WO2007105581A1

WO2007105581A1 - 抗微生物剤及び抗微生物性組成物

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Publication number: WO2007105581A1
Application number: PCT/JP2007/054507
Authority: WO
Inventors: Yuuzou Tsuchida; Kotarou Tsuchida; Kunitomo Watanabe; Daisuke Sakurai; Mamoru Koketsu; Mitsuo Kawabe; Teruo Utsumi
Original assignee: Yuuzou Tsuchida; Kotarou Tsuchida; Kunitomo Watanabe; Daisuke Sakurai; Mamoru Koketsu; Mitsuo Kawabe; Teruo Utsumi
Priority date: 2006-03-10
Filing date: 2007-03-08
Publication date: 2007-09-20
Also published as: EP1994928A4; KR101159699B1; KR20080103090A; CN101442996A; EP2279662A3; TW200800140A; EP2279662A2; RU2008136887A; EP1994928A8; US20090012128A1; CN101442996B; KR20110069158A; RU2414818C2; TWI375554B; HK1133381A1; JPWO2007105581A1; EP1994928A1; US20100190846A1

Abstract

　ｐ－ヒドロキシベンズアルデヒド、５，７，４’－トリヒドロキシ－3’，５’－ジメトキシフラボン、３－ヒドロキシピリジン、及びバニリンからなる群から選ばれる少なくとも１種を有効成分とする抗微生物剤及びこれを含有する抗微生物性組成物。

Description

明細書

抗微生物剤及び抗微生物性組成物

技術分野

[0001] 本発明は抗微生物剤及び抗微生物性組成物に関する。

背景技術

[0002] ササエキスは古くから抗菌性を有することが知られている。例えば、創傷感染症の原因菌となる細菌である黄色ブドウ球菌 (Staphylococcus aureus),緑膿菌 (Pseudomo nas aeruginosa),大腸菌 (Escherichia coli)に対する抗菌効果 (特許文献 1、特許文献 2)や、胃潰瘍の原因菌とされるピロリ菌（Helicobacter pylori)に対する抗菌効果が報告されている。

隈笹は、イネ科ササ属の植物で、一般的に山に生える笹を熊笹という力冬になると葉緑が白く枯れて隈取られるものを総称していう。熊笹と隈笹とは異なり、隈笹の学名は Sasa albo marginato Makino et Shibataである。現在ではほぼ日本全国に栽培されている力これは人為的に広められたものである。

[0003] 古来から隈笹は、東洋医学の「漢方薬」として知られて、るインドのギムマネ ·シルベスタ、中国のグアバ、韓国のクコと並び称されるほどその効能は非常に幅広い。日本においても胃病、糖尿病、高血圧などの伝統的な民間薬 (非特許文献 1 3)として利用されてきた。また、笹団子ゃチマキなどの食品包装材ゃ保健強壮剤として利用されてきた。

戦後、動物実験によって隈笹にネズミの肝癌に対しの抑制活性があることが発見され、制癌活性の面からいくつ力の薬理学的研究 (非特許文献 4)がなされてきた。また、隈笹の有する優れた防腐効果 (非特許文献 5)、抗菌効果 (非特許文献 6)についても研究がなされてきた。しかし、その多くはガスクロマトグラフィーによる有機酸の分析に過ぎず、抗菌効果の本体の単離精製についての報告例は少ない。

タマル酸及びその誘導体が大腸菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌に対する抗菌性を有することも知られてヽる（特許文献 3)。

また、クマザサエキスには、タマル酸、フェルラ酸、カフェ酸、ノ -リン等のフエニルプロパノイド、 3—ヒドロキシピリジン等が含まれ、これらの混合物が大腸菌、黄色ブドゥ球菌、緑膿菌に対する抗菌性を有することも知られている (特許文献 4)。

[0004] 特許文献 l :WO00Z〇67707

特許文献 2：特開 2003 - 201247

特許文献 3：特開 2004— 359626

特許文献 4：特開 2006 -36731

非特許文献 1 :柴田丸，久保恭子，小野田眞：日本薬学会誌， 98, 1436 (1978).

非特許文献 2 : S. Okabe, K. Takeuchi, K. Takagi, M. Shibata, Jpn. J. Pharmacol., 25

, 608 (1975).

非特許文献 3 :柴田丸，佐藤冬恵,竹下一夫，大谷孝吉:生薬学雑誌, 34, 274 (1980) 非特許文献 4 : M. Shibata, K. Kubo, M. Onoda, Folia Pharmacol. Jpn, 72, 531-541 ( 1976)

非特許文献 5 : N. V. Chuyen, T. Kurata, H. Kato, J. Antibact. Antifong. Agents, 11, 69-75 (1983)

非特許文献 6 : N. V. Chuyen, H. Kato, Agric. Biol. Chem., 46, 2795-2801(1982)3-1 128 (2004)

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] 本発明の目的は、抗微生物剤を提供することである。

本発明の他の目的は、該抗微生物剤を含有する抗微生物性組成物を提供することである。

課題を解決するための手段

[0006] 本発明は、以下に示す抗微生物剤及びこれを含有する抗微生物性組成物を提供するものである。

1. p—ヒドロキシベンズアルデヒド、 5, 7, 4，一トリヒドロキシ一 3，， 5，一ジメトキシフラボン、 3—ヒドロキシピリジン、及びバニリンカもなる群力も選ばれる少なくとも 1種を有効成分とする抗微生物剤。

2.微生物力 streptococcus、 Enterococcus、 Staphylococcus、 Escherichia^ Salmonell a、 Yersinia^ Vibrio、 Pseudomonas、 Bacillus^及び Candida力らなる群力ら選ばれる上記 1記載の抗微生物剤。

3. p—ヒドロキシベンズアルデヒド、及び 5, 7, 4，一トリヒドロキシ一 3，， 5，一ジメトキシフラボン力なる群力選ばれる少なくとも 1種を有効成分とする抗微生物剤。

4.微生物;^、 Streptococcus、 Enterococcus、 Staphylococcus、 Escherichia^ Salmonell a、 Yersinia^ Vibrio、 Pseudomonas、 Bacillus^及び Candida力らなる群力ら選ばれる上記 3記載の抗微生物剤。

5. 3—ヒドロキシピリジンを有効成分として含有し、微生物が、 Sterptococcus pneumo niae (月巾炎球菌), Sterptococcus pyogenes (ィ匕膿'性連鎮珠 ift), staphylococcus aureu s、色ブ! ^ゥ珠齒入 Yersinia enterocolitica エノレン-フ Pseudomonas aeruginosa、緑膿菌)，及び Candida sp. (カンジダ）力もなる群力も選ばれる上記 1記載の抗微生物剤。

6. p—ヒドロキシベンズアルデヒドを有効成分として含有し、微生物が、 Streptococcus pneumoniae (月巾炎球菌), Streptococcus pyogenes (ィ匕膿'性連球菌), Stapnylococc us aureus ( 色フドウ球菌), Escherichia coli (大月芴菌) , Salmonella sp.、サノレモネフ! ¾ ), Yersinia enterocolitica (エノレン二ァ), Vibrio paranaemolyticus (月暴ヒ、、ブリオ), Pse udomonas aeruginosa (緑膽菌) , Bacillus cereus (セレゾス菌) , Bacillus subtilis (枯草菌)，及び Candida sp. (カンジダ)力もなる群力選ばれる上記 1記載の抗微生物剤。

7.バニリンを有効成分として含有し、微生物が、 Streptococcus pneumoniae (肺炎球菌), Streptococcus pyogenes (ィ匕膽性連鎮珠 ift), staphylococcus aureus (黄色ブ! ^ゥ球歯), Escherichia con (人月昜菌), Salmonella sp. (サルモネフ菌) , Yersinia enterocolit ica (エノレシ-ァ)， Vibrio parahaemolyticus (月昜炎ビブリオ)， Bacillus cereus (セレウス菌)， Bacillus subtilis (枯草菌)，及び Candida sp. (カンジダ）力なる群から選ばれる上記 1記載の抗微生物剤。

8. 5, 7, 4'—トリヒドロキシ一 3 ' , 5 '—ジメトキシフラボンを有効成分として含有し、微生物力 ^Salmonella sp. (サノレモ不ラ菌)，及び Pseudomonas aeruginosa (緑g菌カらなる群力選ばれる上記 1記載の抗微生物剤。

9.上記 1〜8のヽずれか 1項記載の抗微生物剤を含有する抗微生物性組成物。本発明において「微生物」とは、細菌、放線菌、シァノバクテリア、古細菌、菌類、酵母、藻類、ウィルス等、特にヒトを含む動植物に対して好ましくない影響を及ぼすものを意味するものとする。

