KR100204251B1 - 내한성 트리코데르마 - Google Patents

내한성 트리코데르마 Download PDF

Info

Publication number
KR100204251B1
KR100204251B1 KR1019930700485A KR930700485A KR100204251B1 KR 100204251 B1 KR100204251 B1 KR 100204251B1 KR 1019930700485 A KR1019930700485 A KR 1019930700485A KR 930700485 A KR930700485 A KR 930700485A KR 100204251 B1 KR100204251 B1 KR 100204251B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
plant
trichoderma
atcc
applying
cold
Prior art date
Application number
KR1019930700485A
Other languages
English (en)
Inventor
제니퍼 후앙 맥비쓰
Original Assignee
제니퍼 후앙 맥비쓰
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제니퍼 후앙 맥비쓰 filed Critical 제니퍼 후앙 맥비쓰
Application granted granted Critical
Publication of KR100204251B1 publication Critical patent/KR100204251B1/ko

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/38—Trichoderma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/885—Trichoderma

Abstract

본 발명은 신규한 내한성 진균 기생체 트리코데르마속 균주 및 트리코데르마 분리물이 민감성을 나타내는 살충제에 대해 내성을 나타내는 그의 변이주를 포함한다. 이들 신규한 트리코데르마는 식물에 병원성을 나타내는 진균에 기생할 수 있으며 또한 식물 병원성 진균의 생육을 예방할 수 있는 단백질성의 항진균 물질을 생산할 수 있다.
내한성 트리코데르마 및 그의 바이오타입들은 진균성 식물 병을 예방하는데 사용될 수 있지만 이런 용도에만 국한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 농학적으로 유효한 양의 트리코데르마 분리물 또는 트리코데르마 분리물의 베노밀 내성 변이주를 식물이나 식물 조직에 사용함을 특징으로 하는 식물의 생육과 발달을 촉진하는 방법에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]
내한성(耐寒性) 트리코데르마(Trichoderma)
[발명의 상세한 설명]
[관련출원]
본 출원은 1990년 8월 20일자로 출원된 출원번호 제 07/579,270호의 일부 계속 출원으로서 후자의 출원에 기초를 두고 있으며, 출원번호 07/579,270호의 총 명세서는 본 출원서류에 참고로 구체적으로 삽입되어 있다.
[발명의 배경]
본 발명은 내한성(耐寒性) 트리코데르마(Trichoderma)속 균주의 새로운 분리물(이하 트리코데르마 분리물이라 한다)에 관한 것이다.
본 발명은 또한 베노밀(Benomy1) 및 리도밀(Ridomil)같은 시판되는 살충제에 대해 내성을 갖는 트리코데르마 분리물의 변이주에 관한 것이다.
본 발명은 또한 농학적으로 유효한 양의 내한성 트리코데르마 또는 살충제 내성의 내한성 트리코데르마 변이주를 진균성 병원균으로부터 보호하고자 하는 식물이나 식물 조직에 사용함을 특징으로 하는 식물 병의 전염과 확산을 억제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 농학적으로 유효한 양의 내한성 트리코데르마 또는 트리코데르마 분리물의 살충제 내성 변이주를 방제하고자 하는 식물 또는 식물 조직에 사용함을 특징으로 하는 식물 병의 방제 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 농학적으로 유효한 양의 트리코데르마 분리물 또는 트리코데르마 분리물의 베노밀 내성 변이주를 식물 또는 식물 조직에 사용함을 특징으로 하는 식물의 생육과 발달을 촉진하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 식물 병의 예방(control) 및 방제(treat)에 유용한 트리코데르마 분리물과 관련된 세종의 분자에 관한 것이다.
토양에서 분리되는 병원성 진균같은 식물 병원성 물질은 상업적으로 주요한 많은 작물에 식물의 마름병, 백색 부패증, 시듦병, 남부부패증, 백색 곰팡이병(snow mold), 뿌리 썩음병, 흑색 비듬병 및 회색 곰팡이병을 비롯한 심각한 손상을 입히는 농업학적 문제점으로 인식되어 있다.
예를들면, 이들 진균은 밀, 보리, 귀리, 잔디, 목화, 감자, 토마토, 콩류, 야채류, 화훼류, 포도, 딸기, 피스타키오, 아몬드, 사과, 체리, 배, 복숭아, 배, 페르시몬, 플럼, 프룬, 올리브, 호도, 나무 및 관목에 심각한 손상을 입혀서 농업, 원예업 및 임업에 심각한 문제점을 안겨주고 있다. 과거에는, 이들 병원성균을 예방하는 중요한 방법으로 살충성 화학물질이 사용되어 왔다. 그러나 경제 및 환경에 대한 중요한 인식에 의하여, 이들의 사용이 기피되고 다른 접근 방법이 시도되고 있다.
최근에 식물 병원성 물질의 생물학적 억제방법(생물억제)이 달성되었다. 예를 들면, 길항성 미생물을 이용하여 많은 병원성 진균을 억제할 수 있다는 것이 몇종의 트리코데르마속 균주에 의하여 입증되었다.
트리코데르마속의 1종에 속하는 서로 다른 종이나 또는 균주가 서로 다른 병원성 진균에 대하여 상이하게 길항작용을 한다는 것이 밝혀져 있지만, 트리코데르마 비리데(Trichoderma Viride)와 트리코데르마 하르지아눔(Trichoderma harzianum)은 생물억제제(biocontrol agent)로서 널리 효과적이라는 것이 입증되어 있다.
살충제 화학물질을 사용했을때와 비교하여 트리코데르마를 사용하여 병원성 진균을 생물억제했을 때 얻을 수 있는 장점중에는 식품의 안전성의 개선, 환경 오염의 감소 및 산업 현장에서 일하는 작업자에게 병이 일어날 수 있는 발생율이 감소된다는 점등이 포함된다.
티. 비리데와 티. 하르지아눔의 유용성은 이들이 저온에 대해 민감성을 나타내기 때문에 특정 환경에서만 한정적으로 효과를 나타낸다.
피티둠 에스피피(Pythium spp.) 같은 많은 식물 병원성균들이 차가운 토양속에서 가장 잘 파괴적이기 때문에, 상기 트리코데르마 균들이 토양속에서 생육 및 기능을 발휘하지 못함으로 해서 식물들은 가장 필요한 시기에 보호를 받지 못하게 된다. 따라서, 티. 비리데 및 티. 하르지아눔의 생물억제제로서의 특성을 유지하면서 저온을 충분히 견디어내므로써 차가운 토양속에서도 생물억제제로서 기능을 발휘할 수 있는 미생물이 요구되어 왔다.
이런 내한성 생물억제제는 특히 고위도 지역에서 유용하게 이용될 수 있다.
예를들면 저온 병원성 진균에 의해 유발되는 병인 백색 곰팡이병은 밀, 호밀, 트리티케일 및 보리같은 겨울 곡물의 작황을 나쁘게하는 주요 원인이며, 알라스카뿐만 아니라 다른 고위도 지역에서 겨울 곡물 산업을 확립하기 매우 어렵게 만든다.
스클레로티니아 보레알리스(Sclerotinia borealis), 후사리움 니발레(Fusarium ni-vale), 저온 맥각 담자균류(sLTB), 코프리누스 프시크로모비두스(Coprinus psychr-omobidus)(즉, 저온 담자균류(LTB) 및 티풀라 에스피피(Typhula spp.)등의 미생물은 이러한 진균성 병을 일으키는 가장 우세한 병원균인 것으로 알려져 있다. 상기 진균들은 토양이 아직 동결되지 않은 늦가을 또는 겨울에 숙주 식물에 감염된다.
긴 겨울동안, 두꺼운 눈밑에서 발견되는 어둡고 습기있는 조건하에서 진균은 숙주 조직내에서 증식 및 확산된다. 이 숙주와 기생성 진균사이의 기생적 상호 관계는 숙주의 저장된 영양을 급속히 소모시키고, 세포와 효소에 의해 식물 세포가 파괴되고, 결국은 숙주 식물이 죽게된다.
결과적으로, 내한성 트리코데르마를 이용하여 백색 곰팡이병을 효과적으로 억제하면 생육기가 짧은 알라스카나 다른 지역에서 겨울 곡물같은 새로운 작물을 경작할 수가 있다.
따라서, 당업계에는 저온시 병원성 진균에 의해 유발되는 백색 곰팡이병 및 다른 식물 병에 대해 효과적인 생물억제제가 요구되어 왔다.
또한, 보다 온건한 조건 및 저온에서 존재하는 식물 병원성 진균에 대하여 전반적으로 효과를 나타내는 생물 억제제가 요구되어 왔다.
온건한 조건하에 식물 병원성을 나타내는 진균의 수와 종류는 매우 다양하다.
피코미세테스(Phycomyedtes)균중에서 중요한 식물 병원균으로 마름병을 일으키는 피티움(pythium), 담배의 청색 곰팡이병을 일으키는 페로노스포라 타바시나(Peron-ospora tabacina) 및 감자의 늦마름병을 일으키는 피토프토라 인페스탄스 (Phytoph-thora infestans)이다.
바시디오미세테스(Basidiomycetes)균중에서 중요한 식물 병원균은 뿌리 썩음병을 일으키는 아르밀라리아 에스피(Armillaria sp.) 및 백색 곰팡이 병을 일으키는 티풀라 에스피피(Typhula spp)이다. 아스코미세티스(Ascomycetes)균중에서 중요한 식물 병원균은 각각 백색 썩음병과 백색 곰팡이병을 일으키는 스클레로티니아 스클레로리오룸(Sclerotinia sclerotio-rum)과 에스. 보레알리스(S. borealis)이다. 듀테로비세테스(Deuteromycetes)균 중에서 중요한 식물 병원균은 과수, 야채 및 감자의 시듦병, 완두콩류, 홍당무와 양파의 백색 썩음병, 과일과 묘목의 회색 곰팡이병, 뿌리 썩음병, 흑색 비듬병 및 마름병등을 일으키는 보트리티스 에스피(Botryt-is sp),베르티실리움 에스피.(Verticillium sp), 후사리움 에스피, (Fusarium s-p.), 스클레오치움 에스피(Sclerotium sp.) 및 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia so-lani)이다.
결론적으로 당업계는 저온에서 뿐만이 아니라 온건한 온도에서 존재하는 광범위한 병원성 진균에 대해 효과적인 생물억제제를 요구하여 왔다.
[발명의 요약]
본 발명은 생물학적으로 순수한 내한성 트리코데르마(Trichoderma) 분리물 CHS 861 (ATCC 74015)을 제공하므로써 상기와 같은 당업계의 요구를 충족시키는데 기여한다.
본 발명은 농학적으로 유효한 양의 트리코데르마 분리물 CHS 861(ATCC 74015)를 식물이나 식물조직에 사용함으로써 식물이나 식물조직의 생육과 발달을 촉진하는 방법을 제공한다. 식물 조직에는 예를 들면 열매, 종자 또는 묘목이 포함된다.
본 발명은 또한 병원성 진균으로부터 보호하고자 하는 식물이나 식물 조직에 농학적으로 유효한 양의 트리코데르마 분리물 CHS 861(ATCC 74015)을 사용함을 특징으로 하는 식물 병의 전염과 확산을 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 농학적으로 유효한 양의 트리코데르마 분리물 CHS 861(ATCC 74015)를 사용하므로써 진균성 병원균에 감염된 식물을 처리하는데 적용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는, 진균성 감염으로부터 보호하고자 하는 식물에게 트리코데르마 분리물 CHS 861(ATCC 74015)을 트리코데르마 분리물이 내성을 나타내는 리도밀 또는 리도밀-유사 살충제와 같은 시판되는 살충제와 혼합하여 사용할 수 있다,
본 발명의 구체적인 구현예에서는, 예방할 수 있는 진균성 병원균은 아르밀라리아멜레아(Armillaria melles), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 에프. 니발레(F. nivale), 코프리누스 프시크로모비수스(Coprinus psychromobidus, LTB), sL-TB, 피티움 에스피피. (Pythium spp.), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 에스. 보레아리스(s. borealis), 티풀라 인카르나타(Typhula incarnate), 티. 이다호엔시스(T. idahoensis), 티. 이시카리엔시스(T. ishikariensis), 베르티실리움 다리에(Verticillium dahliae), 스클레로티니아 스클레로티오룸(Sclerotinia sclero-tiorum), 스클레로티움 롤프시이(Sclerotium rolfsii) 및 스클레로티움 세피보룸(Sclerotium cepivorum)이다.
