CN101933526B

CN101933526B - 从香根草中提取防治植物病原真菌活性物质的方法

Info

Publication number: CN101933526B
Application number: CN 201010256476
Authority: CN
Inventors: 高广春; 吕仲贤; 郑许松; 徐红星; 王艳丽; 邱海萍; 杨亚军
Original assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Zhejiang Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2010-08-17
Filing date: 2010-08-17
Publication date: 2013-01-09
Anticipated expiration: 2030-08-17
Also published as: CN101933526A

Abstract

本发明公开了从香根草中提取防治植物病原真菌活性物质的方法，属于农药技术领域。方法包括：(1)原料预处理；(2)酒精粗提取物的制备；(3)石油醚萃取物的制备；(4)乙酸乙酯萃取物的制备等步骤。本发明将香根草植物作为植物源杀菌剂资源，提出了从中制备提取物的方法，并明确该提取物对6种植物病原真菌具有明显的抑制作用和一定的防治效果。该提取物其毒性低，不易产生耐药性及环境污染，有望进一步开发成新的植物源杀菌剂。本发明可在农药开发技术领域中应用。

Description

从香根草中提取防治植物病原真菌活性物质的方法

技术领域

本发明属于农药技术领域，具体涉及从香根草植物中提取具抑制植物病原真菌活性物质的方法及该提取物的应用。

背景技术

香根草(Vetiveria zizanioides)，又名岩兰草，属禾本科香根草属多年生草本植物，原产于印度等热带、亚热带国家，在我国广东省吴川地区也有少量分布。香根草具有生态适应性强、生长速度快、繁殖力强、抗逆性强、抗虫和抗病性强及能增强土壤肥力等特性，被誉为“21世纪最有价值的生态工程技术”之一。由于香根草特殊的生物学特征和生态学特性，我国学者已做了大量的相关研究，推动了香根草在我国的水土保持、污染治理等方面的应用。同时，香根草还具有药用保健和食用功能，香根油能减缓人体疲劳，保护皮肤，杀菌消毒，还可用于其它保健药物的开发；同时香根草的幼嫩叶还可以作为饲料开发利用。

农业上香根草还可用于玉米和水稻作物螟虫的防治，2003年国际昆虫生理生态中心和英国洛桑研究中心的科研人员Van den Berg通过试验发现，香根草对钻蛀性玉米螟虫Chilo partellus是一种诱杀性植物，其雌成虫明显偏好在该植物上产卵，使玉米上的产卵量降低到18％，同时，在香根草上未发现有幼虫存活。我国江西农科院陈先茂等(2007)报道水稻螟虫在香根草上的卵块数和着卵密度是水稻上的4.7倍，且种植时间在3月底至4月初最佳。2009年浙江省农业科学院郑许松等也报道了香根草对水稻二化螟和大螟均有很强的诱杀作用。香根草作为诱杀植物用于螟虫的生态防治具有很大的发展空间，它的推广种植将为我国和世界的经济发展做出更大的贡献。

从目前我国对香根草的研究与应用现状来看，香根草的研究多限于理论研究，而缺少对香根草植物的开发利用，这也限制了香根草的推广种植，不利于发挥其多方面的功能优势。本发明首次利用香根草植物地上部分的提取物并开发其在防治植物病原真菌方面的应用。目前常用于植物病原真菌的杀菌剂同其它化学农药一样具有毒性较大，难降解，易产生抗药性的缺点，对生态环境和人类健康存在着极大的威胁，因此利用香根草的植物体开发绿色环保，低毒无害的植物源杀菌剂既能有效利用香根草植物资源，又可以推动香根草在生态系统中的应用，在保持生态效益的同时获得一定的经济效益，达到互利共赢。

发明内容

本发明目的是，针对目前对香根草抑制植物病原真菌活性物质的提取方法与其用途认识不足的缺陷，提供一种从香根草植物中提取具抑制植物病原真菌活性物质的方法；本发明的另一目的是提出该提取物在防治植物真菌病害中的应用。

