KR100911322B1

KR100911322B1 - 폴리아세틸렌계 화합물을 함유하는 유해 조류 방제용조성물

Info

Publication number: KR100911322B1
Application number: KR1020070104641A
Authority: KR
Inventors: 김진석; 최정섭; 김진철; 민석기
Original assignee: 한국화학연구원
Priority date: 2007-10-17
Filing date: 2007-10-17
Publication date: 2009-08-07
Also published as: KR20090039162A

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1 또는 화학식 2의 폴리아세틸렌계 화합물 또는 이들 화합물 중 적어도 하나를 포함하는 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 유해 조류 방제용 조성물, 및 이를 이용한 유해 조류의 방제방법에 관한 것으로, 본 발명의 폴리아세틸렌계 화합물 및 이를 함유한 식물추출물은 남조류, 적조 등의 유해 조류에 대해 선택적인 생육억제효과를 나타내므로, 이를 함유하는 방제용 조성물은 환경 친화적이면서 효능이 우수한 유해 조류 방제제로서 유용하게 활용될 수 있다.

[화학식 1]

상기 식에서,

R₁및R₂는 각각 독립적으로 H 또는 OH이다.

[화학식 2]

상기 식에서,

R₁은 OAc, Cl 또는 OH이다.

유해조류, 남조류, 적조, 폴리아세틸렌계 화합물, 식물 추출물

Description

폴리아세틸렌계 화합물을 함유하는 유해 조류 방제용 조성물{COMPOSITION FOR CONTROL OF HARMFUL ALGAE COMPRISING POLYACETYLENE COMPOUNDS}

본 발명은 폴리아세틸렌계 화합물 또는 이들 화합물 중 적어도 하나를 포함하는 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 유해 조류 방제용 조성물, 및 이를 이용한 유해 조류의 방제방법에 관한 것이다.

유해 조류의 대발생(HAB, Harmful Algal Blooming)은 이들의 생육 서식지에 따라 산업적으로 다양한 문제를 일으키고 있다. 호수, 하천, 저수지, 양어장 등지에서의 유해조류의 대발생은, 1) 수생생물의 폐사를 일으키고(Duke 등, Weed Sci. 50: 138-151, 2002); 2) 이취미(off-flavor) 물질을 발생시켜 음용수 및 양식어류의 육질을 떨어뜨리는데, 예를 들면, 유해 조류인 오실라토리아 페로나타(Oscillatoria perornata)의 서식지에서는 물고기에 흙냄새(off-flavor)가 나게 되며(Duke 등, Weed Sci. 50: 138-151, 2002); 3) 사람 및 동물에 유해한 독소가 생성되는데, 예를 들어, 마이크로시스티스(Microcystis) 속, 노듈라리아(Nodularia) 속, 아나베나(Anabaena) 속, 아파니조메논(Aphanizomenon)속 등의 일부 조류는 각각 사람 및 동물에 유해한 독소인 마이크로시스틴(microcystins), 노듈라린(nodularin), 아나톡신(anatoxin) 및 삭시톡신(saxitoxin)을 생산한다고 알려져 있고(Haider 등, Chemosphere 52:1-21, 2003); 4) 물의 착색 및 이상발포(scum) 형성 등으로 불쾌감을 유발하고 여가 및 산업 활동을 저해하며; 5) 상수처리과정 중의 여과지 폐쇄 및 응집 침전 저해 등으로 인해 염소의 과다처리가 필요하므로 경제적 손실을 야기한다.

한편, 담수직파답에서는 조류의 대발생이 괴불 형성을 유도하여 입모율을 현저히 감소시키기도 하고, 토양온도를 저하시켜 작물의 생산성을 저감시키기도 한다. 골프장 페어웨이에서는 토양조류의 대발생으로 잔디가 고사하는 경우도 많다. 또한, 건축 및 산업시설 현장에서는 유해조류가 수질오염, 기계의 오작동, 노후화 촉진, 미관 손상 등 다양한 피해를 유발시키기도 한다.

따라서, 유해 조류의 대발생 문제에 효율적으로 대처하기 위하여 물리적, 생물학적 또는 화학적인 방법이 다각도로 연구되어 왔다.

그 중, 화학적 방법은 실용성이 높은 방법 중의 하나로서 주로 무기 또는 유기화합물을 수중에 처리하여 조류 발생을 억제 또는 제거하는 방법을 가리킨다. 그러나, 이러한 화학적 방법은 비선택적일 뿐만 아니라, 사용된 화합물질로 인한 인축독성, 비표적 생물에 대한 환경안전성, 잔류성 등의 문제가 있다.

한편, 최근에 관심을 갖고 연구되고 있는 환경친화적 기술로서 천연물 또는 생화학제를 처리하는 방법이 있다(Schrader K.K., ACS Symposium Series 848: 195-208, 2003). 환경보호의 중요성이 부각됨에 따라 천연물로부터 보다 안전하며 환경친화적인 천연 살조제(natural algicide)를 개발하기 위한 연구가 점점 활성화 되고 있는 상황이다. 그러나, 이러한 방법은 종류에 따라 활성이 낮거나 작용스펙트럼이 좁고 가격이 비싸다는 문제점이 있다.

