KR101161607B1 - 식물스테롤을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 식물스테롤(phytosterol) 화합물 또는 이를 포함하는 디프사쿠스(Dipsacus) 속 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병 방제 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 방제용 조성물은 천연물로부터 유래하여 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으면서 다양한 식물병에 대하여 높은 방제활성을 나타내므로 환경친화적인 천연물 살균제의 개발 및 고부가가치의 유기농산물 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

베타-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 식물 추출물, 식물진균병, 방제 조성물

Description

식물스테롤을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이의 용도{Composition for controlling plant diseases comprising phytosterols as active components and uses thereof}

본 발명은 식물스테롤(Phytpsterol) 화합물 또는 이를 포함하는 천속단(Dipsacus asperoides 또는 D. asper), 산토끼꽃(Dipsacus japonicus) 등을 포함하는 디프사쿠스(Dipsacus) 속 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병 방제 방법에 관한 것이다.

작물 재배시 많은 식물병원균, 해충 및 잡초들이 작물의 생장에 저해를 일으켜, 이들에 대한 방제를 실시하지 않을 경우 작물에 따라서는 30 내지 100%의 수확량 감소가 야기된다. 이러한 유해 생물을 방제하기 위하여 지금까지 많은 합성농약들이 개발되고 사용되어 왔으나 식물병, 해충 및 잡초방제에 오?남용됨에 따라 인축에 대한 독성, 지하수 오염, 환경오염, 생태계 교란, 저항성 유해생물 증가 등 여러 가지 문제점들이 야기되고 있다. 이에 따라 우리나라를 포함한 OECD 가입국들을 중심으로 합성농약의 사용량을 40% 감축하고자 하는 친환경농업정책을 시행 중에 있다. 이러한 정책의 일환으로, 합성농약의 대안으로 떠오르는 기술이 바로 생 물농약이다.

생물농약에는 미생물농약과 생화학농약이 있으며, 생물농약은 환경친화적 작물보호제로서 합성농약과는 달리 인축 및 생태계에 안전하여 부가가치가 높은 농산물을 생산할 수 있고, 합성농약으로 방제하기 어려운 병해충을 효과적으로 방제하여 안전한 농작물의 생산을 증대시킴과 동시에 합성농약의 오남용으로 인한 문제점을 해결할 수 있다. 국내의 경우 미생물농약에 대한 연구는 많이 이루어져 등록된 미생물농약이 다수 있지만, 천연물을 이용한 생화학농약의 경우 2005년에 등록규정이 마련되었음에도 불구하고 아직 등록된 생화학농약은 없는 실정이다.

전 세계적으로 식물 추출물들을 이용하여 상품화에 성공하여 시판되고 있는 살균제 제품은 2004년 현재 5개이며, 가장 대표적인 것이 밀사나(Milsana™)이다. 이 제품은 왕호장근(Reynouria sachalinensis)의 추출물을 이용하여 개발된 친환경살균제로서, 식물병원균을 직접 치사시키는 효과보다는 식물체에 저항성을 유도함으로써 흰가루병에 대한 방제효과를 발휘하는 것으로 나타났다. 또한, 천연물 살균제로서 등록되어 있는 신남알데하이드(cinnamaldehyde)는 카시아 식물체(Cassia tora)의 종자로부터 추출되는 오일로서 살충활성 뿐만 아니라 버티실리엄(Verticillium) 속, 리족토니아(Rhizoctonia) 속, 피티엄(Pythium) 속 및 후사리움 모니리폼 (Fusarium moniliforme var. subglutinans)(근류병: canker disease) 등의 식물병원균들에 대해서도 살균활성이 있는 것으로 보고되어 있다. 또한, 호호바(jojoba) 종자로부터 추출되는 호호바 오일은 살충활성 뿐만 아니라 흰가루병에 대하여 살균활성이 있다. 마클레아이아(Macleaya) 속 추출물은 죽자 초(Macleaya cordata) 추출물로서 흰가루병과 알터나리아(Alternaria) 속 잎점무늬병과 셉토리아(Septoria) 속 잎점무늬병 등에 효과가 있다. 또한, 올레산을 주성분으로 하는 지방산도 흰가루병에 효과가 있다.

