CN113796392B

CN113796392B - 一种中南鱼藤提取物杀菌剂及其制备方法和应用

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Publication number: CN113796392B
Application number: CN202111155869.XA
Authority: CN
Inventors: 孙然锋; 刘启凤; 胡展; 谢佳
Original assignee: Hainan University
Current assignee: Hainan University
Priority date: 2021-09-29
Filing date: 2021-09-29
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2041-09-29
Also published as: CN113796392A

Abstract

本发明提出了一种中南鱼藤提取物杀菌剂对植物病原真菌的应用，中南鱼藤提取物杀菌剂为中南鱼藤枝叶的甲醇提取物或中南鱼藤枝叶的甲醇提取物的有机溶剂萃取物。本发明的中南鱼藤提取物杀菌剂不仅具有广谱的抗真菌活性，还可对香蕉炭疽病和豇豆白粉病具有好的防治效果，具有低毒性、低残留、绿色环保、成本低的优点，制作过程简单，操作方法易控，可作为植物真菌性病害的杀菌剂，减少化学杀菌剂的使用。因此，中南鱼藤在植物真菌病害防治方面具有潜在的应用价值。

Description

一种中南鱼藤提取物杀菌剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及农药杀菌剂领域，特别涉及一种中南鱼藤提取物杀菌剂及其制备方法和应用。

背景技术

当我国是世界上的农业大国之一，从古至今，农作物一直受到病虫草害等的威胁，时常对农业生产造成严重影响。目前，植物病虫草害以化学防治为主，化学农药的使用在一定程度上减轻了农业病虫害的威胁，但是由于长期不合理应用化学农药，导致环境污染严重、抗药性增强、农药残留和食品安全问题等负面影响日益加重。随着人们生活水平和环保意识的提高，安全绿色高效的生物农药和生物防治技术及理念越来越被人们所推崇。植物源农药具有低毒高效、低残留和绿色环保、易降解等特点，植物源农药产业的发展与防治技术的应用已成为人们关注的焦点。

中南鱼藤又名毒鱼藤、白药根、雷公藤蹄，是豆科鱼藤属中的一种攀援灌木，广泛分布于我国长江以南地区，通常生长于浙江、湖北、湖南、海南、贵州、云南等省市的灌木林或疏林中。中南鱼藤在医学方面常用于治疗游走性关节炎、湿癞、老年阴道炎等。农业方面，中南鱼藤大多应用于三个方面：(1) 用作控释肥料，多用于水稻、辣椒、马铃薯、南瓜、番茄、白萝卜、天冬、火龙果、荔枝、香蕉、百香果、山楂、茶树等植物；(2)抗菌杀虫处理剂，中南鱼藤与其他材料制成的处理剂有较好的杀虫效果，用于防治根结线虫、蛴螬、蚜虫等病虫害，多在水稻、瓜果类蔬菜、果树(贡柑)、板蓝根等上使用，能提高产品的产量及品质，此外，这些处理剂针对园林植物种子进行防霉变处理，能显著提高园林植物成活率；(3)菇类培养基，中南鱼藤被制成香菇、杏鲍菇等菇类的培养基，能促进菇类的生长，提高产量且品质更优。此外，中南鱼藤还可作为一种天然成分的甲醛去除剂以及其与根瘤菌共生体可能在生态修复和农业生产中具有应用潜力。在海南，中南鱼藤有着悠久的使用历史，其为三大传统杀虫植物之一，从中南鱼藤根皮甲醇提取物中分离出了鱼藤酮、12ɑ-羟基鱼藤酮、6-甲氧基黄酮三种化合物，其中鱼藤酮、12ɑ-羟基鱼藤酮表现出良好的杀虫活性。鱼藤酮是从鱼藤属植物中分离出来的一种化合物，具有较好的杀虫活性，用于蚜虫、菜粉蝶幼虫、小菜蛾、孑孓等害虫的防治。目前，对中南鱼藤的研究多在杀虫活性方面，在防治植物病原真菌方面还没有系统的研究。

