(황색 포도구균)에 대한 항균 활성
항균 활성을 갖는 성분의 분획 정제
초산 에틸 가용 획분(Sa-1)의 분획
항균 활성을 나타낸 초산 에틸 가용 획분(Sa-1) 52g을 중성 실리카겔 크로마토그래피를 이용하여 분획하였다. 컬럼의 용출 용매는 단계적으로 용매의 혼합비를 변경해 가는 step wise 방식을 채용하였다. n-헥산/초산 에틸=5:5를 2.5L, 4:6, 3:7, 2:8로 각 1L씩, 메탄올만으로 2.5L를 사용하였다. 용출 성분의 분별은 TLC의 결과에 기초하였고, 그들의 스폿의 검출은 UV 254nm을 이용하였다. 그 결과, 초산 에틸 가용 획분을 7 프랙션으로 분획하였다. 7 프랙션은 각각 Sa-1-A(90㎎), Sa-1-B(250㎎), Sa-1-C(3.36g), Sa-1-D(3.00g), Sa-1-E(110㎎), Sa-1-F(1.56g), Sa-1-G(30.0g)으로 하였다.
먼저, Sa-1-C(3.36g)을 클로로포름 5mL에 용해시키고, 클로로포름과 동량의 n-헥산을 가하여 하룻밤 정치하였다. 그러면 두 층으로 분리되었으므로, 상층(이하, Sa-1-C(1)이라 한다)과 하층(이하, Sa-1-C(2)라 한다)으로 나누었다. 이 Sa-1-C(1)을 용매 제거하면 2.22g, Sa-1-C(2)는 1.14g이었다.
Sa-1-C(1)의 분석
Sa-1-C(1) 2.22g에 실리카겔 3.50g을 가하여 흡착시키고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분획하였다. 컬럼의 용출 용매에는 step wise 방식을 채용하고, 그 조성은 클로로포름/아세톤=20:1을 2L, 7:3, 6:4로 각 100mL씩, 아세톤만으로 500mL를 사용하였다. 그 회수에는 110개의 50mL 바이알을 이용하였다. 110개의 50mL 바이알로부터 TLC에 기초하여, 같은 위치에 스폿이 있었던 No. 21, 22의 바이알을 혼합하여 농축함으로써 농축물(이하, Sa-1-C(1)-a라 한다)을 얻었다. 이 농축물을 메탄올(0.5ml)에 녹이고, 고속 액체 크로마토그래프 장치(HPLC)의 분취용 ODS 컬럼을 이용하여 분획을 시도하였다.
No. 21, 22의 바이알 농축물(Sa-1-C(1)-a)의 HPLC 분취
용출 조건: 컬럼: Wakosil-II 5C18HG prep, φ20.0㎜×250㎜, 이동층: 20% 아세토니트릴 수용액, 유속: 5mL/min, 컬럼 온도: 30℃, 검출: UV 260nm
34.5분의 주요한 피크를 분취하여, 백색 고체(이하, Sa-1-C(1)-aa라 한다) 60㎎를 얻었다. 이 백색 고체(Sa-1-C(1)-aa)를 중메탄올로 1H, 13C NMR 스펙트럼을 측정하였다.
백색 고체(Sa-1-C(1)-aa)의 1H, 13C NMR 스펙트럼
Figure 112011034335037-pat00001
1H NMR 스펙트럼에 있어서 δ9.74에 수소 1개의 시그널과 13C NMR 스펙트럼에 있어서 δ192.8의 시그널을 관측한 것으로부터 알데히드기가 존재함이 시사되었다. 1H NMR 스펙트럼에 있어서 δ3.91의 시그널과 13C NMR 스펙트럼에 있어서 δ56.3의 시그널로부터 메톡시기가 존재하는 것이 시사되었다. 또한, 1H NMR 스펙트럼에 있어서 δ6.94(d, J=8.6Hz, 1H)와 δ7.42(d, J=8.6Hz, 1H), δ7.43(s, 1H)에 수소 3개분 및 13C NMR 스펙트럼에 있어서 δ111.2-154.6에 방향족환에 유래하는 6개의 시그널이 관측되었다. 또한, IR 스펙트럼에 있어서 3179㎝-1에 수산기의 특징적인 흡수를 확인하였다. 이상의 결과로부터 백색 고체(Sa-1-C(1)-aa)의 구조는 3-하이드록시-4-메톡시벤즈알데히드(바닐린)라고 추정하였다. 바닐린은 이미 알고 있는 화합물이므로 문헌값(The Aldrich Library of 13C and 1H FT NMR Spectra EDITION 1Volume 2, Aldrich Chemical Company, Inc.)과의 비교를 수행하고, 또한 이성체인 이소바닐린의 가능성도 있으므로 이 백색 고체(Sa-1-C(1)-aa)와 시약으로서 구입한 바닐린, 이소바닐린을 이용하여 고속 액체 크로마토그래프 장치(HPLC)의 분석용 ODS 컬럼으로 확인하여, 이 백색 고체(Sa-1-C(1)-aa)가 바닐린이라고 결정하였다.
다음으로 110개의 50mL 바이알로부터 TLC에 기초하여, 같은 위치에 스폿이 있었던 No. 48-55의 바이알을 혼합하여 농축함으로써 농축물(이하, Sa-1-C(1)-b라 한다) 152㎎를 얻었다. 이것을 다시 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분획을 수행하였다. 컬럼의 용출 용매에는 step wise 방식을 채용하여, 클로로포름만 200mL부터 시작하여, 클로로포름/아세톤=9.5:0.5를 200mL, 9:1, 8:2, 7:3, 아세톤만으로 각 100mL씩, 마지막으로 메탄올만으로 200mL를 사용하였다. 그 회수에는 42개의 50mL 바이알을 이용하였다.
42개의 50mL 바이알로부터 TLC에 기초하여, 같은 위치에 스폿이 있었던 No. 23-33의 바이알을 혼합하여 농축함으로써 농축물(이하, Sa-1-C(1)-ba라 한다) 102㎎을 얻었다. 이 농축물을 분취용 TLC를 이용하여 정제하였다. 전개 용매로는 클로로포름/아세톤=7/3을 사용하였다. 검출에는 UV 254nm을 이용하고, 긁어낸 실리카겔을 아세톤으로 용출하여 흡인 여과 후, 용매 제거하여 담황색 고체(이하, Sa-1-C(1)-baa라 한다) 86㎎를 얻었다. 이 담황색 고체(Sa-1-C(1)-baa)를 중메탄올로 1H, 13C NMR 스펙트럼을 측정하였다.