한편, 천속단(Dipsaci Radix)은 산토끼과(Dipsacaceae)에 속하는 천속단(Dipsacus asperoides 또는 D. asper) 및 산토끼꽃(D. japonicus) 등의 뿌리로서 한약재로서 널리 사용되고 있으며, 살균작용, 항종류(抗腫瘤)작용, 지혈(止血)작용, 진통작용 및 자궁발육촉진작용 등이 있는 것으로 보고되고 있다. 천속단(또는 속단)의 용도와 관련하여 뇌기능개선 조성물(대한민국특허 제2004-0111336호), 아세틸콜린에스테라제 저해제 조성물(대한민국특허 제2003-0031035호) 및 디프사쿠스 사포닌(Dipsacus saponin C)를 유효성분으로 하는 비마약성 중추 진통제(대한민국특허 제1995-0019839호) 등이 보고되어 있다.

한편, 식물스테롤은 β-sitosterol(베타-시토스테롤), campesterol(캄페스테롤) 및 stigmasterol(스티그마스테롤)로 구성되어 있으며, 일반적으로 과일, 채소, 견과류, 곡류, 옥수수, 콩과류 등을 포함하여 식물계에 널리 존재하며, 그 분자구조는 콜레스테롤과 매우 유사하다. 식물스테롤은 장에서 콜레스테롤의 흡수를 차단해 주고, 혈관에 쌓인 콜레스테롤을 감소시켜 주는 역할을 한다. 이러한 효능으로 인하여 식물스테롤은 현재 제약 및 화장품 분야 뿐만 아니라 식품/음료 분야에 있어서도 널리 이용되고 있다. 식물스테롤의 시장 규모는 2005년 1억 8460만 달러에서 2012년 3억 9520만 달러로 성장할 것으로 예측되고 있다.

식물스테롤과 관련해서는 고지혈증, 동맥경화증 및 간질환 예방 및 치료용 조성물(대한민국특허 제2005-0069410), 식물스테롤 함유 식품 및 이의 제조방법(대한민국특허 제2004-0098017), 식물스테롤 또는 식물스테롤 에스테르를 함유하는 식용유지의 제조 방법(대한민국특허 제2004-0019189), 식물스테롤, 헤스페리딘 및 루틴을 포함하는 고지혈증, 동맥경화증 및 간질환 예방 및 치료용 조성물(대한민국특허 제2003-0101482) 등에 대한 특허가 우리나라에 출원되어 있다. 식물스테롤의 항진균활성에 대한 보고는 몇몇 있으며, 이들의 대부분은 베타-시토스테롤에 대한 내용이다. 캄페스테롤과 스티그마스테롤의 항진균활성에 대해서는 거의 보고된 바 없다. 베타-스토스테롤의 경우에도 대상 곰팡이에 따라 항진균활성이 매우 다른 것으로 보고되고 있다. Kiprono 등(2000년)은 Senecio lyratus(Asteraceae)에서 분리한 베타-시토스테롤이 Fusarium속 균의 균사생육은 억제하나, Penicillum속 균의 생장은 억제하지 않는다고 보고하였다(Z. Naturforsch. 55c:485-488). F. Kawamura 등(2004)은 Malaysian Gmelia arborea(Verbenaceae)로부터 4개의 리그난 물질과 베타-시토스테롤을 분리하였는데, 이들 중 4개의 리그난 물질들은 두 개의 담자균, 즉 Tramees versicolor와 Fomitopsis palustris의 균사생육을 저해하지만, 베타-시토스테롤은 이들 두 개의 담자균에 대하여 전혀 활성이 없다고 보고하였다(Holzforschung 58:189-192). 그리고 Lall 등(2006)은 Euclea natalensis(Ebenaceae)에서 분리한 베타-시토스테롤이 Aspergillus niger, A. flavus 및 Cladosporium cladosporioides의 균생생육은 저해하지만, Phytophthora속 균의 균사생육은 거의 저해하지 못한다고 보고하였다(South African J. Bot. 72:579-583). 천연물질이든 합성화합물이든 많은 경우 시험관 내(in vitro)에서의 균사생육 저해효과와 생체 내(in vivo)에서의 식물병에 대한 방제활성은 상당히 다르다. 베타-시토스테롤의 경우 시험관 내에서 일부 진균에 활성이 있다고 보고된 바는 있지만, 식물병에 대한 생체 내 항진균활성은 전혀 보고된 바가 없다. 한편, 캄페스테롤과 스티그마스테롤의 항진균활성에 대해서는 거의 보고된 것이 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 토마토 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 토마토 역병(Phytophthora infestans) 및 벼 도열병에 대하여 우수한 생체 내 항진균활성을 보이는 천속단 뿌리로부터 항진균활성 물질을 분리 및 동정한 결과, 베타-시토스테롤, 캄페스테롤 및 스티그마스테롤이 이들 식물병에 대하여 효과가 있다는 사실을 발견하였다. 이에, 식물 스테롤 및 이를 포함하는 식물 추출물이 다양한 식물병에 대하여 우수한 방제활성을 나타냄을 발견하고, 이를 식물병 방제를 위한 천연물 살균제로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 천연물로부터 유래하여 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으면서 다양한 식물병에 대해 우수한 방제활성을 나타내는 환경친화적인 식물병 방제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방제용 조성물을 이용한 식물병의 방제방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 천속단 뿌리 추출물을 유효성분으로 하는 본 발명의 방제용 조성물은 천연물로부터 유래하여 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으면서 토마토 역병, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병 등의 식물진 균병에 대한 방제활성을 나타내므로 환경친화적인 천연물 살균제의 개발 및 고부가가치의 유기농산물 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1(베타-시토스테롤), 화학식 2(캄페스테롤) 및 화학식 3(스티그마스테롤) 등의 식물스테롤 화합물 또는 이를 포함하는 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다:

