KR100809797B1

KR100809797B1 - 짚신나물 뿌리추출물과 이로부터 분리한 화합물을 함유하는식물의 탄저병 방제 조성물

Info

Publication number: KR100809797B1
Application number: KR1020070008702A
Authority: KR
Inventors: 박준홍; 배수곤; 박현로; 박석희; 김규성; 최장수
Original assignee: 경상북도 농업기술원
Priority date: 2007-01-29
Filing date: 2007-01-29
Publication date: 2008-03-04

Abstract

본 발명은 짚신나물(Agrimonia pilosa L.) 뿌리를 원료로 하는 식물의 탄저병 방제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 짚신나물 뿌리를 메탄올로 추출하여 감압농축하여 얻은 메탄올 추출물과 그리고 이 메탄올 추출물을 유기용매로 분배 추출하여 얻은 헥산 분획물과 이 헥산분획물로부터 분리한 물질인 아그리모폴(agrimophol)은 탄저병에 대한 항진균활성이 우수하여 식물의 탄저병을 효과적으로 예방 및 방제할 수 있다.

짚신나물, 탄저병, 아그리모폴, 예방, 방제

Description

짚신나물 뿌리추출물과 이로부터 분리한 화합물을 함유하는 식물의 탄저병 방제 조성물{Composition for control Anthracnose with extracts and isolated compound from roots of Agrimonia pilosa L.}

도 1은 짚신나물 뿌리의 메탄올 추출물 제조방법을 도식화한 것이다.

도 2는 짚신나물 뿌리의 메탄올 추출물로부터 분배추출한 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물 분획물을 제조하는 방법을 도식화한 것이다.

도 3은 짚신나물 뿌리의 헥산 분획물로부터 칼럼크로마토그래피 방법에 의한 아그리모폴(agrimophol)을 순수 분리하는 방법을 도식화한 것이다.

도 4는 짚신나물 뿌리에서 분리한 화합물 아그리모폴(agrimophol)의 핵자기공명(NMR)분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 5는 짚신나물 뿌리에서 분리한 화합물 아그리모폴(agrimophol)의 농도별 탄저병 항진균 활성을 나타낸 것이다.

도 6은 고추 식물체에 짚신나물 뿌리 헥산분획물 처리에 따른 고추탄저병 방제 효과를 나타낸 것이다.

도 7은 사과 과육에 짚신나물 뿌리 헥산분획물 처리에 따른 사과탄저병 방제 효과를 나타낸 것이다.

화학합성농약은 대부분 독성을 가진 물질로서 유익성으로 나타나는 순기능과 위해성으로 나타나는 역기능을 동시에 가지고 있다. 화학합성농약의 순기능은 병해충 방제에 의한 생산물 증가, 제초작업 생략, 농산물의 품질향상 및 저장 중 품질유지 등을 들 수 있다. 이와 반대적으로 역기능은 식품의 오염원이 되는 농산물 중 잔류농약, 환경매체인 토양, 하천수, 지하수 등 오염유발, 익충, 천적, 조류 등의 개체수 감소 등을 들 수 있으며, 특히 최근에는 화학합성농약의 연속적인 다용으로 인해 병해충의 저항성이 큰 문제가 되고 있으며, 농산물에는 독성이 강한 농약이 허용치 이상으로 검출되어 식품으로서의 가치가 상실되는 경우도 많이 발생되고 있다. 따라서, 인축에 대하여 독성이 없으며 환경오염이 적은 식물 병해충 방제제의 개발은 연구자들의 최대 과제이다. 이를 해결할 수 있는 방법으로 미생물 제제와 천연물을 활용한 제제에 대한 연구 개발이 활발히 진행되고 있으며, 이미 판매되는 제품들도 있다. 그러나, 현재까지 알려져 있는 이들 미생물 제제, 천연물 제제는 방제가가 너무 낮아 사용량이 극히 저조한 실정이다.

탄저병(炭疽病, Anthracnose)은 사과, 고추, 포도, 수박 등의 작물에 주로 나타나는 병으로써 고온다습한 기후에서 많이 발병하며, 주로 콜레토트리쿰(Collectotrichum)속, 글로이오스포리움(Gloeosporium)속 곰팡이가 원인이다. 이 병에 걸리면 식물의 잎, 줄기, 열매, 꽃에 반점들이 생겨나는데, 이 반점들은 점점 커져 조직을 위축시키고 식물을 시들어 죽게 한다.