본 발명의 또 다른 측면은 베노밀(Benomyl) 또는 베노밀-유사 살충제 같은 시판 살충제에 대하여 내성을 갖는 생물학적으로 순수한 내한성 트리코데르마 변이주를 제공하는 것이다.
베노밀-내성 변이주의 예는 바이오타입 453(ATTCD 74016), 바이오타입 603(ATCC 74018), 및 바이오타입 901(ATCC 74017)이다.
본 발명은 또한, 예를 들면 진균성 병원균으로부터 보호하고자 하는 식물이나 식물조직에 농학적으로 유효한 양의 베노밀 내성 트리코데르마 변이주를 사용함을 특징으로 하는 식물 병의 전염과 확산을 예방하는 방법을 제공한다.
이들 트리코데르마 분리물은 예를들면 베노밀 또는 베노밀-유사 살충제와 혼합하여 피보호 식물에 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 농학적으로 유효한 양의 트리코데르마 변이주를 물이나 식물 변이주에 사용하므로써 식물이나 식물 조직의 생육과 발달을 촉진하는 방법을 제공한다.
구제적인 구현예에서, 본 발명은 상술한 것과 같은 농학적으로 유효한 양의 트리코데르마 변이주를 에이, 멜레아, 비. 시네레아, 에프. 니발레, 시. 프시크로모비두스(LTB), sLTB, 피티움 에스피피. 알. 솔라니, 에스. 보레알리스, 티. 인카르나타, 티. 이다호엔시스, 티. 이시카리엔시스, 브이. 달리에, 에스. 스클레로티오룸, 에스. 롤프시이 및 에스. 세피보룸 같은 진균성 병원균에 의해 감염된 식물이나 식물 조직에 사용하므로써 식물 병을 방제하는 방법을 제공한다. 또 다른 구체적인 구현예에서는, 본 발명은 트리코데르마 분리물 CHS 861(ATCC 74015)의 조배양 여액이나 바이오타입 603( ATCC 74018)의 조배양 여액에서 얻은 2개의 열안정성 단백질을 제공한다.
이 단백질들은 각각 약 17kDa과 21kDa의 분자량을 가지며, 내한성 트리코데르마와 연관되어 있고, sLTB와 보트리티스 실네레아, 피티움 에스피피, 에스. 스클레로티오룸, 에스. 롤프시이, 및 에스. 세피보룸의 생육을 예방하며 생물학적으로 순수한 형태를 갖는다.
또 다른 구현예에서. 이들 단백질은 다른 트리코데르마 단백질을 본질적으로 함유하지 않는 5-10KDa 분자이다.
[도면의 간단한 설명]
제1도 : 피티움 에스피피. 에 의해 감염된 완두콩 종자의 발아에 미치는 트리코데르마 분리물 CHS 861(ATCC 74015) 및 그의 변이주인 바이오타입 603(ATCC 74018)의 영향을 비교한 그래프.
제2도 : 피티움 에스피피.를 접종시킨 완두콩의 생중량에 미치는 트리코데르마 분리물 CHS 861(ATCC 74015)와 그의 변이주인 바이오타입 603(ATCC 74018)의 영향을 비교한 그래프.
제3도 : 완두콩의 키에 미치는 트리코데르마 분리물과 그의 변이주의 영향을 비교한 그래프.
제4도 : 완두콩의 생중량에 미치는 트리코데르마 분리물과 그의 변이주의 영향을 비교한 그래프.
제5도 : 완두콩의 건조 중량에 미치는 트리코데르마 분리물과 그의 변이주의 영향을 비교한 그래프.
제6도 : 화훼 생산에 미치는 트리코데르마 분리물과 그의 변이주의 영향을 비교한 그래프.
제7도 : sLTB 건조중량에 미치는 CHS 861(ATCC 74015) 여액의 영향.
제8도 : sLTB의 방사형 생육에 미치는 오토클레이브 멸균된 CHS 861(ATCC 74015)여액과 여과- 멸균된 CHS 861 (ATCC 74015)여액의 영향을 비교한 그래프.
제9도 : sLTB 겨울밀의 생존에 미치는 트리코데르마 분리물과 그의 변이주의 영향을 비교한 그래프.
제10도: 트리코데르마(ATCC 74015)의 생육에 미치는 온도의 영향을 비교한 그래프.
제11도 : 내한성 트리코데르마(ATCC 74015)의 생육에 미치는 pH의 효과를 비교한 그래프.
제12도 : 내한성 트리코데르마를 기생시킨 브이. 달리에 콜로니와 정상적인 브이. 달리에 클로니의 외관을 비교한 사진.
제13도 : 트리코데르마 바이오타입 901의 균사 (작은 직경)가 관통된 LTB 균사(큰직경)이 광학 현미경 사진.
제14도 : 트리코데르마 바이오타입 603을 기생시킨 브이. 달리에의 균사를 보여주는 광학 현미경사진.
제15도 : 아무것도 기생시키지 않은 브이. 달리에의 미세 맥각을 보여주는 광학 현미경 사진.
제16도 : 트리코데르마 분리물 CHS 861(ATCC 74015)를 기생시킨후에 변형된 브이.달리에의 균사를 보여주는 광학 현미경사진.
제17도 : 트리코데르마 분리물 CHS 816을 기생시킨후에 변형된 브이. 달리에의 미세 맥각을 보여주는 광학 현미경 사진.
[바람직한 구현예의 상세한 설명]
본 발명은 저온 병원성 진균을 효과적으로 예방하고 이러한 병원균에 의해 유발되는 병으로부터 식물을 보호할 수 있는 내한성 트리코데르마 분리물 및 그의 베노밀 내성 변이주에 관한 것이다.
본 발명은 또한 내한성 트리코데르마 분리물 또는 그의 변이주를 이용하는, 감염된 식물 또는 식물 조직을 방제하는 방법, 저온 뿐만아니라 온건한 온도 조건하에서 병원성 진균의 확산을 예방하는 방법 및 식물 또는 식물조직의 생육을 촉진하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 온건한 조건하에서 뿐만 아니라 저온에서 병원성 진균의 생육, 발달 및 증식을 효과적으로 예방하는 분자에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 트리코데르마 분리물 또는 그의 변이주와 관련된 용어 내한성(cold-tolerant)은 약 10℃ 이하, 예를 들면 약 4℃에서 잘 확립되고 정상적인 형태로서 생육할 수 있는 상기 미생물들의 능력을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 식물 조직은 식물의 생활기중 어떠한 단계에서는 식물로부터 유래된 모든 조직을 의미한다.
예를 들면 식물 조직은 식물의 열매, 종자 또는 묘목, 또는 조직 배양하여 증식시켰을 때 열매, 종자 또는 묘목에서 유래되는 세포의 모든 것을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 병원성 진균은 식물이나 식물 조직의 생육이나 생존에 악영향을 미칠 수 있는 진균을 의미한다.
저온 병원성 진균은 약 10℃미만, 예를 들면 약 4℃의 온도에서 식물이나 식물 조직의 생육이나 생존에 악영향을 미치는 진균을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 기타 다른 병원성 진균은 식물이나 식물 조직의 생육이나 생존에 악영향을 미칠 수 있으면서, 상기에서 정의한 저온 병원성 진균이 아닌 진균을 의미한다. 온도와 관련하여 본 명세서에서 사용된 용어 보다 온건한 조건은 약 10℃ 이상의 온도를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 용어 생물학적으로 순수한은 정제된 성분의 기능적 특성에 실질적으로 영향을 미치는 불순물이 실질적으로 제거된 화학물질 정도의 순도를 의미한다. 본 명세서에서 사용된 용어 농학적으로 유효한 양은 목적하는 농학적 효과를 얻기에 충분한 유효성분의 양을 의미한다.
예를 들면, 트리코데르마의 경우에, 트리코데르마의 농학적으로 유효한 양은 식물 생육을 제공하고, 식물 병의 감염을 예방하거나, 또는 식물 병을 효과적으로 방제 하는데 필요한 양이 될 것이다. 본 명세서에서 사용된 용어 베노밀(Benomyl) 또는 베노밀-유사 살충제는 1-(부틸카르보밀)-2-벤즈이미다졸 카르바메이트 또는 베노밀의 유사체 또는 베노밀과 실질적으로 동일한 기능적 특성을 나타내는 화합물을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 리도밀(Ridomil) 또는 리도미-유사 살충제는 N-[2,6- 디메틸페닐]-N-[메톡시아세틸]-알라닌 메틸 에스테르 또는 리도밀의 유사체 또는 리도밀과 실질적으로 동일한 기능적으로 동일한 기능적 특성을 나타내는 혼합물을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 항생물질은 예를 들면 세균이나 진균 같은 다른 미생물의 생육을 파괴하거나 억제할 수 있는 미생물, 단백질 또는 혼합물과 같은 물질을 의미한다.
본 명세에서 사용된 용어 항진균제는 진균의 생육을 파괴하거나 억제할 수 있는 항생물질이다. 본 명세서에서 사용된 항균제는 세균의 생육을 파괴하거나 억제할 수 있는 항생물질이다.
내한성 트리코데르마 분리물 CHS 861 (ATCC 74015)는 특허절차를 위한 미생물 기탁의 국제적 인정에 관한 부다페스트 조약의 규정에 따라 ATCC 74015의 수탁번호 매릴랜드 20852 록빌 소재의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Col-lection)에 기탁되어 있다.
내한성 베노밀 내한성 트리코데르마 분리물인 바이오타입 453(ATCC 74016 ), 바이오타입 603(ATCC 74018) 및 바이오타입 901(ATCC 74017)도 비슷하게 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 각각 수탁번호 ATCC-74016, ATCC-74018 및 ATCC-74017로 기탁되어 있다.
저온 병원성 진균에 대해 길항작용을 나타내는 내한성 트리코데르마 분리물을 분리하여 동정하였다. 알라스카 내륙과 남부 중앙 전역의 66곳에서 수집한 토양 시료를 트리코데르마 반선택 배지(TSM)(G. C Papavizas, Phytopathol. 72 : 121~ 125( 1982); 그 내용은 본 명세서에 참고로 삽입되어 있다)에 뿌리고 약 7℃에서 약 10일간 보온하였다.
TSM상의 각 콜로니의 균사를 관찰하고, 트리코데르마의 전형적인 특성, 예를 들면, 극히 미세한 균사 및 녹색 포자를 갖는 것을 감자 덱스트로스 한천(PDA)(DIFCO Lab-oratory)의 사면에 옮겼다. 약 25℃에서 약 10일간 보온한 후 오염의 징후가 없는 분리물을 문헌[J.A. Lewis a-nd G. C. Papavizas, Phytopathol,] 74 : 1240~1244(1984); 이 문헌의 내용은 본 명세서에 참고로 삽입되어 있다]에 기재된 방법대로 V-8쥬스 한천 플레이트에서 계대 배양하고, 약 4℃에서 약 22일간 생육시켰다.
이들 분리물의 방사형 생육을 빠르게 자라는 눈 곰팡이병 진균인 sLTB의 생육과 비교하였다. 56주의 내한성의 빠르게 생육하는 트리코데르마 분리물을 얻었다.
트리코데르마가 다른 진균의 생육을 억제하는 능력을 연구하기 위하여 이중 배양법을 이용하였다. 이들 진균 기생체 연구에 있어서, 병원성 진균의 배양액과 트리코데르마 분리물에서 얻은 직경이 대략 4mm인 플러그를 PDA 플레이트상에서 서로 반대되는 위치에 놓고 약 7℃ 및 약 20℃에서 약 3주간 보온하였다.
트리코데르마 분리물과 병원성 진균간의 상호작용을 관찰하였다.
CHS 861 (ATCC 74015), 바이오타입 603(ATCC 74018) 및 바이오타입 901(ATCC 74017)로 명명된 분리물이 실험실 조건하에서 sLTB 및 시. 프시크모모비두스(LTB) 뿐만 아니라, 비. 시네레아, 알, 솔라니, 피티움 에스피피. 에스. 보레알리스, 에프. 니발레, 티. 인카르나타, 티. 이다호엔시스, 티. 이시카리엔시스, 브이. 달리에, 에스. 스클레로티오룸, 에스. 롤프시이 및 에스. 세피보룸에 기생하는 것으로 나타났다.
CHS 861 (ATCC 74015), 바이오타입 453(ATCC 74016), 바이오타입 603(ATCC 74018) 및 바이오타입 901(ATCC 74017)의 분리물도 비. 시네레아, 피티움 에스피피. 알.솔라니. 에스. 보레알리스, 에프. 니발레, 티. 인카르나타, 티. 이다호엔시스, 티. 이시카리엔시스, 브이. 달리에, 에스. 스클레로티오룸, 에스. 롤프시이 에스.세피보룸 및 sLTB의 생육과 발달을 예방하는데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 분리물 CHS 861(ATCC 74015)는 에이. 멜레아의 생육과 발달을 예방하는 것으로 밝혀졌다. 분리물 CHS 861(ATCC 74015), 바이오타입453(ATCC 74016), 바이오타입 603 (ATCC 74018) 및 바이오타입 901(ATCC)은 완두콩과 화훼식물같은 비감염 식물의 생육, 발달과 생존을 촉진시키거나 생육, 발달 및 생존시킬수 있는 것으로 밝혀졌다. 분리물 CHS 861 (ATCC 74015), 바이오타입 453(ATCC 74016), 바이오타입 603(ATCC 74018) 및 바이오타입 901(ATCC 74017)은 완두콩과 화훼식물같은 비감염 식물의 생육, 발달과 생존을 촉진시키거나 생육, 발달 및 생존시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. 분리물 CHS 861(ATCC 74015)의 콜로니 특성, 포자 형태 및 분생포자병의 가지치기 형태를 검사하였다. 분리물 CHD 861 (ATCC 74015)는 속성형이다.