지금까지 보고된 생화학 제제 또는 천연물 성분으로는 아제티딘카복실산(L-2-azetidinecarboxylic acid) (Kim 등, Aquatic Botany 85:1-6, 2006), 루타크리돈 에폭사이드(Rutacridone epoxide) (Meepagala 등, Phytochemistry 66:2689-2695, 2005), 에틸 2-메틸아세토이세테이트(Ethyl 2-methylacetoacetate) (Li & Hu, Appl. Environ. Microbiol. 71: 6545-6553, 2005) 등이 있다(Duke 등, Weed Sci. 50: 138-151, 2002; Schrader 등, Aquaculture 163: 85-99, 1998).

또한, 국내에서 특허 등록되었거나 공개된 살조용 천연물로는 협죽도과 식물 추출액(대한민국특허 제456467호), 둥굴레속 식물 또는 그 추출물(대한민국특허 제621917호), 아제티딘 유도체(대한민국특허 제592798호), 유기산(대한민국특허 제231912호), 프로디지오신(대한민국특허 제661175호), 편백나무(대한민국 특허공개공보 제2006-0103310호), 여러 종류의 천연재료 자연 숙성 효소액(대한민국 특허공개공보 제2005-0122919호), 바실러스 배양여액(대한민국특허 제610527호), 천연 광물과 여러 가지 식물(대한민국특허 제623993호), 명자나무열매(대한민국특허 제543747호) 등이 있다.

한편, 팔카리놀 또는 팔카린다이올과 같은 폴리아세틸렌계 화합물은 항암활성(Dembitsky V. M., Lipids 41:883-924, 2006; Christensen & Brandt, J. Pharma. Biomedic. Anal. 41: 683-693, 2006; Dall'Acqua 등, J. Natural Product. 67:1588-1590, 2004), 항균활성(Chou 등, Phytotherapy Research 20:153-156, 2006; Lechner 등, Phytochemistry 65:331-335, 2004; Shindo 등, NipponKasei Gakkaishi 57:209-214, 2006), 당뇨, 비만 등의 치료제로서의 이용가능성(Wang 등, Zhongguo Tianran Yaowu 4:275-277, 2006), 기타 의약활성(Choi 등, Phytotherapy Research 19: 839-845, 2005; Dang 등, Arch. Pharma. Res. 28:28-33, 2005; Yoshikawa 등, Bioorg. Medic. Chem. 14:456-463, 2006; Christensen & Brandt, J. Pharma. Biomedic. Anal. 41: 683-693, 2006), 비교적 고농도에서 식물생장억제 및 종자발아 억제활성(Satoh 등, Biosci. Biotech. Biochem. 60:152-153, 1996; Nitz 등, J. Agric. Food Chem. 38:1445-1447, 1990)등에 대해 보고된 바가 있는 화합물로서, 지금까지 20여종 이상의 식물에서 추출되었다. 그러나, 아직까지 폴리아세틸렌 계열 화합물을 유해조류의 방제제(algicide)로 사용한 보고는 없다.

이에, 본 발명자들은 식물 추출물이 유해조류에 대해 우수한 방제효과를 나타내고, 이들 식물추출물에서의 유효성분이 폴리아세틸렌계 화합물이며, 이를 함유하는 조성물을 효과적인 유해조류 방제용 조성물로서 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 유해조류의 생육을 억제하는 자연친화적 천연물을 활성 성분으로 함유하는 유해조류 방제 조성물 및 이를 이용한 방제 방법을 제공하는 것이 다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 하기 화학식 1 또는 2의 폴리아세틸렌계 화합물, 또는 이들 폴리아세틸렌계 화합물 중 적어도 하나를 포함하는 식물 추출물을 활성성분으로 함유하는 유해조류 방제용 조성물을 제공한다.

상기 식에서,

R₁과R₂는 각각 독립적으로 H 또는 OH 이다

상기 식에서,

R₁은 OAc, Cl 또는 OH이다.

상기 다른 목적에 따라, 본 발명은 상기 방제용 조성물을 수중 또는 토양에 처리하는 것을 포함하는 유해조류의 방제방법을 제공한다.

이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 폴리아세틸렌계 화합물 중 바람직한 것은, 상기 화학식 1의 폴리아세틸렌계 화합물로서 팔카리놀[falcarinol, (R₁=H, R₂=OH)], 팔카린다이올[falcarindiol, (R₁=OH, R₂=OH)], 상기 화학식 2의 폴리아세틸렌계 화합물로서 시리네올 A(ciryneol A, R₁=OAc), 시리네올 C(ciryneol C, R₁=Cl) 및 1-헵타데신-11,13-다이인-8,9,10-트라이올(1-heptadecene-11,13-diyne-8,9,10-triol, R₁=OH)이다.