発明の効果

[0007] 本発明の抗微生物剤は、各種の微生物、特に Streptococcus、 Enterococcus、 Staph ylococcus、 Escherichia ^ ¾almonella、 Yersinia^ Vibrio ^ Pseudomonas、 Bacillus ^ Candi da等、さらに具体的には Streptococcus pneumoniae (月巿炎球菌)、 Streptococcus pyog enes (ィ匕膽性連叙球菌)、 Enterococcus faecalis (月昜球菌)、 Staphylococcus aureus \βξ 色ブドウ球菌)、 Escherichia coli (大月昜菌)、 Salmonella sp. (サノレモネラ菌)、 Yersinia e nterocolitica (エノレシ- / 、 Vibrio paranaemolyticus (月昜炎ヒ、、ブリオ)、 Pseudomonas ae ruginosa (緑膿菌)、 Bacillus cereus (セレウス菌)、 Bacillus subtilis (枯草菌)、 Candida sp. (カンジダ)に対して高い抗微生物活性を有する。

発明を実施するための最良の形態

[0008] 本発明者らは、隈笹の抗菌効果の本体を解明し、その抗菌有効成分を特定するため、隈笹の葉の熱水抽出物を各種溶媒にて分画した。次にシリカゲルクロマトグラフィ一で分画した後に、 TLCによる分取や高速液体クロマトグラフ装置の分取用 ODS力ラムを用いて単離精製を行い、さらに、各種スペクトルを用いて単離したィ匕合物の構造を決定するとともに 13種類の菌に対して抗菌試験を行った。その結果、上記 p ヒドロキシベンズアルデヒド、 5, 7, 4，一トリヒドロキシ一 3，， 5，一ジメトキシフラボン（以下、「トリシン」ともいう）、及び 3—ヒドロキシピリジン、トランス一 p—タマル酸（トランス p ヒドロキシ桂皮酸)、バニリンが各種の微生物に対して特異的に抗微生物活性を示すことを見出し、本発明を完成した。

[0009] 以下本発明を具体的に説明する。

実験材料は、鳳凰堂株式会社から入手した隈笹の葉の熱水抽出物（Sasa albo-mar ginato) (商品名 TWEBS)を用いた。この熱水抽出物（以降 Saとする） 10 gをエバポレ一ターで溶媒留去させたところ固形分として 6.2 gを得た。このことから原料である隈笹の葉の熱水抽出物は 38 %の水分を含有して、ることを確認した。

この熱水抽出物を用いて各種溶媒にて分画を行った。すなわち、熱水抽出物（Sa) を酢酸ェチルによる抽出操作を行い得られた酢酸ェチル層を溶媒留去して酢酸ェチル可溶画分（以降 Sa-1とする）とした。水層はさらに n-ブタノールにて抽出操作を行い同様の処理にて、 n-ブタノール可溶画分と水層をそれぞれ得た。この処理によつて得た酢酸ェチル可溶画分（Sa-1)、 n-ブタノール可溶画分、水層および原料である熱水抽出物（Sa)の Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌）に対する抗菌試験を行った。抗菌試験には cup法という方式を用いた。 cup法とは、まず菌培地の中心に直径 7.32 mmのカップを置きそのカップに試料溶液を滴下することでカップを中心に試料溶液が同心円状に広がる。抗菌作用がある場合は菌の繁殖を阻止することを示す阻止円が形成される。すなわち、抗菌作用と阻止円の大きさには正の相関があるため、その阻止円の大きさで抗菌効果の強弱を判定するという方法である。各分画成分の Staphylococcus aureusに対する抗菌試験の結果を表 1に示す。

[0010] [表 1]

判定の表記は、抗菌効果が： ++++かなり強い、 ++ある、 +わずかにある、 -ないここで、ブランク 7.32 mmはカップの直径である。

[0011] 抗菌試験の結果、酢酸ェチル可溶画分が隈笹熱水抽出物の原液とほぼ同様の抗菌活性を示した。一方、 n-ブタノール可溶画分、水層画分の抗菌活性はわずかなものであった。

上記抗菌試験の結果より酢酸ェチル可溶画分に抗菌活性が局在していることが確認されたので隈笹の葉の熱水抽出物（Sa) 2.3 kgを酢酸ェチルで抽出操作を行った。得られた酢酸ェチル層を溶媒留去して酢酸ェチル可溶画分（Sa-1) 78 gを得た。得られた Sa-1の Staphylococcus aureusに対する抗菌活性を確認した結果、活性を示した。

[0012] Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌）に対する抗菌活性抗菌活性をもつ成分の分画精製

酢酸ェチル可溶画分（Sa-1)の分画

抗菌活性を示した酢酸ェチル可溶画分（Sa-1) 52 gを中性シリカゲルクロマトグラフィーを用いて分画した。カラムの溶出溶媒は、段階的に溶媒の混合比を変えていく st ep wise方式を採用した。 n-へキサン/酢酸ェチル = 5:5を 2.5 L、 4:6, 3:7, 2:8で各 1 L づっ、メタノールのみで 2.5 Lを使用した。溶出成分の分別は TLCの結果に基づき、それらのスポットの検出は UV 254 nmを用いた。その結果、酢酸ェチル可溶画分を 7 フラクションに分画した。 7フラクションはそれぞれ Sa-1-Α (90 mg), Sa_l_B (250 mg), Sa-l-C (3.36 g), Sa— 1— D (3.00 g), Sa— 1— E (110 mg), Sa— 1— F (1.56 g), Sa— 1— G (30.0 g)とした。

[0013] まず、 Sa- 1- C (3.36 g)をクロ口ホルム 5 mLに溶解させ、クロ口ホルムと同量の n-へキサンを加えー晚静置した。すると二層に分離したため、上層（以降 Sa-l-C(l)とする )と下層（以降 Sa-1-C(2)とする）に分けた。この Sa-l-C(l)を溶媒留去すると 2.22 g、 Sa-1-C(2)は 1.14 gであった。

Sa-l-C(l)の分析

Sa-l-C(l) 2.22 gにシリカゲル 3.50 gをカ卩ぇ吸着させ、シリカゲルカラムクロマトダラフィーを用いて分画した。カラムの溶出溶媒には step wise方式を採用し、その組成はクロ口ホルム/アセトン =20:1を 2 L、 7:3, 6:4で各 100 mLづっ、アセトンのみで 500 mL を使用した。その回収には、 110個の 50 mLバイアルを用いた。 110個の 50 mLバイアル力も TLCに基づき、同じ位置にスポットがあった No. 21, 22のバイアルを混合して濃縮することで濃縮物（以降 Sa-ト C(l)-aとする）を得た。この濃縮物をメタノール（ 0.5 mL)に溶かし、高速液体クロマトグラフ装置（HPLC)の分取用 ODSカラムを用いて分画を試みた。

[0014] No. 21, 22のバイアル濃縮物（Sa- 1- C(l)- a)の HPLC分取

溶出条件：カラム： WakosiHI 5C18HG prep, 20.0 mm X 250 mm、移動層： 20 %ァセトニトリル水溶液、流速：5 mL I min、カラム温度： 30。C、検出： UV 260 nm

34.5分の主要なピークを分取し、白色固体（以降 Sa-l-C(l)-aaとする） 60 mgを得た。この白色固体（Sa-l-C(l)-aa)を重メタノールで¹ H, ¹³C NMR ^ベクトルを測定した。

白色固体（Sa- 1- C(l)- aa)の 1H, ¹³C NMR ^ベクトル

1H NMR (500 MHz, CD OD)： δ 3.91 (s, 3H), 6.94 (d, J = 8.6 Hz, IH), 7.42 (d, J =

3

8.6 Hz, IH), 7.43 (s, IH), 9.74 (s, IH)

¹³C NMR (125 MHz, CD OD): δ 56.3, 111.2, 116.3, 127.9, 130.6, 149.6, 154.6, 19

3

2.8

IR (KBr)： 3179, 1668 cm"¹

mp： 114-115°C

[0015] ^JH NMR ^ベクトルにお!/、て δ 9.74に水素 1個のシグナルと¹³ C NMR ^ベクトルにおいて δ 192.8のシグナルを観測したこと力アルデヒド基が存在することが示唆された。 ^ NMR ^ベクトルにおいて δ 3.91のシグナルと¹³ C NMR ^ベクトルにおいて δ 56.3 のシグナル力メトキシ基が存在することが示唆された。また、 ^ NMR ^ベクトルにおいて δ 6.94 (d, J = 8.6 Hz, IH)と δ 7.42 (d, J = 8.6 Hz, IH), δ 7.43 (s, IH)に水素 3 個分および¹³ C NMR ^ベクトルにおいて δ 111.2-154.6に芳香族環に由来する 6本のシグナルが観測された。さらに IR ^ベクトルにおいて 3179 cm— ¹に水酸基の特徴的な吸収を確認した。以上の結果から白色固体（Sa-l-C(l)-aa)の構造は、 3—ヒドロキシ —4—メトキシベンズアルデヒド（バニリン）であると推定した。バニリンは、既知化合物であるため文献値（The Aldrich Library of ¹³C and ^JH FT NMR Spectra EDITION 1 Volume 2, Aldrich Chemical Company, In ）との比較を行い、さらに異性体であるィソバニリンの可能性もあるためこの白色固体（Sa-l-C(l)-_aa)と試薬として購入したバ二リン、イソバニリンを用いて高速液体クロマトグラフ装置（HPLC)の分析用 ODSカラムで確認し、この白色固体（Sa-l-C(l)-aa)がバニリンであると決定した。