콜로니는 문헌[Gooding and Lucas, Phytopathol. 49 : 277~ 281(1959); 이 문헌의 내용은 본명세서에 참고로 삽입되어 있다]에 기재된 대로 오트밀 한천에서 생육시켰을 때 약 20℃에서 4일만에 직경 9cm의 크기에 도달한다.
이 분리물은 또한 저온에 대해 현저한 내성을 나타낸다. 오트밀 한천상에서, 약 7℃에서 9일 이내에 직경 9cm의 크기에 도달한다. 약 4℃에서, CHS 861 (ACTT 74015)콜로니는 보다 느리게 생육하지만 콜로니는 잘 확립되고 형태도 정상인 것으로 나타난다. 이 진균의 최적 생육 온도는 33℃ 이다 (제10도 참고).
분리물 CHS 861 (ATCC 74015)의 pH 범위는 약 1.5~ 약 pH 10.0이며, 최적 pH는 약 2.5~약 5.5이다 (제11도 참고). CHS 861 (ATCC 74015)의 콜로니는 초자질이다.
포자를 형성한 후에는 색이 올리브 녹색 내지 검은 녹색으로 변한다.
이들 균은 종종 서로 문합을 형성하여 빽빽한 유리모양의 망사를 형성한다.
티. 하마툼(T. hamatum)과 티. 폴리스포룸(T. polysporum)에서 발견되는 문합을 형성하는 멸균 초자질의 신장과는 달리, CHS 861의 문합은 양이 많은 분생포자병에서 발견된다.
CHS 861의 분생포자병은 보통 2 또는 그 이상의 수로 분산되어 있는 경자에서 끝나있다.
경자는 불규칙하게 굽어있고 크기는 약 5.4~8.1 × 3.2~4.4㎛이다. 분생포자기는 녹색이고 형태는 구형내지 난형이다. 균사는 초자질이고, 표면이 매끄럽고 약 2.7~ 5.4㎛의 크기로 떨어져있다. 분생포자기의 크기는 약 2.4~약 4.1㎛ × 약 2.4~ 약 3.5㎛ 에 이른다.
분생포자기의 이러한 크기 범위는 약 1.25미만의 길이 대 넓이 비율을 가져온다. 3주일된 콜로니의 광학 현미경 및 주사 전자현미경 사진은 분생포자기의 표면이 매우 매끄럽고 전혀 장식이 없는 것을 나타낸다.
CHS 861의 균사는 벽두께가 두꺼운 초자질 유협포자를 형성하는데, 이들은 대부분 절간(節間)위치에 존재한다.
CHS 861(ATCC 74015)의 콜로니는 PDA, 오트밀 한천 및 V-8 쥬스 한천 배지상에서 매우 강한 코코넛 냄새를 낸다.
CHS 861(ATCC)74015의 포자 장식, 포자 크기 및 형태, 경자의 길이와 윤생체 비열, 문합의 존재 및 콜로니의 색상을 다른 트리코데르마 균주의 것과 비교하였다. 이러한 특성들로부터, 분리물 CHS 861(ATCC 74015)는 티. 하마툼, 티. 비리데 및 티. 하르지아눔과는 분류학적으로 다르다는 것이 극명해졌다.
분리물 CHS 861(ATCC 74015)는 테라클로르(Terraclor : PCNB-펜타클로로니트로 벤젠)와 리도밀(Ridomil : N-[2,6-디메틸페닐]-N-[메톡시아세틸]-알라닌 메틸 에스테르)에 대해 내성을 나타내지만 베노밀에 대하여 매우 민감한 것으로 나타났다. 상기 분리물의 생육은 약 5mg/ml농도의 베노밀에서 완전하게 억제되는 것으로 밝혀졌다.
바람직한 트리코데르마 변이주, 예를들면 살충제 내성 변이주는 통상의 변이 발생법에 의해 만들 수 있다.
본 발명의 한 구현에서는, 분리물 CHS 861(ATCC 74015)를 자외선 조사에 노출시켜 베노밀 내성 트리코데르마 변이주를 얻었다.
적절한 선택 배지를 선택하는 등의 통상의 방법에 의해 기타 다른 트리코데르마 변이주를 얻을 수 있다.
보다 구체적으로는, 베노밀 내성 변이주는 다음과 같은 방법으로 유도 및 분리할 수 있다.
활성 포자형성 단계(20℃에서 3일 생육시킨 배양액)의 CHS 861 배양액 (ATCC 74015)[PDA 플레이트]을 GE 살균 램프 아래에 약 22cm의 거리에 있는 위치에 놓는다. 소정 시간동안 UV 조사후에, 약 5ml 부피의 멸균 증류수를 배양 플레이트 위에 피펫을 사용해 적가하였다.
고무 막대를 이용하여 분생포자병으로부터 조사된 포자를 조심스럽게 떼어내고 베노밀을 약 100mg/ml 이상 보강한 V-8 쥬스 한천상에서 배양하였다.
이들 플레이트상에서 생육하는 콜로니를 베노밀을 첨가하지 않은 V-8 쥬스 한천플레이트에 옮기고 4℃에서 20일간 보온하였다.
이들 변이주(바이오타입)의 방사형 성장, 포자 형성 및 포자 형태, 그리고 이들 변이주가 균사 기생체할 수 있는 능력을 측정하고 야생형 트리코데르마 분리물 CHS 861(ATCC 74015)와 비교하였다. UV-유도 베노밀 내성 바이오타입은 약 1000 mg/ml 농도까지의 베노밀에 대해 매우 높은 내성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
이들 바이오타입은 CHS 861 분리물(ATCC 74015)와는 형태학적으로 구분이 안되지만 생육 습관, 항진균 능력 및 식물의 생육과 발달을 촉진하는 능력에 있어서 약간의 차이가 발견되었다.
바이오타입의 생육 속도는 야생형보다 약간 느리다.
약4℃에서 20일간 실시된 생육 시험에서, 바이오타입 453(ATCC 74016), 바이오타입 603(ATCC 74018) 및 바이오타입 901(ATCC 74017)의 방사형 생육은 각각 직경이 약 59cm, 66cm 및 49cm이었으며, 동일한 조건하에서 CHS 861(ATCC 74015)의 방사형 생육은 70cm이었다.
바이오타입 603(ATCC 74018)의 항진균 특성은 CHS 861(ATCC 74015)의 그것과 견줄만 하였다.
그러나, 바이오타입 453(ATCC 74016)과 바이오타입 901(ATCC 74017)의 항진균 특성은 이중 배양 플레이트상에서 억제 구역의 크기를 측정하기 위해 분석하였을 때 CHS 861(ATCC 74015)에 비하여 각각 약간의 감소가 있었다.
모든 세종류의 바이오타입에 있어서 식물 생육과 발달의 증강 작용이 관찰되었다. 바이오타입 453(ATCC 74016)을 접종시킨 완두콩 종자는 가장 빨리 꽃을 피우고 가장 왕성한 생육을 보인다.
UV 조사기간 (15, 30. 45, 60. 90, 120 및 180분)과 유도된 베노밀 내성 바이오타입의 수 사이에는 직접적인 상호 연관성이 관찰되지 않았다. 본 발명의 한 구현예에서는, 분리물 CHS 861 (ATCC 74015)와 선택된 토양성 병원균과의 상호작용을 연구하였다.
작용 태양은 다양하게 나타났다.
예를들면, CHS 861(ATCC 74015)이 주변 콜로니를 억제하여 형성시킨 투명 구역은 sLTB(넓이 약 6mm) 및 에스. 보레알리스에서 매우 현저하였다.
에프. 니발레의 경우에는 투명 구역이 그렇게 명확하지가 않았다.
그러나, 에프. 니발레의 경우에는 독특한 다발형 균사체 형성이 관찰되었지만 다른 병원균에서는 그렇지 않았다.
브이, 달리에, 에스, 스클레로티오룸, 에스, 롤프시이 및 에스. 세피보룸상에서 CHS 861(ATCC 74015)과 바이오타입 603(ATCC 74018)에 의해 형성된 억제 구역은 명확하지 않았다.
그러나, 브이,달리에, 에스, 스클레로티오룸, 에스. 롤프시이 및 에스. 세피보룸의 콜로니상에서 균사 생성의 저지가 관찰되었다.
이 결과는 CHS 861이 이들 병원균 모두에 대해 매우 효과적이라는 것을 시사한다.
이러한 결과는 내한성 트리코데르마가 광범위한 식물 병원균에 대하여 효과를 나타내며, 따라서 내한성 트리코데르마가 진균성 식물 병에 대한 효과적인 일반적 생물 억제제임을 시사하는 것이다.
내한성 트리코데르마 분리물과 그로부터 유도된 베노밀의 내성 변이주는 진정한 진균기생체인 것으로 보인다.
내한성 트리코데르마 균체가 피티움 에스피피, 알. 솔라니, 시. 프시크로모비두스, 티풀라 에스피피, sLTB, 브이. 달리에, 에스. 스클레로티오룸, 에스. 롤프시이. 에스. 세피보룸등의 병원성 진균의 균사내로 소용돌이쳐 들어가 침투하는 것이 관찰된다.
한편, 내한성 트리코데르마는 서서히 식물과 공생관계를 형성할 수 있는 것으로 보인다.
내한성 트리코데르마의 균사와 유협포자 원기가 밀세포에서 관찰되는데 식물에 악영향을 주지 않는다. 소량의 분리물 CHS 861 (ATCC 74015), 바이오타입 453(ATCC 74016), 바이오타입 603(ATCC 74018), 바이오타입 901(ATCC 74017)의 포자를 접종시키면 sLTB, 비.시네레아 및 브이.달리에의 콜로니상에서 균사 분해가 관찰된다.
분리물 CHS 861 (ATCC 74015), 바이오타입 603(ATCC 74018), 바이오타입 901(ATCC 74017)의 균사가 sLTB, LTB(씨. 프시크로모비두스), 브이. 딜리에, 티풀라 에스피피. 알. 솔라니, 및 에프. 니발레의 균사내로 침투하며, 트리코데르마 분리물과 연관된 곳에 이들 병원성 진균의 균사에 천공이 생기는 것이 광학 현미경 및 주사 전자 현미경으로 관찰된다.
분리물 CHS 861 (ATCC 74015) 및 바이오타입 603(ATCC 74018)은 브이. 달리에의 미세 맥각의 발달을 억제할 수 있으며, 이미 형성된 분생포자기와 미세 맥각을 빠르게 퇴화시킨다.
에스.보레알리스에 있어서, 맥각은 백색 곰팡이병 진균의 생존 수단일 뿐만 아니라 그 접종의 근본적인 근원이 된다.
광학 현미경과 주사 전자 현미경 연구에 따르면, 트리코데르마 분리물 CHS 861 (ATCC 74015)은 에스. 보레알리스의 맥각에 기생할 수 있으며, 후자를 영양원으로 이용할 수 있다.
트리코데르마의 균사가 에스. 보레알리스의 맥각에 침투하는 것은 주로 껍질에 발생한 새김눈과 균열을 통해서이다.
sLTB에서 관찰되는 것과 유사한 균사 분해(lysis)가 에스. 보레알리스의 수질 세포에서 관찰된다. 크고 벽이 얇은 수질 세포의 분해는 결국 수질의 본래의 모습을 빠르게 없애버린다.
이어 맥각은 공동을 형성하고 중심에 공동이 생긴다.
맥각은 트리코데르마의 생육과 발달을 뒷받침할 수 있다.
병에 걸린 맥각의 외부와 내부 모두에서 트리코데르마 분리물의 포자 형성이 관찰된다.
백색 곰팡이병 진균 균사가 내한성 트리코데르마에 의해 분해(lysing)되는 것이 화학적 작용의 결과인지의 여부를 이해하기 위하여, 백색 곰팡이병 진균을 트리코데르마 배양 여액의 존재하에 배양하였다.
실험 결과는 조배양 여액이 sLTB, 피티움 에스피피., 브이. 달리에, 에스, 스클레 로티오룸, 및 에스. 롤프시이의 방사형 생육을 현저하게 감소시키는 것을 보여준다.
배양 여액으로부터 2종의 분자가 동정되었는데, 이들 분자는 sLTB의 생육을 억제하는 효과를 갖는 것으로 나타났다.
겔 여과법으로 결정한 이들 분자의 예상 분자량은 각각 17,000Da 및 21,000Da인 것으로 밝혀졌다.
바이오-래드 단백질 표준물질(Bio-Rad Laboratories)로 조정한 미세 등급의 세파덱스 75 컬럼을 통하여 상기 분자들을 분획화하고 엘머-파커(Elmer-Parker)분광계를 이용하여 28nm에서 측정하였다.
특성이 단백질성인 이들 분자는 둘다 모두 열에 대해 안정한 것으로 나타났다. 17kDa 및 21kDa 분자가 단백질이라는 것을 증명하기 위하여, 정제된 제제를 프로나제와 함께 보온하였다.
단백 분해된 물질에 대하여 sLTB의 생육을 억제하는 능력을 분석한 결과, 이들 물질은 완전히 분해되어 더 이상 생물학적 활성을 갖지 못하는 것으로 나타났다.
이러한 결과는 17kDa 및 21kDa 분자가 프로테아제에 대해 민감하여 단백질이라는 것을 시사한다.
배양 여액에 대하여 아미콘(Amicon) 8050 한외여과 장치를 이용하여 한외여과에 의해 저분자량 물질을 분석하였다.
분자량 분획이 5,000인 아미콘 필터를 통하여 조배양 여액을 여과하였다.
필터위에 남아있는 물질을 분자량 분획이 10,000인 제2아미콘 필터를 통하여 여과하였다.
제2필터를 통과한 물질중에서 제3분자를 동정하였다.
이 제3 분자는 sLTB의 생육을 억제하는 활성을 갖는 것으로 밝혀졌으며 계속 특성을 확인하였다.
이 분자는 0.1mg/1 농도의 프로나제에 대해 민감한 것으로 밝혀졌다.
이 5~10kDa 분자를 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피 및 HPLC에 의해 정제한다.
