KR101599911B1

KR101599911B1 - 헤어리베치로부터 분리한 포도 줄기혹병균에 대해 항균활성을 가지는 화합물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101599911B1
Application number: KR1020140037773A
Authority: KR
Inventors: 윤해근; 따리쿨이슬람; 안순영; 김선애
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2014-03-31
Filing date: 2014-03-31
Publication date: 2016-03-04
Also published as: KR20150113595A

Abstract

본 발명은 비스(2-에틸헥실) 프탈레이트(bis(2-ethylhexyl) phthalate), 디에틸 프탈레이트(Diethyl phthalate) 및 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid) 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 항균용 조성물, 및 상기 식물병 방제용 조성물을 식물 또는 토양에 처리하여 식물병을 방제하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 헤어리베치로부터 분리한 포도 줄기혹병균에 항균 활성을 가진 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물은 생물농약 산업에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

Description

헤어리베치로부터 분리한 포도 줄기혹병균에 대해 항균활성을 가지는 화합물 및 이의 용도{Compound with antimicrobial activity against grapevine crown gall pathogen isolated from hairy vetch and uses thereof}

본 발명은 헤어리베치로부터 분리한 포도 줄기혹병균에 대해 항균활성을 가지는 화합물 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 비스(2-에틸헥실) 프탈레이트(bis(2-ethylhexyl) phthalate), 디에틸 프탈레이트(Diethyl phthalate) 및 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid) 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 항균용 조성물, 및 상기 식물병 방제용 조성물을 식물 또는 토양에 처리하여 식물병을 방제하는 방법에 관한 것이다.

세계에서 가장 널리 재배되는 과일 작물 중 하나인 포도는 세균, 곰팡이, 바이러스 질병과 같은 식물병원균에 의해 수확량이 크게 감소된다. 한국의 초여름에 주로 발생하는 포도 줄기혹병은 리조비움 비티스(Rhizobium vitis)에 의해 발병하는 것으로 식물 생장 감소 및 과실 생산성을 감소시켜 경제적 손실을 야기한다. 포도 줄기혹병의 원인균인 리조비움 비티스에 대한 연구는 있었으나, 지금까지 포도 생산기 동안 질병의 관리를 위한 효과적인 방제 방법은 보고된 바 없다. 상업적으로 복숭아 혹병을 제어하기 위한 생물 방제제로 리조비움 리조젠스(R. rhizogenes) 균주 K84가 사용되었지만, 리조비움 비티스의 혹형성에 의한 포도 줄기혹병을 방지하는 효과는 밝혀지지 않았다.

헤어리베치(Vicia villosa)는 무경운 토양에 질소 상태를 개선하기 위해 이용되는 녹비작물의 하나로, 일부 배추 속 식물의 특정 병원균의 성장을 억제하며, 녹비작물 추출물에서 포도 줄기혹병균에 대한 생물학적 활성이 보고되었다.

한편, 비스(2-에틸헥실) 프탈레이트 화합물(Bis(2-ethylhexyl) phthalate;DEHP)은 합성 가소제로 잘 알려진 것으로, 알코니아 코르디폴리아(Alchornea cordifolia), 알로에 베라(Aloe vera), 유포르비아 시파리시아스(Euphorbia cyparissias) 및 유포르비아 세규어리아나(Euphorbia seguieriana)에서 보고되었으며(Mavar, M.H. 2008. Arg. J. Ethnopharmacol 115:25-29), 스트렙토마이세스 방글라데센시스(Streptomyces bangladeshensis), 페니실리움 올소니(Penicillium olsonii), 칼로트로피스 자이겐티아(Calotropis giganteas) 및 사르가숨 위티(Sargassum wightii)에서 분리되고 잠재적인 항균 및 항진균 활성을 보였다(Habib, M.R. 2009. Mycobiology 37:31-36). 디에틸 프탈레이트(diethyl phthalate;DEP)은 석유 화학물로, 헬리코박터 파이로리 및 남극의 퇴적물에서 분리한 스트렙토마이세스 속에서 얻을 수 있으며(Keire, D.A., 2001. J. Biol. Chem 276:48847-48853), 캄필로박터 제주니(Campylobactor jejuni), 대장균(Escherichia coli), 리스테리아 모노시토게니스(Listeria monocytogenes) 및 살모넬라 엔터리카(Salmonella enterica)에 대한 항균제로 보고되었다(Jano, S. 2003. J. Food Protect. 66:1811-1821).