[0016] 次に 110個の 50 mLバイアルから TLCに基づき、同じ位置にスポットがあった No. 48 - 55のバイアルを混合して濃縮することで濃縮物（以降 Sa-l-C(l)-bとする） 152 mgを得た。これを再びシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて分画を行った。カラムの溶出溶媒には _step wise方式を採用し、クロ口ホルムのみ 200 mL力始め、クロ口ホルム /アセトン =9.5:0.5を 200 mL、 9:1, 8:2, 7:3,アセトンのみで各 100 mLづっ、最後にメタノールのみで 200 mLを使用した。その回収には 42個の 50 mLバイアルを用いた。

42個の 50 mLバイアルから TLCに基づき、同じ位置にスポットがあった No. 23- 33 のバイアルを混合して濃縮することで濃縮物（以降 Sa-l-C(l)-b_aとする） 102 mgを得た。この濃縮物を分取用 TLCを用いて精製した。展開溶媒には、クロ口ホルム/ァセトン = 7/3を使用した。検出には、 UV 254 nmを用い、搔き取ったシリカゲルをアセトンで溶出し吸引濾過後、溶媒留去して薄黄色固体（以降 Sa-l-C(l)-ba_aとする） 86 mg を得た。この薄黄色固体（Sa-l-C(l)-baa)を重メタノールで¹ H, ¹³C NMRスペクトルを測定した。

[0017] 薄黄色固体（Sa- 1- C(l)- baa)の， ¹³C NMR ^ベクトル

^JH NMR (500 MHz, CD OD): δ 6.92 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.77 (d, J = 8.4 Hz, 2H),

3

9.76 (s, 1H)

¹³C NMR (125 MHz, CD OD): δ 116.8, 130.2, 133.4, 165.1, 192.8

3

IR (KBr)： 3168, 1670 cm—¹

mp： 118- 119°C

[0018] ^JH NMR ^ベクトルにおいて δ 9.76に水素 1個のシグナルと¹³ C NMR ^ベクトルにおいて δ 192.8のシグナルを観測したこと力アルデヒド基が存在することが示唆された。また、 'H NMRスペクトルにおいて δ 6.92, 7.77に水素 2個分で 8.6 Hzのダブレットのシグナルが認められ、 ¹³C NMR ^ベクトルでは δ 116.8-165.1に 4本の芳香族由来のシグナルが観測されたことよりパラ位に置換された芳香族環で存在することがわかる。さらに IR ^ベクトルにおいて 3168 cm— ¹に水酸基の特徴的な吸収を確認した。以上の結果力この薄黄色固体（Sa-l-C(l)-baa)は、アルデヒド基と水酸基がパラ位に置換した P—ヒドロキシベンズアルデヒドであると考えた。そこで、文献値 (The Aldrich Li brary of ¹³C and 'H FT NMR Spectra EDITION 1 Volume 2, Aldrich Chemical Comp any, In ）との比較を行い、この薄黄色固体（Sa-l-C(l)-baa)は、 p—ヒドロキシベンズアルデヒドであると決定した。

[0019] Sa-1-C(2)の分析

Sa-1-C(2) 1.14 gを 2度の再結晶（アセトン/へキサン）によって薄い黄緑色固体（以降 Sa-l-C(2)-aとする） 478 mgを得た。この薄い黄緑色固体（Sa-l-C(2)-a)を重メタノールで 1H, ¹³C NMR ^ベクトルを測定した。

薄い黄緑色固体 (Sa-l-C(2)-a)の 1H, ¹³C NMR ^ベクトル

1H NMR (500 MHz, CD OD)： δ 6.28 (d, J = 16.0 Hz, IH), 6.81 (d, J = 8.6 Hz, 2H)

3

, 7.45 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 16.0 Hz, IH)

¹³C NMR (125 MHz, CD OD)： δ 115.6, 116.8, 127.2, 131.1, 146.7, 161.1, 171.0

3

IR (KBr)： 3168, 2830, 975 cm—¹

mp： 213-214°C

[0020] ^JH NMR ^ベクトルにおいて δ 6.81 (d, J = 8.6 Hz, 2H)および 7.45 (d, J = 8.6 Hz, 2

H)に水素 4個分の 2個のダブレットシグナルが¹³ C NMR ^ベクトルにおいて δ 115.6および 131.1に炭素 2個分の大きなシグナル力 ¾本観測されたことからこの化合物は、パラ位に置換した芳香族環を有すると判断された。また、 ^ NMR ^ベクトルにおいて δ 6.28 (d, J = 16.0 Hz, IH)および 7.61 (d, J = 16.0 Hz, IH)に 16.0 Hzのカップリング定数がある水素がそれぞれ 2個観測されたところからトランス位に置換したアルケンが 1 組存在することがわかった。さらに、 ¹³C NMR ^ベクトルにおいて δ 171.0にカルボ- ル基の存在が確認された。さらに IR ^ベクトルにおいて 3168 cm— ¹に水酸基の特徴的な吸収を確認した。以上のことからこの薄い黄緑色固体（Sa_ト C(2)_a)の構造は、トランス p タマル酸であると判断した。そこで文献値 (The Aldrich Library of ¹³C an d ^JH FT NMR Spectra EDITION 1 Volume2, Aldrich Chemical Company, Inc.)との比較を行い、この薄い黄緑色固体（Sa-l-C(2)-a)は、トランス p タマル酸であると決定した。

[0021] Sa— 1— Fの分析

酢酸ェチル可溶画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで分画したフラクションのうち Sa- 1- F (1.56 g)にクロ口ホルムを加えよく攪拌し、溶けた液層を取り除いた。その後、クロ口ホルムに溶けな力つたものに対してアセトンをカ卩え、アセトン可溶の液層 (以降 Sa-l-F(l)とする）とアセトン不溶の固層 (以降 Sa-1-F(2)とする）に分けた。 Sa-1-F(

I)は溶媒留去して 162 mg、 Sa-1-F(2)は 1.40 gであった。

[0022] Sa-l-F(l)の分析

Sa-l-F(l) 162 mgに再びアセトンをカ卩ぇ溶かし、静置した。その後、液層の濁っていない上層部のみを回収した。アセトン溶媒を留去し黄色固体（以降 Sa-l-F(l)-aとする） 10 mgを得た。高速液体クロマトグラフ装置（HPLC)の分析用 ODSカラムを用いてこの化合物の純度を確認したところ、純度は非常に高いことがわ力つた。また、 UV 260 nmにお!/、て強!、吸収を持つことがわかった。

この黄色固体（Sa-l-F(l)-a)を重アセトンで¹ H, ¹³C NMR ^ベクトルを測定した。

[0023] 黄色固体（Sa-l-F(l)-a)の 1H, ¹³C NMR ^ベクトル

^JH NMR (500 MHz, (CD ) CO)： δ 3.97 (s, 6Η), 6.26 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 6.56 (d, J

3 2

= 2.3 Hz, 1H), 6.74 (s, 1H), 7.39 (s, 2H)

¹³C NMR (125 MHz, (CD ) CO)： δ 56.9, 94.9, 99.7, 104.7, 105.2, 105.4, 122.4, 14

3 2

0.9, 149.1, 158.8, 163.4, 164.9, 165.1, 183.1

IR (KBr)： 3357, 1615 cm—¹

mp： 276-277°C

MS (FAB)： m/z = 331 [M++1]

[0024] ¹³C NMRスペクトルより炭素が 17個存在し、 DEPTより 1級炭素が 2個、 3級炭素が 5 個、 4級炭素が 10個存在することを確認した。 ^JH NMR ^ベクトルにおいて δ 3.97 (s, 6 H)に水素 6個分のシングレットシグナルカ ³ C NMRスペクトルにおいて δ 56.9にシグナルが観測されたことから 2個の等価なメトキシ基が存在することがわかる。さらに 1 ベクトルにおいて 3357 cm— ¹に水酸基の存在、 1615 cm— ¹に水素結合の可能性のあるカルボニル基の吸収を確認した。また、質量分析の結果、分子量は 330であり、 C H

17 1

0の可能性が考えられた。この黄色固体（Sa-l-F(l)-a)が下記の式で 5, 7, 4'—ト

4 7

リヒドロキシ 3' , 5'ージメトキシフラボンであると考えた。そこで文献値 (C. Kong, X. Xu, B. Zhou, F. Hu, C. Zhang, M. Zhang, Phytochemistry, 65, 1123-1128 (2004))との比較を行い、文献値と近いことからこの黄色固体（Sa-l-F(l)-a)が 5, 7, 4'—トリヒドロキシ 3' , 5'ージメトキシフラボンであると決定した。