담황색 고체(Sa-1-C(1)-baa)의 1H, 13C NMR 스펙트럼
Figure 112011034335037-pat00002
1H NMR 스펙트럼에 있어서 δ9.76에 수소 1개의 시그널과 13C NMR 스펙트럼에 있어서 δ192.8의 시그널을 관측한 것으로부터 알데히드기가 존재함이 시사되었다. 또한, 1H NMR 스펙트럼에 있어서 δ6.92, 7.77에 수소 2개분으로 8.6Hz의 더블렛의 시그널이 인정되고, 13C NMR 스펙트럼에서는 δ116.8-165.1에 4개의 방향족 유래의 시그널이 관측됨으로써, 파라위에 치환된 방향족환으로 존재하는 것을 알 수 있다. 또한, IR 스펙트럼에 있어서 3168㎝-1에 수산기의 특징적인 흡수를 확인하였다. 이상의 결과로부터 담황색 고체(Sa-1-C(1)-baa)는 알데히드기와 수산기가 파라위에 치환된 p-하이드록시벤즈알데히드라고 생각하였다. 여기에서, 문헌값(The Aldrich Library of 13C and 1H FT NMR Spectra EDITION 1Volume 2, Aldrich Chemical Company, Inc.)과의 비교를 수행하여, 이 담황색 고체(Sa-1-C(1)-baa)는 p-하이드록시벤즈알데히드라고 결정하였다.
Sa-1-C(2)의 분석
Sa-1-C(2) 1.14g을 두 번의 재결정(아세톤/헥산)에 의해 옅은 황녹색 고체(이하, Sa-1-C(2)-a라 한다) 478㎎을 얻었다. 이 옅은 황녹색 고체(Sa-1-C(2)-a)를 중메탄올 1H, 13C NMR 스펙트럼을 측정하였다.
옅은 황녹색 고체(Sa-1-C(2)-a)의 1H, 13C NMR 스펙트럼
Figure 112011034335037-pat00003
1H NMR 스펙트럼에 있어서 δ6.81(d, J=8.6Hz, 2H) 및 7.45(d, J=8.6Hz, 2H)에 수소 4개분의 2개의 더블렛 시그널이, 13C NMR 스펙트럼에 있어서 δ115.6 및 131.1에 탄소 2개분의 큰 시그널이 2개 관측된 것으로부터 이 화합물은 파라위에 치환된 방향족환을 갖는 것으로 판단되었다. 또한, 1H NMR 스펙트럼에 있어서 δ6.28(d, J=16.0Hz, 1H) 및 7.61(d, J=16.0Hz, 1H)에 16.0Hz의 커플링 정수가 있는 수소가 각각 2개 관측된 것으로부터 트랜스위에 치환된 알켄이 1조 존재하는 것을 알 수 있었다. 또한, 13C NMR 스펙트럼에 있어서 δ171.0에 카보닐기의 존재가 확인되었다. 또한, IR 스펙트럼에 있어서 3168㎝-1에 수산기의 특징적인 흡수를 확인하였다. 이상의 결과로부터 이 옅은 황녹색 고체(Sa-1-C(2)-a)의 구조는 트랜트-p-쿠마린산이라고 판단하였다. 여기에서, 문헌값(The Aldrich Library of 13C and 1H FT NMR Spectra EDITION 1Volume 2, Aldrich Chemical Company, Inc.)과의 비교를 수행하여, 이 옅은 황녹색 고체(Sa-1-C(2)-a)는 트랜스-p-쿠마린산라고 결정하였다.
Sa-1-F의 분석
초산 에틸 가용 획분을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분획한 프랙션 중 Sa-1-F(1.56g)에 클로로포름을 가하여 잘 교반하고, 녹은 액층을 제거하였다. 그 후, 클로로포름에 녹지 않은 것에 대하여 아세톤을 가하여, 아세톤 가용의 액층(이하, Sa-1-F(1)이라 한다)과 아세톤 불용 고체층(이하, Sa-1-F(2)라 한다)으로 나누었다. Sa-1-F(1)은 용매 제거하여 162㎎, Sa-1-F(2)는 1.40g이었다.
Sa-1-F(1)의 분석
Sa-1-F(1) 162㎎에 다시 아세톤을 가하여 녹이고, 정치하였다. 그 후, 액층의 탁하지 않은 상층부만을 회수하였다. 아세톤 용매를 제거하여 노란색 고체(이하, Sa-1-F(1)-a라 한다) 10㎎을 얻었다. 고속 액체 크로마토그래프 장치(HPLC)의 분석용 ODS 컬럼을 이용하여 이 화합물의 순도를 확인한 결과, 순도는 상당히 높은 것을 알 수 있었다. 또한, UV 260nm에 있어서 강한 흡수를 갖는 것을 알 수 있었다.
이 노란색 고체(Sa-1-F(1)-a)를 중아세톤으로 1H, 13C NMR 스펙트럼을 측정하였다.
노란색 고체(Sa-1-F(1)-a)의 1H, 13C NMR 스펙트럼
Figure 112011034335037-pat00004
13C NMR 스펙트럼으로부터 탄소가 17개 존재하고, DEPt로부터 1급 탄소가 2개, 3급 탄소가 5개, 4급 탄소가 10개 존재하는 것을 확인하였다. 1H NMR 스펙트럼에 있어서 δ3.97(s, 6H)에 수소 6개분의 싱글렛 시그널이 13C NMR 스펙트럼에 있어서 δ56.9에 시그널이 관측된 것으로부터 2개의 등가인 메톡시기가 존재하는 것을 알 수 있다. 또한, IR 스펙트럼에 있어서 3357㎝-1에 수산기의 존재, 1615㎝-1에 수소 결합의 가능성이 있는 카보닐기의 흡수를 확인하였다. 또한, 질량 분석의 결과, 분자량은 330이고, C17H14O7의 가능성을 생각할 수 있었다. 이 노란색 고체(Sa-1-F(1)-a)가 하기의 식으로 5,7,4'-트리하이드록시-3',5'-디메톡시플라본이라고 생각하였다. 여기에서, 문헌값(C. Kong, X. Xu, B. Zhou, F. Hu, C. Zhang, M, Zhang, Phytochemistry, 65, 1123-1128(2004))과의 비교를 수행하여, 문헌값에 가까운 점에서 이 노란색 고체(Sa-1-F(1)-a)가 5,7,4'-트리하이드록시-3',5'-디메톡시플라본이라고 결정하였다.
Sa-1-F(2)의 분석
Sa-1-F(2) 1.40g에 실리카겔 3.00g을 가하여 흡착시키고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분획하였다. 컬럼의 용출 용매에는 step wise 방식을 채용하고, 클로로포름/아세톤=10:1, 8:2를 200mL, 5:5, 3:7, 아세톤만으로 각 300mL씩, 메탄올만으로 200mL를 사용하였다. 그 회수에는 53개의 50mL 바이알을 이용하였다.
53개의 50mL 바이알로부터 TLC의 결과에 기초하여, 같은 위치에 스폿이 있었던 No. 42-48의 바이알을 혼합하여 농축함으로써 담황색 고체(이하, Sa-1-F(2)-a라 한다) 46㎎을 얻었다. 이 담황색 고체(Sa-1-F(2)-a)를 중메탄올로 1H, 13C NMR 스펙트럼을 측정하였다.