고추탄저병의 경우 꽃이 피기 시작하는 6월 중하순경부터 발생하기 시작하는데, 탄저병의 원인 곰팡이는 다습한 환경에서 급속도로 번식하게 되므로 비가 온 다음에는 농약을 살포해 주어야 한다. 일반적으로 고추 재배농가에서는 탄저병 방제를 위하여 6월에서 8월 사이에 화학합성농약을 수차례 살포하고 있는 실정이다. 그럼에도 불구하고 탄저병의 원인 곰팡이는 점점 화학합성 살균제에 대한 내성이 강해져 부분적으로 농약이 살포되지 않은 곳으로부터 밭 전체로 쉽게 번지게 된다.

사과탄저병은 열매에 주로 발생하지만, 때로는 잎이나 나뭇가지에도 발생한다. 열매의 표면에 담갈색의 원형병반이 생기는데, 이것이 확대되어 지름이 3mm가량이 되면 습성을 띠고 병환부는 움푹해진다. 성숙기 및 저장 중에 많이 발생하며, 비가 자주 오는 8-9월경 심하게 발생한다.

짚신나물은 장미과(Rosaceae)의 다년생 초본으로 전초를 건조하여 사용한다. 그 성분으로는 아그리모닌(agrimonin), 아그리모노라이드(agrimonolide), 탄닌(tannin), 스테롤(sterol), 유기산, 사포닌 등이 함유되어 있으며, 수렴지혈(收斂止血), 익기강심(益氣强心), 지사, 지혈(止血), 건위(健胃) 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있다.

그러나, 본 발명자들은 짚신나물의 이러한 약리작용 이외에도 짚신나물 뿌리의 메탄올 추출물이 고추탄저병, 사과탄저병에 대해 항진균 활성이 있음을 확인하였고, 이 메탄올 추출물을 물에 현탁하여 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 용매로 순차적으로 분배추출하여 얻은 헥산층, 에틸아세테이트층, 부탄올층, 물층의 분획물 중에서 헥산 분획물이 고추탄저병, 사과탄저병에 대해 항진균 활성이 있음을 확인 하였으며, 이 헥산 분획물을 칼럼크로마토그래피 방법에 의해 고추탄저병과 사과탄저병에 대한 항진균 활성을 나타내는 물질을 순수 분리시킨 후 화학구조를 동정하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 화학합성농약을 대체하고 천연물을 주성분으로 하는 식물 탄저병 방제 조성물을 제공하는데 있다. 즉, 짚신나물 뿌리를 메탄올로 추출하여 얻은 메탄올 추출물과 다음 단계로 메탄올 추출물을 용매극성별로 분배추출하여 얻은 분획물들의 고추탄저병, 사과탄저병에 대한 항진균 활성정도와 살균력을 실내검정 및 포장검정을 통하여조사하고 항진균활성이 우수한 분획물을 칼럼크로마토그래피(column chromatography) 방법으로 고추탄저병과 사과탄저병에 대한 항진균 활성을 나타내는 물질을 순수분리하고 그 화학구조를 동정함에 있다.

본 발명은 짚신나물(Agrimonia pilosa L.) 뿌리를 메탄올로 추출하여 얻은 추출물과 이 메탄올 추출물로부터 헥산, 에틸아세테이트, 부탄올 용매를 사용하여 순차적으로 분배추출하여 얻은 헥산층, 에틸아세테이트층, 부탄올층, 물층의 4종 분획물에 대해 고추탄저병균과 사과탄저병균에 대하여 항진균활성을 검정하고, 항진활성이 높은 분획물을 칼럼크로마토그래피 방법에 의해 순수 분리하여 화합물을 구조동정하고, 구조동정된 화합물에 대해 농도별 고추탄저병균과 사과탄저병균에 대한 항진균활성을 검정하였고 실제 고추와 사과재배포장에서 짚신나물 뿌리 헥산분획물의 방제효과를 보기 위하여 포장검정을 실시하였다.

실시예 1 : 병원균 포자 수확

실험에 사용된 균주는 고추탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides, KACC 균주번호 40003)과 사과탄저병균(Glomerella cingulata, KACC 균주번호 40299)으로써 농촌진흥청 농업생명공학연구원 한국 농업미생물 자원센터(KACC)에서 분양받아 실험 병원균으로 사용하였다. 분양받은 고추탄저병균과 사과탄저병균 병원균을 피디에이(PDA, potato dextrose agar)배지에 접종하여 인큐베이터(비젼과학, VS-1203P4N)에서 26℃ 암상태로 7일 동안 배양하여 포자를 형성시켰다. 형성된 포자를 살균증류수를 첨가하여 수확하고 광학현미경 하에서 혈구계로 1×10⁷포자수/㎖의 포자농도로 포자현탁액으로 만들어 4℃에서 냉장보관하면서 항진균 활성검정에 사용하였다.