p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid)은 목형(Vitex negundo L.) 및 이소돈 에리오칼리스(Isodon eriocalyx var . laxiflora)에서 분리되었다(Chandramu, C., 2003. Phytother. Res. 17:129-134). 본 발명에서는 헤어리베치의 에틸 아세테이트 추출물로부터 세 가지 화합물을 분리하여 포도 줄기혹병원균에 대한 항균활성을 분석하였다.

한국등록특허 제1000083호에는 "비스에틸헥실프탈레이트의 항암제로서의 용도"가 개시되어 있으며, 한국공개특허 제2009-0063302호에는 "해마 유래 비스(2-에틸헵틸) 프탈레이트 화합물 및 그의 제약학적 용도"가 개시되어 있으며, 미국등록특허 제7141395호에는 "Biological control of crown gall disease"가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 헤어리베치로부터 분리한 포도 줄기혹병균에 항균활성을 가지는 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물에 관해서는 밝혀진 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 헤어리베치 줄기를 에틸 아세테이트로 추출한 추출물의 항균활성을 확인한 후, 항균활성이 높은 분획물을 분리 정제하여 비스(2-에틸헥실) 프탈레이트(bis(2-ethylhexyl) phthalate), 디에틸 프탈레이트(Diethyl phthalate) 및 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid) 화합물인 세 가지 화합물을 동정하고, 포도 줄기혹병 원인균인 리조비움 비티스에 대한 세 가지 화합물의 항균활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 비스(2-에틸헥실) 프탈레이트(bis(2-ethylhexyl) phthalate), 디에틸 프탈레이트(Diethyl phthalate) 및 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid) 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 항균용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방제용 조성물을 식물 또는 토양에 처리하여 식물병을 방제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 헤어리베치로부터 분리된 세 가지 화합물이 포도 줄기혹병 원인균인 리조비움 비티스에 항균활성을 나타냄을 확인함으로써, 생물 방제제로서의 가능성을 규명하였다. 따라서, 본 발명의 헤어리베치로부터 분리한 포도 줄기혹병균에 항균활성을 가지는 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물은 생물농약 산업에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 헤어리베치 줄기의 에틸 아세테이트 추출물로부터 생리활성 화합물 분리를 위한 흐름도를 나타낸다. 헤어리베치 줄기의 에틸 아세테이트 추출물을 실리카겔 상에서 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 세 가지 화합물을 분리하는 과정을 나타낸다.
도 2는 헤어리베치 줄기에서 분리한 세 가지 화합물의 구조를 나타낸다. 화합물 1은 비스(2-에틸헥실)프탈레이트, 화합물 2는 디에틸 프탈레이트 및 화합물 3은 p-히드록시벤조산을 나타낸다.
도 3은 헤어리베치 줄기로부터 분리된 세 가지 화합물(MIC의 적정농도)에 대한 박테리아의 생존능력을 나타낸다. CT는 무처리, C1은 화합물 1, C2는 화합물 2, C3는 화합물 3를 나타내며, 실험은 3번 반복하였으며, 실험에 대한 표준오차는 그래프에 막대로 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 헤어리베치 추출물로부터 유래하며, 항균활성을 나타내는 상기 화학식 1의 비스(2-에틸헥실) 프탈레이트(bis(2-ethylhexyl) phthalate), 하기 화학식 2의 디에틸 프탈레이트(Diethyl phthalate) 및 하기 화학식 3의 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid) 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.