본 발명의 폴리아세틸렌계 화합물들은 유기합성하거나 식물로부터 분리하여 사용할 수 있다. 상기 식물로는 국화과(Asteraceae, Compositae), 십자화과 등의 식물계(family)에 속하는 것을 사용할 수 있으며(Christensen & Brandt, J. Pharma. Biomedic. Anal. 41: 683-693, 2006), 산형과(Apiaceae, Umbelliferae) 또는 두릅나무과(Araliaceae)에 속하는 식물이 바람직하다. 구체적으로, 본 발명의 폴리아세틸렌계 화합물들은 방풍, 당근, 고본, 미나리, 백지(구릿대), 갯기름나물, 천궁, 참나물, 전호, 독활, 어수리, 파슬리, 당귀, 사상자, 인삼, 오갈피나무, 황칠나무, 섬오갈피나무, 강활, 기름나물, 어수리, 천궁, 당귀, 사상자, 냉이(Cardamine)속 식물, 엉겅퀴(Cirsium)속 식물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 식물로부터 추출할 수 있다. 상기 방풍으로는, 원방풍(Ledebouriella seseloides), 식방풍(Peucedanum japonicum) 또는 갯방풍(해방풍, Glehnia littoralis)의 뿌리를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 엉겅퀴는 엉겅퀴(Cirsium japonicum DC.), 바늘엉겅퀴(Cirsium rhinoceros Nakai)(Lee 등, Arch. Pharm. Res. 26:128-131, 2003), 큰엉겅퀴(Cirsium pendulum Fisch.), 도깨비엉겅퀴(Cirsium schantarense Trautv. et Meyer), 동래엉겅퀴(Cirsium toraiense Nakai), 버들잎엉겅퀴(Cirsium lineare (Thunb.) Sch-Bit.), 흰잎엉겅퀴(Cirsium vlassovianum Fisch.), 고려엉겅퀴(Cirsium setidens Nakai), 정영엉겅퀴(Cirsium chanroenicum Nakai) 및 물엉겅퀴(Cirsium nipponicum (Max.) Makino)를 포함하는 써시움속(Cirsium spp.)에 속하는 식물체의 뿌리를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 상기 식물 추출물은 전식물체 또는 이의 건조물, 바람직하게는 식물 뿌리 또는 이의 건조물을 유기용매로 추출함으로써 제조할 수 있다. 상기 유기용매로는 C_1-5 알콜 또는 이의 수용액, 헥산, 에틸아세테이트, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 에틸에테르 등을 단독으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다.

추출은 통상적인 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 건조시킨 식물 뿌리 1 ㎏에 약 5 내지 20 ℓ의 메틸렌클로라이드를 가하고 20 내지 60 ℃에서 6시간 내지 20일 동안 침출시켜 추출물을 얻은 후, 여과 후 감압 농축하여 추출물을 얻을 수 있다. 또 다른 예로, 건조시킨 식물 뿌리 1 ㎏에 약 5 내지 20 ℓ의 C_1-5 알콜을 가하고 20 내지 60 ℃에서 6시간 내지 20일 동안 침출시켜 알콜 추출물을 얻은 후, 이를 상기 예시된 다른 유기용매로 추가로 추출하여 유기용매 추출물을 얻을 수 있다. 또한, 상기 식물 추출물에 대하여 컬럼 크로마토그래피와 같이 당분야에서 통상적으로 사용되는 분획공정을 수행할 수 있다. 이때, 상기 컬럼 크로마토그래피에 사용가능한 컬럼으로는 실리카겔 컬럼, 역상실리카겔 컬럼 또는 세파덱스 컬럼 등이 있고, 용출액으로는 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 아세톤, C_1-5알콜 등과 같은 유기용매 또는 이들의 혼합액을 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시 예에서는, 황새냉이 전식물체, 건조된 방풍 또는 엉겅퀴 뿌리를 메탄올로 추출하고 감압 농축하여 얻은 메탄올 추출물을 증류수로 용해한 후, 이를 헥산 또는 에틸아세테이트로 추출하여 얻은 추출물을 감압 농축한 다음, 농축액을 반복적인 실리카겔 컬럼 크로마토그래피와 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화학식 1 또는 2의 폴리아세틸렌계 화합물을 순수하게 분리한다.

본 발명에 따른 식물 추출물, 이로부터 분리·정제된 화학식 1 또는 2의 폴리아세틸렌계 화합물은 유해조류에 선택적인 방제효과를 나타낸다. 상기 유해조류에는 마이크로시스티스(Microcystis), 아나베나(Anabaena), 오실라토리 아(Oscillatoria), 아파니조메논(Aphanizomenon), 노듈라리아(Nodularia), 코클로디늄(Cochlodinium) 속의 조류 등이 포함된다. 특히, 마이크로시스티스속(Microcystis spp.), 아나베나속(Anabaena spp.) 등과 같은 남조류 및 코클로디늄속(Cochlodinium spp.) 등과 같은 적조류에 대하여 매우 높은 방제효과를 나타내며, 유해하지 않은 클로렐라속(Chlorella spp.), 세네데스무스(Senedesmus spp.) 등의 녹조류에 대해서는 상대적으로 낮은 방제효과를 나타낸다.

본 발명의 방제용 조성물은 폴리아세틸렌계 화합물의 효과를 저해하지 않는 범위 내에서 효과의 안정적 발현, 적용 대상 생물로의 부착 증진, 운반 및 처리의 간편화를 위해 제제학적으로 허용 가능한 고체 담체, 액체 담체, 액체 희석제, 액화된 기체 희석제, 고체 희석제, 또는 기타 적당한 보조제, 예를 들면 유화제, 분산제 또는 기포제 등의 계면활성제를 더욱 포함할 수 있다. 또한, 통상적으로 이용되는 다른 살조제를 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 방제용 조성물은 바람직하게는 유제, 수화제, 입제, 분제, 캅셀형 및 젤상의 제형으로 제제화될 수 있고, 제제의 부력을 위해 도넛형과 같은 제형을 통한 접촉제로서 제공되는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 방제용 조성물은 상기에 예시된 바와 같은 유해조류가 발생한 수중 또는 토양에 처리하여 유해조류를 방제할 수 있다. 이때, 상기 조성물을 유해조류가 발생되는 초기에 처리함으로써 대량증식을 사전에 차단하는 것이 바람직하다.