또한, 본 발명은 상기 방제용 조성물을 작물 또는 토양에 처리하여 다양한 식물병을 방제하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 천연물로부터 유래하여 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으며, 다양한 식물병에 대하여 높은 방제활성을 나타내는 상기 화학식 1 내지 3의 식물스테롤 화합물 또는 이를 포함하는 식물 추출물을 유효성분으로 하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 다양한 식물병에 대하여 방제활성을 나타내는 바람직한 화합물로는 상기 화학식 1의 베타-시토스테롤, 화학식 2의 캄페스테롤, 화학식 3의 스티그마스테롤을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 사용되는 식물재료로는 천속단(Dipsacus asper)을 포함하여 천속단(Dipsacus asperoides), 산토끼꽃(D. japonicus) 등을 포함하는 산토끼과(Dipsacaceae), Senecio lyratus가 속하는 국화과(Asteraceae=Compositae), Gmelia arborea이 속하는 마편초과(Verbenaceae), Euclea natalensis이 속하는 감 나무과(Ebenaceae), Discorea alata가 속하는 마과(Dioscoreaceae)(Aderiye 등, 1996, Folia Microbiologica 41:407-412) 등의 식물을 사용할 수 있다.

바람직하게는 상기 식물 추출물은 디프사쿠스(Dipsacus) 속 식물추출물이며, 더욱 바람직하게는 천속단(Dipsacus asperoides 또는 D. asper) 또는 산토끼꽃(Dipsacus japonicus) 추출물이다.

본 발명에 따른 식물 추출물은 식물스테롤을 포함하는 다양한 식물 조직을 유기용매로 추출함으로써 제조할 수 있다. 본 발명에서 추출용 유기용매로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올과 같은 저급알콜 또는 이의 수용액, 헥산, 에틸아세테이트, 아세톤, 메틸렌클로라이드 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 건조시킨 천속단 뿌리 1 ㎏에 약 5 내지 20 ℓ, 바람직하게는 8 내지 12 ℓ의 저급 알콜을 가하고 20 내지 60℃, 바람직하게는 상온에서 6시간 내지 3일 동안 침출시켜 저급 알콜 추출물을 얻은 후, 이를 다른 유기용매로 추가로 추출하여 유기용매 추출물을 얻는다. 이때, 사용가능한 유기용매로는 헥산, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 아세톤, 메탄올, 에탄올, 에틸에테르 등을 예시할 수 있다. 본 발명에서는 또한 당분야에서 통상적으로 사용되는 분획 공정을 수행할 수도 있다.