[0025] Sa-1-F(2)の分析

Sa-1-F(2) 1.40 gにシリカゲル 3.00 gをカ卩ぇ吸着させ、シリカゲルカラムクロマトダラフィーを用いて分画した。カラムの溶出溶媒には step wise方式を採用し、クロ口ホルム /アセトン = 10:1, 8:2を 200 mL、 5:5, 3:7,アセトンのみで各 300 mLづっ、メタノールのみで 200 mLを使用した。その回収には、 53個の 50 mLバイアルを用いた。

53個の 50 mLバイアルから TLCの結果に基づき、同じ位置にスポットがあった No. 4 2-48のバイアルを混合して濃縮することで薄黄色個体（以降 Sa-l-F(2)-aとする） 46 mgを得た。この薄黄色固体（Sa-l-F(2)-a)を重メタノールで¹ H, ¹³C NMRスペクトルを測定した。

[0026] 薄黄色固体（Sa- 1- F(2)- a)の， ¹³C NMR ^ベクトル

^JH NMR (500 MHz, CD OD)： δ 7.21-7.28 (m, 2H), 7.99 (dd, J = 4.1.0.7 Hz, 1H),

3

8.09 (d, J = 2.3 Hz, 1H)

¹³C NMR (125 MHz, CD OD)： δ 124.4, 125.9, 138.3, 140.8, 155.9

3

IR (KBr)： 3449 cm—¹

mp： 127-128°C

[0027] ^JH NMR ^ベクトルにおいて δ 7.21-7.28 (m, 2H)と δ 7.99 (dd, J = 4.1.0.7 Hz, 1H),

δ 8.09 (d, J = 2.3 Hz, 1H)に水素 4個分および¹³ C NMR ^ベクトルにおいて δ 124.4- 155.9に芳香族環に由来する 5本のシグナルが観測された。さらに IR ^ベクトルにおいて 3168 cm— ¹に水酸基の特徴的な吸収を確認した。以上のことから薄黄色固体（Sa-1 -F(2)-a)力 ¾ーヒドロキシピリジンであると考えた。そこで文献値 (The Aldrich Library of ¹³C and ^JH FT NMR Spectra EDITION 1 Volume2, Aldrich Chemical Company, In c.)との比較を行い、文献値と近いこと、および融点（文献値 126-129°C)力この薄黄色固体（Sa-l-F(2)-a)カ^ーヒドロキシピリジンであると決定した。

[0028] 抗菌試験

寒天希釈法 (Agar dilution法）

トランス一 p—タマル酸， 3—ヒドロキシピリジン， p—ヒドロキシベンズアルデヒド，バニリンに対しては、寒天希釈法という抗菌試験法を用いた。

寒天希釈法とは、はじめに溶カゝした試料溶液を数段階に希釈し、寒天培地と混ぜ、試料濃度の異なる平板培地を作成する。この平板培地に菌を植え付け、試料に抗菌活性がある場合は菌の発育を阻止することができ、菌の発育を阻止できた最も低ヽ濃度を最小発育阻止濃度 (MIC： Minimum Inhibitory Concentration)として試料の抗菌効果の強弱を判定すると、う方法である。まず、試料 400 mgを DMSO 1 mLに溶力し、 400 mg/mLの試料溶液を調製した。この 400 mg/mLの試料溶液 0.5 mLを 2倍希釈し、 200 mg/mLの試料溶液を調製し、同様にして 100 mg/mL, 50.0 mg/mL, 25.0 mg/mLの試料溶液を調製した。また、 300 m g/mL試料溶液も用意した。これらの試料溶液 0.2 mLを BHI (Brain Heart Inlusion Ag ar, Becton Dickinson, MD)培地 19.8 mLと混ぜ、シャーレに試料濃度 4.0 mg/mL, 3. 0 mg/mL, 2.0 mg/mL, 1.0 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.25 mg/mLの平板培地を作成した。試料の抗菌効果の比較対照としてカテキンの同濃度平板培地も作成した。力テキンは DMSOに難溶なため、滅菌水を用いた。

[0029] 今回被験菌として！treptococcus pneumoniae (月巿炎珠！ ¾λ Streptococcus pyogenes (ィ匕膽性連鎖球菌ノ, Enterococcus faecalis (月昜球菌ノ, Staphylococcus aureus、j 色ブトウ ¾H 入 Escnenchia coli、大腸！ ¾ノ, salmonella sp. (サルモ不フ , Yersinia entero colitica (エルン-ァ), Vibrio parahaemolyticus (月昜炎ビブリオ), Pseuaomonas aerugi nosa (緑膿菌)， Bacillus cereus (セレウス菌)， Bacillus subtilis (枯草菌） MB- 32, Bacill us subtilis (枯草菌） ATCC6633, Candida sp. (カンジダ）の 13株を用いた。

これらの菌を滅菌した MHB^R液体培地（Mueller Hinton Broth", Becton Dickinson, M D) 2 mLに混ぜ、濁度 1 (菌濃度 10⁸/mL)の菌液を調製した。あら力じめ目皿のそれぞれのセルに小試験管を入れ滅菌した。目皿のそれぞれの小試験管の中に 13株の菌液 1 mLを注入した。ミクロプランター (SAKUMA,型式 MIT-P)で目皿の各試験管力も 10 Lを摂取し別の試験管に移し、菌液を 100倍（菌濃度 10⁶/mL)に希釈した。ミクロプランターを用いてこの菌液 10 し（菌数 14.0)を各濃度の試料溶液を混入しておいた平板培地に植え付け、 37°Cの恒温器中で 18時間培養し、化合物の抗菌力の評価を行った。結果を表 2〜6に示す。

[0030] [表 2] トランス一 p —クマル酸の抗菌試 S 結果 + 生育する - ：生育しない

No 濃度 (mg/mL) MIC

0 0.25 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0

1 Sterptococcus pneumoniae + + + + 2.0

2 Sterpto coccus pyogenes + + + + 一 ― 3.0

3 Enterococcus faecalis + + + + + +

4 Staphylococcus aureus + + + + + 4.0

5 Escherichia coli + + + + + +

6 Salmonella sp. + + + + + +

7 Yersinia enterocoliuca + + + + + + - 4.0

8 Vibrio trhacaemalyticuss + + + + + - - 3.0

9 Pseudomonas aeruginosa + + + + + +

10 Bacillus cereus + + + + - 3.0

1 1 Bacillus subtiiis B-32 + + + + + +

12 Bacillus subtiiis ATCC 6633 + + + + - - 3.0

13 Candida sp. + + -h ― - 3.0

[0031] [表 3]

[0032] [表 4]

p — ヒドロキシベンズアルデヒドの抗菌試験結果 + ：生育する - ：生育しない

No 濃度 (mg/mL) MIC

0 0.25 0.5 1 .0 2.0 3.0 4.0

1 Sterptococcus pneumoniae + + + + 2.0

2 Sterptococcus pyogenes + + + + 2.0

3 Enterococcus faecalis + + + + + + +

4 Staphylococcus aureus + + + + + 3.0

5 Escherichia coli + + + + 2.0

6 Salmonella sp. 2.0

7 Yersinia enterocolitica + + 0.5

8 Vibrio trhacaemalyticuss + + + + ― ― ― 2.0

9 Pseudomonas aeruginosa + + + + 2.0

10 Bacillus cereus + + + + + 3.0

1 1 Bacillus subtihs MB-32 + + + + + + 3.0

12 Bacillus subtihs ATCC 6633 + + + + + 3.0

13 Candida sp. + + + + + 3.0

[0033] [表 5]

[0034] [表 6]

カテキンの抗菌試験結果 + ：生育する - ：生育しない

No 濃度 (mg/mL) MIC

0 0.25 0.5 1 .0 2.0 3.0 4.0

1 Sterptococcus pneumoniae + + + 1 .0

2 Sterptococcus pyogenes + + + + 2.0

3 Enterococcus faecalis + + + + + + +

4 Staphylococcus aureus + + + 1 .0

5 Escherichia coli + + + + + + + 2.0

6 Salmonella sp. 十 2.0

7 Yersinia enterocolitica + + + 1 .0

8 Vibrio trhacaemalyticuss + + ― ― 0.5

9 Pseudomonas aeruginosa + + + 1 .0

10 Bacillus cereus + + + 1 .0

1 1 Bacillus subtihs MB-32 + + + + 2.0

12 Bacillus subtihs ATCC 6633 + + + + + 3.0

13 Candida sp. + + + 1 .0

[0035] 以上の結果からトランス ρ タマル酸は、 Streptococcus pneumoniae (肺炎球菌)， Streptococcus pyogenes (ィ匕膽性連球菌), Stapnylococcus aureus ( 色ブドウ球菌 ), Yersinia enterocolitica (エノレン-ァ), Vibrio parahaemolyticus (月昜炎ヒ、、ブリオ), Bac illus cereus (セレウス菌)， Bacillus subtilis (枯草菌） ATCC6633, Candida sp. (カンジダ）に対して活性を示した。最小発育阻止濃度（MIC)は、肺炎球菌に対しては 2.0 m g/mL、化膿性連鎖球菌，腸炎ビブリオ，セレウス菌，枯草菌 ATCC6633,カンジダに対しては 3.0 mg/mL,黄色ブドウ球菌，エルシニアに対しては 4.0 mg/mLであった。