이 분자는 또한 클라비박터 세피도니쿰(Claribacter sepidonicum)같은 세균 대하여 항균 작용을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는, 내한성 트리코데르마 분리물과 베노밀 내성 바이오타입을 사용하여 백색 곰팡이병 같은 진균성 병으로부터 겨울 밀 식물을 보호한다.
예를들면, 내한성 트리코데르마의 포자를 피복한 종자에서 발아한 겨울 밑 묘목에 sLTB를 접종하고 약 4℃에서 약 8주간 보온한다.
내한성 트리코데르마 분리물로 처리된 묘목에서는 겨울 밀의 생존율이 현저히 증가된다.
트리코데르마-처리된 겨울밀의 엽초를 검사한 결과 sLTB에 의해 형성되는 맥각의 수가 적극적으로 감소되는 것이 관찰되었다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는, 내한성 트리코데르마를 사용하여 마름병으로부터 식물을 보호하였다.
예를들면, 온식 조건하에서, 정원 완두콩을 트리코데르마 포자로 피복한후 피티움. 에스피피.가 만연되어 있는 땅에 심었다.
피험 피티움 분리물은 피. 아파니데르마툼(P. aphanidermatum), 피. 디쑈토쿰(p.dissotocum), 피. 올리간드룸(P. oligandrum), 피. 울티뭄(P. ultimum) 및 산업적 규모의 온실에서 구입한 국화속 식물의 묘목에서 분리한 일종이었다.
내한성 트리코데르마로 처리된 완두콩과 보호되지 않은 대조군의 완두콩 사이에서는 발아율과 생존율에 있어서 현저한 차이가 있었다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는, 내한성 트리코데르마를 사용하여 검출 가능한 병원균의 부재하에 식물의 생육을 촉진하였다.
예를들면 정원 완두콩의 생육과 발달에 미치는 내한성 트리코데르마 효과를 알아 보는 실험에 있어서, 트리코데르마 처리 완두콩에서는 무처리 대조군과 비교하여 중량, 높이 및 꽃과 열매의 수에 있어서 현저한 증가가 관찰되었다.
다른 야채와 화훼류를 시험한 경우에는 품질면에서 유사한 결과를 얻어졌다.
본 발명의 응용 분야에 있어서 생물학적 억제제의 토양중에서의 생존성은 중심 이슈중의 하나이다.
알라스카의 겨울을 통하여 분리물 CHS 861(ATCC 74015)의 생존성에 대한 예비적 시험을 행하였다.
가을에, 분리물 CHS 861(ATCC 74015)를 서식시킨 호밀 낟알을 밀의 뿌리 구역의 땅에 묻었다.
봄이 다가온후에, 호밀낟알을 꺼내어 분리물 CHS 861(ATCC 74015)를 재분리하였다. 생존성 시험의 결과는 분리물 CHS 861 (ATCC 74015)이 6개월간의 겨울 조건하에서도 토양중에서 잘 생존할 수 있다는 것을 시사하였다.
농학적으로 예방하고, 식물 병을 방제하며 식물 생육을 촉진하기 위하여 내한성 트리코데르마 CHS 861(ATCC 74015), 바이오타입 453 (ATCC 74016), 바이오타입 603(ATCC 74018) 및 바이오타입(ATCC 74017)을 사용하는 방법에는 여러가지가 있다. 이들 진균 기생체의 분생포자기, 균사 또는 유협포자를 단독으로 또는 배합하여 직접 토양, 식물 또는 식물 조직에 사용할 수 있다.
얇은 벽의 분생포자기와 진균의 균사는 건조현상에 의해 빠르게 그의 생존력을 상실하기 때문에, 진균기생체를 직접 사용하는 것은 덜 효과적이다.
알. 티. 반더빌트사[R. T. Vanderbilt Co., Inc. CT, USA]에 의해 파이락스(Pyrax)의 상품명으로 판매되는 것과 같은 농학적으로 허용되는 불활성 물질이나 알지네이트-파이락스, 클레이, 카올린 및 초탄등을 포함하는 담체를 첨가하면 방제 효과를 현저하게 개선할 수 있다.
진균 기생체의 부착성을 개선시키고 나아가 분리물의 항진균 활성을 증강시키기 위하여 유화제, 점착제, 현탁제등의 보조제를 사용할수도 있다.
트리코데르마 조성물은 고형 또는 액체의 형태로 사용할 수 있다.
고형에는 분진, 습식 분말, 과립 및 펠릿이 포함된다.
액체 조성물은 수성 또는 비수성 매질의 형태, 용액, 현탁액, 분산액 또는 농후액의 형태로 있을 수 있다.
내한성 트리코데르마 조성물은 기타 다른 살충제나 화학물질을 포함학 수 있다. 첨가될 수 있는 살충제는 CHS 861(ATCC 74015)또는 그 변이주가 내성을 나타내는 테라클로르(Terraclor),리도밀 또는 베노밀같은 화학물질 살충제일 수 있다.
이 살충제는 또한 세균성 진균기생체(예를들면, 슈도모나스 플루오레센스(Pseudom-onas fluorescens)또는 트리코데르마의 다른 종 또는 분리물과 같은 또 다른 생물 억제제일 수 있다.
담체에 함유되어 있는 내한성 트리코데르마의 분생포자기, 균사 또는 유협포자의 바람직한 농도는 고형 조성물인 경우에 조성물 g당 약105~~약 108콜로니 형성단위(cfu)이거나 또는 액체 조성물의 경우 조성물 g당 약 약105~~약 108cfu이다.
트리코데르마 조성물은 토양을 훈증 소독하거나 열처리한 후에 미생물을 재확립시키거나 토양 처리를 목적으로 하여 토지에 사용할 수 있다.
사용가는한 양은 토양 1m2당 약 50g~약 100g(건조 중량)일 수 있다.
온실에서는, 생물억제 조성물은 육모용 믹스 1kg당 대략 5g을 사용할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에서는, 트리코데르마 조성물을 종자에 사용하여 피막을 형성한다.
바람직한 구현예에서는, 예를들면 겨울 밀과 완두콩의 종자를 내한성 트리코데르마 균사와 포자로 캡슐화하기 위한 담체로서 알지네이트-파이락스가 사용된다.
또 다른 구현예에서는, 트리코데르마 조성물은 농학적으로 허용되는 점착제, 예를 들면 니트라긴사[Nitragin,WI, USA]에 의해 펠겔(pelgel)의 상품명으로 판매되는 것을 함유할 수 있으며, 이 조성물을 마름병, 흑색 비듬병, 백색 곰팡이병 및 뿌리 썩음병같은 진균성 병으로부터 식물을 보호하기 위한 목적으로 종자를 피복하기 위해 사용될수 있다.
점착제를 함유하는 트리코데르마 조성물은 비. 시네레아에 의해 유발되는 회색 곰팡이병으로부터 묘목과 열매, 예를들면 포도와 딸기를 보호하기 위해 사용될수 있다.
예를들면, 트리코데르마 조성물은 다음과 같이 종자에 사용할 수 있다.
트리코데르마 포자 현탁액을 약 2.0 × S105~20 × 106포자/ml의 농도로 1% 알진 산나트륨 용액(Sigma shemical사, St Louis, Mo, USA)에 가한다.
피복시키고자 하는 종자를 알진산나트륨 포자 현탁액에 넣는다.
알진산나트륨 포자 현탁액으로부터 피복 포자를 개별적으로 꺼내어 수분간 50 mM CaCl2용액에 놓는다.
이어, 피복된 종자를 라미나 플로우 후드(laminar flow hood)내에서 whd이 타월로 건조시킨다.
트리코데르마 배양 여액중의 분자들을 이용하여 식물 병 농학적으로 억제 및 방제하고, 식물 생육을 촉진할 수 있다.
분자들은 생물학적으로 순수한 형태 또는 농학적으로 적절한 담체를 비롯한 다른분자와 배합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서는 이들 분자를 함유하는 트리코데르마 배양 배지 또는 이들 분자를 하유하고, 생존 가능한 트리코데르마 미생물을 실질적으로 함유하지 않는 트리코데르마 배양 배지로 이루어진 여액을 농학적으로 허용되는 양으로 방제 또는 보호하고자 하는 식물에 사용할 수 있다.
후술하는 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며 본 발명을 한정하고자 하는 것이 아니다.
또한 상세한 설명은 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내고 있긴 하지만 단지 예시를 위한 것에 불과한데, 그 이유는 당업자가 상세한 설명란으로부터 본 발명의 요지와 범위내에서 수많은 변화와 변경을 할수있기 때문이다.
[실시예 1]
내한성 트리코데르마 CHS 861(ATCC 74015)과 바이오타입 603(ATCC 74018)을 PDA플레이트상에서 20℃에서 계속하여 밝게 하면서 7일간 배양하였다. 배양액중에 형성된 분생포장기를 차가운 증류수가 담긴 세척병을 이용하여 세척하고 용기에 모았다.
분생포자기 현탁액의 소량의 부분 표본을 꺼내어 희석하고 AO 스펜서 브라이트-라인 혈구측정기(AO Spencer Bright-line Hemacytometer)내에서 계수하였다.
종자 캡슐 포획화를 위하여 와링(Waring)블렌데내에서 5g의 알진산나트륨과 50g의 파이락스 ABB를 함께 500ml 증류수에 1분간 혼합해 넣었다.
포자 현탁액을 알진산염-파이락스 혼합물에 첨가하여 최종 포자 농도를2 × 105포자/ml로 만들었다.
완두콩 종자를 포자-알진산염-파이락스 현탁액에 넣고 잘 혼합하였다.
이들 완두콩 종자를 칼슘 글루코네이트 21.5을 증류에 11에 녹여 제조한 칼슘 글루코네이트 용액에 떨어뜨렸다.
캡슐화된 완두콩 종자를 모아 건조시키고 피티움 에스피피를 103포자낭/g 토양의 양으로 접종시킨 펄라이트에 심었다.
트리코데르마로 처리하여 종자(11% 발아율)와 비교할때, CHS 861(ATCC 740)(66% 발아율) 또는 바이오타입 603 ATCC 74015)로 처리한 종자에서 발아율의 현저한 증가가 관찰되었다.
결과는 제1도에 나타내었다.
바이오타입 603(ATCC 74015)로 처리한 완두콩 종자에서는 발아율이 약간 감소되는 것이 관찰되었다.
트리코데르마 CHS 861(ATCC 74015)로 처리한 완두콩 종자에서는 발아에 미치는 악영향이 전혀 관찰되지 않았다.
문헌[Sokal et al.. Biochemistry, Freeman Pbl. Co., 1969 ; 이 문헌의 내용은 본 명세서에 참고로 삽입되어 있다]에 기술된대로 던칸 다중 범위시험(Duncan m-ultriple range test]을 이용하여 데이터를 통계학적으로 분석하였다.
각 데이터점의 평균위에 나타낸 동일한 문자는 이러한 데이터 점간에 있어서 통계학적으로 유의할만한 차이가 없다는 것을 의미한다.
[실시예 2]
발아후에, 완두콩 식물을 2주간 자라게 한후 수확하였다.
생중량으로 측정한 식물의 생존능 및 생육능력을 측정하였다.
피티움 에스피피로 처리한 토양에서 생육시켰을때, 무처리 완두콩 식물은 제2도에 나타낸대로 매우 저조한 생육을 보인다.
감염 토양에서 생육시켰을 때 CHS 861(ATCC 74015) 및 바이오타입 603바이오타입3 (ATCC 74018)으로 처리된 종자에서 발아한 완두콩 식물의 생중량은 현저하게 증가하였다.
무처리 대조군과 비교하였을때, CHS 861(ATCC 74015) 또는 바이오타입 603(ATCC 74018)으로 처리된 종자에서 발아한 식물의 생중량간에는 통계학적 차이가 관찰되지 않았다.
피티움이 만연되거나 또는 만연되지 않은 토양에서 생육시킨 CHS 861(ATCC 74015) 또는 바이오타입 63 (ATCC 74018)으로 처리한 종자에서 발아한 완두콩 식물의 생중량에서 통계학적 차이는 관찰되지 않았다.
[실시예 3]
여러 가지 방법으로 내한성 트리코데르마 CHS 861(ATCC 74015), 바이오타입 453(AT-CC 74016), 바이오타입 603(ATCC 74018) 및 바이오타입 901 (ATCC 74017)이 식물의 생육과 발달에 미치는 영향을 검사하였다.
원예용 완두콩 종자를 실시예 1에 기술한 방법대로 CHS 861(ATCC 74015),바이오타입 453(ATCC 74016), 바이오타입 603(ATCC 74018)또는 바이오타입 901(ATCC 74017)로 피복하였다.
피복된 종자를 토양성 식물 병원균이 감염되어 있지 않은 펄라이트에서 발아 및 생육시켰다.
4주후에, 완두콩 식물을 수확하였다.
처리에 대한 완두콩 식물의 반응을 완두콩의 키로 표시하여 제3도에 나타내었다. 바이오타입 453(ATCC 74016)으로 처리한 식물의 키가 다른 모든 처리군보다도 훨씬 더컸다.
CHS 861(ATCC 74015) 및 다른 3종류의 바이오타입균으로 처리한 완두콩 식물은 대조군보다 현저하게 키가 컸다.
[실시예 4]
(실시예 3에 기술한 것과 같이) 내한성 트리코데르마 CHS 861(ATCC 74015, 바이오 타입 453(ATCC 74016), 바이오타입 603(ATCC 74018) 및 바이오타입 901(ATCC 74017)로 처리한 완두콩 식물이 나타내는 반응을 생중량으로 표시하여 제4도에 나타내었다.
바이오타입 453(ATCC 74016)으로 처리된 식물이 다른 모든 처리군보다 현저하게 무거웠다.
CHS 861(ATCC 74015) 및 세종류의 바이오타입으로 처리한 완두콩 식물은 모두 대조군보다 현저하게 무거웠다.
[실시예 5]