本发明目的通过以下技术方案来实现。

从香根草中提取防治植物病原真菌活性物质的方法，该方法按以下步骤进行：

(1)原料预处理：将香根草的茎叶阴干至含水量少于5％，再切断成1-2cm长后，备用；

(2)酒精粗提取物的制备：在室温下将预处理后的原料和工业酒精按重量1∶25-40比例浸泡提取2-4次，每次浸泡3-8天；过滤、合并提取液后在45-55℃水浴中减压浓缩得膏状酒精粗提取物；

(3)石油醚萃取物的制备：先将酒精粗提取物按重量体积1kg∶2-6L比例溶于70％乙醇水溶液中；再加入等体积60-90沸程的石油醚搅动、萃取三次，每次4h；静置分层后，取石油醚层过滤后在35-48℃水浴中减压浓缩得黑色膏状物即为香根草石油醚萃取物；余下的母液减压浓缩除去70％乙醇后用水定容至原体积、备用；

(4)乙酸乙酯萃取物的制备：将石油醚萃取物母液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，每次4h；乙酸乙酯层过滤后在40-50℃水浴中减压浓缩得深褐色无定型物即为香根草乙酸乙酯萃取物。

所述的香根草提取物是指从香根草植物茎叶中的提取物。

香根草提取物在防治植物真菌病害中的应用，所述的香根草石油醚萃取物和香根草乙酸乙酯萃取物，对水稻纹枯病菌，香蕉炭疽病菌，葡萄炭疽菌，黄瓜立枯丝核菌，黄瓜枯萎病菌及番茄早疫病菌具有抑菌活性；并能用于对水稻纹枯病，香蕉炭疽病，葡萄炭疽病，黄瓜立枯丝核菌病，黄瓜枯萎病及番茄早疫病病害的防治。

本发明的有益效果：

1、本发明将香根草植物作为优良的植物源杀菌剂资源，提出了从该资源中提取对植物病原真菌具抑制作用活性物质的方法，并成功地提取出香根草石油醚萃取物和香根草乙酸乙酯萃取物；

2、经抑菌实验明确，当萃取物浓度在5.0mg/ml时，对6种植物病原真菌具有不同程度的抑制作用(见实施例4、5)，表明这两部分萃取物是香根草中的主要抑菌活性成分；

3、经防病实验明确，萃取物对水稻纹枯病与黄瓜枯萎病有较好的防治效果(见实施例6、7)；

4、通过抑菌和防病实验已明确，香根草石油醚萃取物和香根草乙酸乙酯萃取物这两种来源于香根草的中间产品，现有效果虽不及化学药剂百菌清，但因其毒性低，不易于产生耐药性等优点，具有潜在的开发应用价值，经过添加增效剂、复配及剂型等的研究改进，有望进一步开发成为一种新型的植物源杀菌剂。

具体实施方式

通过下面给出的实施例与试验例可以进一步清楚地理解本发明，但下述内容并不是对本发明的限定。

实施例1：(从香根草中提取防治植物病原真菌活性物质的方法1)

按以下步骤进行：

(1)原料预处理：将香根草的茎叶阴干至含水量少于5％，切断成1-2cm长后，得材料4.5kg，备用；

(2)酒精粗提取物的制备：在室温下将预处理后的原料和95％工业酒精180kg按重量1∶40比例浸泡提取3次，每次浸泡5天；过滤、合并提取液后在48℃水浴中用EYELA旋转蒸发仪减压浓缩得膏状酒精粗提取物530g；

(3)石油醚萃取物的制备：先将酒精粗提取物按重量体积1kg∶2L比例溶于70％乙醇水溶液中；再加入等体积60-90沸程的石油醚搅动、萃取3次，每次4h；静置分层后，取石油醚层过滤后在48℃水浴中减压浓缩得黑色膏状物即为香根草石油醚萃取物产品40g；余下的母液减压浓缩除去70％乙醇后用水定容至2L，备用；

(4)乙酸乙酯萃取物的制备：将石油醚萃取物母液用2L乙酸乙酯萃取3次，每次4h；乙酸乙酯层过滤后在50℃水浴中减压浓缩得深褐色无定型物即为香根草乙酸乙酯萃取物产品40g。

实施例2：(从香根草中提取防治植物病原真菌活性物质的方法2)