发明内容

鉴以此，本发明的目的在于提出一种中南鱼藤提取物杀菌剂及其制备方法和应用，解决上述问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种中南鱼藤枝叶提取物杀菌剂的制备方法，包括如下方法：

其中，制备中南鱼藤枝叶的甲醇提取物，包括如下步骤：取中南鱼藤枝叶，剪成9～11cm的枝叶段，于45～55℃干燥后粉碎，得中南鱼藤枝叶粉末；按料液的用量比为(1.5～2.5)g：30mL，在中南鱼藤枝叶粉末中加入质量浓度80～95％的甲醇溶液，搅拌，浸泡48～96h，过滤，加入质量浓度80～95％的甲醇溶液重复浸泡2～4次，过滤，合并滤液，得浸泡液，将浸泡液于45～60℃进行真空浓缩，得中南鱼藤枝叶的甲醇提取物。

或制备中南鱼藤枝叶的甲醇提取物的有机溶剂萃取物，包括如下步骤：

(1)取中南鱼藤枝叶，剪成9～11cm的枝叶段，于45～55℃干燥后粉碎，得中南鱼藤枝叶粉末；按料液的用量比为(1.5～2.5)g：30mL，在中南鱼藤枝叶粉末中加入质量浓度80～95％的甲醇溶液，搅拌，浸泡48～96h，过滤，加入质量浓度80～95％的甲醇溶液重复浸泡2～4次，过滤，合并滤液，得浸泡液，将浸泡液于45～60℃进行真空浓缩，得中南鱼藤枝叶的甲醇提取物；

(2)取步骤(1)所得的中南鱼藤枝叶的甲醇提取物，按用量比为(0.5～1.5) g：10mL加入水，搅拌，得甲醇提取物水溶液，按体积比为1：1.5～2.5加入石油醚、乙酸乙酯或正丁醇反复萃取3～5次，得石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液或正丁醇萃取液，于45～60℃真空浓缩，得石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物或正丁醇相萃取物，即甲醇提取物的有机溶剂萃取物。

本发明提供了中南鱼藤提取物的提取方法，并通过菌丝生长速率法、孢子萌发法、果实接种法、盆栽法，用中南鱼藤甲醇提取物和各相萃取物对9种常见的植物病原真菌进行离体和活体杀菌活性测试。

植物病原菌具体包括：水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)；苹果轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)；小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)；香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)；火龙果溃疡病菌(Neoscytalidium dimidiatum)；茄链格孢菌(Alternaria solani)；辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)；稻瘟病病菌(Magnaportheoryzae)和豇豆白粉病菌(Podosphaera xanthii)。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供的中南鱼藤提取物，对植物病原真菌具有抑制作用，且具有低毒、低残留、绿色健康、成本低、高抑菌活性、制备过程简单等优势，可作为植物真菌性病害潜在的杀菌剂。

本发明提供的中南鱼藤提取物，尤其是甲醇提取物、石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物和正丁醇相萃取物，对植物病原菌具体包括：水稻纹枯病菌 (Rhizoctoniasolani)、苹果轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)、小麦赤霉病菌 (Fusariumgraminearum)、香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)、火龙果溃疡病菌(Neoscytalidiumdimidiatum)、茄链格孢菌(Alternaria solani)、辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)、稻瘟病病菌(Magnaporthe oryzae)或豇豆白粉病菌 (Podosphaera xanthii)，具有不同程度的抑制作用，表现出广谱的抗真菌活性。