실시예 2 : 짚신나물 뿌리의 메탄올 추출물과 용매분획물의 제조

7월 하순경에 채취한 짚신나물 뿌리를 물로 세척하고 풍건한 후 세절한 다음 40℃ 열풍건조기(Sanyo, MOV-212G)로 건조하였다. 열풍건조한 짚신나물 뿌리시료 60g을 분쇄기(Hanil, FM680T) 로 분쇄한 다음 메탄올(100％) 600㎖를 가하여 상온에서 24시간 추출한 후 여과지(whatman No. 3)로 여과하였다. 위의 추출 여과조작을 총 3회 반복 실시하여 얻은 여과액인 메탄올 추출액을 감압농축기로 40℃에서 감압농축하여 건조된 메탄올추출물을 11.9g을 얻었다.

이 메탄올 추출물 11g을 칭량하여 물 500㎖에 현탁시킨 후 3ℓ 분액깔대기(separatory funnel)에 넣고 헥산 500㎖를 첨가하여 24시간 경과 시킨 후 헥산층을 회수하여 80℃에서 농축하였고, 동일한 방법으로 총 3회 반복하여 건조된 헥산 분획물 1.2g을 얻었다. 헥산 분배추출후 남은 물 현탁액을 에틸아세테이트 용매 500㎖를 분액깔대기에 넣고 24시간 경과시킨 후 에틸아세테이트층을 회수하여 40℃에서 감압 농축하였고, 위와 같은 방법으로 총 3회 반복하여 건조된 에틸아세테이트 분획물 3.6g을 얻었다. 에틸아세테이트 분배추출 후 남은 물 현탁액을 다시 부탄올 용매 500㎖를 분액깔대기에 넣어 24시간 경과시킨 후 부탄올층을 회수하여 60℃에서 감압농축하였고 위와 같은 방법으로 총 3회 반복하여 건조된 부탄올 분획물 3.6g을 얻었으며, 부탄올 분배추출후 남은 물 현탁액을 50℃에서 감압농축하여 건조된 물분획물 4.6g으로 총 4종의 용매분획물을 얻었다.

실시예 3 : 짚신나물 뿌리 메탄올 추출물과 용매분획물의 고추탄저병, 사과탄저병 항진균 활성 실내검정

실시예 2에서 얻은 메탄올 추출물과 4종의 용매분획물을 각각 0.1g 정확하게 무게를 칭량한 후 메탄올용액 10㎖에 녹여 10,000ppm이 되도록 한 후 원형종이(advantec, 8mm)에 50㎕를 분주하여 흡수시킨 후 건조시겼다.

피디에이(PDA, Potato dextrose agar) 배지 조제는 PDA(Difco co.) 39g을 증류수 1ℓ에 녹여 121℃에서 15분간 멸균(autoclave)하고 50℃로 식힌 후 실시예 1에서 미리 수확한 고추탄저병균과 사과탄저병균 포자를 넣어 배지의 포자 농도를 1×10⁴ 포자수/㎖로 희석하여 맞추고 배지가 굳기 전에 일회용 페트리디쉬(녹십자, 9cm)에 10㎖씩 일정하게 분주하여 실험배지로 사용하였다. 짚신나물 뿌리 메탄올 추출물과 4종의 용매분획물을 처리한 원형종이(advantec, 8mm)를 위 실험배지위에 올려 놓고 26℃에서 3일간 인큐베이터에서 배양한 후 균사생장억제정도를 나타내는 크리어존(clear zone) 크기를 측정하였으며 그 측정한 결과는 표 1과 같다.

탄저병에 대한 짚신나물 뿌리의 메탄올 추출물과 이 메탄올 추출물로부터 분배추출한 4종의 용매분획물의 항진균 활성을 검정한 결과는 표 1과 같이 고추탄저병균과 사과탄저병균에 대하여 메탄올추출물과 헥산분획물에서 유사하게 항진균활성을 강하게 나타내어 탄저병을 방제할 수 있는 항진균활성물질이 존재하는 것으로 판단되었다.