본 발명의 방제용 조성물을, 처리 최종농도를 기준으로 화학식 1 또는 2의 폴리아세틸렌계 화합물은 0.5 ㎍/㎖ 내지 20 ㎍/㎖의 농도, 식물추출물은 3 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖의 농도가 되도록 조류가 발생한 수중 또는 토양에 처리하는 것이 바람직하며, 이는 유해조류의 종류, 발생밀도, 생육 정도, 수질 환경 등을 고려하여 적절하게 조절할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 식물 메탄올 추출물의 남조류에 대한 방제효과

(1) 식물 메탄올 추출물의 제조

식물 추출물의 유해조류에 대한 방제효과를 알아보기 위하여, 황새냉이, 방풍 및 엉겅퀴의 메탄올 추출물을 각각 하기와 같이 준비하였다.

① 황새냉이(Cardamine flexuosa With)

개화까지 생육이 진전된 황새냉이 전식물체를 채집하여 생체중 1.5 kg을 음건하고 음건시료를 약 2 cm 크기로 세절한 후 6 ℓ의 메탄올에 침지하여 상온에 2일 동안 두었다. 이를 여과 후 감압 농축하여 메탄올 추출물을 얻었으며 실험에 사용할 때까지 냉장 보관하였다.

② 방풍(Ledebouriella seseloides)

시중에서 구입한 건조 방풍 뿌리 200 g을 분쇄기를 이용하여 0.2 cm 이하로 마쇄한 후 2 ℓ의 메탄올에 침지하여 2일 동안 실온에 두었다가, 이를 여과 후 감압 농축하여 메탄올 추출물을 얻었으며 실험에 사용할 때까지 냉장 보관하였다.

③ 엉겅퀴(Cirsium japonicum)

시중에서 구입한 엉겅퀴의 뿌리 건조시료 3 kg에 7 ℓ의 메탄올을 첨가하고 실온에서 1일 동안 침출하여 얻은 추출물을 여과지를 사용하여 여과하였다. 얻어진 메탄올 추출물을 완전히 감압 농축한 후 실험에 사용할 때까지 냉장 보관하였다.

(2) 남조류에 대한 방제효과 확인

상기 (1)에서 제조한 식물 메탄올 추출물의 남조류에 대한 생육억제활성을 다음과 같이 확인하였다. 본 실시예에서는 유해조류로서 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받은 남조류인 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa UTEX 2388)를 사용하였다.

먼저, 배양액(알렌 배지)에 계대배양 중인 마이크로시스티스 아에루기노사를 접종하고, 조류 농도가 670 nm에서 약 0.08의 흡광도가 될 때까지 배양하였다. 이 배양액을 50 ㎖의 배양병에 10 ㎖씩 분주하고 아래와 같이 조제된 시험 용액 및 대조군 용액 100 ㎕를 각각 상기 균주 배양액에 투여한 후, 25℃, 14시간 광주기, 광도 40-60 μmolm^-2s^-1및 100 rpm의 조건에서 배양하였다.

한편, 상기 (1)에서 제조한 각 메탄올 추출물을 100 ㎍/㎖의 트윈 20(Tween 20™)이 포함된 디메틸설폭사이드에 용해시킨 후 동일 용매를 이용하여 다양한 농도로 시험 용액을 조제하였다. 배양액내의 디메틸설폭사이드와 트윈 20의 최종 농도는 각각 약 1% 및 2 ㎍/㎖이었다. 또한, 증류수에 상기 용매를 동일한 조건으로 첨가한 용액을 대조군으로서 사용하였다.

시험 용액 처리 후 6일째에 흡광도를 측정하여 각 조류의 생장정도를 사전에 설정해 둔 흡광도-건물중 상관식(Kim 등, Aquatic Botany 85: 1-6, 2006)(수학식 1)을 통해 조사한 후, 식물 메탄올 추출물의 조류 방제 효과를 대조군에 대한 건물중 억제정도(%)로 산출하여, 하기 표 1에 표시하였다.

상기 식에서, Y는 흡광도, X는 건물중을 나타낸다

상기 표 1의 결과에서 볼 수 있듯이, 상기 식물 추출물들은 모두 50 ㎍/㎖ 이하의 처리농도에서 높은 조류 생육억제활성을 나타냈으며, 특히 황새냉이와 방풀의 추출물은 약 10 ㎍/㎖의 낮은 농도에서도 95% 이상의 조류 생육억제활성을 나타냈다.

<실시예 2> 추출방법에 따른 식물 추출물의 조류 방제활성

(1) 방풍 추출물의 제조

시중에서 구입한 중국산 원방풍(Ledebouriella seseloides)을 이용하여 아래와 같은 4가지 추출방법으로 추출물을 제조하였다.

① 추출방법 1

건조된 뿌리 200 g을 0.5 cm 내외로 세절한 후 메탄올, 에탄올, 아세톤, 헥산, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드 2 ℓ에 각각 침지하여 실온에서 20일 동안 추출하고 다시 동일한 용매 2 ℓ로 재추출한 다음, 얻어진 유기용매 추출액을 여과지로 여과한 후 감압건조기로 건조시켜 메탄올 추출물(시료 1), 에탄올 추출물(시료 2), 아세톤 추출물(시료 3), 헥산 추출물(시료 4), 에틸아세테이트 추출물(시료 5) 및 메틸렌클로라이드 추출물(시료 6)을 각각 조제하였다.