(실시예 3에 기술한 것과 같이) 내한성 트리코데르마 GHS 861(ATCC 74015), 바이오타입 453(ATCC 74016), 바이오타입 603(ATCC 74018) 및 바이오타입 901(ATCC 74017)로 처리한 완두콩 식물이 처리에 대하여 나타내는 반응을 건중량으로 표시하여 제5도에 나타내었다.
바이오타입 453(ATCC 74016)으로 처리된 식물이 대조군보다 현저하게 단단한 덩어리를 생산한다.
CHS 861(ATCC 74015) 로 처리된 완두콩에서 약간의 건중량의 감소가 관찰되긴 하였지만, 세종류의 바이오타입으로 처리된 완두콩 식물은 대조군보다 훤씬 많은 중량을 가졌다.
[실시예 6]
(실시예 3에 기술한 것과 같이) 내한성 트리코데르마 CHS 861(ATCC 74015), 바이오타입 453(ATCC 74016), 바이오타입 603(ATCC 74018) 및 바이오타입 901(ATCC 74017)로 처리한 완두콩 식물이 처리에 대하여 나타내는 반응을 꽃 생산으로 표시하여 제6도에 나타내었다.
바이오타입 453(ATCC 74016)으로 처리된 식물이 보다 일찍 꽃을 피웠으며 무처리 대조군보다 훨씬 많은 꽃을 피웠다.
[실시예 7]
병원성 진균의 생육과 발달에 미치는 내한성 트리코데르마 배양 여액의 영향을 다음과 같이 연구하였다.
트리코데르마 CHS 861 (ATCC 74015)를 문헌[Madelin, M. F., Ann. Bot. 20 : 307 ~330(1956)]에 기술된 것과 같은 글루코스 효모 엑기스(GVE) 액체 배지 50ml중에서 10℃에서 10일간 배양하였다.
배양액을 와링 블렌더내에서 15초간 혼합하고 4겹의 치즈천을 통과시켜 여과하였다.
이어, 화트만(whatman) No. 1 여과지에 진공하에 여과시켰다.
여액을 10, 000rpm(12,350g)에서 15분간 원심 분리하였다.
상층액을 모으고, 회전 증발기를 20배 농축시키고 멸균 22미크를 밀리포어 필터를 통해 여과하였다.
이 농축 배양 여액 제제를 20ml의 GYE 액체 배지에 희석하였다.
각각 직경이 1cm인 5개의 sLTB 플러그를 각 배양 여액-함유 플라스크에 넣고 배지내에서 약 10℃에서 2주간 배양하였다.
한천 플러그상의 sLTB의 균사를 진공하에 과건조된 중량을 아는 종이위에 수확하였다.
균사를 오븐에서 건조시키고 중량을 측정하였다.
CHS 861(ATCC 74015)의 배양 여액은 sLTB의 생육과 발달을 현저하게 억제하는 것으로 나타났다.
배양 여액의 항진균 활성은 직접적으로 여액의 농도와 관련되어 있다. 결과를 제7도에 나타내었다.
[실시예 8]
내한성 트리코데르마의 배양 여액의 항진균 활성의 안정성을 연구하기 위하여, 농축 단계를 생략하는 것을 제외하고 실시예 7의 방법에 따라 CHS 861 (ATCC 74015)의 배양 여액을 준비하였다.
여액의 희석액을 만들어, 여액을 필터-또는 오토클레이브-멸균한후에 GYE 한천 배지에 첨가하였다.
직경이 약 4mm인 sLTB 플러그를 소정량의 배양 여액이 들어있는 조그만 플레이트의 중심에 놓고 10℃에서 2주간 배양하였다.
배양 여액의 존재하에서의 sLTB의 방사형 생육을 두개의 횡단 측정값의 평균으로서 측정하였다.
필터-멸균된 여액과 오토클레이브-멸균된 여액의 항진균 활성에 있어서 현저한 차이는 관찰되지 않았다.
액체 배양에서 내한성 트리코데르마에 의해 생산된 항진균 활성을 갖는 물질은 제8도에 나타낸대로 열처리에 대해 민감하지 않았다.
[실시예 9]
내한성 트리코데르마와 바이오타입 603(ATCC 74018)에 대하여 백색 곰팡이병으로부터 식물을 보호하는 능력을 연구하였다.
실시예 1에 기재된 방법에 따라 CHS 861(ATCC 74015) 또는 바이오타입 603(ATCC 74018)로 피복시킨 겨울 밀 종자를 발아시키고 3엽 단계까지 생육시켰다.
이어, 식물 주위에 sLTB가 번식된 호밀 낟알을 쌓아놓으므로써 밀 묘목을 백색 곰팡이병 진균에 노출시켰다.
제9도에 나타낸대로 처리한 식물을 차갑고(약 4℃ ), 어둡고 습기가 찬 (약 100% 상대습도)환경하에 8주간 놓아두었다.
겨울 밀 생존 시험의 결과가 제9도에 나타나있다.
극히 견디기 어려운 조건 때문에, sLTB나 진균 기생체에 노출시키지 않은 대조군을 비롯하여 모든 처리군에서 어느 정도의 치사율이 관찰되었다. 겨울 밀 묘목을 sLTB로 처리한 경우에 생존하는 것이 없었다.
묘목을 미리 바이오타입 603(ATCC 74018)이나 CHS 861(ATCC 74015)로 보호한 경우에는 겨울 밀 묘목의 생존율이 현저하게 증가되었다.
CHS 861(ATCC 74015)로 처리된 감염식물과 비교할 때, 바이오타입 603(ATCC 74018)로 처리한 감염식물에서는 치사율이 약간 증가되었지만, CHS 861(ATCC 74015)로 처리한 감염식물과 대조군(sLTB에 노출시키지 않음) 사이에서는 차이점이 관찰되지 않았다.
[실시예 10]
내한성 트리코데르마의 온도범위를 연구하였다.
내한성 트리코데르마 (ATCC 74015)의 콜로니를 오트밀 한천상에 접종하였다. 오트밀 한천은 60g의 분쇄한 귀리 및 12g의 한천을 11의 증류수에 용해시킨 것을 포함한다.
콜로니를 여러 온도에서 보온하였을 때 직경 9cm에 도달할때까지 걸리는 시간을 측정하였다.
결과를 제10도에 나타내었다.
[실시예 11]
내한성 트리코데르마의 pH 범위를 측정하였다. 내한성 트리코데르마 (ATCC 74015)의 콜로니를 오트밀 한천상에 접종시키고 7일후에 pH의 함수로서 방사형 생육을 mm로 측정하였다. 결과를 제11도에 나타내었다.
[실시예 12]
베르티실리움 달리에(Verticillium dahliae), 스클레로티니아 스클레로티오리움(s-clerotinia Sclerotiorium), 스클레로티움 롤프시이(Sclerotium rolfsii) 및 스콜레로티움 세피보룸(Sclerotium cepivorum)의 생욱과 발달에 미치는 내한성 트리코데르마의 영향을 세가지 방법으로 연구하였다.
이중 배양 방법에서는, 상기 병원성 진균의 배양액에서 채취한 직경이 대략 4mm인 플러그와 CHS 861 분리물(ATCC 74015) 및 바이오타입 603(ATCC 74018)에서 채취한 직경이 대략 4mm인 플러그를 PDA플레이트상에 서로 반대 위치에 놓고 약 10℃ 및 23℃에서 보온하였다.
23℃ 및 10℃에서 생육시켰을 때 각각 대략 4일 및 7일 후에 상기 병원성 진균의 생육 및 발달을 완전하게 저지시켰다.
브이. 달리에의 경우에 분생포자기 (포자)가 급격하게 퇴화되고 23℃에서 배양하였을 때 균사는 7일만에 관찰되었다.
미세 맥각은 형성되지도 않았다.
파종법(seeding study)에서는, 각종 발달 단계에서 미세 맥각을 갖는 잘 확립된 브이. 달리에 바이오타입 603(ATCC 74018)의 분생포자기 덩어리를 파종하였다.
바이오타입 603(ATCC 74018)은 새로운 미세 맥각의 발달을 저지시키며 또 이미 형성된 미세 맥각을 퇴화시킬 수 있었다.
죽은 미세 맥각은 어두운 색이 아니라 오히려 초자질이다.
배양 여액법에서는 얇은 막의 배양 여액으로 덮인 PDA 플레이트에 브이. 달리에, 에스. 스클레로티오룸, 에스. 롤프시이, 에스. 세피보룸등의 플러그를 놓았다.
배양 여액은 10일된 배양액을 0.45㎛ 필터에 통과시켜 얻었다.
브이. 달리에, 에스. 스클레로티오룸,에스. 롤프시이, 바이오 타입 603(ATCC 74018)의 배양 여액 1ml로 피복된 PDA 플레이트에 놓았을때 전혀 생육하지 못하였다.
이러한 연구 결과는 CHS 861(ATCC74015) 및 바이오 타입 603(ATCC 74018)이 모두 브이. 달리에, 에스. 스클레로티오룸, 및 에스. 롤프시이의 훌륭한 생물억제제이며, 에스. 세피보룸의 양호한 생물 억제제라는 것을 시사한다.
베르티실리움 달리에는 많은 중요한 곡물과 과일 그리고 견과류 나무, 예를 들면 목화, 감자, 토마토, 딸기, 크루시퍼, 아몬드, 사과, 살구, 체리, 승도 복숭아, 올리브, 복숭아, 배, 피스타키오, 페르시몬, 플럼, 프룬, 호도등에 시듦병을 일으킨다. 브이. 달리에는 느리게 생육하지만 분생포자기와 미세 맥각은 극히 번식력있게 생산하여 이들이 식물의 수관을 막히게 하여 숙주 식물을 시들게하고 죽게한다.
브이. 달리에의 분생포자기와 미세맥각을 빠르게 퇴화시킬수 있는 내한성 트리코데르마의 능력은 식물의 막힘을 완화시켜 생기를 되찾게 할 수 있다.
[실시예 13]
병원성 진균의 통합성에 미치는 내한성 트리코데르마의 영향을 조사하였다.
일련의 실험에 있어서, 브이. 달리에의 전체적인 구조와 형태에 미치는 내한성 트리코데르마의 영향을 연구하였다.
제12도에서, 좌측의 콜로니는 감염되지 않은 건강한 브이. 달리에 이다.
오른쪽의 콜로니는 CHS 861로 감염된 브이. 달리에이다.
브이. 달리에에 대한 CHS 861의 병원성 효과는 오른쪽 콜로니로부터 육안으로 명확하게 볼수 있는데, 오른쪽 콜로니는 무처리 대조에 비해 어두운 외관을 상실하고 있다.
다른 실험에서는 LTB와 브이. 달리에의 균사에 미치는 내한성 트리코데르마의 영향을 검사하였다.
제13도에서, 트리코데르마 바이오타입 901이 LTB의 균사에 침투하는 것이 간섭 광학 현미경 사진에 의해 보여지고 있다.
이 도면에서, 보다 좁은 균사는 트리코데르마의 것이고 보다 넓은 것은 LTB의 것이다
제14도에서는, 트리코데르마 바이오타입 603이 브이. 달리에의 균사에 기생하는 것을 간섭 광학 현미경 사진으로 보여주고 있다.
이 도면에서, 브이. 달리에의 균사는 내한성 트리코데르마에 의해 완전하게 기생당하고 있다.
또 다른 실험에서는, 미세맥각과 균사의 구조적 통합성에 미치는 내한성 트리코데르마의 영향을 검사하였다.
제15도는 건강한 브이. 달리에 미세맥각의 간섭 광학 현미경 사진을 보여준다. 건강한 맥각은 여기 나타낸대로 전형적으로 어둡다.
제17도는 내한성 트리코데르마에 노출시킨후 브이. 달리에의 미세 맥각이 퇴화된 것을 보여주는 간섭 광학 현미경 사진이다.
제16도는 내한성 트리코데르마에 의해 분해된 브이. 달리에의 균사를 보여주는 간섭 광학 현미경 사진이다.
[실시예 14]
진균성 병원균을 예방하는데 유용한 21kDa 열안정성 단백질[이하, 21KDa 살진균성 단백질이라 한다]을 이형의 숙주 세포내에서 클로닝 및 발현시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서는, 21KDa 살진균성 단백질을 코딩하는 유전자를 동정하는데 유용한 핵산 프로브를 다음과 같은 방법으로 제공할 수 있었다.
통상의 실험실 기술로 21kDa, 살진균성 단백질을 정제할 수 있다.
이런 기술에는 황산암모늄 침전법, 폴리에틸렌 글리콜 처리법, 겔 여과 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피가 포함되는데 이들에만 국한되는 것은 아니다.
특히 바람직한 구현예에서는, 약 10일된 배양액을 0.45㎛ 필터에 통과시켜 여과하여 트리코데르마 배양 여액을 얻는다.
21kDa 살진균성 단백질은 미세 등급의 세파덱스 G-75 겔 여과 컬럼을 통하여 분획화 할 수 있다.
sLTB의 생육을 억제하는 것으로 확인된 분획을 동정한다.
단백질은 폴리에틸렌 글리콜 처리법으로 농축시키고 HPLC로 정제한다.
얻어진 단백질은 명료한 아미노산 서열을 얻기에 충분한 정도로 순수하다.
당업자에게 주지된 기술을 이용하여 21kDa 살진균성 단백질의 최소한 일부의 아미노산 서열을 결정할 수 있다.
예를 들면, 21kDa 살진균성 단백질의 N-말단 아미노산 서열은 어플라이드 바이오시스템스사(Applied Biosystems Inc.) 470A 단백질 시퀀서를 이용하여 얻을 수 있다.
확인된 아미노산 서열을 기초로 하여, 아미노산 서열을 코딩할 수 있는 대응 누클레오티드 서열을 예측할 수 있으며, 예측된 서열을 기초로 하여 핵산을 합성법에 의해 제작할 수 있다. 누
그러나 유전 암호의 충첩 현상 때문에, 아미노산 서열을 기초로 한 누클레오티드 서열의 예측에 의해 여러개의 가능한 누클레오티드 서열이 이끌어내질수 있다.
여러개의 가능한 누클레오티드 서열을 포함하는 상이한 핵산 서열을 집합체를 제작하고, 표지화하고, 21kDa 살진균성 단백질 유전자를 함유하는 DNA라이브러리를 스크리닝하는데 사용할 수 있다.
DNA라이브러리는 표준 기술을 이용하여 내한성 트리코데르마 배양액으로부터 얻을 수 있다.
특히 DNA는 문헌[Junghans and Metzkaff, Bio Techniques 8 : 176(1990) ] 에 기술된대로 트리코데르마로부터 얻을 수 있다.
얻어진 DNA의 크기는 예를 들면 문헌[Maniatis et sl,. Molecular Cloning, Clod S-pring Harbor, N.Y. 1982 또는 Schlief et al,. Practiced Methods in Molecular Bilolgy, Springer-Verlag, Inc. N. Y. 1981]에 기재된대로 통상의 겔 전기 영동법에 의해 분석할 수 있다.