담황색 고체(Sa-1-F(2)-a)의 1H, 13C NMR 스펙트럼
Figure 112011034335037-pat00005
1H NMR 스펙트럼에 있어서 δ7.21-7.28(m, 2H)와 δ7.99(dd, J=4.1.0.7Hz, 1H), δ8.09(d, J=2.3Hz, 1H)에 수소 4개분 및 13C NMR 스펙트럼에 있어서 δ124.4-155.9에 방향족환에 유래하는 5개의 시그널이 관측되었다. 또한, IR 스펙트럼에 있어서 3168㎝-1에 수산기의 특징적인 흡수를 확인하였다. 이상의 결과로부터 담황색 고체(Sa-1-F(2)-a)가 3-하이드록시피리딘이라고 판단하였다. 여기에서, 문헌값(The Aldrich Library of 13C and 1H FT NMR Spectra EDITION 1Volume 2, Aldrich Chemical Company, Inc.)과의 비교를 수행하여, 문헌값에 가까운 점 및 융점(문헌값 126-129℃)으로부터 이 담황색 고체(Sa-1-F(2)-a)가 3-하이드록시피리딘이라고 결정하였다.
항균 시험
한천 희석법(Agar dilution법)
트랜스-p-쿠마린산, 3-하이드록시피리딘, p-하이드록시벤즈알데히드, 바닐린에 대해서는, 한천 희석법이라는 항균 시험법을 이용하였다.
한천 희석법이라 함은, 맨 처음 녹인 시료 용액을 수 단계로 희석하여 한천 배치와 섞어, 시료 농도가 서로 다른 평판 배지를 작성한다. 이 평판 배지에 균을 부착하여, 시료에 항균 활성이 있는 경우에는 균의 발육을 저지할 수 있으며, 균의 발육을 저지할 수 있었던 가장 낮은 농도를 최소 발육 저지 농도(MIC: Minimum Inhibitory Concentration)로 하여 시료의 항균 효과의 강약을 판정하는 방법이다.
먼저, 시료 400㎎을 DMSO 1mL에 녹여, 400㎎/mL의 시료 용액을 조제하였다. 이 400㎎/mL의 시료 용액 0.5mL를 2배 희석하여, 200㎎/mL의 시료 용액을 조제하고, 마찬가지로 하여 100㎎/mL, 50.0㎎/mL, 25.0㎎/mL의 시료 용액을 조제하였다. 또한, 300㎎/mL 시료 용액도 준비하였다. 이들 시료 용액 0.2mL를 BHI(Brain Heart Infusion Agar, Becton Dickinson, MD) 배지 19.8mL와 섞고, 샤알레에 시료 농도 4.0㎎/mL, 3.0㎎/mL, 2.0㎎/mL, 1.0㎎/mL, 0.5㎎/mL, 0.25㎎/mL의 평판 배지를 작성하였다. 시료의 항균 효과의 비교 대조로서 카테킨의 동(同)농도 평판 배지도 작성하였다. 카테킨은 DMSO에 녹기 어려우므로 멸균수를 이용하였다.
이번 피시험균으로서 Sterptococcus pneumoniae(폐렴구균), Sterptococcus pyogenes(화농성 연쇄구균), Enterococcus faecalis(장구균), Staphylococcus aureus(황색 포도구균), Escherichia coli(대장균), Salmonella sp.(살모넬라균), Yersinia enterocolitica(예르시니아), Vibrio parahaemolyticus(장염 비브리오), Pseudomonas aeruginosa(녹농균), Bacillus cereus(세레우스균), Bacillus subtilis(고초균) MB-32, Bacillus subtilis(고초균) ATCC6633, Candida sp.(칸디다), 이렇게 13주를 이용하였다.
이들 균을 멸균한 MHBR 액체 배지(Mueller Hinton BrothR, Becton Dickinson, MD) 2mL에 섞어, 탁도 1(균 농도 108/mL)의 균액을 조제하였다. 미리 망접시의 각각의 셀에 소시험관을 넣어 멸균하였다. 망접시의 각각의 소시험관 안에 13주의 균액 1mL를 주입하였다. 마이크로플랜터(SAKUMA, 형식 MIT-P)로 망접시의 각 시험관으로부터 10μL를 취하여 다른 시험관으로 옮기고, 균액을 100배(균 농도 106/mL)로 희석하였다.
마이크로플랜터를 이용하여 이 균액 10μL(균수 14.0)를 각 농도의 시료 용액을 혼입해 둔 평판 배지에 부착하고, 37℃의 항온기 중에서 18시간 배양하여, 화합물의 항균력 평가를 수행하였다. 결과를 표 2~6에 나타낸다.
Figure 112011034335037-pat00006
Figure 112011034335037-pat00007
Figure 112011034335037-pat00008
Figure 112011034335037-pat00009
Figure 112011034335037-pat00010
이상의 결과로부터 트랜스-p-쿠마린산은 Sterptococcus pneumoniae(폐렴구균), Sterptococcus pyogenes(화농성 연쇄구균), Staphylococcus aureus(황색 포도구균), Yersinia enterocolitica(예르시니아), Vibrio parahaemolyticus(장염 비브리오), Bacillus cereus(세레우스균), Bacillus subtilis(고초균) ATCC6633, Candida sp.(칸디다)에 대하여 활성을 나타내었다. 최소 발육 저지 농도(MIC)는 폐렴구균에 대해서는 2.0㎎/mL, 화농성 연쇄구균, 장염 비브리오, 세레우스균, 고초균 ATCC6633, 칸디다에 대해서는 3.0㎎/mL, 황색 포도구균, 예르시니아에 대해서는 4.0㎎/mL였다.
3-하이드록시피리딘은 Sterptococcus pneumoniae(폐렴구균), Sterptococcus pyogenes(화농성 연쇄구균), Staphylococcus aureus(황색 포도구균), Yersinia enterocolitica(예르시니아), Pseudomonas aeruginosa(녹농균), Candida sp.(칸디다)에 대하여 활성을 나타내었다. MIC는 폐렴구균, 화농성 연쇄구균, 황색 포도구균, 예르시니아, 녹농균, 칸디다에 대하여 4.0㎎/mL였다.
p-하이드록시벤즈알데히드는 Sterptococcus pneumoniae(폐렴구균), Sterptococcus pyogenes(화농성 연쇄구균), Staphylococcus aureus(황색 포도구균), Escherichia coli(대장균), Salmonella sp.(살모넬라균), Yersinia enterocolitica(예르시니아), Vibrio parahaemolyticus(장염 비브리오), Pseudomonas aeruginosa(녹농균), Bacillus cereus(세레우스균), Bacillus subtilis(고초균) MB-32, Bacillus subtilis(고초균) ATCC6633, Candida sp.(칸디다)와 많은 균에 대하여 활성을 나타내었다. 특히, 예르시니아에 대하여 강한 활성을 나타내고, MIC는 0.5㎎/mL였다.
