KR101059792B1

KR101059792B1 - 천속단 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병 방제방법

Info

Publication number: KR101059792B1
Application number: KR1020090004604A
Authority: KR
Inventors: 김진철; 최경자; 최용호; 장경수; 최남희; 민병선
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2009-01-20
Filing date: 2009-01-20
Publication date: 2011-08-26
Also published as: KR20100085364A

Abstract

천속단 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병 방제방법으로 보다 상세하게는 하기 화학식 2로 표시되는 신규한 헤데라게닌 사포닌(hederagenin saponin) 화합물 및 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 헤데라게닌 사포닌(hederagenin saponin) 화합물, 이들의 혼합물을 포함하는 천속단 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공하는 것으로 본 발명의 식물병 방제용 조성물은 천연물로부터 유래하여 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으면서 토마토 역병, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병 등의 식물진균병에 대한 방제활성을 나타내므로 환경친화적인 천연물 살균제의 개발 및 고부가가치의 유기농산물 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

천속단, 헤데라게닌 사포닌, 토마토 역병, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병

Description

천속단 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병 방제방법{Composition for controlling plant diseases which comprises hederagenin saponins or Dipsacus spp. extract containing them, and method for controlling plant diseases using the same}

본 발명은 신규한 헤데라게닌 사포닌(hederagenin saponin) 화합물 또는 이를 포함하는 디프사쿠스(Dipsacus) 속 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병 방제방법에 관한 것이다.

작물 재배시 많은 식물병원균, 해충 및 잡초들이 작물의 생장에 저해를 일으켜, 이들에 대한 방제를 실시하지 않을 경우 작물에 따라서는 30 ~ 100%의 수확량 감소가 야기된다. 이러한 유해 생물을 방제하기 위하여 지금까지 많은 합성농약들이 개발되고 사용되어 왔으나 식물병, 해충 및 잡초방제에 오남용됨에 따라 인축에 대한 독성, 지하수 오염, 환경오염, 생태계 교란, 저항성 유해생물 증가 등 여러 가지 문제점들이 야기되고 있다. 이에 따라 우리나라를 포함한 OECD 가입국들을 중심으로 합성농약의 사용량을 40% 감축하고자 하는 친환경농업정책을 시행 중에 있다. 이러한 정책의 일환으로, 합성농약의 대안으로 떠오르는 기술이 바로 생물농약 이다.

생물농약에는 미생물농약과 생화학농약이 있으며, 생물농약은 환경친화적 작물보호제로서 합성농약과는 달리 인축 및 생태계에 안전하여 부가가치가 높은 농산물을 생산할 수 있고, 합성농약으로 방제하기 어려운 병해충을 효과적으로 방제하여 안전한 농작물의 생산을 증대시킴과 동시에 합성농약의 오남용으로 인한 문제점을 해결할 수 있다. 국내의 경우 미생물농약에 대한 연구는 많이 이루어져 등록된 미생물농약이 다수 있지만, 천연물을 이용한 생화학농약의 경우 2005년에 등록규정이 마련되었고, 현재 식물유래 azadirachtin을 이용한 살충제(제품명: 단독) 1개와 식물유래 지방산 perlagonic acid를 이용한 제초제(제품명: 싸이티)가 등록되어 시판되고 있다. 하지만 두 제품 모두 외국에서 개발한 제품을 단지 국내에 등록한 것이며, 자체 개발한 기술은 아니다.

전 세계적으로 식물 추출물들을 이용하여 상품화에 성공하여 시판되고 있는 살균제 제품은 2004년 현재 5개이며, 가장 대표적인 것이 밀사나(Milsana™)이다. 이 제품은 왕호장근(Reynouria sachalinensis)의 추출물을 이용하여 개발된 친환경살균제로서, 식물병원균을 직접 치사시키는 효과보다는 식물체에 저항성을 유도함으로써 흰가루병에 대한 방제효과를 발휘하는 것으로 나타났다. 또한, 천연물 살균제로서 등록되어 있는 신남알데하이드(cinnamaldehyde)는 카시아 식물체(Cassia tora)의 종자로부터 추출되는 오일로서 살충활성 뿐만 아니라 버티실리엄(Verticillium) 속, 리족토니아(Rhizoctonia) 속, 피티엄(Pythium) 속 및 후사리움 모니리폼 (Fusarium moniliforme var. subglutinans)(근류병: canker disease) 등의 식물병원균들에 대해서도 살균활성이 있는 것으로 보고되어 있다. 또한, 호호바(jojoba) 종자로부터 추출되는 호호바 오일은 살충활성 뿐만 아니라 흰가루병에 대하여 살균활성이 있다. 마클레아이아(Macleaya) 속 추출물은 죽자초(Macleaya cordata) 추출물로서 흰가루병과 알터나리아(Alternaria) 속 잎점무늬병과 셉토리아(Septoria) 속 잎점무늬병 등에 효과가 있다. 또한, 올레산을 주성분으로 하는 지방산도 흰가루병에 효과가 있다.