상기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 식물스테롤은 식물 추출물로부터 분리?정제하거나 화학적으로 합성할 수 있다. 상기 식물스테롤의 화학적 합성 방법은 당업계에 공지된 일반적인 방법을 이용할 수 있다.

구체적으로, 방제활성을 갖는 상기 3종의 식물스테롤은 천속단 등의 식물 조 직의 유기용매 추출물을 컬럼 크로마토그래피로 분획하여 분리?정제하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 이때, 사용가능한 컬럼은 실리카겔 컬럼, 역상실리카겔 컬럼 또는 세파덱스 컬럼 등이 있고, 용출액으로는 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 저급알콜 등과 같은 유기용매 및 이들의 혼합액을 사용할 수 있다.

본 발명의 식물병 방제용 조성물은 식물진균병을 효과적으로 방제할 수 있으며, 식물진균병은 바람직하게는 토마토 역병, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 또는 토마토 잿빛곰팡이병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 따른 천속단 뿌리의 메탄올 추출물, 이로부터 분리?정제된 베타-시토스테롤, 캄페스테롤 및 스티그마스테롤은 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병 및 토마토 역병에 대하여 방제활성을 나타낸다 (표 1 및 2 참조).

따라서, 베타-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 또는 이를 포함하는 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물은 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으면서 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병 및 토마토 역병에 대해 우수한 방제활성을 나타내는 천연물 살균제로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 식물병 방제용 조성물은 베타-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤, 또는 이를 포함하는 식물 추출물을 단독으로 포함할 수 있지만, 식물진균병, 특히 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병 및 토마토 역병을 방제하는데 효과적인 것으로 알려진 기존의 시리네올 A(ciryneol A), 시리네올 C(ciryneol C), 1-헵타데신-11,13-다이인-8,9,10-트리올(1-heptadecene-11,13- diyne-8,9,10-triol), 마그놀롤(magnolol), 호노키올(honoliol), 4-메톡시호노키올(4-methoxyhonokiol), 그리세오풀빈(griseofulvin) 및 카스가마이신(kasugamycin) 등의 천연 화합물과 같이 이용될 수도 있다.

본 발명의 방제용 조성물은 통상적으로 이용되는 살충제 또는 살균제에 함유되는 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 활성성분 이외에 부형제로 약제학적으로 허용 가능한 고체 담체, 액체 담체, 액체 희석제, 액화된 기체 희석제, 고체 희석제, 또는 기타 적당한 보조제, 예를 들면 유화제, 분산제 또는 기포제 등의 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 활성성분과 상기 부형제를 혼합한 방제용 조성물을 농약분야에 공지된 다양한 제형으로 제제화시켜 사용할 수 있으며, 제제화를 위해서는 농약분야에서 통상적으로 사용되는 제제화 방법을 어느 것이나 사용할 수 있다.

본 발명의 방제용 조성물은 바람직하게는 수화제, 입제, 분제, 유제, 스프레이상, 연막제, 캅셀형 및 젤상의 제형으로 제제화될 수 있고, 제제의 부력을 위해 도넛형과 같은 제형을 통한 접촉제로서 제공되는 것이 바람직하다.

본 발명의 방제용 조성물은 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병 및 토마토 역병을 효과적으로 방제하기 위하여 식물 추출물은 10 ㎍/㎖ 내지 3,000 ㎍/㎖의 농도로, 베타-시토스테롤, 캄페스테롤, 스티그마스테롤은 각각 50 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖의 농도로 포함하는 것이 바람직하나, 이는 작물의 종류, 생육 정도, 경작지 환경, 식물병의 발병 정도 등을 고려하여 적절하게 조절할 수 있다.