바닐린은 Sterptococcus pneumoniae(폐렴구균), Sterptococcus pyogenes(화농성 연쇄구균), Staphylococcus aureus(황색 포도구균), Escherichia coli(대장균), Salmonella sp.(살모넬라균), Yersinia enterocolitica(예르시니아), Vibrio parahaemolyticus(장염 비브리오), Bacillus cereus(세레우스균), Bacillus subtilis(고초균) MB-32, Bacillus subtilis(고초균) ATCC6633, Candida sp.(칸디다)에 대하여 활성을 갖는 것을 확인하였다. 바닐린도 마찬가지로 많은 균에 대한 활성을 가지며, 그 중에서도 특히 예르시니아에 대하여 강한 활성을 나타내고, MIC는 0.5㎎/mL였다.
Paper Disk법
5,7,4'-트리하이드록시-3',5'-디메톡시플라본의 항균 시험으로서, 용매의 영향이 나타나도 항균 활성 유무의 판정이 가능한 Paper Disk법을 이용하였다.
Paper Disk법이라 함은, 먼저 농도가 다른 시료 용액을 조제하고, 이 시료 용액을 전용 페이퍼 디스크에 흡수시켜 건조시킨다. 조제한 균액과 한천 배지를 섞어 작성한 평판 위에 시료 용액을 흡수시킨 페이퍼 디스크를 늘어 놓는다. 시료에 항균 활성이 있는 경우에는 페이퍼 디스크를 중심으로 균의 번식을 저지함을 나타내는 저지원이 형성된다. 그 저지원의 크기로 항균 효과의 강약을 판정하는 방법이다.
먼저 시료인 5,7,4'-트리하이드록시-3',5'-디메톡시플라본 4㎎을 200μL에 녹여 20㎎/mL의 시료 용액을 조제하였다. 이 20㎎/mL의 시료 용액 100μL에 멸균수 100μL을 가하여, 10㎎/mL의 시료 용액 200μL을 조제하였다. 거기에 DMSO 60μL과 멸균수 140μL을 가하여 5.0㎎/mL의 시료 용액 400μL를 조제하였다. DMSO 30%에서는 시료가 석출되기 때문에 DMSO 40%로 설정하였다. 5.0㎎/mL의 시료 용액 350μL에 DMSO 140μL와 멸균수 210μL을 가하고, 2.5㎎/mL의 시료 용액 700μL을 조제하였다. 같은 방법으로 1.25㎎/mL, 0.625㎎/mL의 시료 용액을 조제하였다. 대조군으로서 DMSO 40%, 멸균수 60% 용액도 준비하였다. 비교 대조로서 동농도의 카테킨 수용액도 준비하였다. 이들 용액 70μL를 페이퍼 디스크(직경 8.12㎜)에 흡수시켜 1일 건조시켰다.
피시험균으로서 Staphylococcus aureus(황색 포도구균), Salmonella sp.(살모넬라균), Yersinia enterocolitica(예르시니아), Pseudomonas aeruginosa(녹농균), Candida sp.(칸디다)를 이용하였다. 이들 균을 멸균수 2mL에 섞어, 탁도 1(108/mL)의 균액을 조제하였다. 이 균액 0.2mL와 BHI 배지 19.8을 섞어, 평판 배지를 작성하였다. 이 평판 배지 위에 건조시킨 페이퍼 디스크를 올리고, 37℃의 항온기 중에서 배양하여 평가를 수행하였다. 결과를 표 7에 나타낸다. 표 중 (-)는 항균 활성을 나타내지 않음을 나타낸다.
Figure 112011034335037-pat00011
이상의 결과로부터, 5,7,4'-트리하이드록시-3',5'-디메톡시플라본은 살모넬라균, 녹농균에 대하여 항균 활성을 갖는 것을 알 수 있었다. 또한, 카테킨과 비교하여도 그 항균 활성은 매우 강한 것을 알 수 있었다.
얼룩 조릿대 잎의 열수 추출물(Sa, 2.3㎏)을 초산 에틸에 의해 추출하여, 초산 에틸 가용 획분(Sa-1, 78g)을 얻었다. Staphylococcus aureus(황색 포도구균)에 대한 항균 시험의 결과, 초산 에틸 가용 획분(Sa-1)에 항균 활성이 국한되었다. 초산 에틸 가용 획분(Sa-1)을 중성 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 7 프랙션으로 분획하였다. 7프랙션은 각각 Sa-1-A(90㎎), Sa-1-B(250㎎), Sa-1-C(3.36g), Sa-1-D(3.00g), Sa-1-E(110㎎), Sa-1-F(1.56g), Sa-1-G(30.0g)으로 하였다. Sa-1-C(3.36g)에 클로로포름과 n-헥산을 가함으로써 2층으로 분리하여, Sa-1-C(1)(2.22g), Sa-1-C(2)(1.14g)을 얻었다. Sa-1-C(1)(2.22g)을 중성 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분획하고, Sa-1-C(1)-a, Sa-1-C(1)-b를 얻었다. Sa-1-C(1)-a를 고속 액체 크로마토그래프 장치(HPLC)의 분취용 ODS 컬럼을 이용하여 분획한 결과, 백색 고체(Sa-1-C(1)-aa) 60㎎을 얻었다. 스펙트럼 데이터 및 HPLC에 의한 분석의 결과, 백색 고체(Sa-1-C(1)-aa)는 바닐린이라고 결정하였다. 또한, Sa-1-C(1)-b를 다시 중성 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분획한 Sa-1-C(1)-ba를 분취용 TLC에 의해 담황색 고체(Sa-1-C(1)-baa) 86㎎를 얻었다. 스펙트럼 데이터로부터 담황색 고체(Sa-1-C(1)-baa)는 p-하이드록시벤즈알데히드라고 결정하였다. 또한, Sa-1-C(2)(1.14g)을 두 번의 재결정에 의해 옅은 황녹색 고체(Sa-1-C(2)-a) 478㎎을 얻었다. 스펙트럼 데이터로부터 옅은 황녹색 고체(Sa-1-C(2)-a)는 트랜스-p-쿠마린산이라고 결정하였다. 다음으로 Sa-1-F(1.56g)를 아세톤 가용의 Sa-1-F(1)(162㎎)와 아세톤 불용의 Sa-1-F(2)(1.40g)으로 분리하였다. Sa-1-F(1)(162㎎)에 다시 아세톤을 가하여 액층을 분리하고, 황색 고체(Sa-1-F(1)-a) 10㎎을 얻었다. 스펙트럼 데이터로부터 황색 고체(Sa-1-F(1)-a)는 5,7,4'-트리하이드록시-3',5'-디메톡시플라본이라고 결정하였다. 또한, Sa-1-F(2)(1.40g)를 중성 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 담황색 고체(Sa-1-F(2)-a) 46㎎을 얻었다. 스펙트럼의 데이터로부터 담황색 고체(Sa-1-F(2)-a)가 3-하이드록시피리딘이라고 결정하였다.