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1-中南鱼藤提取物杀菌剂的制备

取新鲜的中南鱼藤枝叶，剪成9cm的枝叶段，采用烘箱于45℃下烘干后，粉碎机粉碎，得中南鱼藤枝叶粉末；按料液的用量比为1.5g：30mL，取中南鱼藤枝叶粉末1.5kg，加入质量浓度80％的甲醇溶液30L，搅拌，浸泡48h，过滤，再次加入质量浓度80％的甲醇溶液重复浸泡2次，过滤，合并滤液，得浸泡液，将浸泡液采用旋转蒸发仪在45℃的真空条件下浓缩，得中南鱼藤枝叶的甲醇提取物1；

取新鲜的中南鱼藤枝叶，剪成10cm的枝叶段，采用烘箱于50℃下烘干后，粉碎机粉碎，得中南鱼藤枝叶粉末；按料液的用量比为2g：30mL，取中南鱼藤枝叶粉末2.0kg，加入质量浓度90％的甲醇溶液30L，搅拌，浸泡72h，过滤，再次加入质量浓度90％的甲醇溶液重复浸泡3次，过滤，合并滤液，得浸泡液，将浸泡液采用旋转蒸发仪在50℃的真空条件下浓缩，得中南鱼藤枝叶的甲醇提取物2；

取新鲜的中南鱼藤枝叶，剪成11cm的枝叶段，采用烘箱于55℃下烘干后，粉碎机粉碎，得中南鱼藤枝叶粉末；按料液的用量比为2.5g：30mL，取中南鱼藤枝叶粉末2.5kg，加入质量浓度95％的甲醇溶液30L，搅拌，浸泡96h，过滤，再次加入质量浓度95％的甲醇溶液重复浸泡4次，过滤，合并滤液，得浸泡液，将浸泡液采用旋转蒸发仪在60℃的真空条件下浓缩，得中南鱼藤枝叶的甲醇提取物3；

按用量比为1.5g：10mL，分别取150g中南鱼藤枝叶的甲醇提取物2，分别溶解于1000mL的蒸馏水中，得甲醇提取物水溶液，按体积比为1：1.5，分别采用石油醚萃取5次、乙酸乙酯萃取5次和正丁醇萃取5次，在45℃真空条件下浓缩，分别得到石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物和正丁醇相萃取物；将中南鱼藤枝叶的甲醇提取物经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取后所剩余的甲醇提取物水溶液混合，再在60℃真空条件下浓缩，得到水相萃取物。

实施例2-体外抗真菌活性测试

采用菌丝生长速率法，对中南鱼藤提取物杀菌剂进行杀菌活性检测。称取定量的中南鱼藤提取物杀菌剂，用DMF充分溶解后，配制成供试药液，将供试药液与马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)混匀，制成提取物浓度为2.00 mg·mL^-1的带药培养基，以相同含量DMF的PDA培养基为对照。病原真菌用直径为0.5cm的打孔器制成菌饼，接入带药培养基中间，设置3个重复。转接好的病原菌置于28℃的恒温培养箱中培养，待对照组菌落直径达到5.0cm以上时，采用十字交叉法测量菌落的直径。菌丝生长抑制率按下式计算：

I(％)＝[(C-T)/(C-0.5)]×100

式中：I表示抑制率，C表示对照组病原菌在培养上的直径，T表示处理组病原菌在培养基上的直径。采用Excel 2019和SPSS 9.0计算中南鱼藤提取物杀菌剂对病原真菌的EC₅₀值。菌丝生长抑制率和EC₅₀值的结果分别如下表1和表 2所示。

表1

表2中南鱼藤枝叶的甲醇提取物2对9种植物病原真菌的EC₅₀测定结果

由上表可知，中南鱼藤提取物杀菌剂对8种植物真菌均具有一定程度的离体抑菌活性，其中，中南鱼藤枝叶的甲醇提取物对其中7种植物病原菌抑制效果均大于60.00％，对香蕉炭疽病菌的抑制效果最为突出，可达80.00％以上；乙酸乙酯相萃取物表现出最好的抑菌活性，其对8种植物病原真菌均有一定程度的抑菌活性，抑制效果50.00％以上，对苹果轮纹病菌的抑制效果可达80.00％以上。