한편, 한약재로 사용되는 천속단(Dipsaci Radix)은 산토끼꽃과(Dipsacaceae)에 속하는 천속단(Dipsacus asperoides), 천속단(D. asper) 및 산토끼꽃(D. japonicus) 등의 뿌리로서 중국에 널리 분포하며 살균작용, 항종류(抗腫瘤)작용, 지혈(止血)작용, 진통작용, 자궁발육촉진작용 및 신경보호작용 등이 있는 것으로 보고되고 있으며, 예로부터 중국과 한국에서 전통 의약으로 이용되어 왔다. 천속단의 용도와 관련하여 뇌기능개선 조성물, 아세틸콜린에스테라제 저해제 조성물 및 Dipsacus saponin C를 유효성분으로 하는 비마약성 중추 진통제 등이 보고되어 있다. 천속단으로부터의 생리활성 성분으로는 트라이테르페노이드 글리코사이드(triterpenoid glycoside) 및 스테롤 등이 보고된 바 있으며, 또한 이런 구성성분들의 활성에 대해서도 많은 연구가 이루어졌는데 사포닌(saponin)은 항염증 작용(anti-inflammatory), 항보체활성(anticomplementary) 및 세포독성활성에 대한 연구가 각각 Jung(Studies on the terpenoid constituents from the roots of Dipsacus asper Wall. Ph. D. Thesis, Yeungnam University. 1995), Oh(In vitro anticomplementary activity of Hederagenin saponins isolated from roots of Dipsacus asper. Arch. Pharmacal Res. 22(3). 1999. 317-319) 및 Hung(Cytotoxic saponins from the root of Dipsacus asper Wall. Arch. Pharmacal Res. 28(9). 2005. 1053-1056) 등에 의해 보고된 바 있다. 뿐만 아니라 디프사쿠스 사포닌 C(Dipsacus saponin C)는 Suh(Antinociceptive mechanisms of Dipsacus Saponin C administered intrathecally in mice. J. Ethnopharmacol. 71. 2000. 211-218) 등에 의해서 진통작용(antinociceptive activity)이 있는 것으로 발견되었고, caffeoyl quinic acid는 Hung(Antioxidant activity of caffeoyl quinic acid derivatives from the roots of Dipsacus asper Wall. J. Ethnopharmacol. 108. 2006. 188-192) 등에 의해 항산화활성을 갖는다고 보고된 바 있다.

상기에 언급한 바와 같이 천연물에 대한 의약활성에 대해서는 연구가 많이 되어 있지만 식물병에 대한 항진균 활성에 대해서는 아직 보고된 바가 없다. 이에 본 발명자들은 천연추출물 및 물질을 이용하여 인체에 무해하면서 환경친화적인 천연물 살균제를 개발하기 위하여 연구 노력한 결과, 천속단 추출물이 다양한 식물병에 대하여 높은 방제활성을 나타냄을 발견하고, 이를 식물병 방제를 위한 천연물 살균제로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 천연물로부터 유래하여 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으면서 토마토 역병, 토마토 잿빛곰팡이병, 벼 도열병 또는 벼 잎집무늬마름병 등 다양한 식물병에 대해 우수한 방제활성을 나타내는 신규한 헤데라게닌 사포닌(hederagenin saponin) 화합물 및 환경친화적인 식물병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 상기 방제용 조성물을 이용한 식물병의 방제방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 2의 신규한 헤데라게닌 사포닌(hederagenin saponin) 화합물을 제공한다.

본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 헤데라게닌 사포닌(hederagenin saponin) 화합물, 이들의 혼합물을 포함하는 천속단 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방제용 조성물을 작물 또는 토양에 처리하여 다양한 식물병을 방제하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 사용되는 식물재료로는 상기 화학식 1 내지 2의 방제활성성분을 생산하는 천속단(Dipsacus asperoides)으로부터 추출되는 것으로, 상기 천속단의 추출물은 천속단의 뿌리 건조물을 유기용매로 추출함으로써 제조될 수 있다. 본 발명에서 추출용 유기용매로는 탄소수 1 내지 7의 저급알코올 및 이의 수용액, 헥산, 아세톤, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된 용매를 사용하여 추출되는 것으로 바람직하게는 아세톤을 사용한다.

예를 들어 천속단 뿌리의 건조시료 3kg에 80% 메탄올을 가한 후 상온에서 1일간 추출하여 얻은 메탄올 추출물을 여과지를 사용하여 여과한 다음 여과액을 감압 농축하여 수득된 메탄올 추출물을 다른 유기용매로 추가로 추출하여 유기용매 추출물을 수득한다. 본 발명에서는 당분야에서 통상적으로 사용되는 분획공정을 수행할 수도 있다.

