KR100422457B1

KR100422457B1 - 길항미생물 버홀더리아 글라디올리 지비-0999 균주, 이를포함하는 미생물제제 및 이를 이용하여 식물의 풋마름병을방제하는 방법

Info

Publication number: KR100422457B1
Application number: KR10-2000-0066371A
Authority: KR
Inventors: 이재호; 최기현; 최성원; 도기석; 김지태
Original assignee: 주식회사 그린바이오텍
Priority date: 2000-11-09
Filing date: 2000-11-09
Publication date: 2004-03-12
Also published as: KR20020036265A

Abstract

본 발명은 토양으로부터 분리된 막대 모양의 간균인 버홀더리아 글라디올리 (Burkholderia gladioli)GB-0999 균주, 이를 유효성분으로 포함하는 미생물 제제, 및 이를 이용하여 식물의 세균성 병해를 방제하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명에서 제공되는 버홀더리아 글라디올리(Burkholderia gladioli) GB-0999 균주는 이를 병원균에 감염된 식물 부위에 적용할 경우에, 일차적으로 병원성 세균의 생육을 억제하고, 이차적으로 적용된 부위에서 정착하면서 병원성 세균의 활성을 지속적이고 원천적으로 억제함에 의해, 보다 더 광범위하고 강력한 항균활성을 나타내므로 식물의 세균성 병해인 풋마름병의 방제에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

길항 미생물 버홀더리아 글라디올리 지비-0999 균주, 이를 포함하는 미생물 제제 및 이를 이용하여 식물의 풋마름병을 방제하는 방법{The antagonist, Burkholderia gladioli GB-0999}

본 발명은 국내의 토양으로부터 분리된 막대 모양의 간균인 버홀더리아 글라디올리(Burkholderia gladioli)GB-0999 균주, 이를 유효성분으로 포함하는 미생물 제제, 및 이를 이용하여 식물의 세균성 병해를 방제하는 방법에 관한 것이다.

국내에서 농작물에 피해를 주는 병해충으로는 4,157여종이 기록되어 있으나, 현재 발생이 확인된 것으로는 1,199종(병 574, 해충 625)으로서, 이들은 농작물의 재배기간 및 저장중 농작물에 기생, 이를 섭취하므로써 농업경제에 막대한 손실을 초래하고 있다.

이러한 병해충에 의한 농작물의 피해를 방지하기 위해 일반적으로 사용되는 것이 유기합성 농약이나, 최근 이들 유기합성 농약의 여러 가지 문제 예를 들어, 안전성의 문제, 오염 문제, 주변 환경 예컨대 농작물 및 토양 등에의 잔류 문제, 및 이로인한 자연생태계의 파괴에 대한 가능성이 제기되면서, 점차 이의 사용에 대한 부정적 시각이 증대되고 있다.

따라서, 이러한 유기합성 농약의 여러 가지 문제점을 보안하기 위해, 보다 더 안전하고 저독성인 유기합성 농약의 개발에 대한 노력이 있어 왔으며, 또한 유기합성 농약에 대한 대안으로서 미생물 제제를 이용한 생물학적 방제 방법이 각국에서 연구되어 왔다. 특히, 최근에 활성화되고 있는 미생물 제제의 개발은 유전공학의 급속한 발전과 연계하여 그 전망이 매우 밝다고 하겠다.

미생물을 이용하여 병해충을 방제한 연구의 역사는 1880년에 독일에서 곰팡이로 딱정벌레목해충을 방제하기 위한 시도 이후 많은 연구가 이루어져서 세계적으로 약 70여종이 미생물 농약으로 실용화되어 있다.

외국에서의 개발 현황을 살펴보면, 미생물 자체를 이용한 생물 농약으로서 많은 연구가 시도되고 있는 바, 이는 미생물 자체를 이용한 병해방제 시도로서, 각종 식물병원균에 대한 증식억제작용, 기생작용, 항생작용 및 포식작용을 나타내는 길항미생물을 이용하는 연구가 대표적이다.

1927년 미국에서 감자 더뎅이병 방제에 방선균을 이용하였으며, 일종의 면역작용을 나타내게 하는 교차보호를 이용한 바이러스 방제, 곰팡이를 이용한 고구마 줄기썩음병 방제에 대한 연구가 1951년 시도되었다.