본 발명에 사용되는 식물 재료로는 헤어리베치(Vicia villosa R.)일 수 있으며, 바람직하게는 헤어리베치 줄기일 수 있으며, 가장 바람직하게는 45일된 헤어리베치의 줄기일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 헤어리베치 추출물은 다양한 식물 조직을 유기용매로 추출함으로써 제조할 수 있다. 본 발명에서 추출용 유기용매로는 n-헥산, 에틸 아세테이트, 아세톤, 메탄올과 같은 용매를 단독으로 사용할 수 있다. 바람직하게는 헤어리베치 분말 1 kg에 n-헥산, 에틸 아세테이트, 아세톤, 메탄올을 각각 혼합하여 25℃에서 72시간 동안 140rpm로 침출시켜 추출물을 얻는다. 본 발명에서는 또한 당분야에서 통상적으로 사용되는 분획 공정을 수행할 수도 있다.

상기 화학식 1 내지 3으로 표시되는 화합물은 헤어리베치 추출물로부터 분리·정제하거나 화학적으로 합성할 수 있다. 상기 화합물의 화학적 합성 방법은 당업계에 공지된 일반적인 방법을 이용할 수 있다.

구체적으로, 항균활성을 갖는 상기 3종의 화합물은 헤어리베치 식물 조직의 유기용매 추출물을 컬럼 크로마토그래피로 분획하여 분리·정제하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 이때, 사용가능한 컬럼은 실리카겔 컬럼, 역상실리카겔 컬럼 또는 세파덱스 컬럼 등이 있고, 용출액으로는 헥산, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 저급알콜 등과 같은 유기용매 및 이들의 혼합액을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 n-헥산, 에틸 아세테이트, 아세톤, 메탄올일 수 있으나, 가장 바람직하게는 에틸 아세테이트이다.

본 발명의 식물병 방제용 조성물은 포도 줄기혹병의 원인균인 리조비움 비티스(Rhizobium vitis)에 대해 항균 활성을 나타내는 것으로 포도 줄기혹병을 방제할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

따라서, 비스(2-에틸헥실) 프탈레이트(bis(2-ethylhexyl) phthalate), 디에틸 프탈레이트(Diethyl phthalate) 및 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid) 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물은 천연물 살균제로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 방제용 조성물은 통상적으로 이용되는 살균제에 함유되는 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 활성성분 이외에 부형제로 약제학적으로 허용 가능한 고체 담체, 액체 담체, 액체 희석제, 액화된 기체 희석제, 고체 희석제, 또는 기타 적당한 보조제, 예를 들면 유화제, 분산제 또는 기포제 등의 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 활성성분과 상기 부형제를 혼합한 방제용 조성물을 농약분야에 공지된 다양한 제형으로 제제화시켜 사용할 수 있으며, 제제화를 위해서는 농약분야에서 통상적으로 사용되는 제제화 방법을 어느 것이나 사용할 수 있다.

본 발명의 방제용 조성물은 바람직하게는 수화제, 입제, 분제, 유제, 스프레이상, 연막제, 캅셀형 및 젤상의 제형으로 제제화될 수 있고, 제제의 부력을 위해 도넛형과 같은 제형을 통한 접촉제로서 제공되는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 식물병 방제용 조성물을 식물 또는 토양에 처리하여 식물병을 방제하는 방법을 제공한다.

상기와 같이 제형화된 본 발명의 방제용 조성물을 방제가 필요한 식물체 또는 지역에 처리함으로써 포도 줄기혹병을 방제할 수 있다. 바람직한 방법은 상기 방제용 조성물을 식물 병원균과 직접 접촉할 수 있도록 적용하여 방제하는 것으로, 토양에 혼화 처리하거나 식물에 직접 분무하는 방법이 가장 바람직하다.