② 추출방법 2

상기 추출방법 1의 메탄올 추출물의 건고물을 증류수로 녹인 다음 동량의 에틸아세테이트로 추출하여 건조시켰다(시료 7).

③ 추출방법 3

상기 추출방법 1의 메탄올 추출물의 건고물을 증류수로 녹인 다음 동량의 헥산으로 추출하여 건조시키고(시료 8), 수용액 층에 동량의 에틸아세테이트를 가해 추출한 다음 이를 건조시켰다(시료 9).

④ 추출방법 4

상기 추출방법 1의 메탄올 추출물의 건고물을 80% 메탄올로 용해하고 동량의 헥산으로 분획한 다음, 상층의 헥산추출물을 농축하였다(시료 10). 수용액 층에는 증류수를 첨가한 후 동량의 에틸아세테이트로 추출하고 이를 농축하였다(시료 11).

(2) 방풍 추출물의 조류 방제효과 확인

상기 시료들을 이용하여 실시예 1과 동일한 방법으로 조류의 95% 생육억제 최소농도를 측정하고, 결과를 하기 표 2에 표시하였다.

표 2에 표시된 결과에서 볼 수 있듯이, 방풍 뿌리 200 g으로부터 추출한 추출물의 95% 방제 가능한 용적은 메틸렌클로라이드로 직접 추출하는 방법에 의한 추출물(시료 6)의 경우에 가장 높았다.

<실시예 3> 황새냉이로부터 폴리아세틸렌계 화합물의 분리 및 정제

실시예 1에서 제조한 황새냉이 추출물 11 g을 80% 메탄올에 용해하고 동량의 헥산으로 분획한 다음, 분리된 두 층을 다시 농축하였다. 수용액층은 증류수(2 ℓ)로 다시 용해하였으며, 이것을 동량의 에틸아세테이트와 부탄올을 가지고 순차적으로 분획한 후 각 유기용매층을 농축하였다. 얻어진 각 분획층에 대하여 실시예 1에서와 동일한 방법으로 남조류의 생육억제활성을 조사하고, 결과를 표 3에 표시하였다.

표 3에 표시된 결과에서 볼 수 있는 바와 같이, 에틸아세테이트층이 가장 높은 조류 생육억제활성을 나타내었다.

활성이 우수한 에틸아세테이트층을 헥산:에틸아세테이트(2:1, v/v) 전개용매를 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그라피(실리카겔 60F, 230-400 메쉬, 100 g, 4.2×60 cm)로 다시 50 ㎖씩 분획하였다. 다시, 박층 크로마토그라피(thin layer chromatography; TLC) 패턴에 의한 11개의 분획(분획1 내지 11)으로 나누어 농축한 다음 마이크로시스티스 아에루기노사에 대하여 생육억제활성을 조사하였다. 그 결과 분획 8 내지 11이 높은 생육억제활성을 나타내었으며, 이들 분획을 혼합한 혼합물 530 mg을 100% 메탄올 전개용매를 사용하여 세파덱스 LH-20 컬럼(1.0×40 cm)로 다시 분획하였고 최종적으로 약 30 mg의 물질을 얻었다. 이 물질은 TLC에서 단일 스팟(spot)을 나타냈고, 또한 GC-MS분석시 단일 피크를 보임에 따라 순수한 물질임을 확인하였다. 이 물질의 구조를 동정하기 위하여 전자분사 이온화법(electrospray ionization mode)으로 질량분석을 실시한 결과, 분자이온(H⁺)은 나타나지 않았으며, 주요 분자이온으로는 m/z 171, 157, 142, 129(base peak), 115, 105, 91 및 77이 확인되었다. 이 물질의 분자량을 결정하기 위하여 화학 이온화법(chemical ionization mode)으로 질량분석을 실시한 결과, [M+1]⁺con이 m/z 261에서 나타남에 따라 분자량이 260임을 알 수 있었다. 이 물질의 정확한 구조를 결정하기 위하여 ¹H 및 ¹³C-핵자기공명분석을 실시한 결과, 황새냉이로부터 분리한 물질은 Nitz 등(J. Agric. Food Chem. 38(7):1445-1447, 1990)에 보고된 팔카린다이올 [falcarindiol, heptadeca-1,9(Z)-diene-4,6-diyne-3,8-ol]과 일치하는 것으로 확인되었다.

<실시예 4> 방풍으로부터 폴리아세틸렌계 화합물의 분리 및 정제

실시예 1에서 제조한 건조된 방풍(Ledebouriella seseloides) 뿌리의 메탄올 추출물 20 g을 70% 메탄올 1ℓ로 용해시킨 후, 동량의 헥산, 에틸에테르, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 층으로 각각 2회씩 분획하여 감압 농축하였다. 각각의 분획물에 대해 유해 남조류인 마이크로시스티스 아에루기노사의 생육저해활성을 실시예 1과 동일한 방법으로 조사하고, 결과를 표 4에 표시하였다.