实施例3-香蕉炭疽病菌分生孢子萌发抑制活性测定

称取定量中南鱼藤枝叶的甲醇提取物2、石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、正丁醇相萃取物和水相萃取物，溶于DMF中，配置成供试药液，加入PDA 培养基中充分混匀，制成1.0mg·mL^-1的带药培养基。吸取1.0mL带药培养基置于载玻片上，待凝固后，在培养基表面均匀涂抹香蕉炭疽病菌孢子悬浮液(1×10⁷ cfu·mL^-1)，以含同等比例DMF的无菌水作为对照，每个处理设置3个重复，实验重复3次。处理后的载玻片置于28℃恒温培养箱中培养，对照组孢子萌发率超95.00％后于显微镜下观察各处理组分生孢子萌发情况，每个重复观察3个视野，且记录不少于300个分生孢子的萌发情况，并计算萌发率与相对抑制率，公式如下：

结果如下表3：

由上表可知，石油醚相萃取物与乙酸乙酯相萃取物对香蕉炭疽病菌分生孢子的萌发具有较好的抑制活性，其中乙酸乙酯相萃取物活性最好。

实施例4-对香蕉果实炭疽病的防治效果

称取定量中南鱼藤枝叶的甲醇提取物2、石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物、正丁醇相萃取物和水相萃取物，溶于DMF中，用0.1％吐温-80水溶液稀释成3.20mg·mL^-1的药液。选取成熟度、大小一致、完好无损的香蕉，清洗香蕉自然晾干。将香蕉置于配置好的药液中浸泡10min，以嘧菌酯为阳性对照，嘧菌酯的使用浓度为0.50mg·mL^-1，以含有同等比例DMF的0.5％吐温-80水溶液为空白对照，自然晾干，24h后，喷洒浓度为1×10⁷cfu·mL^-1香蕉炭疽病菌分生孢子悬浮液，将处理过的香蕉置于28℃条件下培养，对照发病后，观察各处理发病情况并分级，试验进行3次，每次试验设置7个重复，其分级标准如下：

0级：无病；

1级：病斑面积占果实面积的<5％；

3级：病斑面积占果实面积的≥6％～10％；

5级：病斑面积占果实面积的≥11％～25％；

7级：病斑面积占果实面积的≥26％～50％；

9级：病斑面积占果实面积的≥50％；

结果如下表4：

由上表可知，中南鱼藤枝叶的甲醇提取物2对香蕉炭疽病的防治效果为 71.11％，乙酸乙酯相萃取物的防治效果可达87.21％，表明本发明提供的中南鱼藤提取物对香蕉炭疽病有较好的防治效果，防治效果与化学杀菌剂嘧菌酯相当，可作为植物真菌性病害的杀菌剂。

实施例5-对豇豆白粉病的防治效果

播种豇豆种子，待到豇豆发芽后于温室中正常培养15天，选取二叶期长势一致的豇豆幼苗作为供试植株。称取中南鱼藤提取物杀菌剂，用少量DMF溶解后，加入0.1％吐温-80水溶液配置成浓度为1.0mg·mL^-1的供试药液备用。用毛笔收集植株上的白粉孢子，配成浓度为1×10⁷cfu·mL^-1的孢子悬浮液备用。将12mL 供试药液用喷雾机均匀喷洒于5株豇豆叶片上，喷药后等药液自然晾干后，将豇豆置于温室中正常培养，24h后喷洒豇豆白粉病孢子悬浮液；喷洒药液及豇豆白粉病孢子悬浮液时喷雾压力均为1.5kg/cm²。处理后的植株置于温室(25℃，相对湿度80％)中培养。每个处理设置5个重复。以丙环唑为阳性对照，丙环唑使用浓度为0.025mg·mL^-1，设置等量DMF的吐温-80水溶液作为空白对照。培养14 d后调查发病情况以及防治效果。实验重复3次，豇豆白粉病分级标准如下：