한편, 해충에 기생하여 조직, 기관 및 해충 자체를 죽이거나, 미생물이 함유하고 있는 독소에 의해 해충을 치사케 하는 각종 천적 미생물을 이용한 연구를 통해, 1921년부터 각종 미생물이 방제에 이용되기 시작하였다.

전세계적으로 현재까지 병충해 방제용 미생물을 이용한 생물농약으로서 실용화된 것으로는 병해방제용이 16종, 해충 방제용이 50여종이 알려져 있으며, 많은 미생물 제제의 실용화가 추진중에 있다.

미생물을 이용한 병해 방제제는 1960년 이후부터 농약의 형태로 실용화되었고, 일본에서는 1962년에 담배 허리마름병에 트리코더마 생균제제를 사용한 것을 시작으로 많은 제품이 시판중에 있다. 그러나, 시판중인 대부분의 제품이 모잘록병 방제용으로 개발되었음이 주목된다.

한편, 국내에서의 개발현황을 살펴보면, 미생물 자체를 이용하여 병해방제용으로 연구된 것으로는 1985년부터 국가연구기관 및 대학의 병리학자를 주축으로 담배의 TMV, Bacterialwilt, 오이의 시들음병, 고추의 역병, 딸기의 시들음병, 눈마름병, 사탕무우의 모잘록병, 벼의 도열병, 잎집무늬마름병 방제 등에 관한 연구가 보고된 바 있고, 해충방제에 미생물을 이용한 연구는 뿌리혹 선충과 솔잎혹파리 방제용 곰팡이 분리, 핵다각체병 바이러스를 이용한 배추흰나비, 세포질 다각체병 바이러스를 이용한 담배나방 연구가 보고된 바 있다.

특히, 보고된 연구 결과중 현재 활용가능성이 높아 우수한 균주로 알려져 있는 고추역병 방제용 바실러스 균주인 AC-1(한국 특허등록 제10-049807호)과 해충방제용 바실러스 튜리기엔시스 균주는 이미 특허등록되어 일부 시판중이며, 오이 덩굴쪼김병 방제용인 비병원성 균주와 각종 작물에 발생되고 있는 흰가루병균 기생균은 특허계류중으로 실용화가 가능한 것으로 간주되고 있다.

본 발명자들은 토양이나 무토양 양액재배 시스템에 사용되는 배지 내에서 보다 더 안정적으로 정착하고 병해 방제 활성이 보다 더 우수한 균주를 분리하기 위한 연구를 계속하여 수행하였으며, 그 결과 국내 토양에서 최초로 분리한 버홀더리아 글라디올리(Burkholderia gladioli) GB-0999 (KFCC-11217) 균주가 농작물의 주요 병해를 일으키는 곰팡이에 대한 방제효과 및 곰팡이에 의한 작물의 주요 병해의 방제 효과를 나타냄을 발견하므로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 식물 병해 방제용 길항미생물 및 이를 포함하는 미생물 제제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 미생물 제제를 이용하여 식물의 풋마름병을 방제하는 방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 길항미생물인 버홀더리아 글라디올리(Burkholderia gladioli) GB-0999 균주 및 이를 유효성분으로 함유하는 미생물 제제를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 감염된 식물체를 상기 미생물 제제를 사용하여 처리하는 것을 포함하는 식물 풋마름병의 방제 방법을 제공한다.

버홀더리아 글라디올리(Burkholderia gladioli)는 일반적으로 난류나 글라디올리스, 양파썩음병, 버섯 갈변병을 일으키는 것으로서 해외에서 보고된 포유동물에 대한 독성이 아직까지 전세계적으로 보고된 바가 없는 세균종이며, 국내에서는 글라디올리스의 목썩음병이 보고되어 있다.

본 발명의 버홀더리아 글라디올리(Burkholderia gladioli) GB-0999 균주는또한 국내의 자연토양에서 분리한 세균으로 각종 식물에 병원성 시험결과로 비병원성임이 확인된 균주이다.

본 미생물 제제는 잿빛곰팡이병, 잘록병, 입고병, 시들음병 및 브라운 패취, 라지 패취 등의 곰팡이성 병해의 주요원인 미생물들에 대해 강한 생육저지효과가 있으며, 특히 난방제 병해인 토마토 풋마름병 병원세균(Ralstonia solanacearum)에 대해 매우 강한 길항효과를 낼 뿐 아니라 기타 다른 작물의 주요 곰팡이성 병해 방제에도 효과적이다. 이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다.

