KR102201525B1

KR102201525B1 - 바실러스 아밀로리쿼파시엔스와 식물추출물 혼합제형 해충방제제

Info

Publication number: KR102201525B1
Application number: KR1020190111028A
Authority: KR
Inventors: 강범용; 김철홍; 한송희; 박주연
Original assignee: (주)현농
Priority date: 2019-09-06
Filing date: 2019-09-06
Publication date: 2021-01-12

Abstract

본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스와 식물추출물 혼합제형 해충방제제에 관한 것으로, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens PPL)와 식물추출물을 유효성분으로 포함하며, 점박이응애 (Tetranychus urticae Koch), 복숭아혹진딧물(Myzus persicae)에 방제 활성을 갖는다.

Description

바실러스 아밀로리쿼파시엔스와 식물추출물 혼합제형 해충방제제{Pest control of the formulations of Bacillus amyloliquefaciens PPL and plant extract against}

본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스와 식물추출물 혼합제형 해충방제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 점박이응애(Tetranychus urticae Koch), 복숭아혹진딧물(Myzus persicae)에 방제 활성을 갖는 해충방제제에 관한 것이다.

각종 농작물과 화훼류의 식물병에 의해 생산량 저하, 품질 저하 및 품종 퇴화 등을 초래되며 농업생산 전반에 걸쳐 심각한 경제적 피해를 주고 있다

종래의 화학농약을 사용하지 않고 식물병을 방제하려는 시도는 다양한 방법으로 이루어지고 있고, 고품질 안전농산물에 대한 수요가 높아지고 있는 현 시점에서, 농가 소득증대와 소비자의 요구를 모두 충족할 수 있는 방법으로 환경 친화적인 농법이 유일한 대안으로 부상하고 있다.

최근, 고추 탄저병을 포함한 주요 병의 방제를 위한 유용 미생물과 식물 추출물, 천연물 등 유기농업용 농자재를 이용하는 (비)생물학적 방제제가 환경 친화적인 농업기술로 개발되어 실용화되고 있다.

특히 병원성 진균, 세균 및 선충에 관한 생물학적 방제 연구가 많이 진행되어 왔고, 그 중에서 중복기생균, 비병원성 퓨자리움균, 균근균 (vesicular-arbuscular mycorrhizal, VAM)을 이용한 생물학적 방제가 시도되고있다. 또한 바실러스 서브틸리스 QST 713 (Bacillus subtilis QST 713)을 이용한 세레나데 (Serenade), 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 GB 99 (B. amyloliquefaciens GB 99) 및 바실러스 서브틸리스 GB 122 (B. subtilis GB122)로 만든 바이오일드 (BioYield) 등이 사용되고 있다

하지만 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 PPL (Bacillus amyloliquefaciens PPL)과 식물추출물을 혼합한 혼합제형에 대하여 해충방제제로 이용가능성은 전혀 알려진 바 없다.

대한민국 등록특허 제10-0823085호

본 발명은 상기의 문제점을 개선하기 위하여, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 PPL와 식물추출물을 포함하는 해충방제제를 제공하는데 그 목적이 있다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 해충방제제는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens PPL)와 식물추출물을 유효성분으로 포함한다.

본 발명의 해충방제제는 점박이응애(Tetranychus urticae Koch), 복숭아혹진딧물(Myzus persicae)에 방제 활성을 갖는다.

상기 식물추출물은 님(Azadirachta indica) 추출물, 데리스(Derris elliptica) 추출물, 담배(Nicotiana tabacum L.) 추출물 중 적어도 어느 하나를 포함한다

상기 해충방제제는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 배양액 0.0001 내지 0.01중량%, 식물추출물 0.00001 내지 0.001중량% 혼합된다.

그리고 본 발명의 해충방제제는 꽃황새냉이(Cardamine amaraeformis) 추출물을 더 포함할 수 있다.

본 발명은 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 PPL와 식물추출물을 이용하여 해충방세효과가 우수한 해충방제제를 제공한다.

도 1은 실시예 1과 실시예 2의 점박이응애에 대한 해충방제율을 나타내는 표.
도 2는 실시예 1과 실시예 2의 복숭아혹진딧물에 대한 해충방제율을 나타내는 표.
도 3은 각 표준액을 농도별로 희석하여 LC-MS/MS로 측정한 후 얻어진 크로마토그래프이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시 예에 따른 바실러스 아밀로리쿼파시엔스와 식물추출물 혼합제형 해충방제제에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명의 일 실시예에따른 해충방제제는 유효성분으로서 바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens PPL)와 식물추출물을 포함한다.