상기 화학식 1 및 2로 표시되는 헤데라게닌 사포닌(hederagenin saponin) 화합물, 바람직하게는 카울로사이드 A(cauloside A)와 신물질인 콜치사이드(colchiside)(3-O-β-D-xylopyranosyl-23-O-β-D-glucopyranosyl-28-O-β-D-(6-O-acetyl)-glucopyranosyl hederagenin)과 3개의 파이토스테롤(phytosterol), 바람직하게는 베타-시토스테롤(β-sitosterol), 캄페스테롤(campesterol), 스티그마스테롤(stigmasterol)를 천속단으로부터 분리, 정제할 수 있다.

구체적으로 5종의 방제활성을 갖는 헤데라게닌 사포닌(hederagenin saponin) 화합물 및 파이토스테롤(phytosterol)은 천속단의 유기용매 추출물을 컬럼 크로마 토그래피로 분리, 정체하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 도 1을 참조한다. 이때, 사용가능한 컬럼은 실리카겔 컬럼, C18 실리카겔 칼럼 또는 세파덱스 컬럼등이 있고, 용출액으로는 헥산, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 저급알콜 등과 같은 유기용매를 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는, 건조된 천속단 뿌리를 메탄올로 추출하고 감압 농축하여 얻은 메탄올 추출물을 70% 메탄올에 용해시킨 후 동량의 n-헥산으로 추출한 후 n-헥산층과 수용액층을 감압 농축하고 농축한 수용액층을 증류수로 용해한 후 동량의 에틸아세테이트(EtOAc)와 부탄올과 같은 유기용매로 추출한 추출물 및 수용액층을 감압 농축한 다음 반복적인 실리카겔 컬럼, C18 실리카겔 칼럼 또는 세파덱스 컬럼과 분리용 HPLC로 분리 정제하여 카울로사이드 A(cauloside A)와 신물질인 콜치사이드(colchiside)(3-O-β-D-xylopyranosyl-23-O-β-D-glucopyranosyl-28-O-β-D-(6-O-acetyl)-glucopyranosyl hederagenin), 베타-시토스테롤(β-sitosterol), 캄페스테롤(campesterol) 및 스티그마스테롤(stigmasterol)를 순수하게 분리한다.

본 발명에 따른 천속단의 메탄올 추출물로부터 분리, 정제된 상기 분리한 5개의 물질의 방제활성을 조사한 결과, 천속단 추출물은 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병 및 고추 탄저병 등의 총 7가지 식물병에 대하여; 베타-시토스테롤은 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병, 벼 도열병과 벼 잎집무늬마름병에 대하여; 캄페스테롤의 경우 벼 잎집무늬마름병, 토마토 역병과 벼 도열병에 대하여; 스티그마스테롤은 토마토 역병, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병에 대하여도 활성을 나타내었다. 그리고 카울로사이드 A(cauloside A)의 경우 토마토 역병, 토마토 잿빛곰팡이병 및 벼 도열병에 대하여; 신물질로 동정된 콜치사이드(colchiside)는 7가지 식물병 중 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 역병에 대하여 활성을 나타내었다. 표 1 내지 3을 참조한다.

상기 카울로사이드 A(cauloside A)는 항균활성(Anisimov et al., Antimicrobial activity of triterpene glycosides from Caulophyllum robustum. Antibiotiki 17. 1972. 834-837)을 갖는다고 보고되어 있지만, 항진균활성에 대해서는 보도된 바가 없었으나 본 발명의 7가지 식물병에 대한 생체 내 검정(in vivo assay)을 수행한 결과, 벼 도열병, 토마토 역병 및 토마토 잿빛곰팡이병에 대하여 높은 방제 활성을 확인하였으며 이는 카울사이드 A(cauloside A)의 식물병에 대한 높은 방제활성은 본 발명에서 처음으로 확인한 것이다.

상기와 같은 특성을 나타내는 5종의 방제활성물질을 포함하는 천속단 추출물은 식물진균병을 효과적으로 방제할 수 있으며, 식물진균병은 바람직하게는 토마토 역병, 토마토 잿빛곰팡이병, 벼 도열병 또는 벼 잎집무늬마름병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

따라서, 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 헤데라게닌 사포닌(hederagenin saponin) 화합물, 이들의 혼합물을 포함하는 천속단 추출물을 유효성분으로 함유하는 토마토 역병, 토마토 잿빛곰팡이병, 벼 도열병 및 벼 잎집무늬마름병 방제용 조성물 역시 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명의 식물병 방제용 조성물은 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 헤데라게닌 사포닌(hederagenin saponin) 화합물, 이들의 혼합물을 포함하는 천속단 추출물을 단독으로 포함할 수 있지만, 식물진균병, 특히 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병 및 토마토 역병을 방제하는데 효과적인 것으로 알려진 기존의 시리네올 A(ciryneol A), 시리네올 C(ciryneol C), 1-헵타데신-11,13-다이인-8,9,10-트리올(1-heptadecene-11,13-diyne-8,9,10-triol), 마그놀롤(magnolol), 호노키올(honoliol), 4-메톡시호노키올(4-methoxyhonokiol), 그리세오풀빈(griseofulvin) 및 카스카마이신(kasugamycin) 등의 천연 화합물과 같이 이용될 수도 있다.