상기와 같이 제형화된 본 발명의 방제용 조성물을 방제가 필요한 식물체 또는 지역에 처리함으로써 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병 또는 토마토 역병을 방제할 수 있다. 바람직한 방법은 상기 방제용 조성물을 식물 병원균과 직접 접촉할 수 있도록 적용하여 방제하는 것으로, 토양에 혼화 처리하거나 작물에 직접 분무하는 방법이 가장 바람직하다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 천속단 뿌리 추출물의 식물병에 대한 방제활성

시중에서 구입한 천속단(D. asper)의 뿌리 건조시료 3 kg에 7 ℓ의 80% 메탄올을 첨가하고 실온에서 24시간 동안 침출하여 얻은 추출물을 여과지를 사용하여 여과하였다. 이로부터 얻어진 메탄올 추출물은 완전히 감압 농축한 후 실험에 사용할 때까지 냉장 보관하였다.

메탄올 추출물의 식물병에 대한 방제활성을 조사하기 위하여, 대표적인 식물병인 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병 및 고추 탄저병에 대한 방제활성 실험을 하기와 같이 수행하였다. 먼저, 메탄올 추출물을 메탄올에 용해시킨 후 250 ㎍/㎖의 트윈 20(Tween 20) 용액으로 희석하여 최종 농도가 3,000 ㎍/㎖이 되도록 준비하였다. 이때, 메탄올의 최종 농도는 5% 수준이 되도록 하였고, 증류수 30 ㎖에 1.5 ㎖의 메탄올(최 종 농도 5%)과 7.5 ㎎의 트윈 20(최종 농도 250 ㎍/㎖)을 첨가한 용액을 음성 대조군으로 사용하였다. 이와 같이 제조된 메탄올 추출물과 대조군 시료들을 각각 병원균 접종 1일전에 식물체 유묘의 엽면에 분무 살포한 후 상온에서 24시간 동안 건조시켰다.

실험에 사용한 벼, 토마토, 보리 및 밀은 지름 4.5 ㎝의 플라스틱 포트에 수도용 상토 또는 원예용 상토를 70% 정도 채운 후, 종자를 파종하여 25±5℃의 온실에서 1주 내지 4주간 재배하였다. 벼 도열병은 3～4엽기의 유묘에 도열병의 원인균인 마그나포르테 그리세아(Magnaporthe grisea, 한국화학연구원)의 포자 현탁액(5X10⁵ 포자/㎖)을 분무 접종하고, 25℃의 습실상에서 하루 동안 습실처리한 후, 25℃의 항온실에서 5일간 배양하여 발병을 유도하였다. 벼 잎집무늬마름병은 잎집무늬마름병의 원인균인 타네이트포러스 큐큐메리스(Thanatephorus cucumeris, 한국화학연구원)를 배지(밀기울 90 g, 왕겨 15 g 및 증류수 100 ㎖)에서 7일간 배양하여 얻은 배양물을 5엽기 유묘에 접종하고 25℃의 습실상에서 4일간 습실처리한 후, 25℃의 항온실에서 4일간 배양하여 발병을 유도하였다. 토마토 역병은 3～4엽기 토마토 유묘에 역병의 원인균인 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans, 강릉대학교)의 유주자낭(10⁵ 유주자낭/㎖)에서 나출된 유주자 현탁액을 분무 접종한 후 25℃의 습실상에서 2일간 습실처리하고 25℃의 항온항습실에서 1일간 배양하여 발병을 유도하였다. 토마토 잿빛곰팡이병은 토마토 3～4엽기 유묘에 잿빛곰팡이병의 원인균인 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea, 한국화학연구원)의 포 자 현탁액(10⁶ 포자/㎖)을 처리한 후, 20℃의 습실상에서 3일간 배양하여 발병을 유도하였다. 밀 붉은녹병은 1엽기 유묘에 활물기생균으로 알려진 녹병의 원인균인 퍽시니아 리콘디타(Puccinia recondita, 인천대학교)의 포자를 250 ㎍/㎖의 트윈 20 용액에 0.67 g 포자/ℓ의 양으로 현탁하여 분무 처리하고 20℃의 습실에서 하루 동안 습실처리한 후 20℃의 항온실로 옮겨 6일간 배양하여 발병을 유도하였다. 보리 흰가루병은 보리의 1엽기 유묘에 숙주 식물에서 계대배양된 흰가루병의 원인균인 에리시페 그래미니스 폼 스피시스 호르데이(Erysiphe graminis f. sp. hordei, 한국화학연구원)의 포자를 털어서 접종하고 20℃의 항온실에서 7일간 배양하여 발병을 유도하였다. 벼 도열병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병은 접종 7일 후, 벼 잎집무늬마름병은 접종 8일 후, 그리고 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병은 접종 3일 후에 병반면적율을 조사하였다.