또한, 본 발명은 비스(2-에틸헥실) 프탈레이트(bis(2-ethylhexyl) phthalate), 디에틸 프탈레이트(Diethyl phthalate) 및 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid) 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 항균용 조성물을 제공한다. 상기 항균용 조성물은 바람직하게는 리조비움 비티스(Rhizobium vitis)에 대한 항균용 조성물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것을 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물 재료

녹비작물로 헤어리베치는 영남대학교(경산소재)의 온실에서 재배하였다. 헤어리베치는 파종 45일 후에 45-50 cm 길이의 줄기를 수집하여 물로 세척한 후 25℃에서 건조하여 파쇄하였다. 헤어리베치의 종자는 지역 종자공급업체(화훼무역, 안양, 한국)에서 구입하였다.

2. 미생물 및 배양

리조비움 비티스 천안 493(Rhizobium. vitis Cheonan 493)(그람-음성균주) 및 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis)(그람-양성균주)는 한국농업미생물자원센터(KACC, 수원소재)에서 분양받았다. 일반적으로 항균 활성 스크리닝에 사용되는 바실러스 서브틸리스 균주는 항박테리아 활성의 변화를 보정하기 위한 대조군으로 사용되었다. 박테리아 균주는 20%(v/v) 글리세롤을 함유하는 LB 배지(10g 트립톤/L, 5g 효모 추출물/L 및 10g의 NaCl/L)에 넣어 -70℃에서 보관하였다. LB 배지를 포함하는 125㎖의 멸균 플라스크에 박테리아를 넣은 후 28℃, 140rpm으로 진탕배양하여 얻어진 초기 대수생장기의 세포로부터 세포 현탁액을 준비하였다. 박테리아 세포는 농도를 1×10⁸ CFU/㎖(OD600 = 1.0)로 조정한 후, 3,200rpm으로 15분간 원심분리하여 수확한 후, 멸균수로 세척하였다.

3. 기기 분석

분리된 화합물의 자외선-가시광선 스펙트럼은 마이크로 볼륨 UV -VIS 분광 광도계(모델명 ASP - 3700, Gentaur, 브뤼셀, 벨기에)에 기록되었다. 분리된 화합물은 각각 1㎖의 에틸 아세테이트에 0.1mg이 용해된 것을 200-750 nm의 스펙트럼으로 기록하기 위해 사용되었다. ¹H-NMR, ¹³C-NMR 및 2D NMR 스펙트럼은 600 MHz에서 작동하는 FT-NMR(VNS 모델 600, 베리안사, 호주)을 이용하여 CDCl₃에서 측정하였다. ¹H를 위해 0에서 12 ppm 및 ¹³C를 위해 0-200 ppm의 영역이 사용되었다. 신호는 내부 표준 테트라 메틸실란에 기초하여 확인되었다. CDCl₃0.75 ㎖에 용해된 화합물이 각각 9.0, 7.5, 6.5 mg으로 분리된 것은 스펙트럼 기록을 위해 사용되었다.

4. 에틸 아세테이트 추출물에서 생리 활성 화합물의 분리

① 추출물의 준비 : 연속 추출물은 같은 분말을 사용하여 극성이 증가되는 용매를 사용하여 수행하였다. 건조된 헤어리베치 줄기 분말 약 1Kg을 각각의 용매(n-헥산, 에틸 아세테이트, 아세톤, 메탄올)와 혼합하고, 25℃에서 72시간 동안 140rpm으로 진탕한 후 거즈 4겹으로 여과한 후 와트만 1번 여과지로 여과하였다. 여과액은 용매를 제거하기 위해 연속적으로 진공회전증발기(도쿄 Rikakikai(주), 도쿄, 일본)를 사용하여 동결 건조하고, 사용할 때까지 4℃에 저장하였다. 모든 추출물은 디스크 확산법(Mahmoodzadeh H. 2004. Vitis 43:75-79)으로 항균활성을 스크린하였다. 그 중 에틸 아세테이트 추출물이 높은 항균 활성을 나타내었기 때문에 생리 활성 화합물 분리 및 정제를 위해 선택되었다. 추출 및 정제를 위한 전 과정은 도 1에 나타내었다.