본 발명의 방제용 조성물은 통상적으로 이용되는 살충제 또는 살균제에 함유되는 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 활성성분 이외에 부형제로 약제학적으로 허용 가능한 고체 담체, 액체 담체, 액체 희석제, 액화된 기체 희석제, 고체 희석제, 또는 기타 적당한 보조제, 예를 들면 유화제, 분산제 또는 기포제 등의 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 활성성분과 상기 부형제를 혼합한 방제용 조성물을 농약분야에 공지된 다양한 제형으로 제제화시켜 사용할 수 있으며, 제제화를 위해서는 농약분야에서 통상적으로 사용되는 제제화 방법을 어느 것이나 사용할 수 있다.

본 발명의 방제용 조성물은 바람직하게는 수화제, 입제, 분제, 유제, 스프레이상, 연막제, 캅셀형 및 젤상의 제형으로 제제화될 수 있고, 제제의 부력을 위해 도넛형과 같은 제형을 통한 접촉제로서 제공되는 것이 바람직하다.

본 발명의 방제용 조성물은 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병 및 토마토 역병을 효과적으로 방제하기 위하여 천속단 추출물은 10㎍/㎖ 내지 4,000㎍/㎖의 농도로, 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 헤데라게닌 사포닌(hederagenin saponin) 화합물 이 30 내지 1,000㎍/㎖ 농도로 포함하는 것이 바람직하나, 이는 작물의 종류, 생육 정도, 경작지 환경, 식물병의 발병 정도 등을 고려하여 적절하게 조절할 수 있다.

상기와 같이 제형화된 본 발명의 방제용 조성물을 방제가 필요한 식물체 또는 지역에 처리함으로써 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병 또는 토마토 역병을 방제할 수 있다. 바람직한 방법은 상기 방제용 조성물을 식물 병원균과 직접 접촉할 수 있도록 적용하여 방제하는 것으로, 토양에 혼화 처리하거나 작물에 직접 분무하는 방법이 가장 바람직하다.

본 발명에 따르면, 천속단 뿌리 추출물을 유효성분으로 하는 본 발명의 방제용 조성물은 천연물로부터 유래하여 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으면서 토마토 역병, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병 등의 식물진균병에 대한 방제활성을 나타내므로 환경친화적인 천연물 살균제의 개발 및 고부가가치의 유기농산물 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 천속단 추출물의 식물병에 대한 방제활성

천속단 추출물과 분획들 그리고 분리한 물질의 벼 도열병(Magnaporthe grisea), 벼 잎집무늬마름병(Rhizoctonia solani), 토마토 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 보리 흰가루병(Erysiphe graminis f. sp. hordei), 토마토 역병(Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(Puccinia recondita) 및 고추 탄저병(Colletotrichum coccodes)의 7가지 식물병에 대한 in vivo 항균활성을 조사하였다. 각각의 물질을 아세톤(최종농도, 10%)으로 용해한 후 계면활성제 트윈 20을 250㎍/㎖ 수준으로 포함하는 증류수에 희석하였다. 이때 대조구는 10% 아세톤과 250㎍/㎖의 트윈 20을 함유하는 증류수를 사용하였다. 각 식물병당 2개의 포트를 이용하였고, 활성성분 시료를 엽면에 분무 살포한 후 24시간 동안 풍건한 다음 각각의 식물 병원균을 접종하였다.