[표 1] 짚신나물 뿌리의 메탄올 추출물과 용매분획물의 탄저병에 대한 항진균 활성

실시예 4 : 고추탄저병 항진균 활성을 나타내는 화합물 분리, 구조동정 및 항진균활성 검정

짚신나물 뿌리의 헥산분획물에서 고추탄저병균과 사과탄저병균에 대해 항진균활성을 나타내는 화합물 분리는 다음과 같다. 실시예 2의 헥산 분획물(1.2g)을 실리카겔(Merck, 7734)과 혼합하여 유발에서 미세한 분말로 조제한 후 실리카겔이 충진된 유리칼럼(직경5cm)에 상부에 올려놓고 칼럼크로마토그래피(column chromatography)의 방법으로 분리를 실시하였다. 용매는 헥산과 에틸아세테이트의 비율을 처음에는 10대 1로 흘리다가 이후 헥산과 에틸아세테이트의 비율을 5대 1, 2대 1, 1대 1의 비율로 순차적으로 흘리면서 100㎖씩을 각각의 시험관에 받아내었다. 이 받아낸 액을 실시예 3의 항진균 활성 실내검정 방법으로 검정하여 활성을 나타내는 분리물을 모아 농축하여 순수화합물 30mg을 얻었다(도 3). 이 화합물의 핵자기공명분석(NMR)과 고속원자충격질량(FAB-MS) 분석기기로 분석한 결과 및 구조식은 다음과 같다.

물질의 성상 : 노랑색 결정형

물질의 분자식 : C₂₆H₃₄O₈

¹H-NMR(CDCl₃, 500MHz) δ : 3.86(1H, m, H-8), 0.88(3H, t, J=7.5Hz, H-10), 1.17(3H, d, J=6.5Hz, H-11), 1.91(3H, s, H-12), 1.05(3H, s, H-13), 2.98, 3.10(2H, AB, 14-CH₂-), 3.10(2H, m, H-8'), 1.75(2H, m, H-9'), 1.01(3H, t, J=7.5Hz, H-10'), 3.78(3H, s, H-11'), 2.20(3H, s, H-12')

¹³C-NMR(CDCl₃, 125MHz) δ : 209.67(C-7), 207.06(C-7'), 200.92(C-2), 190.35(C-4), 174.25(C-6), 163.03(C-2'), 160.70(C-6'), 160.40(C-4'), 112.34(C-3'), 107.54(C-1'), 106.18(C-5'), 104.49(C-3), 104.22(C-5), 61.55(C-11'), 52.61(C-1), 44.23(C-8'), 43.02(C-8), 27.82(C-14), 26.66(C-13), 26.53(C-9), 18.08(C-9'), 16.83(C-11), 13.92(C-10'), 11.84(C-10), 9.12(C-12'), 7.01(C-12)

FAB-MS m/z : 475.4 [M+H]⁺

[구조식]

이상의 NMR과 FAB-MS의 분석 결과로 이 화합물은 분자량이 474인 벤제노이드(benzonoid) 계통의 아그리모폴(agrimophol)로 동정되었다.

이 순수 분리하여 구조동정된 화합물이 아그리모폴(agrimophol)의 처리농도별 고추탄저병균(Colletotrichum gloeosporioides)과 사과탄저병균(Glomerella cingulata)에 대한 항진균 활성검정 결과는 표 2와 같이 고추탄저병균과 사과탄저병균 모두 30ppm의 저농도에서도 우수한 항진균활성을 나타내었다.

[표 2] 아그리모폴의 처리농도별 고추탄저병균과 사과탄저병균에 대한 항진균 활성

실시예 5 : 짚신나물 뿌리 헥산분획물의 고추탄저병, 사과탄저병 방제효과 포장실험

짚신나물 뿌리 헥산분획물의 포장에서 고추탄저병과 사과탄저병 에 대한 방제효과를 조사하기 위하여 다음과 같이 포장검정을 실시하였다.