Figure 112011034335037-pat00012
바닐린, p-하이드록시벤즈알데히드, 트랜스-p-쿠마린산, 3-하이드록시피리딘의 항균 활성은 한천 희석법을 이용하여 조사하였다. 그 결과, 바닐린, p-하이드록시벤즈알데히드, 트랜스-p-쿠마린산, 3-하이드록시피리딘이 항균 활성을 갖는 것을 확인하였다. 그 중에서도 특히 바닐린, p-하이드록시벤즈알데히드는 식중독균인 Yersinia enterocolitica(예르시니아)에 대하여 강한 항균 활성을 나타내었다. 5,7,4'-트리하이드록시-3',5'-디메톡시플라본의 항균 시험에는 Paper Disk법을 이용하였다. 그 결과, 5,7,4'-트리하이드록시-3',5'-디메톡시플라본은 Salmonella sp.(살모넬라균), Pseudomonas aeruginosa(녹농균)에 대하여 항균 활성을 나타내었다. 이 활성은 카테킨과 비교하여도 강한 것이었다.
본 발명자는 얼룩 조릿대 이외의 식물에 대해서도 상술한 유효 성분의 추출을 시도하였다. 그 결과, 벼과에 속하는 많은 식물, 예를 들면, 벼, 보리, 옥수수, 대맥, 호밀, 사탕수수, 대나무, 참억새, 팜파스그래스, 갈대 등에도 5,7,4'-트리하이드록시-3',5'-디메톡시플라본(트리신)이 다량으로 포함되는 것을 발견하였다. 구체적인 식물명은 다음과 같다.
벼, 보리, 대맥, 메귀리, 호밀, 기장, 조, 피, 옥수수, 손가락조, 수수, 대나무, 줄풀, 사탕수수, 율무, 갈대, 참억새, 조릿대, 물대, 팜파스그래스, 잔디.
벼과 Gramineae
대나무아과 Bambusioideae(대나무과 Bambusaceae)
봉래죽속 Bambusa: 봉래죽, 봉황죽(이상 뱀부류)
하구세속 Shibataea: 하구세
왕대속 Phyllostachys: 맹종죽, 왕대, 담죽
업평죽속 Semiarundinaria: 업평죽, 야차죽(이상 대나무류)
환절죽속 Pleioblastus: 좀해장죽, 유죽, 환절죽, 유구죽
이대속 Pseudosasa: 이대, 신위대
조릿대속 Sasamorpha: 조릿대
아즈마자사속 Arundrinaria: 아즈마자사, 스에코자사
조릿대속 Sasa: 난장이조릿대, 제주조릿대, 얼룩조릿대, 섬조릿대(이상 조릿대류)
포아풀아과 Poelideae
개밀속 Agropyron: 구주개밀, 개밀, 속털개밀
뚝새풀속 Alopecurus: 뚝새풀, 쥐꼬리뚝새풀
물대속 Arundo: 물대
방울보리사초속 Briza: 방울보리사초, 방울새풀
귀리속 Bromus: 귀리, 개보리
오리새속 Dactylis: 오리새
참새그령속 Eragrostis: 그령, 참새그령, 능수참새그령
대맥속 Horudeum: 대맥, 보리풀
소맥속 Triticum: 소맥
독보리속 Lolium: 호밀풀, 쥐보리, 독보리
포아풀속 Poa: 새포아풀, 포아풀
김의털속 Festuca: 들묵새, 김의털, 김의털아재비
진들피속 Glyceria: 육절보리풀, 진들피
쌀새속 Melica: 왕쌀새, 쌀새
조릿대풀속 Lophatherum: 조릿대풀
드렁새속 Leptochloa: 드렁새
개피속 Beckmannia: 개피
쥐꼬리새풀속 Sporobolus: 쥐꼬리새풀, 나도잔디
왕바랭이속 Eleusine: 왕바랭이, 손가락조
우산잔디속 Cynodon: 우산잔디
갈대속 Phragmites: 황금풍지초, 갈대, 달뿌리풀
산기장속 Phaenosperma
나도겨풀속 Leersia
벼속 Oryza: 벼
줄풀속 Zizania: 줄풀
메귀리속 Avena: 메귀리, 귀리
Deshampsia속: crinkled hair grass, 좀새풀
잠자리피속 Trisetum: 잠자리피, 산잠자리피
도랭이피속 Koeleria: 도랭이피
향모속 Hierochloe: 향모, 산향모
갈풀속 Phalaris: 갈풀, 카나리새풀
흰겨이삭속 Agrostis: 흰겨이삭, 겨이삭
쇠돌피속 Polypogon
조아재비속 Phleum: 조아재비, 큰조아재비,
실새풀속 Calamagrostis: 실새풀, 갯조풀, 산조풀
잔디속 Zoysia: 잔디, 금잔디, 왕잔디, 갯잔디
수수아과 Panicoideae
새속 Arundinella
개억새속 Eulalia: 개억새, 털개억새
무늬사사대나무속 Isachne: 무늬사사대나무, 누운기장대풀
기장속 Panicum: 기장, 미국개기장, 개기장
피속 Echinochloa: 피, 돌피
주름조개풀속 Oplismenus: 주름조개풀
강아지풀속 Setaria: 사사키비, 강아지풀, 조, 금강아지풀
참새피속 Paspalum: 참새피, 물참새피, 큰참새피
바랭이속 Digitaria: 바랭이, 민바랭이
수크령 Pennisetum: 수크령, 목초
스피니펙스속 Spinifex: 스피니펙스
사탕수수속 Saccharum: 사탕수수, 코끼리풀
띠속 Imperata: 띠
기름새속 Eccoilopus: 기름새
참억새속 Miscanthus: 참억새, 물억새, 산새풀
나도바랭이새속 Microstegium: 민바랭이새, 나도바랭이새
포고나테룸속: Pogonatherum
잔디바랭이속 Dimeria: 잔디바랭이
쇠치기풀속 Hemarthria: 쇠치기풀
모새달속 Phacelurus: 모새달
쇠보리속 Ischaemum: 쇠보리, 참쇠보리
조개풀 Arthraxon: 조개풀
개솔새속 Cymbopogon: 개솔새
나도기름새속 Bothriochlo: 나도기름새
쇠풀속 Schizoachyrium: 쇠풀
나도솔새속 Andropogon: 나도솔새
솔새속 Themeda: 솔새
수수속 Sorgham: 수수, 사탕수수, 시리아수수새, 수단수수
율무속 Coix: 염주, 율무
옥수수속 Zea: 옥수수
상기 식물의 잎, 줄기 등을 적절한 용매를 사용하여 추출하고, HPLC 등의 분리 정제 수단을 이용하여 트리신을 분리 정제할 수 있다. 예를 들면, 수 추출물을 농축하여, 고형물을 알콜, 함수 알콜(예를 들면 메탄올, 에탄올, 함수 메탄올, 함수 에탄올) 추출하고, 고형분을 물에 용해하여, 초산 에틸과의 분배 등에 의해 정제할 수 있다. 얼룩조릿대의 건조잎 5g을 각종 유기 용매 50ml에 침적 정치하고, 추출액을 농축하여 고형분을 얻었다. 얼룩조릿대 잎의 질량을 100으로 했을 때의 각종 추출액의 고형분의 비율과 이 고형분 중에 포함되는 트리신의 비율을 이하의 표에 나타낸다.