3—ヒ口³ rシピリンンは、 Sterptococcus pneumoniae (月—巾炎球菌), Sterptococcus py ogenes (ィ匕g'性連鎖球菌), Staphylococcus aureus (I色フドウ ¾ · λ Yersinia entero colitica エノレシニア), Pseudomonas aeruginosa 菌), Candida sp. (カンンタ )に対して活性を示した。 MICは、肺炎球菌，化膿性連鎖球菌，黄色ブドウ球菌，エルシ二了,緑膿菌，カンジダに対して 4.0 mg/mLであった。

[0036] p ヒドロキシべンズァノレデヒドは、 Streptococcus pneumoniae (月巿炎球菌)， Streptoc occus pyogenes (ィ匕膽性連鎖珠入 staphylococcus aureus、色ブ！ ^SklS), Esche ncnia coli、人月暴歯), Salmonella sp. (サノレモ不フ菌), Yersinia enterocolitica (エノレン

Vibrio paranaemolyticus (月昜炎ビブリオ), Pseudomonas aeruginosa (緑膽菌) , Β acillus cereus (セレウス菌)， Bacillus subtilis (枯草菌） MB- 32, Bacillus subtilis (枯草菌） ATCC6633, Candida sp. (カンジダ）と多くの菌に対して活性を示した。特にエルシニアに対して強い活性を示し、 MICは 0.5 mg/mLであった。ノ -リンは、 Streptococcus pneumoniae (月巿炎球菌), Streptococcus pyogenes (ィ匕膽性連鎖球菌), Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌), Escherichia coli (大腸 ), S almonella sp. (サノレモ不フ歯), Yersinia enterocolitica (エノレンユア), Vibrio parahaem olyticus (月昜炎ビブリオ)， Bacillus cereus (セレウス菌)， Bacillus subtilis (枯草菌） MB-

32, Bacillus subtilis (枯草菌） ATCC6633, Candida sp. (カンジダ）に対し活性を有することを確認した。バニリンも同様に多くの菌に対する活性を有し、そのなかでも特にエルシニアに対して強い活性を示し、 MICは 0.5 mg/mLであった。

Paper Disk法

5, 7, 4'—トリヒドロキシ一 3 ' , 5 '—ジメトキシフラボンの抗菌試験として、溶媒の影響が出ても抗菌活性の有無の判定が可能な Paper Disk法を用いた。

Paper Disk法とは、はじめに濃度の異なる試料溶液を調製し、この試料溶液を専用のペーパーディスクに吸収させて乾燥させる。調製した菌液と寒天培地と混ぜて作成した平板の上に試料溶液を吸収させたペーパーディスクを並べる。試料に抗菌活性がある場合はペーパーディスクを中心に菌の繁殖を阻止することを示す阻止円が形成される。その阻止円の大きさで抗菌効果の強弱を判定するという方法である。まず、試料である 5, 7, 4，一トリヒドロキシ一 3，， 5，一ジメトキシフラボン 4 mgを 200 μ Lに溶力し 20 mg/mLの試料溶液を調製した。この 20 mg/mLの試料溶液 100 μしに滅菌水 100 μ Lを加え、 10 mg/mLの試料溶液 200 μ Lを調製した。そこに DMSO 60 μ Lと滅菌水 140 μ Lを加え、 5.0 mg/mLの試料溶液 400 μ Lを調製した。 DMSO 30 %では試料が析出してしまうため、 DMSO 40 %に設定した。 5.0 mg/mLの試料溶液 35 0 μ Lに DMSO 140 μ Lと滅菌水 210 μ Lを加え、 2.5 mg/mLの試料溶液 700 μ Lを調製した。同様にして 1.25 mg/mL, 0.625 mg/mLの試料溶液を調製した。コントロールとして DMSO 40 %,滅菌水 60 %溶液も用意した。比較対照として同濃度のカテキン水溶液も用意した。これらの溶液 70 μ Lをペーパーディスク（直径 8.12 mm)に吸収させ、 1日乾燥させた。

被験菌として Staphylococcus aureus 色プゥ球菌)， salmonella sp. (サノレモ、フ菌)， Yersinia enterocolitica (エノレンニフ ), Pseudomonas aeruginosa (緑膿菌)， Candia a sp. (カンジダ）を用いた。これらの菌を滅菌水 2 mUこ混ぜ、濁度 1 (10⁸/mL)の菌液を調製した。この菌液 0.2 mLと BHI培地 19.8 mLを混ぜ、平板培地を作成した。この平板培地の上に乾燥させたペーパーディスクを置き、 37°Cの恒温器中で培養し、評価を行った。結果を表 7に示す。表中（一）は抗菌活性を示さないことを表す。

[0038] [表 7]

[0039] 以上の結果より、 5, 7, 4，—トリヒドロキシ— 3，， 5，—ジメトキシフラボンは、サルモネラ菌，緑膿菌に対して抗菌活性を有することがわ力つた。また、カテキンと比較してもその抗菌活性はとても強、ことがわ力つた。

[0040] 隈笹の葉の熱水抽出液（Sa, 2.3 kg)を酢酸ェチルによって抽出し、酢酸ェチル可溶画分（Sa-1, 78 g)を得た。 Staphylococcus aureus (黄色ブドウ球菌）に対する抗菌試験の結果、酢酸ェチル可溶画分（Sa-1)に抗菌活性が局在した。酢酸ェチル可溶画分（Sa-1)を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて 7フラクションに分画した。 7フラクションはそれぞれ Sa-1- A (90 mg), Sa- 1- B (250 mg), Sa- 1- C (3.36 g), Sa -1-D (3.00 g), Sa-l-E (110 mg), Sa— 1— F (1.56 g), Sa— 1— G (30.0 g)とした。 Sa— 1— C ( 3.36 g)にクロ口ホルムと n-へキサンをカ卩えることで 2層に分離し、 Sa-l-C(l) (2.22 g), Sa-1-C(2) (1.14 g)を得た。 Sa- 1- C(l) (2.22 g)を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて分画し、 Sa-l-C(l)-a, Sa-l-C(l)-bを得た。 Sa-l-C(l)-aを高速液体クロマトグラフ装置（HPLC)の分取用 ODSカラムを用いて分画した結果、白色固体（Sa-1 -C(l)-aa) 60 mgを得た。スペクトルデータおよび HPLCによる分析の結果、白色固体 (Sa-l-C(l)-aa)は、バニリンであると決定した。また、 Sa-l-C(l)-bを再度中性シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて分画した Sa-l-C(l)-baを分取用 TLCによって薄黄色固体（Sa-l-C(l)-baa) 86 mgを得た。スペクトルデータから薄黄色固体（Sa-1 -C(l)-baa)は、 p ヒドロキシベンズアルデヒドであると決定した。さらに Sa- 1- C(2) (1. 14 g)を 2度の再結晶によって薄い黄緑色固体（Sa-l-C(2)-a) 478 mgを得た。スぺクトルデータ力薄い黄緑色固体（Sa-l-C(2)-a)は、トランス一 p—タマル酸であると決定した。次に Sa- 1- F (1.56 g)をアセトン可溶の Sa- 1- F(l) (162 mg)とアセトン不溶の Sa-1-F(2) (1.40 g)に分離した。 Sa- 1- F(l) (162 mg)に再度アセトンを加え、液層を分離し、黄色固体（Sa-ト F(l)- a) 10 mgを得た。スペクトルデータから黄色固体（Sa- 1 -F(l)-a)は、 5, 7, 4，一トリヒドロキシ一 3，， 5，一ジメトキシフラボンであると決定した。さらに Sa-1-F(2) (1.40 g)を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて薄黄色個体（Sa-l-F(2)-a) 46 mgを得た。スペクトルのデータから薄黄色固体（Sa-l-F(2)-a) 力 S 3—ヒドロキシピリジンであると決定した。

[0042] バニリン， p ヒドロキシベンズアルデヒド，トランス一 p—タマル酸， 3 ヒドロキシピリジンの抗菌活性は寒天希釈法を用いて調べた。その結果、バニリン， p ヒドロキシベンズアルデヒド，トランス p タマル酸， 3—ヒドロキシピリジンが抗菌活性を有することを確認した。その中でも特にバニリン， p ヒドロキシベンズアルデヒドは食中毒菌である Yersinia enterocolitica (エルシ-ァ）に対して強い抗菌活性を示した。 5, 7, 4 ，一トリヒドロキシ一 3，， 5，一ジメトキシフラボンの抗菌試験には、 Paper Disk法を用いた。その結果、 5, 7, 4'—トリヒドロキシ一 3 ' , 5 '—ジメトキシフラボンは Salmonella sp. (サルモネラ菌)， Pseudomonas aeruginosa (緑膿菌）に対して抗菌活性を示した。この活性は、カテキンと比較してもとても強いものであった。