② 에틸 아세테이트 추출물 분획 : 활성화된 실리카겔(70-230 메쉬)은 용매로서 n-헥산을 사용하여 유리 컬럼 (560×38mm)에 충전되었다. 15.0g의 미정제 에틸 아세테이트 추출물은 실리카켈 상에서 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 용출 과정은 1mL/min 유속(flow rate)으로 500㎖의 헥산, 3,000㎖의 헥산:에틸 아세테이트(75:25 0:100, v/v), 2500 ㎖의 에틸 아세테이트:아세톤(75:25 0:100, v/v), 2000 ㎖의 아세톤:메탄올(75:25 0:100, v/v)로 실시하였다. 최종적으로, 27 분획물이 측정을 위해 각 샘플당 200㎖를 진공회전증발기를 사용하여 농축하고 수집하였다.

③ 박층 크로마토그래피(Thin layer chromatography) : 플레이트는 헥산:에틸 아세테이트(90:10, v/v), 헥산:에틸 아세테이트(60:40, v/v), 헥산:에틸 아세테이트(40:60, v/v), 에틸 아세테이트:아세톤(90:10, v/v) 및 아세톤:메탄올(80:20, v/v) 용매 시스템을 사용하여 농축된 분획의 분취 시료를 각각 박층 크로마토그래피 실리카겔 60 F254(20×20cm) 상에 로딩하였다. 스팟(spots)은 이후 254 및 365 nm의 UV 광(모델 VL- 4.LC, Vilber Lourmat, 세덱스 프랑스)에서 검출되었다. 박층 크로마토그래피 플레이트에서 동일한 R_f 값의 분획물은 항박테리아 활성 검정 후에 번호가 부여되었다(Fr.1-Fr.7).

④ 생체 활성 분획의 정제 : 높은 항균활성을 보이는 분획 3, 4, 5를 컬럼 크로마토그래피의 제1단계에서 획득하였다(도 1). Fr.3의 2.0g, Fr.4의 1.5g 및 Fr.5의 1.2g은 실리카겔(70-230 메쉬) 컬럼(450×20mm)을 사용하여 더욱 정제하였다. 컬럼은 헥산-아세테이트 용매 시스템으로 용출되었다. Fr.3의 12분획, Fr.4의 15분획, Fr.5의 10분획 부분을 100㎖로 각각 측정하였다. 분획물 분취량은 TLC 플레이트 상에 로딩된 후에 수집하여 농축시켰다. R_f값이 유사한 것들은(Fr.3.1.-Fr.3.3, Fr.4.1.-Fr.4.3 및 Fr.5.1.-Fr.5.3) 개별적으로 수집하고, 추가로 항균작용에 대한 검사를 수행하였다. 두 번째 단계의 컬럼에서 높은 항균 활성을 나타내는 부분을(Fr3.2, Fr4.2, Fr 5.2) 추가로 정제하였다(도 1). 200㎎의 Fr.3.2, 90㎎의 Fr.4.2 및 100mg의 Fr.5.2을 추가로 실리카겔(70-230 메쉬) 컬럼(600×15mm)을 사용하여 정제하였다. 컬럼은 헥산-에틸 아세테이트 300㎖(0:100에서 90:10, v/v), 헥산-에틸 아세테이트 1200㎖(95:5에서 0:100, v/v) 및 에틸 아세테이트-아세톤 600㎖(95:5에서 0:100, v/v)으로 유속 5 ㎖/min으로 용출되었다. 마지막으로, 50 ㎖의 측정 45분획(Fr.3.2, Fr.4.2 및 Fr.5.2)을 각각 수집하여 농축하였다. R_f값이 유사한 부분은 별도로(Fr.3.2.1-Fr.3.2.3, Fr.4.2.1-Fr.4.2.3 및 Fr.5.2.1-Fr.5.2.3) 수집하였다. 이 중에서, 세번째 단계에서 얻어진 Fr.3.2.2, Fr.4.2.1 및 Fr.5.2.1는 TLC 프로파일에서 단일 스팟을 보였다(도 1). 선택된 화합물들의 구조를 규명하기 위해 다양한 분광기법을 실시하였다.