먼저, 고추탄저병에 대한 포장 방제효과 실험은 다음과 같다. 짚신나물 뿌리 헥산 분획물 1g을 물 500㎖에 용해하고 이를 트윈 20(tween 20) 용액을 250㎕을 첨가하여 최종 1,000㎖가 되게 하여 헥산분획물의 농도를 1,000ppm으로 맞추었다. 준비한 헥산분획물을 고추 과육에 흘러내릴 정도로 충분히 스프레이한 후에 자연건조하였다. 대조구로는 헥산분획물 대신 트윈 20(tween 20) 250ppm만 첨가된 증류수를 스프레이 처리하였다. 고추 과육의 표면에 물기가 없음을 확인하고 여기에 고추탄저병균을 스프레이 접종처리 하였다. 이때 병원균 접종 포자농도는 ㎖당 1.2×10⁷개이었다. 이렇게 처리한 고추는 과습상태를 유지하기 위하여 24시간 동안 비닐로 덮고 5일후에 이병과를 조사하여, 아래 수학식에 따라 이병과율을 계산하였다.

[수학식]

이병과율(％)=(이병과수/조사과수)×100

짚신나물 뿌리 헥산분획물의 고추탄저병에 대한 포장방제효과는 표 3과 같이 무처리의 이병과율이 74.0％인데 비해 헥산분획물 처리에서 36.5％로 우수한 방제활성을 나타내었다.

[표 3] 짚신나물 뿌리 헥산분획물 처리에 따른 고추탄저병 포장방제효과

짚신나물 뿌리 헥산분획물 처리에 따른 사과탄저병에 대한 포장 방제효과검정은 다음과 같이 실시하였다.

짚신나물 뿌리 헥산분획물 1g을 물 500㎖에 용해하고 이를 트윈 20(tween 20) 용액을 250㎕을 첨가하여 최종 1,000㎖가 되게 하여 헥산분획물의 농도를 1,000ppm으로 맞추었다. 준비한 헥산분획물을 사과 포장의 사과 과육에 흘러내릴 정도로 충분히 스프레이한 후에 자연건조하였다. 대조구로는 헥산분획물 대신 트윈 20(tween 20) 250ppm만 첨가된 증류수를 스프레이 처리하였다. 사과 과육의 표면에 물기가 없음을 확인하고 여기에 사과탄저병균을 접종처리 하였다. 이때 병원균 접종 포자농도는 ㎖당 1.2×10⁷개이었으며, 병원균 접종은 위의 포자 현탁액을 사과과육에 바늘로 상처를 낸 후 스프레이 접종처리하였으며 과습상태로 만들기 위해 지 퍼팩으로 봉지를 씌워 실험을 수행하였고, 5일후 사과탄저병 병반면적크기를 조사하였다.

짚신나물 뿌리 헥산분획물 처리에 따른 사과탄저병에 대한 포장방제효과는 표 4과 같이 헥산분획물처리의 병반면적크기가 4.5×6.0mm로 무처리의 8.5×8.8mm 비해 적어 짚신나물 뿌리 헥산분획물이 사과탄저병균의 생육을 억제한 것으로 나타났다.

[표 4] 짚신나물 뿌리의 헥산분획물 처리에 따른 사과탄저병 포장방제효과

이상의 결과로 볼 때 짚신나물 뿌리를 메탄올로 추출하고 감압농축한 후에 이를 헥산으로 분배추출하여 얻어진 헥산 분획물과 이 분획물에서 순수 분리한 아그리모폴(agrimophol)은 고추탄저병과 사과탄저병에 처리하면 효과적으로 예방 및 방제할 수 있을 것으로 판단된다.

이상에서 상술한 바와 같이 본 발명은 짚신나물 뿌리를 메탄올로 추출하고 감압농축하여 얻은 메탄올 추출물, 이 메탄올 추출물로부터 얻은 헥산 분획물, 그리고 헥산 분획물로부터 순수 분리한 단일화합물인 아그리모폴(agrimophol)이 고추탄저병과 사과탄저병에 대한 항진균 활성과 살균력이 우수하여 상기 메탄올 추출 물, 헥산분획물과 단일화합물인 아그리모폴은 탄저병의 예방 및 방제제로써 활용 가치가 높으며 천연물농약 산업상 매우 유용한 발명이다.

Claims

짚신나물 뿌리를 메탄올로 추출하고 감압농축하여 얻은 메탄올 추출물을 이용한 식물의 탄저병 방제 조성물
청구항 1항에 있어서, 메탄올추출물을 물에 현탁하여 헥산으로 분배추출한 다음 감압농축하여 얻은 헥산 분획물을 특징으로 하는 식물의 탄저병 방제 조성물
청구항 2항에 있어서, 헥산 분획물을 칼럼크로마토그래피의 방법으로 분리하여 얻은 벤제노이드(benzenoid) 계통의 아그리모폴(agrimophol)화합물을 포함하는 식물의 탄저병 방제 조성물