한편, 고추 탄저병에 대한 방제활성 실험을 위해서는, 지름 7.0 ㎝의 플라스틱 포트에 원예용 상토를 70% 정도 채운 후 최아된 고추 종자를 파종하고, 이를 온실에서 3～4엽기까지 키운 다음 상기에서 준비된 천속단 뿌리의 메탄올 추출물 시료를 엽면 살포하였다. 시료 살포 후 24시간 동안 상온에서 건조시킨 다음 고추 탄저병원균인 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes, 고려대학교)의 포자 현탁액(4X10⁵ 포자/㎖)을 분무 접종하였다. 습실상에서 2일간 발병시킨 후 25℃의 항온실에 1일간 방치하였고, 접종 3일 후에 병반면적율을 조사하였다.

이로부터 얻은 병반면적율을 이용하여 하기 수학식 1에 따라 방제가를 계산 하였고, 상기 7가지 식물병에 대한 천속단 뿌리의 메탄올 추출물의 방제활성을 하기 표 1에 나타내었다.

시료	농도(㎍/㎖)	방제가(%)
		RCB	RSB	TGM	TLB	WLR	BPM	PAN
천속단 뿌리 메탄올 추출물	3,000	66	5	82	73	53	0	64
RCB: 벼 도열병; RSB: 벼 잎집무늬마름병; TGM: 토마토 잿빛곰팡이병; TLB: 토마토 역병; WLR: 밀 붉은녹병; BPM: 보리 흰가루병; PAN: 고추 탄저병

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 천속단 뿌리의 메탄올 추출물은 벼 도열병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병 및 고추 탄저병에 대하여 방제활성을 나타내었다.

<실시예 2> 방제 활성성분의 분리, 정제 및 구조 결정

천속단 뿌리의 건조시료 3 kg에 7 ℓ의 80% 메탄올을 가한 후 상온에서 1일간 침출하여 얻은 메탄올 추출물을 여과지를 사용하여 여과한 다음 여과액을 감압 농축하였다. 상기 천속단 뿌리의 메탄올 추출물을 2 ℓ의 70% 메탄올에 용해시킨 후 동량의 헥산(hexane)으로 2회 추출한 후 헥산층과 수용액층을 감압 농축하였다. 농축한 수용액층을 다시 2 ℓ의 증류수로 용해한 후 동량의 에틸아세테이트(ethylacetate)와 부탄올(butanol)로 2회씩 각각 추출하였다. 상기에서 얻은 세 가지 유기용매 추출물 및 수용액층을 감압 농축한 후 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 7가지 식물병에 대한 방제활성을 조사하였다.

시료	농도(㎍/㎖)	방제가(%)
		RCB	RSB	TGM	TLB	WLR	BPM	PAN
헥산층	2,000	90	5	50	81	60	0	69
에틸아세테이트층	2,000	94	10	96	96	60	8	55
뷰탄올층	2,000	66	5	7	38	43	8	60
수용액층	2,000	50	0	21	46	13	8	0
RCB: 벼 도열병; RSB: 벼 잎집무늬마름병; TGM: 토마토 잿빛곰팡이병; TLB: 토마토 역병; WLR: 밀 붉은녹병; BPM: 보리 흰가루병; PAN: 고추 탄저병

그 결과, 상기 표 2에 나타난 바와 같이, 헥산층과 에틸아세테이트층이 7가지 식물병에 대해 전반적으로 가장 높은 방제활성을 보여 헥산층과 에틸아세테이트층을 각각 별도로 방제 활성성분의 분리 및 정제에 사용하였다.