5. 고성능액체크로마토그래피 ( HPLC )

화합물의 순도는 컬럼(5, 4.6×150㎜, 그레이스, 웨스트 잭스, 온타리오, 캐나다) 데날리 C-18(120)을 구비한 펌프로 이루어지는 역상 HPLC 시스템을 사용하는 HPLC 및 UV 검출기(모델 YL9100, 영린, 서울, 한국)에 의해 확인되었다. 메탄올:물(80:20, v/v)은 11㎖/min에 이동상으로 적용되었다.

6. 항균 활성의 결정

정제된 화합물은 개별적으로 항균활성을 종이 디스크 확산법으로 시험하였다. 표준화된 박테리아 현탁액 100㎕를 45℃의 PDA(potato dextrose agar) 한천배지 20㎖와 혼합하여 균일하게 펼쳐 1시간 동안 건조시켰다. 시료는 멸균 필터 디스크(와트만 제1호, 직경 6mm)에 모세관 마이크로파이펫을 사용하여 디스크당 50, 75, 100㎍가 되도록 흡수시켰다. 디스크는 10분간 건조한 후 박테리아 세포를 포함하는 PDA 플레이트에 놓아두었다. 박테리아 시험을 위한 양성 대조군으로 카나마이신 50㎍/디스크가 사용되었다. 음성대조군은 시료를 녹인 각각의 용매를 사용하여 준비하였다. 모든 플레이트는 28℃에서 24시간 동안 배양하여 억제영역의 직경을 캘리퍼스를 사용하여 측정하였다. 각 분석에 대한 모든 측정은 3반복 실시하였다.

7. 최소억제농도 ( MIC )의 결정 및 최소 살균 농도( MBC )

화합물의 MIC는 두-배 연속 희석법(Bajpai, V.K. 2009. Food Chem. Toxicol. 47:1876-1883)으로 결정하였다. 요약하면, 시험 화합물은 먼저 에틸 아세테이트에 용해시킨 다음 1000㎍/디스크 농도로 얻어진 박테리아 병원균을 LB 배지를 혼입하여 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.62 및 7.81 ㎍/㎖로 각각 연속적으로 희석하였다. LB 배지에서 배양된 세포의 활성배양은 UV-Vis 분광 광도계(모델 S-3130, 신코 (주)서울, 한국)를 이용하여 600 nm에서 생물 시험을 위해 대략 1×10⁸ CFU/㎖로 신선한 LB 용액을 사용하여 조정하여 희석하였다. 리조비움 비티스 및 바실러스 서브틸리스 각각 10㎕(1×10⁸ CFU/㎖)의 표준 현탁액을 테스트튜브로 옮겼다. 박테리아 현탁액만 포함한 대조구는 28℃에서 24시간 동안 140rpm으로 진탕 배양하였다. 육안에 의한 평가 후에 시험 미생물의 성장을 보이지 않은 화합물의 최저 농도는 MIC에서 조사하였고, ㎍/㎖로 나타내었다. 박테리아 병원균의 성장을 완전히 억제하는 농도를 확인하기 위해, 50㎕의 배양액을 한천 플레이트로 옮겨 28℃에서 24시간 동안 140rpm으로 진탕 배양하였다. 시료의 최저 농도에서 한천 배지의 표면에 박테리아 콜로니의 생장이 전혀 없는 것을 최소살균농도로 정의하였다. 모든 측정은 3반복 실시하였다.