트리코데르마 배양액으로부터 분리된 DNA는 제한 효소로 부분 소화시켜 단편 푸울을 만들고 이로부터 구조 유전자를 클로닝할 수 있다.
사용되는 제한 효소는 얻고자 하는 DNA단편의 크기에 의해 결정된다.
바람직한 제한 효소는 SauIIIA이다.
그 DNA의 비필수적 영역내에 DNA 단편을 보유하고 숙주 세포내에서 복제할 수 있는 적절한 벡터를 DNA 단편에 연결시켜 재조합 DNA 분자의 라이브러리를 만들 수 있다.
본 발명과 관련하에, 사용하기 적절한 벡터는 숙주 세포내로 옮겨지거나 숙주 세포를 감염시킬수 있고 숙주 세포내에서 복제할 수 있는 플라스미드나 비루스(예를 들면 박테리오파지)이다.
본 발명의 바람직한 구현예에서는, 총 RNA로부터 분리한 mRNA를 사용하여 게놈 DNA 라이브러리 대신에 cDNA 라이브러리를 제작하였다.
총 RNA는 통상의 실험실 기술을 이용하여 트리코데르마 배양액으로부터 얻을 수 있다.
총 RNA로부터 mRNA를 분리하는 것은 mRNA의 3' 말단에 폴리 A 꼬리가 존재하는 것을 이용한다.
3' 꼬리는 다른 RNA로부터 mRNA를 분리하는데 사용된다.
분리는 mRNA의 폴리 A 꼬리가 셀룰로오스 컬럼상의 T 잔기에 결합하는 올리고 dT 셀룰로오스 컬럼 크로마토그래피에 의해 달성된다.
미결합 RNA는 컬럼으로부터 세척해내고, mRNA는 A-T 이중나선을 불안정하게 만드는 통상의 완충액을 이용하여 용출시킬 수 있다.
이어 분광측정법으로 RNA 농도를 측정한다.
mRNA 제제의 통합성, 즉 이것이 플-랭쓰의 것인가 아니면 단순히 3' 폴리 A 꼬리를 갖는 작은 단편인가 하는 것은 mRNA의 생체내 해독에 의해 결정할 수 있다.
플-랭쓰 mRNA를 선택하고 cDNA라이브러리 제작에 사용한다.
mRNA로부터 cDNA 라이브러리를 제작할 수 있는 방법은 당업자에게 주지되어 있다. 예를 들면 상기한 마니아티스등의 방법은 사용할 수 있다.
구체적으로는, 역전사효소를 이용하여 분리 mRNA를 cDNA 분자의 제1 가닥의 합성 주형으로 사용할 수 있다.
이어서, cDNA 분자의 제1가닥을 DNA폴리머라 제I같은 효소를 이용하여 cDNA의 제2가닥의 합성 주형으로 사용할 수 있다.
cDNA 라이브러리중에서 21kDa 살진균성 단백질을 코딩하는 누클레오티드 서열을 찾기 위하여, 21kDa 살진균성 단백질의 부분 아미노산 서열에 기초를 두고 예측된 누클레오티드 서열을 함유하는 상보적 핵산 탐침을 이용한다. 또는, 각각 실험용 동물 또는 하이브리도마내에서 살진균성 단백질에 대한 다중클론성 또는 단일클론성 항체를 생산하여, 21kDa 살진균성 단백질을 생산하는 형질전환 숙주 세포를 동정하는데 사용한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서는, 아미노산 서열 분석에 의하여, 정제된 21kDa살진균성 단백질의 아미노산 서열중 최소한 일부를 결정한다.
예측된 누클레오티드 서열을 기초로 한 핵산 탐침을 통상의 실험실 기술에 따라 제작할 수 있다.
제작하고자 하는 서열을 형성하는데 있어서는 여러가지 전략을 채택할 수 있다. 여러 위치에서 누클레오티드가 명확하지 않은 경우에는, 모든 코돈의 조합을 나타내는 누클레오티드 혼합물을 합성하므로써 불명료성을 회피할 수 있다.
그러나, 코돈 불명료성이 지나치게 클때에는 다른 전략을 이용할 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서는, 각 군에서의 명료성이 최소로 유지되고 각 군간에 있어서 서열의 조합이 모든 가능한 코딩 조합을 나타낼 수 있도록 혼합 올리고누클레오티드 군을 합성하였다.
예를들면, 각 서열이 약 15 ~20bp를 포함하고 모든 가능한 코돈 조합을 나타내는 짧은 핵산 서열의 집합체를 만들 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서는, 긴 핵산 서열, 예를 들면 약 30 ~ 약 60bp를 함유하고 부정합 염기쌍이 최소가 되도록 하여 긴 핵산 서열을 설계할 수도 있다.
이들 누클레오티드의 합성은 예를 들면 문헌[Suggs et al,. Proc. Natl. Acad. Sc-i., 78 : 6613 ~ 6617(1981), Ullrich et al., EMBO J., 3 : 361 ~364(1984), Shahet al., Science, 233 : 478 ~ 481(1986) 및 Lathe, R., J. Mol. Bio., 183 : 1 ~12(1985), Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260 : 2605 ~ 2608 1985), Martin Ca-stro, Nucleic Acid Res. 13 : 8927 ~ 8938(1985)]에 예시되어 있다.
본 발명의 또다른 구현예에서는 불명료한 코돈 위치에서, 이중 나선 형태를 불안정화시키지 않으면서 천연의 염기와 염기쌍을 이룰 수 있는 염기 유사체를 이용하여 탐침을 설계할 수 있다.
특히, 2-데옥시아데노신은 A/C 또는 G/T에서 염기쌍을 이룰 수 있기 때문에 사용 가능하다.
염기 유사체 사용에 의한 불명료함과 불안정성은 이중나선 형성에 문제를 일으킬만큼 크지 않다.
또는, 하이브리드화 잠재력이 큰 염기유사체, 예를 들면 2-아미노-2-데옥시아데노신을 탐침내의 정상적인 염기 대신에 사용할 수 있다.
이 2-아미노 2-데옥시아데노신은 T잔기와 쌍을 이룰 수 있고, 정상적인 2개의 수소 결합 대신에 세개의 수소 결합을 이룰수 있다.
이 결합은 이중 나선의 안정성을 부가시켜 코돈의 중첩 위치에서의 불명료성에 의한 파괴적 효과를 보상한다.
이런 방법을 둘 또는 그 이상 도입하는 것도 탐침을 만드는 접근 방법이다.
이런 기술을 어떻게 조합시키든 최종 결과는 당해 유전자에 특이적인 핵산 서열이 될 것이다.
21kDa 살진균성 단백질 유전자를 검출하기 위한 핵산 탐침을 예를 들면 3' 또는 5' 말단에 [32P] 포스페이트로 표지화하거나 비오틴 분자로 표지화하여 극히 소량의 유전자를 검출하도록 변형시킬수 있다.
표지화 방법은 예를 들면 문헌[Rig by et al., J. Mol. Biol., 113 : 237 ~251(1977), Murasugi et al., DNA. 3 : 269 ~ 277(1984) and Haas et al., Nucleic Acid R-es., 14 : 3976(1986)]에 기재되어 있다.
방사성 표지화는 예를 들면 애머샴 코포레이션 (Amershsam Corporation. Arlington H-eights, III.)이나 뉴잉글랜드 누클에어 (New England Nuclear, Bos ton, Mass.)로부터 시판되는 3 또는 5 말단 표지화 키트를 이용하여 제작자의 지시에 따라 수행할 수 있다.
이어, DNA 라이브러리중의 21kDa 살진균성 단백질 유전자를 표지화 탐침과 하이브리드화시켜 동정할 수 있다.
본 발명의 구제적인 구현예에서, 상술한 것과 같은 트리코데르마 cDNA 라이브러리를 함유하는 재조합 람다 파지는 [32P]-표지화 21kDa 살진균성 단백질 특이적 올리고뉴클레오티드 탐침을 이용하여 실질적으로 상술한 마니아티스등의 방법에 따라 스크리닝 한다.
하이브리드화는 37℃ ~ 42℃에서 16 ~ 24시간 동안 행하며, 이어 필터를 42℃ 또는 65℃에서 세척한다.
21kDa 살진균성 단백질 유전자를 보유하는 하이브리드 벡터를 동정하기 위해 막의 자동 방사성 사진을 찍는다.
21kDa 살진균성 단백질 특이적 탐침과 양성 반응을 하는 DNA를 분리하고, 21kDa 살진균성 단백질 유전자를 분리하여 다른 벡터에 연결시킬 수 있다.
예를들면, 람다 gt11 파지 벡터가 사용된 경우에는 cDNA가 파지 벡터의 EcoR I 부위에 삽입되어 있으므로 EcoR I 소화에 의해 목적 DNA를 벡터로부터 제거할 수 있다.
이어 21kDa 살진균성 단백질을 코딩하는 유전자를 다량으로 생산하기 위해 또 다른 플라스미드에 서브클로닝 한다.
본 발명의 구체적인 구현예에서는, 유전자를 플라스미드 pBR 322에 서브 클로닝하여 이. 콜리 (E. Coli)내에 유지시켰다.
21kDa 살진균성 단백질 유전자를 함유하는 삽입물을 갖는 pBR 322 플라스미드를 함유하는 이. 콜리 세포를 증식시켜 다량의 유전자를 얻는다.
이 DNA는 당업자에게 주지되어 있는 통상의 기술을 이용하여 형질 전환체 세포로부터 추출해낼 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서는, 21kDa 살진균성 단백질을 함유하는 DNA 단편을 유전자가 적절한 프로모터의 통제하에 놓일수 있도록 적절한 프로모터에 연결시킬 수 있다.
적절한 프로모터란 형질 전환된 숙주내에서 기능을 발휘할 수 있는 것이다.
예를 들면, 형질 전환시키고자 하는 숙주가 식물인 경우에는, 21kDa 살진균성 단백질 유전자는 노팔린 합성용 프로모터인 Pnos같은 식물 프로모터에 연결시킬 수 있고; 형질 전환시키고자 하는 숙주가 세균인 경우에는, 21kDa 살진균성 단백질 유전자는 이. 콜리의 trp, lac 또는 프로모터 같은 세균 프로모터에 연결시킬 수 있다.
또는, 21kDa 살진균성 단백질을 콜리플라우워 모자이크 비루스의 1S 및 35S 프로모터 같은 비루스 프로모터에 연결시킬 수 있다.
프로모터는 21kDa 살진균성 단백질 유전자에 기능적으로 연결되어야만 한다. 본 발명에 있어서, 기능적으로 연결이란 프로모터가 구조 유전자에 대하여 적절한 위치에 놓여있어 프로모터와 유전자가 형질 전환 숙주 세포내에서 유도시에 생물학적으로 활성인 21kDa 살진균성 단백질을 높은 수준으로 전사 및 해독할 수 있게 끔 적절한 방향, 위치 및 판독 프레임에 놓이게 되는 것을 의미한다.
프로모토와 프로모터 주변의 DNA 서열의 선택은 형질 전환 숙주내에서의 발현에 미치는 상기 서열의 영향에 의해 결정된다.
본 발명의 또 다른 구체적인 구현예에서는, 21kDa 살진균성 단백질 유전자를 또 다른 구조 유전자에 연결시켜 형질 절환 숙주내에서 융합 단백질을 발현시킬 수 있다. 이러한 융합 단백질에는 제2폴리펩티드에 고유적으로 결합된 21kDa 살진균성 단백질이 포함된다.
예를 들면, 융합 단백질은 살진균성 단백질에 연결된 이. 콜리 단백질 β-갈락토시다제의 일부일 수 있다.
살진균성 단백질이 융합 단백질로 발현되는 경우에는, 융합 단백질을 코딩하는 유전자는 적절한 벡터내의 적절한 프로모터에 기능적으로 연결되어야만 한다.
또한, 21kDa 살진균성 단백질을 코딩하는 유전자는 제2폴리펩티드와 동일한 판독프레임내에 있어야 한다.
적절한 프로모터에 기능적으로 연결된 21kDa 살진균성 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 벡터는 통상의 기술을 이용하여 적절한 숙주를 형질 전환시키는데 이용될 수 있다.
적절한 형질 전환 숙주는 21kDa 살진균성 단백질 DNA 서열을 발현시킬 수 있는 것이다.
바람직한 구현예에 있어서, 적절한 형질 전환 숙주는 형질 전환전에는 21kDa 살지균 단백질을 유의할 만한 양으로 생산할 수 없다가 형질 전환후에는 상당량의 21kDa 살진균성 단백질을 생산할 수 있게된다.
이러한 숙주는 식물, 세균 또는 진균일 수 있다.
식물 숙주는 담배류 또는 풀 같은 1년생 식물이거나 또는 다년생 식물일 수 있다. 세균은 어떤 종류의 세균도 무방하며, 예를 들면 이.콜리, 바시러스(Bacillus) 속균주 또는 아그로박테리윰(Agrobacterium)속 균주일 수 있다.
진균은 락타리우스(Lactarius)속, 아스퍼질러스(Aspergillus)속 및 트리코데르마(Trichoderma)속으로 이루어진 군에서 선택된다.
형질 전환된 세포는 21kDa 살진균성 단백질을 발현시키기 위하여 적절한 배지내에서 배양한다.
21kDa 살진균성 단백질은 표준 방법을 이용하여 분리할 수 있다.
얻어진 단백질 제제는 일반적으로 다른 트리코데르마 단백질을 함유하지 않는다.
내한성 트리코데르마와 관련된 17kDa 및 5~10kDa 살진균성 단백질을 정제된 단백질 제제로부터 클로닝 및 발현하기 위해 동일한 방법을 사용할 수 있다.
17kDa 단백질은 HPLC를 이용하는 겔 여과에 의해 다음과 같이 내한성 트리코데르마 배양여액으로 부터 정제할 수 있다.
특히 바람직한 구현예에서는 C-18 겔 여과 컬럼 사용된다.
5 ~ 10 kDa 항진균 분자는 다음과 같이 내한성 트리코데르마 배양 여액으로부터 정제할 수 있다.
먼저 단백질을 상술한대로 한외여과에 의해 정제하고 HPLC를 이용한 겔 여과에 의해 더 정제한다.