실험에 사용한 벼, 토마토, 보리 및 밀은 지름 4.5㎝의 플라스틱 포트에 수도용 상토 또는 원예용 상토를 70% 정도 채운 후, 종자를 파종하여 25±5℃의 온실에서 1주 내지 4주간 재배하였다. 벼 도열병은 3 ~ 4엽기의 유묘에 도열병의 원인균인 마그나포르테 그리세아(Magnaporthe grisea, 한국화학연구원)의 포자 현탁액(5×10⁵ spores/㎖)을 분무 접종하고, 25℃의 습실상에서 하루 동안 습실처리한 후, 25℃의 항온실에서 5일간 배양하여 발병을 유도하였다. 벼 잎집무늬마름병은 잎집무늬마름병의 원인균인 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani, 한국화학연구 원)를 배지(밀기울 90g, 왕겨 15g 및 증류수 100㎖)에서 7일간 배양하여 얻은 배양물을 5엽기 유묘에 접종하고 25℃의 습실상에서 4일간 습실처리한 후, 25℃의 항온실에서 4일간 배양하여 발병을 유도하였다. 토마토 역병은 3 ~ 4엽기 토마토 유묘에 역병의 원인균인 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans, 강릉대학교)의 유주자낭(10⁵ sporangia/㎖)에서 나출된 유주자 현탁액을 분무 접종한 후 25℃의 습실상에서 2일간 습실처리하고 25℃의 항온항습실에서 1일간 배양하여 발병을 유도하였다. 토마토 잿빛곰팡이병은 토마토 3 ~ 4엽기 유묘에 잿빛곰팡이병의 원인균인 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea, 한국화학연구원)의 포자 현탁액(10⁶ spores/㎖)을 처리한 후, 20℃의 습실상에서 3일간 배양하여 발병을 유도하였다. 밀 붉은녹병은 1엽기 유묘에 활물기생균으로 알려진 녹병의 원인균인 퍽시니아 리콘디타(Puccinia recondita, 인천대학교)의 포자를 250㎍/㎖의 트윈 20 용액에 0.67g spores/ℓ의 양으로 현탁하여 분무 처리하고 20℃의 습실상에서 하루 동안 습실처리한 후 20℃의 항온실로 옮겨 6일간 배양하여 발병을 유도하였다. 보리 흰가루병은 보리의 1엽기 유묘에 숙주 식물에서 계대배양된 흰가루병의 원인균인 에리시페 그래미니스 폼 스피시스 호르데이(Erysiphe graminis f. sp. hordei, 한국화학연구원)의 포자를 털어서 접종하고 20℃의 항온실에서 7일간 배양하여 발병을 유도하였다. 벼 도열병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병은 접종 7일 후, 벼 잎집무늬마름병은 접종 8일 후, 그리고 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병은 접종 3일 후에 병반 면적율을 조사하였다.

한편, 고추 탄저병에 대한 방제활성 실험을 위해서는, 지름 7.0㎝의 플라스틱 포트에 원예용 상토를 70% 정도 채운 후 최아된 고추 종자를 파종하고, 이를 온실에서 3 ~ 4엽기까지 키운 다음 상기에서 준비된 천속단의 메탄올 추출물 시료를 엽면 살포하였다. 시료 살포 후 24시간 동안 상온에서 건조시킨 다음 고추 탄저병원균인 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes, 고려대학교)의 포자 현탁액(4×10⁵ 포자/㎖)을 분무 접종하였다. 습실상에서 2일간 발병시킨 후 25℃의 항온실에 1일간 방치하였고, 접종 3일 후에 병반면적율을 조사하였다.

상기로부터 얻은 병반면적율을 이용하여 다음과 같은 식에 따라 방제가를 계산하였다.

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 천속단 뿌리의 메탄올 추출물은 벼 도열병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병 및 고추 탄저병에 대하여 방제활 성을 나타내었다.

[실시예 2] 방제 활성성분의 분리, 정제

천속단 뿌리의 건조시료 3kg에 7ℓ의 80% 메탄올을 가한 후 상온에서 1일간 추출하여 얻은 메탄올 추출물을 여과지를 사용하여 여과한 다음 여과액을 감압 농축하여 600g의 추출물을 얻었다. 이 메탄올 추출물을 2ℓ의 70% 메탄올에 용해시킨 후 동량의 n-헥산으로 2회 추출한 후 n-헥산층과 수용액층을 감압 농축하였다. 농축한 수용액층을 다시 2ℓ의 증류수로 용해한 후 동량의 에틸아세테이트(EtOAc)와 부탄올로 2회씩 각각 추출하였고 유기용매 추출물 및 수용액층을 감압 농축한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 7가지 식물병에 대한 방제활성을 조사하였다.

그 결과 상기 표 2에 나타난 바와 같이, n-헥산층과 에틸아세테이트(EtOAc)층이 7가지 식물병에 대해 전반적으로 가장 높은 방제활성을 보여 n-헥산층과 에틸아세테이트(EtOAc)층을 각각 별도로 방제 활성성분의 분리 및 정제에 사용하였다.