8. 화합물이 박테리아 생존에 미치는 영향

세균 측정을 위한 활성배양은 LB액체 배지를 이용하였다(Bajpai, V.K. 2009. Foood Chem. Toxicol. 47:1876-1883). 각 균주는 1㎖의 활성 저장 용액을 4㎖의 LB 액체배지로 옮겼다. 모든 박테리아 배양은 28℃에서 2시간 동안 유지한 후 3,200rpm으로 15분간 원심분리하였다. 팰릿은 1㎖의 인산완충용액(phosphate-buffered saline)으로 재현탁하였다. 세균측정을 위해, 10㎖의 LB용액에 리조비움 비티스 및 바실러스 서브틸리스의 현탁액(1×10⁷CFU/㎖) 및 각 화합물을 MIC 농도로 접종하여 28℃로 유지하였다. 생존 세포수를 위한 시료는 0, 1, 2, 3, 4 및 5시간 간격으로 처리하였다. 생존 세포수는 배양 후 재현탁 배양액 1㎖에 완충 펩톤수 9㎖을 넣어 10배로 희석하고, 각 시료 0.1㎖를 LB 고제배지에 도말하였다. 28℃에서 24시간 배양한 후 콜로니를 계수하였다. 대조구는 위에서 설명한 바와 동일한 실험 조건 하에서 각각의 박테리아 균주만 접종하여 배양하였다. 균주의 군집 정도는 Log₁₀ cfu/㎖로 나타내었다. 각 분석에 대한 모든 측정은 3반복 실시하였다.

9. 통계 분석

던컨의 다중검정(DMRT)으로 유의성을 결정하였다(P<0.05). 모든 통계 처리는 Windows(SPSS, 시카고, IL, USA) SPSS 19.0을 이용하여 수행하였다.

실시예 1. 생리 활성 화합물의 정제 및 동정

헤어리베치 줄기를 에틸 아세테이트로 추출물한 후 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 통해 세 가지 순수한 화합물을 얻었고, 그들의 스펙트럼 데이터에 기초하여 화학적 구조를 규명하였다. 화합물의 ¹H NMR 스펙트럼상의 7.50(dd) 및 7.68(dd)ppm 사이에서 방향족은 오르토-치환된 링(ortho-substituted ring)에서 양성자에 대한 결합 상수가 있고, 4.18(m)ppm의 신호는 에스테르 알코올기에 메틸렌기의 제미에 할당된다. 분자의 대칭성을 확인하는 ¹³C NMR 스펙트럼에서 2개의 메틸기를 가진 2개의 4쌍 3메틸기와 5메틸렌 탄소 디-(2-에틸헥실)프탈레이트에 의해 예상되는 12탄소 공명을 나타내었다(표 1). 화합물 1의 구조는 1D 및 2D NMR 분석에 의해 측정하였다(도 2). ¹H NMR 신호의 화학적 이동과 통합 영역은 화합물 2의 것과 일치하였다(도 2). 용매 피크 이외의 세 가지 주요(방향족, 메틸렌, 메틸) 신호는 7.51, 4.33(4중선)을 중심으로, 1.35(3중선)ppm으로 하였다. 7.71 및 7.51 ppm으로의 방향족 신호의 대칭 세트오르토-치환된 방향족 고리와 일치하였다. 4.234 및 1.35에서 신호는 스핀 결합되었고, 방향족 바운드 에톡시기에 적합한 화학적 이동을 보였다(표 1). 화합물 3의 경우, ¹³C NMR 스펙트럼은 벤젠 고리 탄소(d 115.29-162.7) 및 카복실탄소(d 171.15)에 속하는 7개의 탄소 신호를 보여주었다. 또한, ¹H NMR 스펙트럼에서, 양성자 신호 중 1쌍은(7.98 와 6.86을 개발, 2H, D, J = 7.95 Hz에서 각각) 화학적으로 동일하고 파라-치환된 벤젠고리에서 발생한 것으로 밝혀졌다(표 1). 화합물 1, 2 및 3은 분광 데이터의 부가적인 분석으로 각각 비스(2-에틸 헥실)프탈레이트(DEHP), 디에틸 프탈레이트(DEP) 및 p-하이드록시 벤조산으로 확인되었다.