실시예 1 : 길항미생물의 검색 및 선별

병원성 곰팡이로는 잿빛곰팡이병균(Botrytis cineria), 시들음병균(Fusariumsp.), 입고병·잘록병(Pythiumsp.), 고추역병균(Phytophtora capsici), 탄저병균 (Colletotrichum gloeosporiodes), 브라운패취(Rhizoctonia solaniAG1-1A), 라지패취(Rhizoctonia solaniAG2-2Ⅳ)의 10종과 병원성 세균으로는 토마토 풋마름병균 (Ralstonia solanacearum), 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas vesicatoria)의 2종에 대하여 길항 미생물을 탐색하였다.

상기의 공시 병원성 미생물에 대한 길항활성을 갖는 미생물을 분리하기 위해서, 경기 및 강원도 지역의 밭토양과 삼림토양을 계절별로 토양시료를 채취하였다. 길항균을 분리하기 위해 통상의 삼중층평판법을 이용했다. 양질의 밭토양 250g에 2배량의 증류수를 넣고 가압멸균시킨 다음, 거즈를 이용하여 여과했다. 여액을 증류수를 사용하여 1ℓ로 조정한 다음 한천 15g를 용해하고 30㎖용 시험관에 10㎖씩 분주한 다음, 통상의 방법으로 가압멸균하여 50℃의 항온수조에 보관했다. 이어서 채취한 토양시료 1g를 멸균 생리식염수 100㎖에 잘 현탁한 다음, 현탁액 2-3방울을 상기 시험관에 넣고 잘 혼합한 후, 곧바로 페트리디쉬에 부어 고화시켰다. 고화시킨 페트리디쉬 상에 한천용액 5㎖를 분주하여 고화시켰다. 다음, 계대배양중인 사면배지로부터 식물병원성 미생물의 포자현탁액(1×10⁵cfu/㎖)을 만들고, 이를 50℃ 항온기에 준비된 감자한천배지 10㎖에 2-3방울 첨가하고 잘 혼합한 후에 상기의 페트리디쉬에 다시 분주하여 삼중층평판배지를 제조했다. 제조한 평판배지를 30℃ 항온기에서 3-7일간 배양하고, 대상 식물 병원성 미생물에 대한 길항성(투명환의 형성으로 판단)을 조사한 다음, 우수한 미생물을 통상의 방법으로 순수분리하고 일반세균 배양용 배지(Nutrient Broth)를 이용하여 배양한 다음, 통상의 대칭배양법과 투명환직경을 조사하고, 특이적으로 식물 세균병해에 대하여 길항력이 높으면서 조사한 식물 곰팡이성 병해에 대하여 모두 상당한 길항활성을 보이는 길항미생물 GB-0999를 선별하였다(한국종균협회, 2000.9.25. 기탁, 수탁번호 KFCC-11217).

실시예 2: 작물의 주요병해를 일으키는 곰팡이에 대한 길항미생물의 동정

실시예 1에서 분리한 GB-0999 균주는 가느다란 막대 형태로 내성포자를 형성하지 않았으며, 세포 지방산 분석과 생리·생화학적 분석을 통하여Burkholderia gladioli로 동정했다(표 1 참조).

표 1. GB-0999 균주의 동정 결과

세포 지방산 분석
Fatty acids	contents	Fatty acids	contents
C14:0	4.4%	C16:0	26.9%
C14:0 3OH/ C16:1 iso I	6.7%	C16:1 w7c/C15:0 iso 2OH	8.4%
C17:0 cyclo	17.3%	C16:1 2OH	<1.0%
C16:0 3OH	4.8%	C18:1 w7c	16.3%
C18:0	1.0%	C19:0 cyclo w8c	9.2%
C18:1 2OH	1.7%
생리 생화학적 분석(API 20NE)
Test	Reactions/Enzymes	Btri K
NO3	reduction of nitrates to nitrites	+
NO3	reduction of nitrates to nitrogen	-
TRP	indole production	-
GLU	acidification	-
ADH	arginine dihydrolase	-
URE	urease	-
ESC	hydrolysis(β-glucosidase)	+
GEL	hydrolysis(protease)	+
PNG	β-galactosidase	+
GLU	glucose assimilation	+
RAR	arabinose assimilation	+
MNE	mannose assimilation	+
MAN	mannitol assimilation	+
NAG	N-acetyl-glucosamine assimilation	+
MAL	maltose assimilation	-
GNT	gluconate assimilation	+
CAP	caprate assimilation	+
ADI	adipate assimilation	-
MLT	malate assimilation	+
CIT	citrate assimilation	+
PAC	phenyl-acetate assimilation	+
OX	cytochrome oxidase	+
동정결과	Burkholderia gladioli