용매 추출액 중의 고형분의 비율(%) 고형분 중의 트리신의 비율(%)
에탄올 4.2 0.048
메탄올 11.7 0.035
n-부탄올 2.4 0.057
이소프로판올 2.2 0.070
초산 에틸 1.9 0.065
아세톤 1.8 0.095
헥산 1.3 0
다음으로 얼룩조릿대 잎 50g, 용매 1L를 이용하여 추출하고, 추출액의 용매를 제거했을 때의 고형분에 포함되는 트리신의 양(㎎)을 구하였다. 결과를 이하의 표에 나타낸다.
용매 고형분 중의 트리신의 비율(㎎)
에탄올 2.02
메탄올 4.10
n-부탄올 1.37
이소프로판올 1.54
초산 에틸 1.62
아세톤 1.71
헥산 0
얼룩조릿대 잎 50g을 메탄올 500ml에 침적하고 정치하였다. 그 후, 여과하여 용매 제거하고 메탄올 추출물 5.05g을 얻었다. 다음으로 헥산, 클로로포름, 초산 에틸, n-부탄올의 순으로 분배 작업을 수행하여, 고형분의 양 및 그 중의 트리신의 양을 구하였다. 결과를 이하의 표에 나타낸다.
용매 추출액 중의 고형분의 비율(%) 고형분 중의 트리신의 비율(%)
헥산 17.6 0
클로로포름 4.7 0.61
초산 에틸 6.9 0.09
n-부탄올 38.4 0
수층 33.3 0
다음으로 얼룩조릿대 잎 50g을 이용하여 메탄올 500ml로 추출을 수행하고, 용매 제거 후 이것을 물에 용해하고, 각종 용매를 이용하여 분배 작업했을 때의 각 고형분에 포함되는 트리신의 양을 구하였다. 결과를 이하의 표에 나타낸다.
용매 고형분 중의 트리신의 비율(%)
헥산 0
클로로포름 3.35
초산 에틸 0.73
n-부탄올 0
수층 0
얼룩조릿대 잎의 각종 함수 에틸알콜 추출액을 농축 건조하여 고형분(B)을 얻었다. 이것을 물에 용해 후, 초산 에틸과의 분배 작업을 수행하고, 용매를 제거하여 고형분(C)을 얻었다. 고형분(B)을 100으로 했을 때의 초산 에틸 추출 고형분(C)의 비율을 이하의 표에 나타낸다. 또한, 고형분(B) 및 고형분(C) 중의 트리신의 분석 결과(질량%)도 함께 나타낸다.
함수 알콜 중의 알콜의 비율(질량%) 고형분(B)
(질량%)		 (B) 중의 트리신(질량%) 고형분(C)
(질량%)		 (C) 중의 트리신(질량%)
0* 62.0 0.025 5.5 0.38
5 3.0 0.010 7.7 0.057
10* 51.6 0.031 7.1 0.29
15 3.1 0.043 11.1 0.12
25 3.2 0.15 12.2 0.77
30* 55.4 0.092 11.4 0.80
70 4.9 0.30 26.5 1.1
90 3.9 0.45 33.3 0.95
100* 23.8 0.11 37.4 0.51
*예비 농축제
갈대의 잎, 줄기 및 대나무 잎의 각종 함수 에틸알콜 추출액(D)의 용매를 제거하여 고형분(E)을 얻었다. 이것을 물에 용해하고, 초산 에틸에 의해 분배 작업을 수행하여, 초산 에틸 가용부의 고형분(F)을 얻었다. 고형분(E) 100g 이용한 경우의 고형분(E) 및 고형분(F) 중의 트리신의 양을 분석하였다. 결과를 이하의 표에 나타낸다.
추출액(D) 고형분(E) 100g 중의 트리신의 양(㎎) 고형분(F) 100g 중의 트리신의 양(㎎)
갈대의 잎(25% 에탄올) 31 45.8
갈대의 줄기(25% 에탄올) 28 19.6
대나무의 잎(70% 에탄올) 110 64.0
대나무의 잎(90% 에탄올) 150 109.2
본 발명의 항미생물성 조성물
상기 화합물(바닐린, p-하이드록시벤즈알데히드, 트랜스-p-쿠마린산, 3-하이드록시피리딘, 5, 7, 4'-트리하이드록시-3', 5'-디메톡시플라본)(이 명세서에 있어서 '본 발명의 화합물'이라고도 한다) 중 적어도 1종을 유효성분으로 하는 본 발명의 항미생물제는 각종 형태로 사용할 수 있다. 예를 들면, 점막 보호 조성물, 세균 감염 예방 및/또는 치료용 조성물, 방부제, 여과 장치 등의 항미생물제로서 적합하다.
본 발명의 항미생물제의 제형은 액체상, 고체상, 기체상 모두 가능하다. 본 발명의 항미생물제는 경구, 비경구 투여 모두 가능하다. 경구 투여 형태로는 정제, 환제, 분말제, 액제, 츄잉검, 사탕, 쵸콜렛, 빵, 쿠키, 소바, 우동, 각종 드링크제 등의 식품 형태가, 비경구 투여 형태로는 주사제, 국소 투여제(크림, 연고 등), 좌약 등을 들 수 있다. 국소 투여제의 제형이 예로는, 본 발명의 항미생물제를 천연 섬유 또는 합성 섬유제의 거즈 등의 담체에 함침시킨 것, 립스틱 등의 화장품에 함유시킨 것 등을 들 수 있다.
본 발명의 항미생물제는 사람은 물론, 사람 이외의 포유류, 조류, 어류, 파충류용 등의 항미생물제로도 유효하다. 따라서 본 발명의 항미생물제는 이들 동물용의 항미생물제(예를 들면 펫용 의약, 펫 푸드 등)로서 사용할 수 있다. 또한 본 발명의 항미생물제는 동물 이외에, 각종 식물에 대한 항미생물제로서도 유용하며, 또한 방부제로도 유용하다.
본 발명의 여러 제형의 항미생물제의 제조에는 소정량의 상기 화합물 외에, 통상의 의약 조성물, 화장품, 피부용 조성물 등에 사용되는 유성 성분 등의 기재 성분, 보습제, 방부제 등을 사용할 수 있다.
항미생물제에 사용하는 물은 수도수, 천연수, 정제수 등, 특별히 한정되지 않지만, 일반적으로 이온 교환수 등의 고순도의 물이 바람직하다.