0级：无病；

1级：病斑面积占叶片面积的<5％；

3级：病斑面积占叶片面积的≥6％～10％；

5级：病斑面积占叶片面积的≥11％-20％；

7级：病斑面积占叶片面积的≥21％-40％；

9级：病斑面积占叶片面积的≥40％；

结果如下表5：

由上表可知，中南鱼藤枝叶的甲醇提取物2对豇豆白粉病具有好的防治效果，防治效果可达91.67％；各相萃取物对豇豆白粉病均有一定程度的防治效果，其中正丁醇相萃取物防治效果最好，达到94.07％，表明本发明提供的中南鱼藤提取物杀菌剂可有效用于防治豇豆白粉病，防治效果与化学杀菌剂丙环唑相当，可作为植物真菌性病害的杀菌剂。

综上所述，本发明所得到的中南鱼藤提取物杀菌剂对常见的9种植物病原菌均具有一定程度的抑菌活性，表现出广谱的抗真菌活性；其中，中南鱼藤枝叶的甲醇提取物、石油醚相萃取物和乙酸乙酯相萃取物对香蕉炭疽病菌的分生孢子具有较高的萌发抑制率，并对香蕉炭疽病有较好的防治效果，其防治效果与化学杀菌剂嘧菌酯相当；中南鱼藤枝叶的甲醇提取物、石油醚相萃取物和正丁醇相萃取物可有效用于防治豇豆白粉病，防治效果与化学杀菌剂丙环唑相当；本发明所得到的中南鱼藤提取物杀菌剂可作为植物真菌性病害的杀菌剂。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种中南鱼藤提取物杀菌剂在抑制植物病原真菌中的应用，其特征在于，所述中南鱼藤提取物杀菌剂为中南鱼藤枝叶的提取物；

所述中南鱼藤枝叶的提取物为中南鱼藤枝叶的甲醇提取物或甲醇提取物的有机溶剂萃取物；

所述甲醇提取物的有机溶剂萃取物为石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物或正丁醇相萃取物；

所述植物病原真菌为水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、苹果轮纹病菌(Botryosphaeria dothidea)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、香蕉炭疽病菌(Colletotrichum musae)、火龙果溃疡病菌(Neoscytalidium dimidiatum)、茄链格孢菌(Alternaria solani)、辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)、稻瘟病病菌(Magnaportheoryzae)或豇豆白粉病菌(Podosphaera xanthii)。

2.一种中南鱼藤枝叶提取物杀菌剂的制备方法，其特征在于：制备中南鱼藤枝叶的甲醇提取物，包括如下步骤：取中南鱼藤枝叶，剪成9～11cm的枝叶段，于45～55℃干燥后粉碎，得中南鱼藤枝叶粉末；按料液的用量比为(1.5～2.5)g：30mL，在中南鱼藤枝叶粉末中加入质量浓度80～95％的甲醇溶液，搅拌，浸泡48～96h，过滤，加入质量浓度80～95％的甲醇溶液重复浸泡2～4次，过滤，合并滤液，得浸泡液，将浸泡液于45～60℃进行真空浓缩，得中南鱼藤枝叶的甲醇提取物。

3.一种中南鱼藤枝叶提取物杀菌剂的制备方法，其特征在于，制备所述甲醇提取物的有机溶剂萃取物，包括如下步骤：

(2)取步骤(1)所得的中南鱼藤枝叶的甲醇提取物，按用量比为(0.5～1.5)g：10mL加入水，搅拌，得甲醇提取物水溶液，按体积比为1：1.5～2.5加入石油醚、乙酸乙酯或正丁醇反复萃取3～5次，得石油醚萃取液、乙酸乙酯萃取液或正丁醇萃取液，于45～60℃真空浓缩，得石油醚相萃取物、乙酸乙酯相萃取物或正丁醇相萃取物，即甲醇提取物的有机溶剂萃取物。