실시예 3 : 각종 식물병원균에 대한 생육저지효과 검정

병원성 곰팡이로는 잿빛곰팡이병균(Botrytis cineria), 시들음병균(Fusarium oxysporum), 입고병·잘록병(Pythium ultimum), 고추역병균(Phytophtora capsici), 탄저병균(Colletotrichum gloeosporiodes), 잔디의 피시움 마름병균(Pythium aphanidermatum), 브라운패취 병원균(Rhizoctonia solaniAG1-1A), 라지패취 병원균(Rhizoctonia solaniAG2-2Ⅳ)의 8종과 병원성 세균으로는 토마토풋마름병균(Ralstonia solanacearum), 고추 세균성 점무늬병(Xanthomonas vesicatoria)의 2종과 대장균(E. coli)의 1종에 대하여 길항 미생물의 항균 활성을 측정하였다. 병원성 곰팡이의 경우 감자한천배지를 살균한 후 50℃의 배지에 각 병원균의 균사, 포자를 혼합 평판하고 배지가 완전히 굳은 다음 길항미생물 배양액을 원심분리한 상등액을 페이퍼디스크(직경 8mm)에 60㎕ 묻힌 후 병원균이 혼합된 페트리디쉬에 올려놓고 각종 병원균의 생육이 잘되는 온도에서 3∼4일 배양했다. 길항미생물이 각종 병원성 곰팡이에 미치는 영향을 저지원의 직경으로 조사하였다. 병원성 세균 및 대장균의 경우에는 육즙한천배지(Nutrient agar)배지 위에 멸균한 0.8% 한천 용액에 병원성 세균 배양액을 혼합하여 평판한 후에 배지가 완전히 굳은 다음 길항미생물을 배양액을 원심분리한 상등액을 페이퍼디스크(직경 8mm)에 60㎕ 묻힌 후 병원균이 혼합된 페트리디쉬에 올려놓고 각 세균의 생육이 잘되는 온도에서 1∼2일 배양했다. 길항미생물이 각 병원성 세균과 대정균에 미치는 영향을 저지원의 직경으로 조사하였다.

표 2.에서 볼 수 있는 바와 같이, 길항미생물 버홀더리아 글라디올리 (Burkholderia gladioli) GB-0999 (KFCC-11217) 균주와 식물 병원균과의 길항효과 검정결과, 잿빛곰팡이병의 원인이 되는 보트리티스 시네리아(Botrytis cineria)에 대하여 생육저지효과를 나타내어 균사생육억제 현상이 높았으며, 작물의 시들음병의 원인이 되는 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 입고병과 잘록병의 원인균 피시움 울티멈(Pythium ultimun), 잔디의 주요 병원성 균인 피시움 마름병균 (Pythium aphanidermatum), 브라운패취 병원균(R. solaniAG1-1A), 라지패취 병원균(R. solaniAG2-2Ⅳ)에 대하여서도 상당한 억제효과를 나타내었다. 풋마름병원 세균과 대장균의 경우, 풋마름병원 세균에는 강한 활성을 나타낸 반면에 대장균에 대한 활성은 없는 선택적인 활성을 갖는 것으로 나타났다.

표 2. 길항미생물 버홀더리아 글라디올리(Burkholderia gladioli) GB-0999의

항균 스펙트럼

검정 대상균	활성크기
세균	E. coli	-
	Ralstonia solanacearum	+++
	Xanthomonas vesicatoria	+
곰팡이	Botrytis cineria	+++
	Colletotrichum gloeosporiodes	++
	Fusarium oxysporum	++
	Phytopthora capsici	++
	Pythium aphanidermatum	+++
	Pythium ultimum	+++
	Rhizoctonia solaniAG1-1A	++
	Rhizoctonia solaniAG2-2Ⅳ	++

+ : Clear zone의 크기 10∼14mm

++ : Clear zone의 크기 15∼17mm

+++ : Clear zone의 크기 18mm 이상

실시예 4 : 길항미생물의 배양 및 제제화

길항미생물 버홀더리아 글라디올리(Burkholderia gladioli) GB-0999를 500ℓ 발효기를 사용하여 배양했다. 생산배지로서, 증류수 1ℓ당 대두분 8g, 옥수수 정분 5g, 제 2인산 나트륨 12g, 황산암모늄 5g, 인산칼슘 3g, 황산마그네슘 1.5g을넣고 잘 섞은 후에 pH를 7.0으로 조절한 액체배지를 제조하여 사용했다. 종배양을 효모엑기스 0.5%, 트립톤 1.0%, 소금 0.5%을 이용하여 삼각플라스크를 사용하여 수행했다.