헥산 추출물을 헥산:클로르포름:에탄올(20:20:1, v/v)로 평형화된 실리카겔(70-230 메쉬, 150 g; 머크사)이 충진된 컬럼(4×55 cm)에 가한 다음, 평형화 용매와 동일한 용매 조건으로 용출시키면서 삼각 플라스크에 50 ㎖씩 분취하였다. TLC를 통하여 비슷한 분획 양상을 가진 것들을 모아 4개의 분획층(분획 1 내지 4)으로 나누어 조류방제활성을 조사한 결과, 분획 2(215.1 mg)가 가장 높은 활성을 나타내었다. 이 분획 2를 가지고 헥산:클로르포름:에탄올(14:14:1, v/v)의 전개용매를 이용하여 분취 TLC(preparative TLC)를 수행한 결과, 서로 다른 Rf값을 나타내는 3개의 밴드를 확인하였다. 각 밴드의 실리카겔을 회수하여 에틸아세테이트로 용출한 후 감압 농축한 다음 생물검정을 통하여 가장 조류 생육억제활성이 우수한 물질을 얻었다.

얻어진 결과 물질을 가지고 다시 세파덱스-LH20(25~100 μm, 시그마사)을 이용하여 컬럼크로마토그라피(2.5×55 cm)를 실시하였다. 메틸렌클로라이드:메탄올(85:15, v/v)의 용매조건으로 용출한 후, 분획 수집기를 이용하여 시험관에 10 ㎖씩 분취하였다. TLC 분석을 통하여 동일한 분획층을 모은 다음, 상기 분획층에 대해 에틸아세테이트:헥산(1:5, v/v) 전개용매를 이용하여 분취 TLC를 실시한 결과, Rf 값이 서로 다른 4개의 밴드를 확인하였다. 해당 밴드의 실리카겔을 회수하여 에틸아세테이트로 용출한 다음 이 농축물에 대한 생물검정을 통하여 조류의 생육억제활성이 가장 우수한 물질(76.6 mg)을 얻었다. 이 물질은 TLC에서 단일 스팟을 보였고, 또한 GC-MS분석시 단일 피크를 보임에 따라 순수한 물질임을 확인하였다. 본 물질의 구조를 동정하기 위하여 전자분사 이온화법(electrospray ionization mode)으로 질량분석을 실시한 결과, 분자이온(H⁺)은 나타나지 않았으며, 주요 분자이온으로는 m/z 171, 157, 142, 129(base peak), 115, 105, 91 및 77이 나타났다. 분자량을 결정하기 위하여 화학 이온화법(chemical ionization mode)으로 질량분석을 실시한 결과, [M+1]⁺con이 m/z 277에서 나타남에 따라 분자량이 276임을 알 수 있었다. 또한, 이 물질의 정확한 구조를 결정하기 위하여 ¹H 및 ¹³C-핵자기공명분석을 실시한 결과, 황새냉이로부터 분리한 살조물질은 Nitz 등(J. Agric. Food Chem. 38(7):1445-1447, 1990)에 보고된 팔카리놀(falcarinol; heptadeca-1,9(Z)-diene-4,6-diyne-3-ol)과 일치하는 것으로 나타났다.

<실시예 5> 엉겅퀴로부터 폴리아세틸렌계 화합물의 분리 및 정제

실시예 1에서 제조한 엉겅퀴 뿌리 추출물을 70% 메탄올에 용해시키고 동량의 헥산으로 2회 추출한 다음 헥산층과 수용액층을 감압 농축하였다. 농축한 수용액층을 다시 2 ℓ의 증류수로 용해한 후 동량의 에틸아세테이트, 에틸에테르 및 뷰탄올로 2회씩 각각 추출하였다. 상기 4 가지 유기용매 추출물 및 수용액층을 감압 농축한 후, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 마이크로시스티스 아에루기노사에 대한 생육억제활성을 조사하고, 결과를 하기 표 5에 표시하였다.

표 5에 표시된 바와 같이, 헥산층과 에틸아세테이트층이 전반적으로 가장 높은 방제활성을 보였으며, 이들 층을 혼합한 혼합물 7 g에 대하여 헥산:에틸아세테이트 혼합액(5:1, 2:1)과 클로로폼:메탄올의 혼합액(9:1)을 전개용매로 하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(내경 5×60 ㎝, 카이젤 겔 60, 70-230 메쉬, 400 g; 머크사)를 실시하였다. 이로부터 얻은 용출액을 분취한 후 클로로폼:메탄올의 혼합액(95:5, v/v)을 전개용매로 하는 박층 크로마토그래피(카이젤 겔 60 F254, 0.25 ㎜; 머크사)로 분석하였다. TLC의 패턴에 따라 분획 1 내지 7의 7개 분획으로 나누고 이들의 조류 생육억제활성을 조사한 결과 분획 2, 5 및 6이 높은 활성을 보였다. 분획 2는 박층 크로마토그래피상에서 순도가 높은 물질로 나타났으며, 메틸렌클로라이드:헥산:메탄올(5:5:1, v/v/v)을 이용한 세파덱스-LH20 컬럼 크로마토그래피를 통하여 물질 1(110 ㎎)을 순수하게 분리하였다. 또한, 분획 5로부터 메틸렌클로라이드:헥산:메탄올(5:5:1, v/v/v)을 이용한 세파덱스-LH20 컬럼 크로마토그래피를 통하여 물질 2(320 ㎎)를 순수하게 분리하였다. 분획 6 역시 분획 2 및 5와 동일한 조건으로 각각 세파덱스-LH20 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 약 500 mg의 순수한 물질을 획득한 후 아세톤을 이용한 재결정화를 통하여 물질 3(400 mg)을 순수하게 분리하였다.