실시예 2. 항균 활성

헤어리베치 줄기 분말 1000g을 헥산, 에틸 아세테이트, 아세톤 및 메탄올을 사용하여 연속적으로 추출한 미정제 추출물을 각각 12.0g, 15.0g, 3.0g 및 10.0g을 얻었다(도 1). 네 가지 추출물 중, 에틸 아세테이트 추출물이 항균 실험에 대하여 가장 높은 항박테리아 활성을 보여주었다. 모든 화합물(50, 75 및 100 ㎍/디스크)은 7.3±0.1에서 11.2±0.3mm의 범위 내의 억제 영역으로 박테리아 병원균 실험에 대해 잠재적인 억제 효과를 보여주었다(표 2). 화합물 3은 화합물 1 및 2 보다 박테리아 균주 실험에 대해 높은 항균활성을 보여주었다(표 2). 반면에, 카나마이신은 11.3±1.2에서 17.3±1.2mm의 범위의 억제영역의 직경을 나타내었다.

실시예 3. 최소억제 및 최소살균농도

헤어리베치 줄기 유래의 미정제 추출물은 3.12㎍/㎖의 MIC 값을 가진 리조비움 비티스 및 바실러스 서브틸리스에 대해 항균 활성을 나타내었으며(Islam, MD. 2012. Journal of plant pathology 94(3) p591), 또한, 화합물 1, 2 및 3은 박테리아 병원균 실험에 대해 잠재적 억제 효과를 보여주었다. 화합물 1, 2 및 3의 MIC 및 MBC 값은 각각 62.5에서 125 및 125에서 250 ㎍·㎖^-1의 범위를 보여주었다(표 3). 바실러스 서브틸리스는 MIC 및 MBC에서 각각 62.5 및 125㎍·㎖^-1값을 나타냄으로써, 모든 화합물에 감수성이 높았다.

실시예 4. 세균의 생존력에 대한 화합물의 효과

리조비움 비티스 및 바실러스 서브틸리스와 같은 그람 음성 및 그람 양성 세균의 세균 측정에 대한 화합물 1, 2 및 3의 효과를 평가하였다. 시험 세균의 생장에 대한 화합물의 효과는 사용된 농도에서 감소된 생존 능력을 보여 주었다(도 3). 특히, 3시간 동안 화합물에 노출된 시험 균주의 70~80%가 죽음을 야기하였다. 바실러스 서브틸리스는 화합물에 4시간 동안 노출되면 생존능력을 완전히 상실한 반면, 리조비움 비티스는 화합물에 5시간 동안 노출되면 완전히 죽는다(도 3). 이들 결과들은 화합물에 4-5시간 동안 노출 후 살균 효과를 통해 생존 세포의 수가 급격하게 감소됨을 시사한다(도 3).

Claims

하기 화학식 1의 비스(2-에틸헥실) 프탈레이트(bis(2-ethylhexyl) phthalate), 하기 화학식 2의 디에틸 프탈레이트(Diethyl phthalate) 및 하기 화학식 3의 p-히드록시벤조산(p-hydroxybenzoic acid) 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 포도 줄기혹병 방제용 조성물.
[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]
제1항에 있어서, 상기 화학식 1 내지 3의 화합물은 헤어리베치 (Vicia villosa R.)로부터 추출된 것을 특징으로 하는 포도 줄기혹병 방제용 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 포도 줄기혹병의 원인균은 리조비움 비티스(Rhizobium vitis)인 것을 특징으로 하는 포도 줄기혹병 방제용 조성물.
제1항, 제2항, 제4항 중 어느 한 항에 따른 포도 줄기혹병 방제용 조성물을 포도 식물 또는 토양에 처리하여 포도 줄기혹병을 방제하는 방법.
삭제
삭제
제5항에 있어서, 상기 포도 줄기혹병의 원인균은 리조비움 비티스(Rhizobium vitis)인 것을 특징으로 하는 방법.
비스(2-에틸헥실) 프탈레이트(bis(2-ethylhexyl) phthalate), 디에틸 프탈레이트(Diethyl phthalate) 및 p-히드록시벤조산(p-hydr oxybenzoic acid) 화합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 화합물 또는 이의 염을 유효성분으로 함유하는 리조비움 비티스(Rhizobium vitis)에 대한 항균용 조성물.
삭제