30℃에서 200rpm으로 12시간동안 진탕배양시킨 종배양물 1∼2ℓ를 30ℓ의 생산배지를 함유하는 50ℓ의 발효기에 접종하고, 30∼32℃에서 100∼150rpm, 0.5∼1vvm, pH 6.8∼7.2의 조건으로 10∼15시간 전배양한 다음, 400ℓ의 생산배지를 함유하는 500ℓ 발효기에 접종하고, 길항활성이 가장 높은 시점(발효개시로부터 20∼28시간)까지 30∼32℃, 100∼150rpm, 0.5∼1vvm, pH 6.8∼7.2의 조건하에서 배양했다.

상기의 배양물 90%에 부재료 혼합 용액(10% soidium alginate, 1% sodium propionate, 5% tweeen 80, 10% polyethylene glycol) 10%를 혼합하여 액제로 제제화 하였다.

실시예 5: 온실내 토마토 풋마름병 방제효과

실시예 1 및 3에서 제조한 길항미생물 GB-0999 균주가 근래에 전국적으로 대발생하여 문제가 되고 있는 토마토 풋마름병 병원세균 랄스토니아 솔라나시아룸(Ralstonia solanacearum)에 대하여 강한 길항활성이 있는지 여부를 확인했다. 온실 내에서 암면 배지를 사용한 양액 재배시에 길항미생물 GB-0999를 주성분으로 하는 미생물 제제의 토마토 풋마름병에 대한 방제효과를 시험한 결과, 100배 희석하여 1주일 간격으로 처리한 경우, 이 병해에 대한 방제 효과(방제가 80%)가 탁월하였으며, 무처리구에 비하여 생육 촉진 효과도 있었다.

실시예 6: 토마토 암면재배 유리농장에서의 길항미생물제제처리에 의한 미생물상의 변화

토마토 풋마름병이 대발생한 수경 재배 농장에 길항미생물 버홀더리아 글라디올리(Burkholderia gladioli) GB-0999 (KFCC-11217)을 이용한 미생물 제제(액제)을 100배 희석하여 1주일 간격으로 점적 관수 시스템을 통하여 암면 배지에 처리하였을 때에 양액 및 암면 배지 내의 토마토 풋마름병원세균의 밀도 감소가 관찰되었다. 3회에 걸친 다른 장소 및 방법으로 처리한 결과 평균 96.3%의 풋마름병원균의 밀도 감소가 관찰되었다(하기 표 3 참조).

표 3. 길항미생물 버홀더리아 글라디올리(Burkholderia gladioli) GB-0999 (KFCC-11217)을 이용한 미생물 제제(액제)의 처리에 의한 토마토 풋마름병원 세균의 밀도 변화

100배 희석처리 회수	병원 세균의 수 (10만 / g)	감소율	비 고
100배 희석처리 회수	처리전	감소율	비 고	처리후
1 회	1180	47	96.0%	암면
2 회	5800	400	93.1%	1주 간격,펄라이트
3 회	830	0.35	99.9%	3일 간격,암면
평 균			96.3%

상기한 바와 같이, 본 발명의 버홀더리아 글라디올리 GB-0999 균주는 식물의 풋마름병을 포함한 세균성 병해에 대해 광범위한 활성을 가질 뿐만아니라, 양액 재배 시스템에서도 우수한 방제활성을 가지므로, 식물의 풋마름병에 대한 유용한 미생물 제제로서 사용될 수 있다.

Claims

식물 병해 방제능을 갖는 길항미생물인 버홀더리아 글라디올리(Burkholderia gladioli)GB-0999 균주(KFCC-11217).
삭제
길항미생물 버홀더리아 글라디올리(Burkholderia gladioli)GB-0999(KFCC- 11217)를 유효성분으로 하는 가지과 식물의 풋마름병(Bacterial wilt) 방제용 살균제.