n-헥산층(12.9g)으로부터 활성성분을 분리하기 위하여 n-헥산:에틸아세테이 트 혼합액(3:1, v/v)을 전개용매로 하는 실라카 겔 컬럼 크로마토그래피(5×60㎝, Kiesel gel 60, 70-230 mesh, 500g: Merck)를 실시하였다. 이로부터 얻은 용출액을 분취한 후 n-헥산:에틸아세테이트 혼합액(3:1, v/v)을 전개용매로 하는 씬 레이어 컬럼 크로마토그래피(TLC: Kiesel gel 60 F254, 0.25㎜; Merck)로 분석하였다. TLC의 패턴에 따라 F1 내지 F12의 12개 분획으로 나누고, 각 분획을 클로로프롬으로 50㎎/㎖ 수준으로 용해한 다음 벼 도열병균에 대하여 생물검정을 실시하였다. 벼 도열병균에 대한 생물검정은 7일간 25℃, 150rpm으로 PDB(potato dextrose broth)에서 배양한 도열병균을 blender를 이용하여 10초간 마쇄하였다. 이 도열병균의 혼탁액을 멸균한 후 식은 PDA(potato dextrose agar)배지에 1%의 양으로 접종후 잘 흔들어준 다음 페트리 디쉬에 부었다. 배지를 잘 굳히고 지름 8mm의 페이퍼 디스크에 각각의 분획의 용액을 35㎕씩 점적한 다음 용매를 제거한 후 도열병균이 접종된 배지위에 치상하였다. 이 때 무처리구의 경우 용매만 35㎕처리하여 건조한 후 치상하였다. 25℃에서 3일간 배양한 다음 저지대(inhibition zone)를 조사하였다. 그 결과 F6 내지 F9의 4개의 분획이 효과가 있는 것으로 나타나 이들 4개의 분획을 합하였다. 활성 분획(998.3mg)으로부터 항균물질을 더 순수분리하기 위하여 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피(Sephadex LH-20 column chromatography)를 실시하였다. 용출용매로는 메틸렌클로라이드:n-헥산:메탄올(5:5;1, v/v/v)을 사용하였다. 동일한 컬럼을 3회 반복 실시하여 씬 레이어 컬럼 크로마토그래피에서 단일 물질로 보이는 분획을 365.4mg 분리하였다. 분리한 물질의 순도를 조사하기 위하여 HPLC분석을 실시한 결과, 3개의 물질이 함유되어 있는 것으로 나타나 정제용 액체 크로마토그래피(preparative HPLC)를 이용하여 3개의 물질을 각각 분리하였다. 이 때 분리용 액체크로마토그래피(preparative HPLC) 조건은 다음과 같다; column: Capcell Pak C18(20mm×250mm), 용출용매: 100% 메탄올, 유속: 10㎖/min, 검출파장: 210nm. 이상과 같은 조건에서 물질 1(stigmasterol)은 19.5분과 21.0분 사이에서, 물질 2(campesterol)은 21.0분에서 23.0분 사이에서, 그리고 물질 3(β-sitosterol)은 23.0분과 25.0분 사이에서 용출되었다. 이상과 같이 실시하여 물질 3(β-sitosterol)(181.0 mg), 물질 2(campesterol)(51.3 mg) 및 물질 1(7.7 mg)을 순수하게 분리하였다.

또한, 에틸아세테이트층(100g)으로부터 활성 물질을 분리하기 위하여, n-헥산:에틸아세테이트(9:1, 8:1, 6:4, 5:5, 4:6, 2:8, 1:9, v/v), 에틸아세테이트 100%, 아세톤 100%, 메탄올 100%를 전개용매로하여 플래쉬 실라카 겔 컬럼 크로마토그래피(7×60㎝, Kiesel gel 60, 70-230 mesh, 500g: Merck)를 실시하였다. 용출액을 분취하여 클로로프롬:메탄올:증류수(30:9:1, v/v)과 클로로프롬:메탄올:증류수:아세트산(55:36:8:1, v/v)의 조건으로 TLC분석을 실시한 다음, 크게 2개 분획물로 나누었다. 그 중 F1(20g) 분획물을 다시 실리카 겔(70-230 mesh, 600g)이 충진된 컬럼(5.2×50㎝)에 가한 후 클로로프롬:메탄올(5:1, v/v)로 용출하였다. 동일한 컬럼을 4회 반복실시한 다음 C18 resin(200g)이 충진된 C18 컬럼 크로마토그래피(2.4×50㎝)를 3회 실시하여 물질 4(466㎎)를 순수하게 분리하였다. F2(4g)분획물은 실리카 겔(70~230 mesh, 250g)이 충진된 컬럼에(3.6×50㎝) 가한 후 클로로프롬:메탄올:증류수:아세트산(55:36:8:1, v/v)로 용출하여 물질 5(2.2g)를 순수하게 분리하였다.

[실시예 3] 방제 활성성분의 구조 결정

상기 실시예 2에서 분리된 5개의 방제 활성성분들을 질량분석기를 이용하여 분석하였다. 상기와 같이 분리한 세 개의 물질의 구조를 동정하기 위하여 gas chromatograph-mass spectrometer(GC/MS) 분석을 실시하여 분석한 결과 천속단의 n-헥산 분획으로부터 분리한 3개 물질, 즉 물질 1, 물질 2 및 물질 3이 각각 28.44분, 26.48분 및 27.17분에 피크가 나타났으며, 이들 각각의 질량 스펙트럼(mass spectrum)을 라이브러리(library)에 있는 것과 비교하였을 때, 각각 베타-시토스테롤(β-sitosterol), 캄페스테롤(campesterol), 스티그마스테롤(stigmasterol)가 일치하는 것으로 나타났다.