유성 성분으로는 스쿠알란, 우지, 돈지, 마유, 라놀린, 밀랍 등의 동물성유, 올리브유, 포도씨유, 팜유, 호호바유, 배아유(예를 들면 쌀 배아유) 등의 식물성유, 유동 파라핀, 고급 지방산 에스테르(예를 들면 팔미틴산옥틸, 팔미틴산이소프로필, 미리스틴산옥틸도데실), 실리콘유 등의 합성유, 반합성유를 들 수 있다.
유성 성분은 피부의 보호, 유연성 부여 효과(피부 표면을 박막으로 덮어 건조를 막음과 동시에, 유연성, 탄력성을 부여하는 효과), 상쾌감 등의 요구 성능에 맞추어 적절하게 조합하여 이용할 수 있다. 스쿠알란, 올리브유 및 미리스틴산옥틸도데실의 조합은 바람직한 예의 하나이다.
항미생물제의 굳기, 유동성을 조절하기 위하여, 스테아린산, 스테아릴알콜, 베헤닌산, 세탄올, 바세린 등의 고체유가 이용되고, 바람직하게는 스테아린산과 세탄올을 조합하여 이용한다.
본 발명의 항미생물제를 크림 조성물로서 제조하기 위해서는 본 발명의 화합물, 물, 유성 성분을 크림상으로 하기 위한 크림화제가 이용된다. 크림화제는 특별히 한정되지 않지만, 모노스테아린산글리세린과 자기 유화형 모노스테아린산글리세린(모노스테아린산글리세린에 유화제를 첨가한 것)을 조합하여 사용하는 것이 일반적이다.
본 발명의 항미생물제에는 필요에 따라 안정화제, 보습제, 창상 치유제, 방부제, 계면 활성제 등을 더 함유시킬 수 있다.
안정화제로는 카르복시비닐 폴리머와 수산화칼륨의 조합, 디스테아린산 폴리에틸렌글리콜 등을 들 수 있다. 특히, 세스퀴스테아린산 폴리에틸렌글리콜(디스테아린산 폴리에틸렌글리콜과 모노스테아린산 폴리에틸렌글리콜의 1:1 혼합물)(폴리에틸렌글리콜이 분자량은 1000~2만)은 안정성이 높고, 물과 기름으로 분리되는 일이 없으며, 또한 크림 조성물로서 피부에 도포할 때의 굳기를 효과적으로 조절할 수 있으므로 바람직하다.
보습제로는 히알루론산나트륨, 콜라겐, 알로에 엑기스(특히, 목립 알로에 유래의 알로에엑기스(2)가 바람직하다), 요소, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 트레할로스, 솔비톨, 아미노산, 피롤리돈카르본산나트륨 등을 들 수 있다.
창상 치유제로는 알란토인, 글리틸리틴산디칼륨, 감초 엑기스, 쑥 엑기스 등을 들 수 있다.
방부제는 본 발명의 화합물 자체에 항균 작용이 있으므로 보조적으로 이용되는 것이다. 예를 들면 안식향산나트륨, 파라하이드록시안식향산 저급 알킬에스테르(예를 들면 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸 에스테르 등의 파라벤이라 칭해지는 것), 프로피온산나트륨, 혼합지방산에스테르(카프린산글리세릴, 라우린산폴리글리세릴-2, 라우린산 폴리글리세릴-10의 혼합물), 페녹시에탄올, 감광소 201호(황색 색소), 1, 2-펜탄디올 등을 들 수 있는데, 파라벤, 혼합 지방산 에스테르, 1,2-펜탄디올이 바람직하다.
계면 활성제로는, 예를 들면 N-아실-L-글루타민산나트륨, 폴리옥시에틸렌솔비탄 모노스테아레이트 등을 들 수 있다.
또한, 필요에 따라 향 성분, 예를 들면 오렌지 오일, 레몬 오일, 등피유, 향료 등을 함유시킬 수 있다.
본 발명의 항미생물제를 함유하는 점막 보호 조성물, 세균 감염 예방 및/또는 치료용 조성물은 눈, 코, 목, 귀, 항문, 음부 등의 점막이나, 창상 부위 및 피부로부터의 감염성 세균의 체내로의 침입을 효과적으로 억제하여, 원내 감염을 포함하는 세균 감염을 효과적으로 예방 및/또는 치료하는 것이다. 점막 보호 조성물, 세균 감염의 예방 및/또는 치료용 조성물의 더욱 구체적인 형태로는 점막 보호포나 구강 조성물을 들 수 있다.
점막 보호포는 통기성을 갖는 담체, 예를 들면 실크, 면, 마 등의 천연 섬유, 폴리우레탄, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에스테르, 아크릴 등의 합성 섬유, 반합성 섬유, 혹은 이들 중 2종 이상의 혼합물의 섬유 자체 또는 실, 또는 그 직포, 편포, 부직포, 종이 등에 본 발명의 항미생물제를 함침, 분무 등의 방법에 의해 함유시킨 것이다. 이 명세서 중 '보호포'에는 편의상, 포 외에 섬유 자체, 실, 종이 등도 포함하는 것으로 한다.
구체적인 형태로는, 거즈, 마스크, 안대, 생리대, 생리용 냅킨, 포대, 토일렛 페이퍼, 치질 처리용 거즈, 귀마개, 반창고 등의 위생용품으로 분류되는 점막이나 피부에 직접 접촉하는 보호포 외에, 백의 등의 의류, 장갑, 모자, 양말, 덧버선 등의 의류품 소품, 시트, 이불 커버, 베개 커버, 침대 용품 등의 침구류, 커텐, 벽지, 카펫 등의 실내 장식품 및 내장 재료, 수술용 봉합사 등의 의료 재료 등, 피부에 직접 또는 간접으로 접촉하는 물품도 들 수 있다.
본 발명의 항미생물제를 함유하는 구강 조성물로는 예를 들면, 구미, 젤리, 트로키, 캔디, 츄잉검, 정제, 환제, 구강세정제, 수제, 치약, 점막 첩부 필름, 인두부 염증 치료용 분무제 등을 들 수 있다.
앞의 실험예로부터 명백하듯이, 본 발명의 화합물은 얼룩조릿대 엑기스 중 그 고형분에 대하여 대략 1000분의 1~10만분의 1의 농도로 포함되어 있다. 따라서, 본 발명의 화합물을 항미생물제로서 사용하는 경우에는 얼룩조릿대 엑기스 고형분의 사용량의 약 1000분의 1~10만분의 1의 농도면 된다. 그 농도는 사용 목적에 맞추어 적절하게 결정된다.
예를 들면, 본 발명의 화합물을 점막 보호포에 함유시킬 때는 예를 들면, 보호포를 본 발명의 화합물의 2~20×(1000분의 1~10만분의 1)질량% 용액(물, 알콜, DMSO 등의 유기 용매 또는 이들의 혼합 용매)에 함침하고, 혹은 보호포에 본 발명의 화합물의 2~20×(1000분의 1~10만분의 1)질량% 용액을 분무하여 건조하면 된다. 이때, 본 발명의 화합물의 함침량 또는 분무량은 본 발명의 화합물의 고형분으로 바람직하게는 2~20×(1000분의 1~10만분의 1)질량%, 더욱 바람직하게는 6~15×(1000분의 1~10만분의 1)질량%, 가장 바람직하게는 8~12×(1000분의 1~10만분의 1)질량% 정도로 하는 것이 적당하다.