식물추출물은 님(Azadirachta indica) 추출물, 데리스(Derris elliptica) 추출물, 담배(Nicotiana tabacum L.) 추출물 중 적어도 어느 하나를 포함한다. 가령 님추출물과 데리스추출물을 혼합하여 사용하거나, 또는 담배추출물 만을 포함하여 사용할 수 있다.

님은 님나무에서 자라는 잎을 일컫는 것으로, 님나무는 멀구슬나무과에 반 상록교목으로 아열대 및 열대지방에서 많이 자란다. 님은 50% 이상이 인도에 서식하고 있다. 2~3월 흰 꽃이 피며, 꽃이 지고 난 후 달리는 녹색 열매는 7~8월이 되면 노랗게 익어 새들이 즐겨 찾는다. 건조에 강하며 내염성도 높다. 열매는 식용 가능하며 민간 약재로도 이용한다. 주요성분으로 아자디라크틴(azadirachtin)을 함유하고 있다.

데리스는 쌍떡잎식물 장미목 콩과의 덩굴성 관목으로 어린 가지에 갈색 털이 빽빽이 난다. 잎은 홀수깃꼴겹잎이고, 작은잎 9∼13개로 이루어지며 좁은 달걀을 거꾸로 세운 듯한 모양이다. 꽃은 총상꽃차례에 달리고 홍색이다. 꼬투리는 편평하고 한쪽에 좁은 날개가 있다. 주요성분으로 로테논(rotenone)을 함유하고 있다.

담배는 쌍떡잎식물 통화식물목 가지과의 여러해살이풀로 줄기는 곧게 서고 높이가 1.5~2m이다. 잎과 줄기에는 점액을 분비하는 선모가 빽빽이 있어 끈적끈적하다. 잎은 어긋나고 길이가 50cm이며 타원형으로 끝이 뾰족하고 가장자리는 밋밋하다. 잎자루는 짧고 날개가 있다. 꽃은 7~8월에 연한 홍색으로 끝부분의 색이 짙고 원줄기 끝에 큰 원추꽃차례로 달리며 소화경은 10~20(25)mm이다. 꽃받침은 원통형으로 길이가 12~20(25)mm로서 작은 꽃가지와 비슷하며 선모가 있고 갈라진 조각은 피침모양이다. 주요성분으로 니코틴(nicotine)을 함유하고 있다.

본 발명은 님, 데리스, 담배의 잎을 이용하며, 다양한 방법으로 추출이 가능하다. 일 예로 님, 데리스, 담배의 잎 각각에 추출용매를 중량비로 2 내지 20배를 가한 후 10 내지 150℃에서 1 내지 40시간 동안 열수추출, 냉침 또는 온침 추출 등을 이용할 수 있다. 또한, 환류냉각추출, 초음파 추출방법 등을 이용할 수 있다. 또한, 상술한 추출방법 뿐만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 활성 분획도 추출물에 포함될 수 있다.

추출용매로 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 다가 알코올 또는 이들의 혼합물로부터 선택된 적어도 어느 하나를 이용할 수 있다. 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올로 메탄올, 에탄올 등을 이용할 수 있고, 다가 알코올로부틸렌글리콜 및 프로필렌글리콜, 펜틸렌글리콜, 글리세롤 등을 이용할 수 있다. 그리고 혼합물로는 물 및 저급알코올의 혼합물, 물 및 다가 알코올의 혼합물, 저급 알코올 및 다가 알코올의 혼합물, 또는 물 및 저급알코올 및 다가 알코올의 혼합물을 이용할 수 있다.

이와 달리 식물추출물은 시중에 판매되는 제품을 구매하여 사용할 수 있다.

본 발명의 해충방제제는 공지의 부형화물질을 추가로 포함할 수 있다. 가령, 공지의 부형화 물질로 고체 담체, 액체 담체, 액체 희석제, 액화된 기체 희석제, 고체 희석제, 또는 기타 적당한 보조제, 예를 들면 유화제, 분산제 또는 기포제 등의 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 해충방제제는 농약분야에 공지된 다양한 제형으로 제제화시켜 사용할 수 있으며, 제제화를 위해서는 농약분야에서 통상적으로 사용되는 제제화 방법을 어느 것이나 사용할 수 있다. 가령, 수화제, 입제, 분제, 유제, 스프레이상, 연막제, 캅셀형 및 젤상의 제형으로 제제화될 수 있다.