Claims (38)

  1. 생물학적으로 순수한 내한성 CHS 861(ATCC 74015). 트리코데르마(Trichoderma)분리물.
  2. 청구항 제1항의 트리코데르마 분리물의 농학적으로 유효한 양을 식물 또는 식물 조직에 적용함을 특징으로 하는 식물 또는 식물 조직의 생육과 발달을 촉진하는방법.
  3. 청구항 제1항의 트리코데르마 분리물의 농학적으로 유효한 양을 진균성병원균으로부터 보호하고자 하는 식물 또는 식물 조직에 적용함을 특징으로 한는 식물병의 예방방법.
  4. 리도밀(Ridomil) 또는 리도일-유사 살충제와 혼합된 청구항 제1항의 트리코데르마 분리물의 농학적으로 유효한 양을 진균성 병원균으로부터 보호하고자 하는 식물 또는 식물 조직에 적용함을 특징으로 하는 식물병의 예방방법.
  5. 청구항 제1항의 트리코데르마 분리물의 농학적으로 유효한 양을 진균성 병원균에 감염된 식물에 적용함을 특징으로 하는 식물병의 방제방법.
  6. 제5항의 식물병의 방제방법에 있어서, 상기 진균성 병원균은 아르밀라리아 멜레아(Armillaria mellea), 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 스클레로티니아 보레알리스(Sclerotinia borealis). 후사리움 니발레(Fusarium nivale). 티풀라 에스피피.(Typhula spp), 보트리티스 시네레아(Botrytis cinerea), 피티움 에스피피.(Pythium spp.), 맥각성 저온 바시디오미세테(basidiomycete) 및 저온 바시디오미세테(basidiomycete)로 이루어진 군에서 선택됨을 특징으로 하는 식물병의 방제 방법.
  7. 청구항 1항의 내한서 트리코데르마 분리물의 변이주에 있어서 트리코데르마 분리물이 민감한 살충제에 대하여 내성을 나타냄을 특징으로 하는 변이주.
  8. 청구항 1항의 내한성 트리코데르마 분리물의 변이주에 있어서 베노밀 내성임을 측징으로 하는 변이주.
  9. 제8항의 변이주에 있어서 바이오타입 453(ATCC 74016), 바이오타입 603(ATCC 74018) 및 바이오타입 901(ATCC 74017)로 이루어진 군에서 선택됨을 특징으로 하는 변이주.
  10. 청구항 제8항의 변이주에 있어서 바이오타입 453(ATCC 74016)임을 특징으로 하는 변이주.
  11. 청구항 제8항의 변이주에 있어서 바이오타입 603(ATCC 74018)임을 특징으로 하는 변이주.
  12. 청구항 제8항의 변이주에 있어서 바이오타입 901(ATCC 74017)임을 특징으로 하는 변이주
  13. 청구항 제7항의 변이주의 농학적으로 유효한 양을 식물 또는 식물 조직에 적용함을 특징으로 하는 식물 또는 식물 조직의 생육 촉진방법.
  14. 청구항 제7항의 변이주의 농학적으로 유효한 양을 진균성 병원균으로부터 보호하고자 하는 식물 또는 식물 조직에 적용함을 특징으로 하는 식물병의 예방방법.
  15. 베노밀 도는 베노밀-유사 살충제와 혼합된 청구항 제7항의 변이주의 농학적으로 유효한 양을 진균성 병원균으로부터 보호하고자 하는 식물 또는 식물 조직에 적용함을 특징으로 하는 식물병의 예방방법.
  16. 리도밀 또는 리도밀-유사 살충제와 혼합된 청구항 제7항의 변이주의 농학적으로 유효한 양을 진균성 병원균으로부터 보호하고자 하는 식물 또는 식물 조직에 적용함을 특징으로 하는 식물병의 예방방법.
  17. 청구항 제7항의 변이주의 농학적으로 유효한 양을 진균성 병원균에 감염된 식물 또는 식물 조직에 적용함을 특징으로 하는 식물병의 방제 방법.
  18. 제17항의 식물병을 방제하는 방법에 있어서, 상기 진균성 병원균은 아르밀라리아 멜레아, 리족토니아 솔라니, 스클레로티니아 보레알리스, 후사리움 니발레, 티풀라 에스피피. 보트리티스 시네레아, 피티움 에스피피. 맥각성 저온 바시디오미세테 및 저온 바시디오미세테로 이루어진 군에서 선택됨을 특징으로 하는 식물병의 방제방법.
  19. 티플라 에스피피. 에스 보레알리스, 비. 시네레아, 저온 바시디오미세테 및 맥각성 저온 바시디오미세테로 이루어진 군에서 선택된 진균의 생육을 저지하며, 분자량이 약 17kDa이고. 내한성 트리코데르마와 연관되어 있으며, 생물학적으로 순수한 형태임을 특징으로 하는 진균성 병원균을 예방하는데 유용한 열안정성 단백질.
  20. 티풀라 에스피피. 에스 보레알리스, 비. 시네레아, 저온 바시디오미세테 및 맥각성 저온 바시디오미세테로 이루어진 군에서 선택된 진균의 생육을 저지하며, 분자량이 약 21kDa이고, 내한성 트리코데르마와 연관되어 있으며, 생물학적으로 순수한 형태임을 특징으로 하는 진균성 병원균을 예방하는데 유용한 열안정성 단백질.
  21. 청구항 제19항 또는 20항의 열안정성 단백질을 함유하는 조성물의 유효한 양을 진균성 병원균으로부터 보호하고자 하는 식물 또는 식물 조직에 적용함을 특징으로 하는 식물병의 예방방법.
  22. 청구항 제19항 또는 20항의 열안정성 단백질을 함유하는 조성물의 농학적으로 유효한 양을 진균성 병원균에 의해 감염된 식물 또는 식물 조직에 적용함을 특징으로 하는 식물병의 방제방법.
  23. 제22항의 식물병을 방제하는 방법에 있어서, 상기 진균성 병원균은 티풀라에스피피. 에스 보레알리스. 비. 시네레아, 저온 바시디오미세테 및 맥각성 저온 바시디오미세테로 이루어진 군에서 선택됨을 특징으로 하는 식물병의 방제방법.
  24. 베노밀 또는 베노밀-유사 살충제와 혼합된 청구항 19항 또는 20항의 열안정성 단백질을 함유하는 조성물의 농학적으로 유효한 양을 진균성 병원균으로부터 보호하고자 하는 식물 또는 식물조직에 적용함을 특징으로 하는 식물병의 예방방법.
  25. 리도밀 또는 리도밀-유사 살충제와 혼합된 청구항 19항 또는 20항의 열안정성 단백질을 함유하는 조성물의 농학적으로 유효한 양을 진균성 병원균으로부터 보호하고자 하는 식물 또는 식물 조직에 적용함을 특징으로 하는 식물병의 예방방법.
  26. 살충제와 혼합된 청구항 제7항의 변이주의 농학적으로 유효한 양을 진균성 병원균으로부터 보호하고자 하는 식물 또는 식물 조직에 적용함을 특징으로 하는 식물병의 예방방법.
  27. 살충제와 혼합된 청구항 제7항의 변이주의 농학적으로 유효한 양을 진균성 병원균에 감염된 식물 또는 식물 조직에 적용함을 특징으로 하는 식물병의 방제방법.
  28. 제27항의 식물병의 방제 방법에 있어서, 상기 살충제는 베노밀 또는 베노밀-유사 살충제임을 특징으로 하는 식물병의 방제방법.
  29. 제27항의 식물병의 방제방법에 있어서, 상기 살충제는 리도밀 또는 리도밀-유사 살충제임을 특징으로 하는 식물병의 방제방법.
  30. 제5항 또는 17항의 식물병의 방제방법에 있어서, 진균성 병원균은 베르티실리움 달리에, 스클레로티니아 스클레로티오리움, 스클레로티움 롤프시이 및 스클레로티움 세피보룸으로 이루어진 군에서 선택됨을 특징으로 하는 식물병의 방제방법.
  31. sLTB의 생육을 저지하고, 분자량이 약 5kDa ~ 약 10kDa이며, 내한성 트리코데르마와 연관되어 있고 분리된 형태로 있음을 특징으로 하는 진균성 병원균을 예방하는데 유용한 항생물질 분자.
  32. 청구항 제31항의 항생물질 분자를 함유하는 조성물의 유효한 양을 진균성 또는 세균성 병원균으로부터 보호하고자 하는 식물 또는 식물 조직에 적용함을 특징으로 하는 식물병의 예방방법.
  33. 청구항 제31항의 항생물질 분자를 함유하는 조성물의 농학적으로 허용되는 양을 진균성 또는 세균성 병원균에 의해 감염된 식물 또는 식물 조직에 적용함을 특징으로 하는 식물병의 예방방법.
  34. 베노밀 또는 베노밀-유사 살충제와 혼합된 청구항 제31항의 항생 물질분자를 함유하는 조성물의 농학적으로 유효한 양을 진균성 또는 세균성 병원균으로부터 보호하고자 하는 식물 또는 식물 조직에 적용함을 특징으로 하는 식물병의 예방방법.
  35. 리도밀 또는 리도밀-유사 살충제와 혼합된 청구항 제31항의 항생물질 분자를 함유하는 조성물의 농학적으로 유효한 양을 진균성 또는 세균성 병원균으로부터 보호하고자 하는 식물 또는 식물 조직에 적용함을 특징으로 하는 식물병의 예방방법.
  36. 제19항에 있어서, 상기 단백질은 기타 다른 트리코데르마 단백질을 본질적으로 함유하지 않는 정제된 형태임을 특징으로 하는 항생물질 분자.
  37. 제20항에 있어서, 상기 단백질은 기타 다른 트리코데르마 단백질을 본질적으로 함유하지 않는 정제된 형태임을 특징으로 하는 항생물질 분자.
  38. 제31항에 있어서, 상기 분자는 기타 다른 트리코데르마 단백질을 본질적으로 함유하지 않는 정제된 형태임을 특징으로 하는 항생 물질 분자.
KR1019930700485A 1990-08-20 1991-08-20 내한성 트리코데르마 KR100204251B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US57027090A 1990-08-20 1990-08-20
US570,270 1990-08-20
PCT/US1991/005891 WO1992003056A1 (en) 1990-08-20 1991-08-20 Cold tolerant trichoderma