상기 헥산층(12.9 g)으로부터 방제 활성성분을 분리하기 위하여, 헥산:에틸아세테이트 혼합액(3:1, v/v)을 전개용매로 하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(5X60 ㎝, 카이젤 겔 60, 70-230 메쉬, 500 g: 머크사)를 실시하였다. 이로부터 얻은 용출액을 분취한 후 헥산-에틸아세테이트(3:1, v/v)을 전개용매로 하는 박층 크로마토그래피(카이젤 겔 60 F254, 0.25 ㎜; 머크사)로 분석하였다. TLC의 패턴에 따라 F1 내지 F12의 12개 분획으로 나누고, 각 분획을 클로로포름으로 50 mg/㎖ 수준으로 용해한 다음 벼 도열병균에 대하여 생물검정을 실시하였다. 벼 도열병균에 대한 생물검정은 7일간 25℃, 150 rpm으로 감자덱스트로스액체배지(potato dextrose broth: PDB)에서 배양한 도열병균을 blender를 이용하여 10초간 마쇄하였다. 이 도열병균의 혼탁액을 멸균한 후 식은 감자덱스트로스한천배지(potato dextrose agar: PDA)에 1%의 양으로 접종하고 잘 흔들어준 다음 페트리디쉬에 부었다. 배지를 잘 굳힌 다음 지름 8 mm의 종이디스크(paper disc)에 각각의 분획의 용액을 35 ㎕씩 점적한 다음 용매를 제거한 후 도열병균이 접종된 배지위에 치상하였다. 이 때 무처리구의 경우 용매만 35 ㎕ 처리한 다음 건조한 후 치상하였다. 25℃에서 3일간 배양한 다음 저지원을 조사하였다. 그 결과 F6 내지 F9의 4개의 분획이 효과가 있는 것으로 나타나, 이들 4개의 분획을 합하였다. 활성 분획(998.3 mg)으로부터 항균물질을 더 순수분리하기 위하여 Sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피를 실시하였다. 용출용매로는 디메틸클로라이드:헥산:메탄올(5:5;1, v/v/v)를 사용하였다. 동일한 컬럼을 3회 반복 실시하여 TLC에서 단일한 물질로 보이는 분획을 365.4 mg 분리하였다. 분리한 물질의 순도를 조사하기 위하여 HPLC 분석을 실시한 결과, 3개의 물질이 함유되어 있는 것으로 나타나, 분취 HPLC(preparative HPLC)를 이용하여 3개의 물질을 각각 분리하였다. 이 때 HPLC 조건은 다음과 같다. 컬럼: Capcell Pak C18(20 mm X 250 mm), 용출용매: 100% 메탄올, 유속: 10 ml/min, 검출파장: 210 nm. 이상과 같은 조건에서 스티그마스테롤은 19.5분과 21.0분 사이에서, 캄페스테롤은 21.0분에서 23.0분 사이에서, 그리고 베타-시토스테롤은 23.0분과 25.0분 사이에서 용출되었다. 이상과 같이 실시하여 베타-시토스테롤(181.0 mg), 캄페스테롤(51.3 mg) 및 스티그마스테롤(7.7 mg)을 순수하게 분리하였다.

분리한 3개의 물질의 순도 및 구조를 결정하기 위하여 GC-MS 분석을 실시하였다. GC-MS 분석 조건은 다음과 같다. 컬럼: DB-5 capillary column (0.25 mm X 30 m, 0.25 ㎛ film thickness), 주입기 온도: 300℃, 인터페이스 온도: 280℃, 컬럼 시작온도: 120℃(5 min), 온도 증가 속도: 10℃/min, 컬럼 최종온도: 270℃(30 min). 이와 같이 분석하였을 때, 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤은 각각 26.48분, 27.17분 및 28.44분에 단일 피크가 나타났으며, 이들 각각의 질량스펙트럼을 library에 있는 것과 비교하였을 때, 일치하는 것으로 나타났다. 도 2, 3, 4는 각각 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤의 질량스펙트럼을 라이브러리에 있는 질량스펙트럼과 비교하여 나타내었다.

<실시예 3> 천속단 뿌리 추출물 유래 방제 활성성분의 식물병에 대한 방제활성

상기 실시예 2에서 천속단 뿌리 추출물로부터 분리?동정한 캄페스테롤, 스티그마스테롤 및 베타-시토스테롤의 생체 내(in vivo) 방제활성을 조사하기 위하여, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병 및 고추 탄저병 등의 총 7가지 식물병에 대하여 하기와 같이 방제활성 실험을 수행하였다.