[0043] 本発明者は隈笹以外の植物についても上述の有効成分の抽出を試みた。その結果、イネ科に属する多くの植物、例えば、イネ (米）、コムギ (小麦)、トウモロコシ、ォォムギ、ライムギ、サトウキビ、タケ、ススキ、パンパスグラス、ァシ (葦、ヨシともいう）等にも 5, 7, 4，一トリヒドロキシ一 3，， 5，一ジメトキシフラボン（トリシン）が多量に含まれることを見出した。具体的な植物名は以下のとおりである。

イネ、コムギ、ォォムギ、カラスムギ、ライムギ、キビ、ァヮ、ヒェ、トウモロコシ、シコクビエ、モロコシ、タケ、マコモ、サトウキビ、ハトムギ、ヨシ、ススキ、ササ、ダンチタ、シロガネヨシ、シバ。

[0044] イネ科 Gramineae

タケ亜科 Bambusioideae (タケ科 Bambusaceae)

ホウライチク属 Bambusa:ホウライチタ、ホウォゥチタ（以上バンブー類）ォカメザサ属 Shibataea:ォカメザサ

マダケ属 Phyllostachys:モウソゥチク、マダケ、ハチク

ナリヒラダケ属 Semiarundinaria:ナリヒラダケ、ヤシャダケ（以上タケ類）メダケ属 Pleioblastus :ネザサ、ァズマネザサ、メダケ、リュウキユウチタャダケ属 Pseudosasa:ャダケ、ャクシマダケ

スズダケ属 Sasamoi ha:スズタケ

ァズマザサ属 Arundrinaria：ァズマザサ、スェコザサ

ササ属 Sasa:ミヤコザサ、チマキザサ、クマザサ、チシマザサ（以上ササ類） [0045] イチゴツナギ亜科 Poelideae

カモジグサ属 Agropyron:シバムギ、カモジグサ、ァォカモジグサ

スズメノテツポゥ属 Alopecurus :スズメノテツポゥ、セトガヤ

ダンチク属 Arundo :ダンチタ

コパンソゥ属 Briza:コ/ ンソゥ、ヒメコノンソゥ

スズメノチヤヒキ属 Bromus :スズメノチヤヒキ、ィヌムギ

力モガャ属 Dactylis :カモガヤ

スズメガャ属 Eragrostis :カゼクサ、スズメガヤ、シナダレスズメガヤ、ニヮホコリォォムギ属 Horudeum:ォォムギ、ムギクサ

コムギ属 Triticum:コムギ

ドクムギ属 Lolium:ホソムギ、ネズミムギ、ドクムギ

イチゴツナギ属 P_{0a :}スズメノカタビラ、イチゴツナギ

ゥシノケグサ属 Festuca:ナギナタガヤ、ゥシノケダサ、トボシガラ

ドジヨウツナギ属 Glyceria:ムツオレダサ、ドジヨウツナギ

コメガャ属 Melica:ミチシバ、コメガヤ

ササクサ属 Lophatherum :ササクサァゼガヤ属 Leptochloa:ァゼガヤ

カズノコグサ属 Beckmannia:カズノコグサ

ネズミノォ属 Sporobolus :ネズミノォ、ヒゲシバ

ォヒシバ属 Eleusine :ォヒシノ、シコクビエ

ギヨウギシバ属 Cynodon:ギヨウギシバ

ヨシ属 Phragmites:ゥラハグサ、ヨシ、ツルヨシ

タキキビ属 Phaenosperma

サャヌ力グサ属 Leersia

イネ属 Oryza:イネ

マモ属 Zizania:マ =！モ

カラスムギ属 Avena:カラスムギ、ェンパク

コメススキ属 Deshampsia:コメススキ、ヒロハノコメススキカニッリグサ属 Trisetum:カニッリグサ、リシリカ-ッリミノボロ属 Koeleria:ミノボロ

コゥボウ属 Hierochloe :コゥボウ、ミヤマコゥボウ

クサヨシ属 Phakris:クサヨシ、カナリ一クサヨシ

コヌカグサ属 Agrostis :コヌカグサ、ヌカボ

ヒェガエリ属 Polypogon

ァヮガエリ属 Phleum：ァヮガエリ、ォオアヮガエリ

ノガリヤス属 Calamagrostis：ノガリヤス、ホッスガヤ、ャマァヮシバ属 Zoysia:シバ、コゥライシパ、ォ-シバ、ナガミオ-シバキビ亜科 Panicoideae

卜ダシバ属 Arundinella

ゥンヌケ属 Eulalia:ゥンヌケ、ゥンヌケモドキ

チゴザサ属 Isachne:チゴザサ、ハイチゴザサ

キビ属 Panicum:キビ、ハイキビ、ヌカキビ

ヒェ属 Echinochloa:ヒェ、ィヌビエ

チヂミザサ属 Oplismenus：チヂミザサェノコログサ属 Setaria:ササキビ、ェノコログサ、ァヮ、キンエノコロ

スズメノヒェ属 Paspalum:スズメノヒェ、キシュウスズメノヒェ、シマスズメノヒェメヒシバ属 Digitaria、メヒシバ、アキメヒシパ

チカラシバ属 Pennisetum:チカラシノく、ナビアグラス

ツキィゲ属 Spinifex：ツキィゲ

サトウキビ属 Saccharum:サトウキビ、ヮセォパナ

チガヤ属 Imperata:チガヤ

アブラススキ属 Eccoilopus :アブラススキ

ススキ属 Miscanthus:ススキ、オギ、トキヮススキ、カリヤス

ァシボソ属 Microstegium :ササガヤ、ァシボソ

イタチガヤ属 Pogonatherum:イタチガヤ

カリマタガャ属 Dimeria:カリマタガヤ

ゥシノシッペイ属 Hemarthria：ゥシノシッペイ、コパノウシノシッペイ

アイァシ属 Phacelurus :アイァシ

力モノハシ属 Ischaemum :力モノハシ、ケカモノハシ

コブナダサ属 Arthmxon：コブナダサ

ォガルカャ属 Cymbopogon:ォガノレカャ

ヒメアブラススキ属 Bothriochloa：ヒメアブラススキ

ゥシクサ属 Schizoachyrium：ゥシクサ

メリケンカルカャ属 Andropogon:メリケンカルカャ

メガルカャ属 Themeda:メガルカャ

モロコシ属 Sorgham:モロコシ、サトウモロコシ、セィバンモロコシ、スーダングラスジュズダマ属 Coix:ジュズダマ、ハトムギ

トウモロコシ属 Zea:トウモロコシ

上記植物の葉、茎等を適切な溶媒を使用して抽出し、 HPLC等の分離精製手段を用いてトリシンを分離精製できる。例えば、水抽出物を濃縮し、固形物をアルコール、含水アルコール（例えば、メタノール、エタノール、含水メタノール、含水エタノール）抽出し、固形分を水に溶解し、酢酸ェチルとの分配等により精製できる。隈笹の乾燥葉 5gを各種有機溶媒 50mlに浸漬静置し、抽出液を濃縮し、固形分を得た。隈笹の葉の質量を 100としたときの各種抽出液の固形分の割合とこの固形分中に含まれるトリシンの割合を以下の表に示す。

[0048] 次に隈笹の葉 50g、溶媒 1Lを用いて抽出し、抽出液の溶媒を留去した際の固形分に含まれるトリシンの量 (mg)を求めた。結果を以下の表に示す。

隈笹の葉 50gをメタノール 500mlに浸漬し、静置した。その後、濾過し、溶媒留去してメタノール抽出物 5. 05gを得た。次にへキサン、クロ口ホルム、酢酸ェチル、 _n—ブタノールの順で分配作業を行い、固形分の量及びその中のトリシンの量を求めた。結果を以下の表に示す。

[0050] 次に隈笹の葉 50gを用いてメタノール 500mlで、抽出を行、、溶媒留去後、これを水に溶解し、各種溶媒を用いて分配作業した際の各固形分に含まれるトリシンの量を求めた。結果を以下の表に示す。

隈笹の葉の各種含水エチルアルコール抽出液を濃縮乾燥して固形分 (B)を得た。これを水に溶解後、酢酸ェチルとの分配作業を行い、溶媒を留去し、固形分 (C)を得た。固形分 (B)を 100としたときの酢酸ェチル抽出固形分 (C)の割合を以下の表に示す。また固形分 (B)及び固形分 (C)中のトリシンの分析結果 (質量％)も合わせて示す。