본 발명의 화합물은 예를 들면, 구미, 젤리, 트로키, 캔디, 츄잉검, 정제, 환제(예를 들면 笹丹), 구강세정제, 수제, 치약, 점막 첩부 필름 등의 구강 조성물에 함유시킬 때에는 구강 조성물 제조 중 어느 한 단계에서, 구강 조성물 원료에 대하여, 본 발명의 화합물의 고형분으로 바람직하게는 2~20×(1000분의 1~10만분의 1)질량%, 더욱 바람직하게는 6~15×(1000분의 1~10만분의 1)질량%, 가장 바람직하게는 8~12×(1000분의 1~10만분의 1)질량% 정도 첨가하는 것이 적당하다.
본 발명의 구강 조성물에는 제형에 따라 적절한 관용의 성분을 배합할 수 있다.
예를 들면, 포도당, 유당, 자당, 물엿, 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 부형제, 아라비아검, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 결정 셀룰로오스, 검베이스 등의 결합제, 전분 등의 붕괴제, 스테아린산마그네슘, 자당 지방산에스테르 등의 활택제, 향료, 클로로필, 박하, 1-멘톨 등의 청량화제 등을 들 수 있다.
본 발명의 점막 보호 조성물을 보호포의 형태로 사용하는 경우, 점막이나 창상 부위에 접촉하는 부위의 보호포(거즈 등)에 본 발명의 화합물을 함유시켜 두고, 이것을 1일 1~3회 정도 교환하면 좋다. 수술용 봉합사의 형태로 사용한 경우, 봉합 환부로부터의 세균의 침입을 효과적으로 억제하고, 환부의 염증을 억제하여 수술 부위의 회복을 촉진한다.
병원 등에서의 원내 감염 방지를 위하여 본 발명의 점막 보호 조성물을 보호포의 형태로 사용하는 경우, 본 발명의 점막 보호 조성물의 감염 방지 효과는 장기간에 걸쳐 존속한다. 세탁에 의해 그 효과가 저감한 경우에는 적절하게 교환하거나, 본 발명의 화합물을 다시 함유시키기 위한 처리를 수행하면 된다.
본 발명의 점막 보호 조성물을 구강 조성물의 형태로 사용하는 경우, 그 섭취량은 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 화합물의 고형분으로서, 2~15×(1000분의 1~10만분의 1)㎎ 정도를, 예를 들면 1일 1~5회, 통상은 1~3회 정도 섭취하면 좋다. 섭취량, 섭취 횟수는 목적에 맞춰 적절하게 증감할 수 있다.
본 발명의 점막 보호 조성물은 본 발명의 화합물을 고형분으로 2~20×(1000분의 1~10만분의 1) 질량% 함유하고 있으며, 종래, 항생 물질이 듣지 않는 내성균에 대해서도 현저한 살균 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명의 점막 보호 조성물을 구강 조성물로서 사용하는 경우, 적절하게 필요한 때에 입에 물고 있음으로써, 아주 간편하게 감염성 세균의 감염을 예방하고, 또한 그 증식을 억제할 수 있다. 또한, 츄잉검, 캔디 등의 서방성 형태의 조성물은 그 효과를 장기간에 걸쳐 발휘할 수 있어 유리하다.
본 발명의 점막 보호 조성물은 로션이나 오일의 형태로 사용할 수도 있다. 본 발명의 화합물을 고형분으로 2~20×(1000분의 1~10만분의 1) 질량% 함유하는 로션이나 오일을 피부 등에 도포해 둠으로써 아주 간편하게 감염성 세균의 감염을 예방하고, 또한 그 증식을 억제할 수 있다.
방부제
본 발명은 또한, 본 발명의 화합물을 유효 성분으로서 함유하는 방부제를 제공하는 것이다. 방부제로서 사용할 때의 형태는 특별히 한정되지 않는다. 방부 대상이 되는 조성물로는 예를 들면, 식품, 음료수, 조미료, 화장품(로션이나 오일을 포함), 창상 부위 치료용 분무제, 인두부 염증 치료용 분무제 등을 들 수 있다. 이들 대상물에 본 발명의 화합물을 고형분으로 바람직하게는 2~20×(1000분의 1~10만분의 1) 질량%, 더욱 바람직하게는 6~15×(1000분의 1~10만분의 1)질량%, 가장 바람직하게는 8~12×(1000분의 1~10만분의 1)질량% 정도 함유시키는 것이 적당하다.
여과 장치
본 발명은 또한, 본 발명의 화합물을 유효 성분으로서 함유하는 공기의 여과 장치를 제공하는 것이다. 구체적인 형태로는 환기팬, 에어컨, 카 에어컨, 공기 흡입구, 공기 배출구, 망호(網戶), 공기 청정기 등의 공기가 통과하는 부위에 사용되는 필터를 들 수 있다. 필터의 소재는 특별히 한정되지 않지만, 실크, 면, 마 등의 천연 섬유, 폴리우레탄, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에스테르, 아크릴 등의 합성 섬유, 반합성 섬유, 혹은 이들 중 2종 이상의 혼합물의 직포, 편포, 부직포, 종이 등을 들 수 있다. 이들 필터에 본 발명의 화합물의 희석액을 함침, 분무 등의 방법에 의해 함유시켜 건조하면 된다. 필터 중의 본 발명의 화합물의 함유량은, 고형분으로 바람직하게는 2~20×(1000분의 1~10만분의 1) 질량%, 더욱 바람직하게는 6~15×(1000분의 1~10만분의 1)질량%, 가장 바람직하게는 8~12×(1000분의 1~10만분의 1)질량% 정도로 하는 것이 적당하다.

Claims (4)

  1. 삭제
  2. 3-하이드록시피리딘을, 미생물이 스트렙토코커스(Streptococcus), 스타필로코커스(Staphylococcus), 예르시니아(Yersinia), 비브리오(Vibrio), 슈도모나스(Pseudomonas) 및 칸디다(Candida)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 미생물에 대한 항미생물 활성의 유효성분으로 포함하는 항미생물용 조성물.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 미생물은 폐렴구균(Sterptococcus pneumoniae), 화농성 연쇄구균(Sterptococcus pyogenes), 황색 포도구균(Staphylococcus aureus), 예르시니아(Yersinia enterocolitica), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 및 칸디다(Candida sp.)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항미생물용 조성물.
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 미생물은 폐렴구균(Sterptococcus pneumoniae), 화농성 연쇄구균(Sterptococcus pyogenes), 황색 포도구균(Staphylococcus aureus), 예르시니아(Yersinia enterocolitica) 및 칸디다(Candida sp.)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항미생물용 조성물.
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