엉겅퀴 뿌리 추출물로부터 분리된 상기 물질 1 내지 3의 구조를 각각 하기와 같이 확인하였다. 먼저, 물질 1에 대하여 전자방사 이온화법으로 질량분석을 실시한 결과, [M+Na]⁺ 이온이 m/z 319.4에서 나타나 분자량이 296으로 추정되었다. ¹H 및 ¹³C-핵자기공명 분석 결과, 물질 1은 다카이시 등(Takaishi 등, Phytochemistry 29:3849-3852, 1990)이 보고한 시리네올(ciryneol) C와 일치하는 것으로 확인되었다. 물질 2는 고속원자충격질량분석법(Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry)으로 질량분석을 실시한 결과 [M+K]⁺ 이온이 m/z 359에서 나타났고, 또한 [M+H]⁺ 이온이 321에서 나타나 분자량이 320으로 추정되었다. 핵자기 공명분석 결과, 물질 2는 다카이시 등(1990)이 보고한 시리네올(ciryneol) A인 것으로 확인되었다. 또한, 물질 3은 전기분무 질량분석법(Electrospray ionization mass spectrometry)을 이용한 질량분석 결과, [M+Na]+ 이온이 m/z 301에서 나타나 분자량이 278로 추정되었고, 핵자기 공명분석 결과 다카이시 등(1990)이 보고한 1-헵타데신-11,13-다이인-8,9,10-트라이올(1-heptadecene-11,13-diyne-8,9,10-triol)인 것으로 확인되었다.

<실시예 6> 분리된 폴리아세틸렌계 화합물의 담수조류에 대한 생육억제활성

실시예 3 내지 5에서 분리 동정된 폴리아세틸렌계 화합물에 대한 담수조류의 생육억제활성을 다음과 같이 조사하였다.

먼저, 각 화합물을 200 ㎍/㎖의 트윈 20(Tween 20)이 포함된 디메틸설폭사이드에 용해시킨 후, 실시예 1에서와 같이 알렌 배지(Allen's medium)에 희석하여 하기 표 6에 표시된 최종 농도가 되도록 시험 용액을 준비하였다. 이때, 디메틸설폭사이드와 트윈 20의 최종 농도는 각각 약 1% 및 2 ㎍/㎖이었다. 대조군으로는 증류수에 상기 용매를 동일한 조건으로 첨가한 용액을 사용하였다. 본 시험에서의 담수조류는 한국생명공학연구원 생물자원센터에서 분양받은 유해한 남조류 2종[마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa, UTEX 2388) 및 아나베나 아피니스(Anabaena affinis)]과 유익한 녹조류 2종[클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) 및 세네데스무스속(Scenedesmus spp.)]를 사용하였다. 배양액(알렌 배지)에 계대배양 중인 상기 조류들을 각각 접종하고, 조류 농도가 670 nm에서 약 0.08의 흡광도가 될 때까지 배양하였다. 이 배양액을 50 ㎖의 배양병에 10 ㎖씩 분주하고 시험 용액 및 대조군 용액 100 ㎕를 각각 상기 균주 배양액에 투여한 후, 25℃, 14시간 광주기, 광도 40-60 μmolm^-2s^-1및 100 rpm의 조건에서 배양하였다. 녹조류의 경우 5일, 남조류의 경우 6일동안 배양하였으며, 배양이 종료된 이후 배양액의 흡광도를 측정하여 각 조류의 생장정도를 사전에 설정해 둔 흡광도-건물중 상관식(Kim 등, Aquatic Botany 85: 1-6, 2006)(수학식 1 내지 4)을 통해 조사한 후, 팔카린다이올 및 팔카리놀 용액의 담수조류에 대한 방제 효과를 대조군에 대한 건물중 억제정도(%)로 산출하여 하기 도 1 및 도 2에 표시하였다(수학식 1-마이크로시스티스 아에루기노사, 수학식 2-클로렐라 불가리스, 수학식 3-세네데스무스 속, 수학식 4-아나베나 아피니스).

수학식 1

상기 식에서, Y는 흡광도, X는 건물중을 의미한다.

도 1에 표시된 결과에서 볼 수 있듯이, 황새냉이로부터 분리된 팔카린다이올은 남조류인 마이크로시스티스 아에루기노사에 대해 0.25, 0.5 및 1.0 ㎍/㎖의 처리농도에서 각각 48.8, 76.8 및 99.6%의 생육억제활성을, 녹조류인 클로렐라 불가리스에 대해서는 2.5, 5.0 및 10 ㎍/㎖의 처리농도에서 각각 45.4, 62.8 및 97.1%의 억제 활성을 나타내었다. 이러한 결과로부터, 상기 팔카린다이올이 유해조류인 마이크로시스티스 아에루기노사의 생육을 상대적으로 더 강하게 억제하는 것을 알 수 있었다.

또한, 도 2에 표시된 결과에서 볼 수 있듯이, 방풍으로부터 분리된 팔카리놀 역시 남조류인 마이크로시스티스 아에루기노사에 대해서는 0.4 및 1.5 ㎍/㎖에서 각각 83.0% 및 100%의 높은 방제활성을 나타낸 반면, 녹조류인 클로렐라 불가리스에 대해서는 6.0 및 25 ㎍/㎖에서 각각 74.5, 85.3%의 억제 활성을 나타내어 상기 팔카리놀이 유해조류인 마이크로시스티스 아에루기노사의 생육을 상대적으로 더 강하게 억제하는 것을 알 수 있었다.