*:予備濃縮済

葦（ァシ、ヨシ）の葉、茎、及び及び竹の葉の各種含水エチルアルコール抽出液 (D )の溶媒を留去して固形分 (E)を得た。これを水に溶解し、酢酸ェチルにより分配作業を行い、酢酸ェチル可溶部の固形分 (F)を得た。固形分 (E)lOOg用いた場合の固形分 (E)及び固形分 (F)中のトリシンの量を分析した。結果を以下の表に示す。抽出液（D ) 固形分（E) 1 0 0 g中の固形分（ F ) 1 0 0 g中のトリシンの量（m g ) トリシンの量（m g ) 葦の葉 ( 2 5 %エタノール） 31 45.8

葦の茎（ 2 5 %ェタノール） 28 19.6

竹の葉（ 7 0 %ェタノール） 110 64.0

竹の葉（ 9 0 %エタノール） 150 109.2 [0053] 本発明の抗微生物性組成物

上記化合物（バニリン， p ヒドロキシベンズアルデヒド，トランス— p—タマル酸， 3— ヒドロキシピリジン、 5, 7, 4 '—トリヒドロキシ 3' , 5，ージメトキシフラボン）（この明細書にお 1、て「本発明の化合物」ともヽぅ）の少なくとも 1種を有効成分とする本発明の抗微生物剤は、種々の形態で使用できる。例えば、粘膜保護組成物、細菌感染予防及び Z又は治療用組成物、防腐剤、濾過装置等の抗微生物剤として好適である。本発明の抗微生物剤の剤型は、液体状、固体状、気体状いずれでも良い。本発明の抗微生物剤は、経口、非経口投与いずれの投与形態で投与してもよい。経口投与形態としては錠剤、丸剤、粉剤、液剤、チューインガム、飴、チョコレート、パン、クッキ一、そば、うどん、各種ドリンク剤等の食品形態が、非経口投与形態としては、注射剤、局所投与剤 (クリーム、軟膏等)、座薬等が挙げられる。局所投与剤の剤型の例としては、本発明の抗微生物剤を、天然繊維又は合成繊維製のガーゼ等の担体に含浸させたもの、口紅等の化粧品に含有させたもの等が挙げられる。

本発明の抗微生物剤は、ヒトはもとより、ヒト以外の哺乳類、鳥類、魚類、爬虫類等用の抗微生物剤としても有効である。従って本発明の抗微生物剤は、これらの動物の用の抗微生物剤（例えば、ペット用医薬、ペットフード等）として使用することができる。さらに本発明の抗微生物剤は、動物以外に、各種植物に対する抗微生物剤としても有用であり、また、防腐剤としても有用である。

[0054] 本発明の種々の剤型の抗微生物剤の製造には、所定量の上記化合物のほか、通常の医薬組成物、化粧品、皮膚用組成物等に使用される油性成分等の基材成分、保湿剤、防腐剤等を使用することができる。

抗微生物剤に使用する水は、水道水、天然水、精製水等、特に限定されないが、一般にイオン交換水等の高純度の水が好まし、。

油性成分としては、スクヮラン、牛脂、豚脂、馬油、ラノリン、蜜蝌等の動物性油、ォリーブ油、グレープシード油、パーム油、ホホバ油、胚芽油（例えば、米胚芽油）等の植物性油、流動パラフィン、高級脂肪酸エステル (例えば、パルミチン酸ォクチル、パルミチン酸イソプロピル、ミリスチン酸オタチルドデシル）、シリコーン油等の合成油、半合成油が挙げられる。油性成分は、皮膚の保護、ヱモリヱント性付与効果 (皮膚表面を薄膜で覆い、乾燥を防ぐと共に、柔軟性、弾力性を与える効果)、さっぱり感等の要求性能に合わせて適宜組み合わせて用いられる。スクヮラン、ォリーブ油及びミリスチン酸オタチルドデシルの組合せは好まし!/、例の一つである。

抗微生物剤の硬さ、流動性を調節するために、ステアリン酸、ステアリルアルコール、ベへニン酸、セタノール、ワセリン等の固体油が用いられ、好ましくはステアリン酸とセタノールが組み合わせて用いられる。

[0055] 本発明の抗微生物剤をクリーム組成物として製造するためには、本発明の化合物、水、油性成分をクリーム状にするためのクリーム化剤が用いられる。クリーム化剤は、特に限定されないが、モノステアリン酸グリセリンと自己乳化型モノステアリン酸グリセリン (モノステアリン酸グリセリンに乳化剤を添加したもの）とを組み合わせて使用するのが一般的である。

本発明の抗微生物剤には、さらに必要に応じて安定化剤、保湿剤、創傷治癒剤、防腐剤、界面活性剤等を含有させることができる。

安定化剤としては、カルボキシビ二ルポリマーと水酸ィ匕カリウムの組合せ、ジステアリン酸ポリエチレングリコール等が挙げられる。特に、セスキステアリン酸ポリエチレングリコール（ジステアリン酸ポリエチレングリコールとモノステアリン酸ポリエチレングリコールの 1： 1混合物）（ポリエチレングリコールの分子量は 1000〜2万）は、安定性が高ぐ水と油に分離することがなぐまた、クリーム組成物として皮膚に塗布する際の硬さを効果的に調節することができるので好ましい。

保湿剤としては、ヒアルロン酸ナトリウム、コラーゲン、アロエエキス（特に、木立ァロェ由来のアロエエキス（2)が好ましい）、尿素、 1, 3—ブチレングリコール、グリセリン、トレハロース、ソルビトール、アミノ酸、ピロリドンカルボン酸ナトリウム等が挙げられる

創傷治癒剤としては、アラントイン、グリチルリチン酸ジカリウム、カンゾゥエキス、ョモギエキス等が挙げられる。

[0056] 防腐剤は、本発明の化合物自体に抗菌作用があるため補助的に用いられるものである。例えば、安息香酸ナトリウム、ノラヒドロキシ安息香酸低級アルキルエステル (例えば、メチル、ェチル、プロピル又はブチルエステル等のパラベンと称されるもの）、プロピオン酸ナトリウム、混合脂肪酸エステル (カプリン酸グリセリル、ラウリン酸ポリグリセリル 2、ラウリン酸ポリグリセリル 10の混合物）、フエノキシエタノール、感光素 201号 (黄色色素）、 1, 2—ペンタンジオール等が挙げられるが、パラベン、混合脂肪酸エステル、 1, 2—ペンタンジオールが好ましい。

界面活性剤としては、例えば、 N—ァシル—L グルタミン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート等が挙げられる。

さらに必要により、香り成分、例えば、オレンジオイル、レモンオイル、トウヒ油、香料等を含有させてもよい。

[0057] 本発明の抗微生物剤を含有する粘膜保護組成物、細菌感染予防及び Z又は治療用組成物は、目、鼻、喉、耳、肛門、陰部等の粘膜や、創傷部位及び皮膚力もの感染性細菌の体内への侵入を効果的に抑制し、院内感染を含む細菌感染を効果的に予防し、及び Z又は治療するものである。粘膜保護組成物、細菌感染の予防及び Z 又は治療用組成物のさらに具体的な形態としては、粘膜保護布や口腔組成物が挙げられる。

[0058] 粘膜保護布は、通気性を有する担体、例えば、シルク、綿、麻等の天然繊維、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル、アクリル等の合成繊維、半合成繊維、あるいはこれらの 2種以上の混合物の繊維自体又は糸、又はその織布、編布、不織布、紙等に本発明の抗微生物剤を含浸、噴霧等の方法により含有させたものである。この明細書中「保護布」には、便宜上、布の他、繊維自体、糸、紙等も含むものとする。

具体的な形態としては、ガーゼ、マスク、眼帯、生理帯、生理用ナプキン、包帯、トィレットペーパー、痔疾処置用ガーゼ、耳栓、水絆創膏等の衛生用品に分類される粘膜や皮膚に直接接触する保護布の他、白衣等の衣類、手袋、帽子、靴下、足袋等の衣料品小物、シーツ、布団カバー、枕カバー、ベッド用品等の寝具類、カーテン、壁紙、カーペット等の室内装飾品及び内装材料、手術用縫合糸等の医療材料等、皮膚に直接又は間接に接触する物品も挙げられる。

[0059] 本発明の抗微生物剤を含有する口腔組成物としては、例えば、グミ、ゼリー、トローチ、キャンディー、チューインガム、錠剤、丸剤、洗口剤、嗽剤、歯磨き、粘膜貼付フイルム、咽頭部炎症治療用噴霧剤、等が挙げられる。

[0060] 先の実験例から明らかなように、本発明の化合物はクマザサエキス中その固形分に対しておよそ 1000分の 1〜： LO万分の 1の濃度で含まれている。従って、本発明の化合物を抗微生物剤として使用する場合は、クマザサエキス固形分の使用量のおよそ 1000分の 1〜10万分の 1の濃度で良い。その濃度は使用目的に合わせて適宜決定される。