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR100204251B1 true KR100204251B1 (ko) 1999-06-15

Family

ID=24278944

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1019930700485A KR100204251B1 (ko) 1990-08-20 1991-08-20 내한성 트리코데르마

Country Status (10)

Country Link
US (1) US5418165A (ko)
EP (1) EP0544811B1 (ko)
KR (1) KR100204251B1 (ko)
AT (1) ATE112138T1 (ko)
AU (1) AU659610B2 (ko)
CA (1) CA2090040C (ko)
DE (1) DE69104370T2 (ko)
MX (1) MX9100741A (ko)
NZ (1) NZ239452A (ko)
WO (1) WO1992003056A1 (ko)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL95066A (en) * 1990-07-12 1996-01-19 Peri Dev Applic 1985 Ltd Fungicidal preparations containing isolate I-259 of trichoderma razionum T-93 and their use against b. Cinera Wes. Sclerotiorum
AUPM365794A0 (en) * 1994-02-02 1994-02-24 Minister for Agriculture & Rural Affairs for the State of NSW, The Biocontrol of take-all using phialophora sp. (lobed hyphopodia)
WO1996028977A1 (fr) * 1995-03-20 1996-09-26 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Filaments fongiques antagonistes des champignons pathogenes constitues par la moisissure des neiges, et agent et methode de lutte contre la moisissure des neiges utilisant ces filaments
SE508838C2 (sv) * 1997-01-21 1998-11-09 Jacques Ricard Fungicid beredning, förfarande för dess framställning samt användning därav
US20050112551A1 (en) * 2003-11-24 2005-05-26 Agouron Pharmaceuticals, Inc. Dual assay for evaluating activity and cytotoxicity of compounds in the same population of cells
US7497947B2 (en) * 2004-04-14 2009-03-03 Embro Corporation Devices for water treatment
DE102005018855B4 (de) * 2005-04-22 2010-01-28 Theta System Elektronik Gmbh Vorrichtung zur Inspektion von Druckererzeugnissen
WO2007110686A2 (en) * 2006-03-28 2007-10-04 Council Of Scientific And Industrial Research A synergistic composition useful as bioinoculant
NZ587233A (en) * 2008-02-14 2012-06-29 Lincoln University Methods and compositions comprising trichoderma atroviride for the biological control of soil borne plant pathogens and promoting plant growth
CA2845931C (en) 2011-09-07 2016-07-12 Embro Corporation Use of moss to reduce disinfection by-products in water treated with disinfectants
US9795809B2 (en) 2013-12-23 2017-10-24 Embro Corporation Use of moss to improve dental health

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE452242B (sv) * 1981-02-19 1987-11-23 Hultman Miljokonsult Behandlingsmedel for att skydda vexter, buskar, tred och liknande mot angrepp av patogena svampar, forfarande for framstellning av behandlingsmedlet jemte anvendning av detta
US4489161A (en) * 1982-10-25 1984-12-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Strain of Trichoderma viride to control fusarium wilt
IL68129A0 (en) * 1983-03-15 1983-06-15 Bio Technology Gen Israel Ltd Fungicidal compositions and method for using them
US4915944A (en) * 1983-03-15 1990-04-10 Yissum Research Development Corp. Of The Hebrew University Of Jerusalem Novel isolate of trichoderma, fungicidal compositions containing said isolate and use thereof
FR2545099B1 (fr) * 1983-04-28 1985-08-23 Santerre Produits Organiques Nouvelle souche de trichoderma harzianum procede d'isolement de cette souche, procede de culture de cette souche, nouveaux peptides produits par cette souche, et application de cette souche et ces nouveaux peptides ou du produit obtenu par le procede de culture comme moyen de lutte biologique sous forme de produit phytosanitaire
IL69368A (en) * 1983-07-28 1990-03-19 Yissum Res Dev Co Fungicidal compositions containing trichoderma harzianum t-35 active against fusarium and method for using them
US4797361A (en) * 1983-10-24 1989-01-10 Lehigh University Microorganism and process
US4828600A (en) * 1987-07-29 1989-05-09 Cetus Corporation Biological inoculant for corn
US4931352A (en) * 1987-10-07 1990-06-05 Merck & Co., Inc. Antifungal fermentation product
US4847284A (en) * 1988-03-23 1989-07-11 Merck & Co., Inc. Antifungal fermentation product and derivatives and compositions thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US5418165A (en) 1995-05-23
DE69104370T2 (de) 1995-05-04
ATE112138T1 (de) 1994-10-15
AU8502491A (en) 1992-03-17
WO1992003056A1 (en) 1992-03-05
NZ239452A (en) 1993-04-28
CA2090040A1 (en) 1992-02-21
EP0544811A1 (en) 1993-06-09
MX9100741A (es) 1992-04-01
AU659610B2 (en) 1995-05-25
CA2090040C (en) 2002-11-26
EP0544811B1 (en) 1994-09-28
DE69104370D1 (de) 1994-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111356761B (zh) 用于植物病原体的生物防治的方法和组合物
RU2127521C1 (ru) Штамм актиномицета streptomyces lydicus для защиты растений от грибковой инфекции, композиция для защиты растений от грибковой инфекции (варианты), способ снижения чувствительности растения к грибковой инфекции (варианты)
KR102078252B1 (ko) 인삼 뿌리썩음병에 대한 길항력을 가지는 바실러스 벨레젠시스 arri17 및 이의 이용
CA2059642C (en) Myconematicide
Amsellem et al. Recent advances in the biocontrol of Orobanche (broomrape) species
US20090175837A1 (en) Method and agent for controlling plant disease using bacteria of genus bacillus
BG105982A (bg) Щам bacillus pumilus за контролирaне на болести по растенията
US20220132862A1 (en) Pseudomonas sp. strain, composition comprising the same, and uses thereof
JP2001503642A (ja) 植物の真菌感染の生物学的コントロール
WO1996029874A1 (en) Use of streptomyces bacteria to control plant pathogens and degrade turf thatch
KR102375337B1 (ko) 브레비바실러스 브레비스 hk544 균주를 이용한 식물병 방제용 조성물
KR100204251B1 (ko) 내한성 트리코데르마
Abada et al. Management of pepper Verticillium wilt by combinations of inducer chemicals for plant resistance, bacterial bioagents and compost
KR100294023B1 (ko) 작물의병해방제용균주,이를함유하는미생물제제및그용도
KR100422457B1 (ko) 길항미생물 버홀더리아 글라디올리 지비-0999 균주, 이를포함하는 미생물제제 및 이를 이용하여 식물의 풋마름병을방제하는 방법
JP2003531603A (ja) 新規のトリコデルマ属微生物菌株を利用した生物学的防除用微生物製剤およびその製造方法
WO2000015761A1 (en) Novel bacterial strains and methods of controlling fungal pathogens
KR100459066B1 (ko) 케토미움 글로보숨 ｆ0142 및 이에 의해 생산된 케토비리딘 ａ 및 ｂ를 이용한 식물병의 생물학적 방제 방법
KR100319135B1 (ko) 식물병해 길항 미생물 제제
US5968504A (en) Fungus Gliocladium catenulatum for biological control of plant diseases
KR100314323B1 (ko) 작물의 병해 방제용 균주, 이를 함유하는 미생물제제 및 그 용도
KR20150079323A (ko) 토양근권세균 슈도모나스 오티티디스 균주 yjr27을 포함하는 식물병 방제 및 식물 생장촉진용 조성물
US20220369646A1 (en) Methods and compositions for bioprotection of tomatoes from clavibacter michiganensis subsp. michiganensis
KR20230105465A (ko) 고추 탄저병과 세균병 방제 및 생육촉진 효과를 가진 다기능 천연식물보호제 개발
AU762764B2 (en) Novel bacterial strains and methods of controlling fungal pathogens

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
N231 Notification of change of applicant
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20110311

Year of fee payment: 13

EXPY Expiration of term