본 발명의 해충방제제는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 PPL과 식물추출물이 혼합된 혼합물을 0.00001 내지 90중량% 함유한다. 본 발명의 해충방제제는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 PPL과 식물추출물이 혼합된 혼합물을 멸균수와 혼합하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 PPL 배양액 0.0001 내지 0.01중량%, 식물추출물 0.00001 내지 0.001중량% 혼합된다. 식물의 품종, 생육 정도, 경작지 환경, 해충의 밀집 정도 등을 고려하여 적절하게 농도를 조절할 수 있다.

또한, 본 발명의 해충방제제는 꽃황새냉이 추출물을 더 포함할 수 있다.

꽃황새냉이( Cardamine amaraeformis) 쌍떡잎식물 양귀비목 겨자과의 두해살이풀로 산골짜기의 냇가에서 자란다. 줄기는 곧게 서며 높이가 20cm 정도이다. 뿌리에서 난 잎은 뭉쳐나고 깃 모양으로 갈라지며, 갈라진 조각은 2∼3쌍이고 큰 톱니가 있다. 줄기에서 난 잎은 어긋나고 3∼7개의 작은잎으로 갈라지며 작은잎은 바소꼴로 가장자리가 밋밋하거나 톱니가 있다.

본 발명에서는 꽃황새냉이의 줄기와 잎을 사용하며, 추출방법은 님, 데리스, 담배 추출물 추출방법과 동일하며, 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 피피엘 100중량부에 대해 1 내지 30중량부가 혼합될 수 있다.

본 발명의 해충방제제는 식물이 생장하고 있는 토양 또는 생장 중인 식물의 잎 등에 처리함으로써 해충을 방제할 수 있다.

본 발명은 점박이응애 (Tetranychus urticae Koch), 복숭아혹진딧물(Myzus persicae)에 우수한 방제 활성을 갖는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명에 대해 설명하고자 한다. 다만, 하기의 실시 예는 본 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 하기의 실시예로 한정하는 것은 아니다.

(실시 예1)

바실러스 아밀로리쿼파시엔스 피피엘(Bacillus amyloliquefaciens PPL, KACC92167P)균주를 MBP 배지(5% peptone, 5% mannitol, 1% mung bean extract, 0.45% yeast extract, 0.3% vegetable oil, 0.1% NaCl, 0.08% egg yolk)에서 28℃, 120 rpm으로 5일 진탕 배양하고 1×10⁸ cfu/ml 농도로 사용하였다. 이 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 상등액을 회수한 후 0.2 ㎛ membrane filter (Millipore Filter Corp., Bedford, MA, USA)로 여과하여 균을 제거하고 사용하였다. 균이 제거된 상등액에 멸균수를 혼합하여 60%(v/v)의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 상등액을 수득하였다.

식물추출물은 담배(nicotine 2.2%)의 원재를 구입(그린포커스, 화성, 경기)하여 사용하였다. 담배를 멸균수에 혼합하여 3%(v/v)의 식물추출물(이하, TB추출물)을 수득하였다.

그리고 60%(v/v)의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 상등액 20㎖과 TB추출물 1㎖을 혼합한 뒤 멸균수에 250배, 500배, 750배, 1000배로 각각 희석하였다.

(실시 예2)

실시 예1의 60%(v/v)의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 상등액을 준비하고,

그리고 식물추출물은 님(azadirachtin 0.75%), 데리스(rotenone 0.05%)의 원재를 구입(그린포커스, 화성, 경기)하여 사용하였다. 님과 데리스를 각각 멸균수에 혼합하여 각각 3%(v/v)님 추출물과 2%(v/v)의 데리스 추출물을 수득한 뒤 혼합하여 식물추출물(이하, NR추출혼합물)을 수득하였다.

그리고 60%(v/v)의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 상등액 20㎖과 NR추출혼합물 1㎖을 혼합한 뒤 멸균수에 250배, 500배, 750배, 1000배로 각각 희석하였다.

(실시예 3)

실시예 1의 60%(v/v) 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 상등액과 NR추출혼합물을 준비한 뒤, 꽃황새냉이 추출물을 준비하였다.