例えば、本発明の化合物を粘膜保護布に含有させるには、例えば、保護布を本発明の化合物の 2〜20 X (1000分の 1〜10万分の 1)質量％溶液（水、アルコール、 D MSO等の有機溶媒又はこれらの混合溶媒）に含浸し、あるいは、保護布に本発明の化合物の 2〜20 X (1000分の 1〜： L0万分の 1)質量％溶液を噴霧し、乾燥すればよい。この際、本発明の化合物の含浸量又は噴霧量は、本発明の化合物の固形分で好ましくは 2〜20 X (1000分の 1〜10万分の 1)質量⁰ /₀、さらに好ましくは 6〜15 X ( 1000分の 1〜10万分の 1)質量⁰ /₀、最も好ましくは 8〜12 X (1000分の 1〜10万分の 1)質量％程度とするのが適当である。

[0061] 本発明の化合物を、例えば、グミ、ゼリー、トローチ、キャンディー、チューインガム、錠剤、丸剤 (例えば、笹丹)、洗口剤、嗽剤、歯磨き、粘膜貼付フィルム、等の口腔組成物に含有させるには、口腔組成物製造のいずれかの段階で、口腔組成物原料に対して、本発明の化合物の固形分で好ましくは 2〜20 X (1000分の 1〜10万分の 1 )質量⁰ /₀、さらに好ましくは 6〜15 X (1000分の 1〜： L0万分の 1)質量⁰ /₀、最も好ましくは 8〜 12 X ( 1000分の 1〜 10万分の 1)質量％程度添加するのが適当である。

[0062] 本発明の口腔組成物には、剤型により適宜適切な慣用の成分を配合することができる。

例えば、ぶどう糖、乳糖、蔗糖、水あめ、デキストリン、シクロデキストリン等の賦形剤、アラビアガム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、ガムベース等の結合剤、澱粉等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、蔗糖脂肪酸エステル等の滑沢剤、香料、クロロフィル、ハツ力、 1 メントール等の清涼化剤等が挙げられる。

[0063] 本発明の粘膜保護組成物を保護布の形態で使用する場合、粘膜や創傷部位に接触する部位の保護布 (ガーゼ等）に本発明の化合物を含有させておき、これを 1日 1 〜3回程度交換すればよい。手術用縫合糸の形態で使用した場合、縫合患部からの細菌の侵入を効果的に抑制し、患部の炎症を抑制し、手術部位の回復を促進する。病院等における院内感染防止のために本発明の粘膜保護組成物を保護布の形態で使用する場合、本発明の粘膜保護組成物の感染防止効果は長期間にわたり存続する。洗濯によりその効果が低減した場合には、適宜交換するか、本発明の化合物を再度含有させるための処理を行えば良い。

[0064] 本発明の粘膜保護組成物を口腔組成物の形態で使用する場合、その摂取量は特に限定されないが、本発明の化合物の固形分として、 2〜15 X (1000分の 1〜10万分の l) mg程度を、例えば、 1日 1〜5回、通常は 1〜3回程度摂取すればよい。摂取量、摂取回数は目的に合わせて適宜増減すればよい。

[0065] 本発明の粘膜保護組成物は、本発明の化合物を固形分で 2〜20 X (1000分の 1 〜10万分の 1)質量％含有しており、従来、抗生物質が効力ない耐性菌に対しても顕著な殺菌効果を示す。

また、本発明の粘膜保護組成物を口腔組成物として使用する場合、適宜、必要な際に、口に含んでおくことにより、極めて簡便に感染性細菌の感染を予防し、またその増殖を抑制することができる。また、チューインガム、キャンディ一等の徐放性形態の組成物はその効果を長時間にわたって発揮することができ有利である。

本発明の粘膜保護組成物は、ローションやオイルの形態で使用することもできる。本発明の化合物を固形分で 2〜20 X (1000分の 1〜10万分の 1)質量％含有するローションやオイルを、皮膚等に塗布しておくことにより、極めて簡便に感染性細菌の感染を予防し、またその増殖を抑制することができる。

[0066] 防腐剤

本発明はまた、本発明の化合物を有効成分として含有する防腐剤を提供するものである。防腐剤として使用する際の形態は特に限定されない。防腐対象となる組成物としては、例えば、食品、飲料水、調味料、化粧品（ローションやオイルを含む）、創傷部位治療用噴霧剤、咽頭部炎症治療用噴霧剤等が挙げられる。これらの対象物に本発明の化合物を固形分で好ましくは 2〜20 X (1000分の 1〜10万分の 1)質量 %、さらに好ましくは 6〜15 X (1000分の 1〜： LO万分の 1)質量⁰ /₀、最も好ましくは 8 〜 12 X ( 1000分の 1〜 10万分の 1)質量％程度含有させるのが適当である。

濾過装置

本発明はまた、本発明の化合物を有効成分として含有する空気の濾過装置を提供するものである。具体的な形態としては、換気扇、エアコン、カーエアコン、空気吸入口、空気排出口、網戸、空気清浄機等の空気が通過する部位に使用されるフィルタ一が挙げられる。フィルターの素材は特に限定されないが、シルク、綿、羊毛、麻等の天然繊維、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル、ァクリル等の合成繊維、半合成繊維、あるいはこれらの 2種以上の混合物の織布、編布、不織布、紙等が挙げられる。これらのフィルターに本発明の化合物の水希釈液を、含浸、噴霧等の方法により含有させ、乾燥すればよい。フィルタ一中の本発明の化合物の含有量は、固形分で好ましくは 2〜20 X (1000分の 1〜10万分の 1)質量％、さらに好ましくは 6〜15 X (1000分の 1〜10万分の 1)質量⁰ /₀、最も好ましくは 8〜12 質量％程度とするのが適当である。

Claims

請求の範囲

[1] p—ヒドロキシベンズアルデヒド、 5, 7, 4，一トリヒドロキシ一 3，， 5，一ジメトキシフラボン、 3—ヒドロキシピリジン、及びバニリンカもなる群力も選ばれる少なくとも 1種を有効成分とする抗微生物剤。

[2] 微生物;^、 Streptococcus、 Enterococcus、 Staphylococcus、 Escnenchia、 Salmonella

、 Yersinia^ Vibrio、 Pseudomonas、 Bacillus^及び Candida力らなる群力ら選ばれる請求項 1記載の抗微生物剤。

[3] p—ヒドロキシベンズアルデヒド、及び 5, 7, 4，一トリヒドロキシ一 3，， 5，一ジメトキシフラボン力なる群力選ばれる少なくとも 1種を有効成分とする抗微生物剤。

[4] 微生物;^、 Streptococcus、 Enterococcus、 Staphylococcus、 Escnenchia、 Salmonella

、 Yersinia^ Vibrio、 Pseudomonas、 Bacillus^及び Candida力らなる群力ら選ばれる請求項 3記載の抗微生物剤。

[5] 3—ヒドロキシピリジンを有効成分として含有し、微生物が、 Sterptococcus pneumoni ae (月巾炎球菌), Sterptococcus pyogenes (ィ匕膿'性連鎖球菌), Staphylococcus aureus、黄色ブ! ^ゥ球菌), Yersinia enterocolitica エノレン-,), Pseudomonas aeruginosa (緑膿菌)，及び Candida sp. (カンジダ）力もなる群力も選ばれる請求項 1記載の抗微生物剤。

[6] p—ヒドロキシベンズアルデヒドを有効成分として含有し、微生物が、 Streptococcus pneumoniae (月—巾炎球菌), Streptococcus pyogenes (ィ匕膽性連鎖球菌ノ, Staphylococcu s aureus (¾色ブドウ球菌), Escherichia con (大月昜菌), Salmonella sp. (サルモネフ菌) , Yersinia enterocolitica エノレンニフ ), Viono parahaemolyticus (月芴炎ヒブリ才), Pseu domonas aeruginosa (緑膽菌) , Bacillus cereus (セレウス菌), Bacillus subtilis f古草菌 ),及び Candida sp. (カンジダ)力もなる群力も選ばれる請求項 1記載の抗微生物剤。

[7] バニリンを有効成分として含有し、微生物が、 Streptococcus pneumoniae (肺炎球菌 ), Streptococcus pyogenes (ィ匕膽性連鎖球菌), Staphylococcus aureus ( 色フドウ球 0), Escherichia coli、人月昜歯), salmonella sp. (サノレモ不フ歯), Yersinia enterocolitic a (エノレシ-ァ)， Vibrio parahaemolyticus (月昜炎ビブリオ)， Bacillus cereus (セレウス菌 ), Bacillus subtilis (枯草菌)，及び Candida sp. (カンジダ）力なる群から選ばれる請求項 1記載の抗微生物剤。

[8] 5, 7, 4' トリヒドロキシ 3 ' , 5 'ージメトキシフラボンを有効成分として含有し、微生物力 ^Salmonella sp. (サノレモ不ラ菌)，及び Pseudomonas aeruginosa (緑膿菌力らなる群から選ばれる請求項 1記載の抗微生物剤。

[9] 請求項 1〜8の!ヽずれか 1項記載の抗微生物剤を含有する抗微生物性組成物。