천속단의 에틸아세테이트층로부터 분리한 두 개의 물질 중 물질 4의 구조를 동정하기 위하여 LC-MS 분석을 실시한 결과 [M+Na]⁺ 이온이 m/z 627.4에서 나타나 분자량이 604로 추정되었다. 물질 4의 정확한 구조를 확인하기 위하여 ¹³C-NMR(도 2), ¹H-NMR(도 3), DEPT135°, ¹H-¹H COSY 및 ¹H-¹³C COSY 분석을 확인한 결과, 이전에 Caulophyllum robustum으로부터 분리되었던 카울로사이드 A(cauloside A)와 일치하는 것으로 나타났다. 따라서 물질 4를 분자식은 C₃₅H₅₆O₈이고, 분자량은 604.4의 카울로사이드 A(cauloside A)(hederagenin 3-O-arabinoside)(화학식 1)로 결정하였다.

물질 5의 구조를 결정하기 위하여 FAB-MS 분석을 실시하였으며 [M+Na]⁺ 이온은 m/z 994에서 나타나 분자량이 971로 추정되었다(도 4). 물질 5의 정확한 구조를 확인하기 위하여 ¹³C-NMR(도 5), ¹H-NMR(도 6), DEPT135°, ¹H-¹³C COSY 및 ¹H-¹H COSY 분석 등을 수행한 결과 물질 5의 분자식은 C₄₉H₇₈O₁₉이며, 분자량은 971이고, 구조는 3-O-β-D-xylopyranosyl-23-O-β-D-glucopyranosyl-28-O-β-D-(6-O-acetyl)-glucopyranosyl hederagenin(화학식 2)로 동정되었다. 이 물질은 지금까지 전혀 보고되지 않은 신물질로서 이 물질을 콜치사이드(colchiside)라 명명하였다.

[실시예 4] 천속단 추출물 유래의 방제 활성성분의 식물병에 대한 방제활성

상기 실시예 2 및 3에서 천속단 추출물로부터 분리, 동정된 베타-시토스테롤(β-sistosterol), 캠퍼스테롤(campesterol), 스티그마스테롤(stigmasterol), 카울로사이드 A(cauloside A) 및 콜치사이드(colchiside)의 생체 내(in vivo) 방제활성을 조사하기 위허여, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병 및 고추 탄저병 등의 총 7가지 식물병에 대하여 하기와 같이 방제활성 실험을 수행하였다.

상기 5가지 활성성분 각각을 아세톤에 용해시킨 후 250㎍/㎖의 트윈 20 용액을 가하여 최종 농도를 250과 500㎍/㎖로 조절하였으며, 모든 시료의 최종 아세톤 농도는 10%로 맞추었다. 이때, 대조군으로는 10% 아세톤과 250㎍/㎖의 트윈 20을 함유하는 용액을 사용하였다. 각 식물병당 2개의 포트를 이용하였고, 활성성분 시료를 엽면에 분무 살포한 후 24시간 동안 풍건한 다음 각각의 식물 병원균을 접종 하였다. 이들 7가지 식물병에 대한 방제활성은 실시예 1에 기재된 방법에 따라 조사하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병에 효과를 보였으며, 벼 도열병과 벼 잎집무늬마름병에 대해서도 활성을 보였다. 캄페스테롤의 경우 벼 잎집무늬마름병에 대하여 상대적으로 높은 활성을 보였고, 토마토 역병과 벼 도열병에 대해서도 활성을 보였다. 스티그마스테롤은 토마토 역병에 비교적 높은 활성을 보였으며, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병에 대하여도 활성을 보였다.

카울로사이드 A(cauloside A)의 경우 토마토 역병, 토마토 잿빛곰팡이병 및 벼 도열병에 대하여 매우 높은 활성을 보였다. 도 7은 카울로사이드 A(cauloside A)에 의한 토마토 역병이 효과적으로 방제된 것을 보여준다. 신물질로 동정된 콜치사이드(colchiside)는 7가지 식물병 중 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 역병에 대해서 방제 활성을 보였다. 그러나 콜치사이드(colchiside)는 카울로사이드 A(cauloside A)와 비교할 때 상대적으로 낮한 활성을 보였다. 카울로사이드 A(Acauloside A)와 같은 계열의 물질인 카울로사이드 C(cauloside C)는 종양세포주에 대한 세포독성 등 많은 연구가 진행되어 있지만(Aminin et al., The effect of PH on biological activity of plant cytotoxin cauloside C. Comparat. Biochem. Physiol. Part A. 122. 1999. 45-51, Likhatskaya et al.,The pH-dependent channels formed by cauloside C. Adv. Exp. Med. Biol. 404. 1996. 239-249) 카울로사이드 A(cauloside A)에 대한 보고는 거의 없다. 카울로사이드A(cauloside A)가 항균활성(Anisimov et al., Antimicrobial activity of triterpene glycosides from Caulophyllum robustum. Antibiotiki 17. 1972. 834-837)을 갖는다고 보고되상기 표 3에서 나타난 바와 같이, 분리한 5개의 물질들 베타-시토스테롤은 어 있지만, 항진균활성에 대한 연구는 거의 없다. 하지만 본 연구에서 카울로사이드 A(cauloside A)의 항균활성에 대한 실험을 수행한 결과 in vitro 실험에서는 활성을 보이지 않았지만 7가지 식물병에 대한 생체 내 검정(in vivo assay)을 수행한 결과에서는 벼 도열병, 토마토 역병 및 토마토 잿빛곰팡이병에 대하여 높은 방제 활성을 보였다. 카울사이드 A(cauloside A)의 식물병에 대한 높은 방제활성은 본 연구에서 처음으로 확인하였다.