꽃황새냉이 추출물은 세척 및 건조시켜 준비한 꽃황새냉이를 잘게 자른 후, 꽃황새냉이에 대하여 물을 중량비로 10배를 가한 후 90℃에서 6시간 동안 가열한 후 여과하여 액상으로 수득하였다

그리고 실시예 1의 60%(v/v)의 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 상등액 20㎖와 NR추출혼합물 1㎖, 꽃황새냉이 추출물 2㎖를 혼합하였다. 이후 멸균수에 100배로 희석하였다.

<해충방제 검정>

점박이응애와 복숭아혹진딧물에 대한 해충방제 효능을 실험하기 위하여 전남생물산업진흥원의 친환경농생명연구센터에서 점박이응애와 복숭아혹진딧물을 분양 받아 실험을 진행하였다.

분양받은 점박이응애와 복숭아혹진딧물은 25 ± 3℃의 유리온실에서 사육하였다. Petri dish (SPL, Insect breeding dish 90 × 15 mm, ventilation hole size 40 mm, Pocheon, Korea)에 일정한 크기(5ⅹ5 cm)의 수분이 공급된 필터페이퍼와 탈지면을 놓은 후 소독된 고추 잎과 강낭콩 잎을 놓은 다음 복숭아혹진딧물과 점박이응애를 접종하였다.

복숭아혹진딧물은 무시충을 사용하였으며, 각 해충들을 엽절편 하나에 각각 20마리씩 접종하고 3반복 3회 검정하였다.

처리구로, Petri dish에 준비된 각 해충에 분무기로 1 ml씩 실시예 1,2에 따른 약제를 25cm 거리에서 잎 절편에 골고루 묻게 살포한 후. 1 시간 동안 음건하였다. 각 처리구들은 25 ± 3℃ (16L : 8D, RH 50 ~ 60%) 조건에서 보관하면서 생충수와 사충수를 조사하였다. 치사여부는 가는 붓으로 충체를 접촉하여 반응이 없거나 이동하지 못하는 개체를 죽은 것으로 판단하였다,

대조구로 실시예 1의 방법으로 수득한 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 PPL균주 상등액을 약제로 사용하였으며 방법은 처리구와 동일하다.

도 1은 실시예 1과 실시예 2의 점박이응애에 대한 해충방제율을 나타내는 표이다.

도 1을 참조하면, 점박이응애를 대상으로 실시예 1(TB)를 처리한 결과 500배까지 희석한 처리구에서 58% 이상의 살충율을 나타냈다. 실시예 2(NR)을 처리한 결과 250 ~ 500배 농도까지 70%의 높은 살충율을 나타냈으며, 반수치사시간일(LT₅₀)은 3.60 ~ 6.74일이었다. 하지만 750 ~ 1000배 농도까지 희석한 처리구에서는 21 ~ 40% 이하의 살충효과가 있었다.

대조구의 경우 점박이응애에 대한 살충율은 28%로 효과가 낮았으나 처리구의 경우 53%까지 살충효과가 증대된 것으로 보아 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 PPL균주와 혼합된 식물추출물의 길항능력에 의한 상승작용이 해충방제 효과를 더욱 높임을 알 수 있었다.

도 2는 실시예 1과 실시예 2의 복숭아혹진딧물에 대한 해충방제율을 나타내는 표이다.

도 2를 참조하면, 복숭아혹진딧물을 대상으로 실시예1(TB)를 처리한 결과 500배까지 희석한 처리구에서 97%의 높은 살충율을 나타냈으며, 실시예2(NR)를 1000배까지 희석한 처리구는 91 ~ 100%의 우수한 살충율을 나타냈으며, 반수치사시간은 1.18 ~ 4.74일이었다.

대조구의 경우 점박이응애에 대한 살충율은 79%로 였으나 처리구의 경우 대조구에 비해 8 ~ 21%까지 살충효과가 증대된 것으로 보아 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 PPL균주와 혼합된 식물추출물의 길항능력에 의한 상승작용이 해충방제 효과를 더욱 높임을 알 수 있었다.

상기 실험결과를 통해 본 발명의 해충방제제는 해충방제효과가 매우 우수함을 확인할 수 있었다.

<LC-MS/MS를 이용한 biosurfactant 분석>

바실러스 아밀로리쿼파시엔스 상등액을 n-butanol을 이용하여 유기용매 층을 분리하였다. 유기용매 분획층은 진공농축장치로 완전 농축하여 methanol로 녹인 후 0.2 μm syringe filter (Whatman, PTFE)로 여과하여 LC-MS/MS 분석을 위해 사용하였다.