3가지 활성성분 각각을 아세톤에 용해시킨 후 250 ㎍/㎖의 트윈 20 용액을 가하여 최종 농도를 250과 500 ㎍/㎖로 조절하였으며, 모든 시료의 최종 아세톤 농도는 10%로 맞추었다. 이때, 대조군으로는 10% 아세톤과 250 ㎍/㎖의 트윈 20을 함유하는 용액을 사용하였다. 각 식물병당 2개의 포트를 이용하였고, 활성성분 시료를 엽면에 분무 살포한 후 24시간 동안 풍건한 다음 각각의 식물 병원균을 접종하였다. 이들 7가지 식물병에 대한 방제활성은 실시예 1에 기재된 방법에 따라 조사하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

활성성분	농도 (㎍/㎖)	방제가(%)
		RCB	RSB	TGM	TLB	WLR	BPM	PAN
베타-시토스테롤	500	25	33	50	52	0	0	0
	250	25	0	30	42	0	0	0
캠퍼스테롤	500	25	47	10	25	0	0	0
	250	13	33	0	17	0	0	0
스티그마스테롤	500	25	20	30	63	0	0	0
	250	13	20	10	33	0	0	0
RCB: 벼 도열병; RSB: 벼 잎집무늬마름병; TGM: 토마토 잿빛곰팡이병; TLB: 토마토 역병; WLR: 밀 붉은녹병; BPM: 보리 흰가루병; PAN: 고추 탄저병

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 베타-시토스테롤은 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병에 효과를 보였으며, 벼 도열병과 벼 잎집무늬마름병에 대해서도 활성을 보였다. 캄페스테롤의 경우 벼 잎집무늬마름병에 대하여 상대적으로 높은 활성을 보였고, 토마토 역병과 벼 도열병에 대해서도 활성을 보였다. 스티그마스테롤은 토마토 역병에 비교적 높은 활성을 보였으며, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병에 대하여도 활성을 보였다.

세 개의 물질을 각각 분리하기 전 단계, 즉 세 개의 물질이 혼합되어 있는 것을 식물스테롤(phytosterol)이라 하는데, 보통 식물스테롤 40%라 하면 베타-시토스테롤의 함량이 40%인 것을 나타낸다. 천속단에서 분리하여 분취형 HPLC 전단계까지 분리한 식물스테롤의 경우 GC-MS 분석 결과, 베타-스토스테롤의 함량이 약 40%였다. 이 물질에 대하여 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병에 대하여 생체 내 항균활성을 조사한 결과, 도 1과 같이 두 식물병에 대하여 농도가 증가함에 따라 높은 방제활성을 보였다.

도 1은 식물스테롤의 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병에 대한 생체 내 항균활성을 나타낸 것이다.

도 2는 분리한 캄페스테롤(A)과 라이브러리 캄페스테롤(B)의 질량스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 3은 분리한 스티그마스테롤(A)과 라이브러리 스티그마스테롤(B)의 질량스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 4는 분리한 베타-시토스테롤(A)과 라이브러리 베타-시토스테롤(B)의 질량스펙트럼을 나타낸 것이다.

Claims (7)

1. 하기 화학식 2의 캄페스테롤(campesterol), 또는 이를 포함하는 디프사쿠스(Dipsacus) 속 식물추출물을 유효성분으로 함유하는 벼 잎집무늬마름병 방제용 조성물:

   [화학식 2]

   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 디프사쿠스(Dipsacus) 속 식물이 천속단(Dipsacus asperoides 또는 D. asper) 또는 산토끼꽃(Dipsacus japonicus)인 것을 특징으로 하는 벼 잎집무늬마름병 방제용 조성물.
6. 제1항에 있어서, 상기 디프사쿠스(Dipsacus) 속 식물추출물은 10 ㎍/㎖ 내지 3,000 ㎍/㎖의 농도로, 캄페스테롤은 50 ㎍/㎖ 내지 500 ㎍/㎖의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 벼 잎집무늬마름병 방제용 조성물.
7. 제1항, 제5항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 작물 또는 토양에 처리하여 벼 잎집무늬마름병을 방제하는 방법.

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