[실시예 5] 추출용매에 따른 방제가의 비교

천속단 추출물을 살균제로 개발하기 위한 최적 제제를 선발하기 위해서는 시간적인 면이나 경제적인 면을 고려해봤을 때 순수 분리된 물질을 이용하는 것보다는 용매 추출물을 이용하는 것이 더 효율적이기 때문에 최적의 추출용매를 선발하기 위하여 여러 가지 유기 용매로 천속단을 추출하여 그 용매 추출물의 식물병 방제효과를 조사하였다. 천속단 뿌리 시료(10g)를 마쇄하여 100㎖의 n-헥산, 에틸아세테이트, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세톤 및 메탄올에 각각 침지시켜 하루 동안 shaking한 다음 여과한 후 감압농축하였다. 각각의 추출물을 아세톤(최종농도 10%)으로 용해하여 7가지 식물병에 대하여 처리한 후 방제효과를 측정하였다. 그 결과 추출물의 양은 n-헥산, 에틸아세테이트, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 메탄올 추출물 각각 70㎎, 130㎎, 290㎎, 130㎎ 및 2.15g 이였다. 5가지 활성성분 각각을 아세톤에 용해시킨 후 250㎍/㎖의 트윈 20 용액을 가하여 최종 농도를 1,000과 2,000㎍/㎖로 조절하였으며, 모든 시료의 최종 아세톤 농도는 10%로 맞추었다. 이때, 대조군으로는 10% 아세톤과 250㎍/㎖의 트윈 20을 함유하는 용액을 사용하여 추출물들을 7가지 식물병에 대한 방제활성을 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 조사를 하였다.

그 결과, 상기 표 4에 나타난 바와 같이, 아세톤 추출물과 에틸아세테이트 추출물이 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병에 대해서 모두 90% 이상의 높은 활성을 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 하지만 이 두 가지 용매추출물의 양을 고려해 봤을 때, 아세톤 추출물의 양이 에틸아세테이트 추출물보다 2배 이상의 양이 추출되었기 때문에 최적제제로 선발하기 위한 용매추출물은 아세톤 추출물이 가장 적합하였다.

도 1은 본 발명의 실시예 2에 따라 천속단으로부터 방제 활성성분을 분리, 정제하는 과정을 도식화한 것이다.

도 2는 천속단 추출물로부터 분리한 물질 4(cauloside A)의 ¹³C-NMR 분석 결과를 보여주는 것이다.

도 3은 천속단 추출물로부터 분리한 물질 4(cauloside A)의 ¹H-NMR 분석 결과를 보여주는 것이다.

도 4는 천속단 추출물로부터 분리한 물질 5(colchiside)의 FAB-MS 분석 결과를 보여주는 것이다.

도 5는 천속단 추출물로부터 분리한 물질 5(colchiside)의 ¹³C-NMR 분석 결과를 보여주는 것이다.

도 6은 천속단 추출물로부터 분리한 물질 5(colchiside)의 ¹H-NMR 분석 결과를 보여주는 것이다.

도 7은 천속단 추출물로부터 분리한 물질 4(cauloside A)의 토마토 역병에 효과적인 방제를 보여주는 것이다.

(a: 무처리구, b: cauloside A(500㎍/ml) 처리구, c: dimethomorph(10㎍/ml) 처리구)

Claims

하기 화학식 2로 표시되는 헤데라게닌 사포닌(hederagenin saponin) 화합물.
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하기 화학식 2로 표시되는 헤데라게닌 사포닌(hederagenin saponin) 화합물 을 유효성분으로 함유하는, 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 병원균에 대한 항진균 활성을 나타내는 항진균 조성물.
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제 4항에 있어서,

상기 화학식 2로 표시되는 헤데라게닌 사포닌(hederagenin saponin) 화합물이 30 내지 1,000 ㎍/㎖ 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 항진균 조성물.
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제 4항 또는 제 8항에 따른 항진균 조성물을 작물 또는 토양에 처리하는 것을 포함하는, 토마토 역병, 토마토 잿빛곰팡이병 또는 벼 잎집무늬마름병의 방제방법.