LC-MS/MS (API- 3200, AB SCIEX, Framingham, MA, USA) 분석에 사용된 컬럼은 Capcell Core C18 (2.1 mm I.D× 150mm, 2.7 um)이며, 분리용매는 A (0.1% formic acid in distilled water)와 B (0.1% formic acid in methanol)를 사용하였다. 모든 화합물은 ESI (electro spray ionization) 및 positive mode에서 이온화 하였고 MRM (Multiple Reaction Monitoring, Table 1) mode로 분석하였다. Biosurfactant의 표준용액은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다: fengycin(CAS Number 102577-03-7), surfactin (CAS Number 24730-31-2), iturin A (CAS Number 52229-90-0). 각 표준액을 농도별로 희석하여 LC-MS/MS로 측정한 후 얻어진 크로마토그램상의 peak 면적을 검량선과 비교하여 정량하였다.

도 3을 참조하면, Iturin A와 surfactin 표준물질의 검출시간은 각각 10.61분과 18.19분이었으며, fengycin 표준물질은 11.90, 12.48분이 유효 검출시간이었다.

정량을 위해 LC-MS/MS의 피크면적을 계산한 결과 하기 표 1과 같이 iturin A는 8.5 mg/g이 검출되었고, surfactin과 fengycin이 각각 185.6과 1.0 mg/g으로 검출되었다.

구분	Iturin A	surfactin	fengycin
함량(mg/g)	8.5±0.2	185.6±3.9	1.0±0.1

생물적 방제균 Bacillus sp. 항균물질은 cyclic lipopeptide 계통인 surfactin, iturin, fengycin 등을 생성한다고 알려져 있다. Surfactin은 직접적으로 항균활성을 나타내거나 biofilm을 생성하여 식물 뿌리 표면에 병원균이 붙지 못하게 하여 식물을 보호하며, iturin과 fengycin은 다양한 병원균에 대해 강력한 항생작용을 한다고 알려져 있다(Ongena and Jaccques, 2008).따라서 바실러스 아밀로리쿼파시엔스는 surfactin, iturin, fengycin을 생성하는 것으로 확인되었으므로, 이러한 biosurfactant에 의해 본 발명은 우수한 방제효과를 갖는 것으로 보인다.

<라디칼 소거 활성>

실시예 3의 해충방제제에 대한 라디칼 소거 활성능을 측정한 결과를 하기의 표 1에 나타내었다.

시료의 항산화 활성(electron donation ability, EDA%)은 Blois의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 2mL에 0.2mM의 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)용액 2mL를 혼합한 후 30분간 방치한 다음 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 라디칼 소거 활성능은 시료 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다. 라디칼 소거 활성능은 다음과 같은 식에 의해 계산하여 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

라디칼소거활성능(%) = (1-시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도)×100

실험에서 실험구의 시료로 실시예 3의 해충방제제를, 대조구의 시료로 BHT(합성산화방지제)를 각각 이용하였다.

구분	라디칼소거활성능
실험구	57.8±0.3
대조구	56.7±0.4

상기 표2의 결과를 살펴보면, 실시 예3의 해충방제제의 라디칼 소거능은 대조구로 사용된 통상적인 합성산화방지제 보다 라디칼 소거능보다 더 우수한 것으로 나타났다. 상기의 실험결과를 통해 꽃황새냉이 추출물을 함유하는 본 발명의 해충방제제는 항산화 성능을 나타내며, 부패를 방지 할 수 있음에 따라 장시간 동안 보관하여 사용할 수 있다.

이상, 본 발명은 실시 예를 참고로 설명하였으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 실시 예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 보호 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 정해져야 할 것이다.

Claims

바실러스 아밀로리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens PPL)와 식물추출물 및 항산화 활성을 갖는 꽃황새냉이(Cardamine amaraeformis) 추출물을 포함하며,
상기 식물추출물은 님(Azadirachta indica)추출물, 데리스(Derris elliptica) 추출물, 담배(Nicotiana tabacum L.) 추출물 중 적어도 어느 하나를 포함하고,
점박이응애(Tetranychus urticae Koch), 복숭아혹진딧물(Myzus persicae)에 방제 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스와 식물추출물 혼합제형 해충방제제.
삭제
제1항에 있어서, 상기 해충방제제는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스 배양액 0.0001 내지 0.01중량%, 식물추출물 0.00001 내지 0.001중량% 혼합되는 것을 특징으로 하는 바실러스 아밀로리쿼파시엔스와 식물추출물 혼합제형 해충방제제.
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