한편, 엉겅퀴로부터 분리된 시리네올 C와 1-헵타데신-11,13-다이인-8,9,10-트라이올은 하기 표 6에 표시된 바와 같이 10 ㎍/㎖ 이하의 처리농도에서 마이크로시스티스 아에루기노사에 대해 우수한 생육억제효과를 나타내었다.

<실시예 7> 방풍으로부터 분리된 팔카리놀의 적조에 대한 방제효과

국립수산과학원으로부터 분양받은 코클로디늄 폴리크리코이데스(Cochlodinium polykrikoides)를 해수로 조제된 F/2 배지(Guillard & Ryther, Can. J. Microbiol. 8: 229-239, 1962)에서 20℃, 광주기 14시간 및 광도 45 μmolm^-2s^-1의 조건 하에 계대배양시켰다. 배양된 코클로디늄 폴리크리코이데스를 1.5×10³ 세포/㎖ 배지가 되도록 삼각플라스크에 50 ㎖씩 분주하고, 상기 실시예 3에서 분리 동정된 팔카리놀을 하기 표 7에 제시된 농도로 각 플라스크에 투여하였다. 이때, 대조군으로는 증류수에 상기 용매를 동일한 조건으로 첨가한 용액을 사용하였다. 이를 20℃ 및 14시간 광주기(광도: 45 μmolm^-2s^-1)의 조건에서 배양하면서 매일 5 ㎕씩 취해 광학현미경(150배)으로 개체수 및 운동성을 조사하였다. 이때, 조사는 처리군당 5회씩 반복하였으며, 운동성 저해효과는 0 내지 100 등급표에 준하여 달관조사를 실시한 후 정상적으로 움직이는 것을 0, 전혀 움직이지 않는 것을 100으로 하여 결과를 분석하였다. 팔카리놀 처리 후 5일째에 측정된 결과를 하기 표 7에 표시하였다.

상기 표 7에 표시된 결과에서 볼 수 있듯이, 팔카리놀은 약 3 ㎍/㎖ 이상의 처리 농도에서 코클로디늄 폴리크리코이데스에 대해 우수한 방제효과를 나타내었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 폴리아세틸렌계 화합물은 유익한 조류에는 독성이 적으면서 남조류 및 적조류 등의 유해조류만을 선택적으로 유효하게 방제하므로, 이를 함유하는 방제 조성물은 자연친화적이면서 효능이 우수한 유해조류 방제제로서 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 실시예 3에서 분리한 팔카린다이올(falcarindiol)이 담수조류인 마이크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa)와 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)의 생육억제에 미치는 효과를 나타낸 결과이고,

도 2는 실시예 4에서 분리된 팔카리놀(falcarinol)이 4가지 담수조류의 생육억제에 미치는 효과를 나타낸 결과이다.

Claims

하기 화학식 1 또는 화학식 2의 폴리아세틸렌계 화합물 또는 이들 화합물 중 적어도 하나를 포함하는 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 유해 조류 방제용 조성물:

[화학식 1]

상기 식에서,

R₁및 R₂는 각각 독립적으로 H 또는 OH 이다.

[화학식 2]

상기 식에서,

R₁은 OAc, Cl 또는 OH이다.
제1항에 있어서,

폴리아세틸렌계 화합물이 팔카리놀(falcarinol), 팔카린다이올(falcarindiol), 시리네올 A(ciryneol A), 시리네올 C(ciryneol C) 및 1-헵타데신-11,13-다이인-8,9,10-트라이올(1-heptadecene-11,13-diyne-8,9,10-triol)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 유해 조류 방제용 조성물.
제1항에 있어서,

식물이 방풍, 당근, 고본, 미나리, 백지(구릿대), 갯기름나물, 천궁, 참나물, 전호, 독활, 어수리, 파슬리, 당귀, 사상자, 인삼, 오갈피나무, 황칠나무, 섬오갈피나무, 강활, 기름나물, 어수리, 천궁, 당귀, 사상자, 냉이(Cardamine)속 식물, 엉겅퀴(Cirsium)속 식물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 유해 조류 방제용 조성물.
제1항에 있어서

유해조류가 마이크로시스티스(Microcystis), 아나베나(Anabaena), 오실라토리아(Oscillatoria), 아파니조메논(Aphanizomenon), 노듈라리아(Nodularia) 및 코클로디늄(Cochlodinium) 속의 조류로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 유해 조류 방제용 조성물.
제1항의 조류 방제용 조성물을 마이크로시스티스(Microcystis), 아나베나(Anabaena), 오실라토리아(Oscillatoria), 아파니조메논(Aphanizomenon), 노듈라 리아(Nodularia) 또는 코클로디늄(Cochlodinium) 속의 조류가 서식하는 수중 또는 토양에 처리하는 것을 포함하는, 유해 조류의 방제방법.
제5항에 있어서,

제1항의 유해 조류 방제용 조성물을 폴리아세틸렌계 화합물의 최종농도가 0.5 ㎍/㎖ 내지 20 ㎍/㎖가 되도록 유해 조류에 처리하는 것을 특징으로 하는, 유해 조류의 방제방법.
제5항에 있어서,

제1항의 유해 조류 방제용 조성물을 식물 추출물의 최종농도가 3.0 ㎍/㎖ 내지 100 ㎍/㎖가 되도록 유해 조류에 처리하는 것을 특징으로 하는, 유해 조류의 방제방법.