本例中，步骤(1)原料预处理：香根草原料为1.0kg；步骤(2)酒精粗提取物的制备：将原料1.0kg和95％工业酒精25kg按重量1∶25比例浸泡提取2次，每次浸泡8天；在55℃水浴中减压浓缩得酒精粗提取物120g；步骤(3)石油醚萃取物的制备：酒精粗提取物120g与400ml 70％乙醇水溶液的重量体积比为1kg∶3.3L；再加入等体积石油醚萃取3次，每次4h；经35℃水浴减压浓缩后得香根草石油醚萃取物产品9.5g；母液减压浓缩除乙醇后用水定容至400ml；步骤(4)乙酸乙酯萃取物的制备：将母液用400ml乙酸乙酯萃取3次，每次4h；乙酸乙酯层过滤后在40℃水浴中减压浓缩得香根草乙酸乙酯萃取物产品10g；其余工艺、条件同于实施例1。

实施例3：(从香根草中提取防治植物病原真菌活性物质的方法1)

本例中，步骤(1)原料预处理：香根草原料为2.5kg；步骤(2)酒精粗提取物的制备：将原料2.5kg和95％工业酒精90kg按重量1∶36比例浸泡提取4次，每次浸泡3天；在45℃水浴中减压浓缩得酒精粗提取物250g；步骤(3)石油醚萃取物的制备：酒精粗提取物250g与1.5L 70％乙醇水溶液的重量体积比为1kg∶6L；再加入等体积石油醚萃取3次，每次4h；经40℃水浴减压浓缩后得香根草石油醚萃取物产品20g；母液减压浓缩除乙醇后用水定容至1.5L；步骤(4)乙酸乙酯萃取物的制备：将母液用1.5L乙酸乙酯萃取3次，每次4h；乙酸乙酯层过滤后在45℃水浴中减压浓缩得香根草乙酸乙酯萃取物产品18g；其余工艺、条件同于实施例1。

实施例4：(石油醚和乙酸乙酯萃取物对供试植物病原真菌的抑菌作用测定)

1.供试病原真菌：水稻纹枯病菌，香蕉炭疽病菌，葡萄炭疽菌，黄瓜立枯丝核菌，黄瓜枯萎病菌，番茄早疫病菌；

2、石油醚和乙酸乙酯萃取物：采用实施例1、2或3的提取物；

3.试验方法：

采用菌丝生长速率法测定。具体方法参考文献(吴振宇，王燕，艾启俊。鹿蹄草素对桃褐腐病菌的抑制作用及其抑菌机理[J]。中国农业科学，2009，42(8)：2784-2792)。方法简述为：①将石油醚和乙酸乙酯萃取物(各1.25g)用2ml乙醇溶解，备用；②1000ml PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基配制好后121℃灭菌30min，温度降至80℃后取出加入1mg硫酸链霉素防止细菌污染培养基；③将各部分已溶解好的提取物加入到250ml培养基中，充分摇匀后配制成5.0mg/ml的带药培养基，然后将该培养基用移液管移入到直径5cm的培养皿中，每皿8ml，以纯PDA和与样品相同体积的乙醇加入的250ml培养基平板作空白对照，凝固后待用；④用直径0.5cm的打孔器在供试菌菌落外缘切下生长一致的带菌培养基柱，即菌饼，将菌饼带菌丝的一面接种到培养皿中央；⑤将各处理置于28℃恒温培养箱中培养。每个处理设三次重复。待对照组菌丝即将长满整个培养皿时，采用十字交叉法测量菌落直径。用下式求出抑菌率：

抑菌率＝(对照菌落直径-菌饼直径)-(处理菌落直径-菌饼直径)/(对照菌落直接-菌饼直径)×100％

利用spss数据分析软件进行不同处理与对照间的差异显著性检验。

3.试验结果：

抑制作用结果见表1。

表1石油醚和乙酸乙酯萃取物对供试植物病原真菌的抑制作用

**表示在0.01的显著性水平下均值有显著性差异。

如表1所示，当香根草石油醚和乙酸乙酯萃取物浓度在5.0mg/ml时，其对以上6种植物病原真菌具有不同程度的抑制作用，其中石油醚萃取物对水稻纹枯病菌的抑菌率达到77.55％，对黄瓜立枯丝核菌的抑菌率为54.20％；乙酸乙酯萃取物对水稻纹枯病菌的抑菌率为55.78％。在该浓度下，两部分萃取物的抑菌圈直径与对照相比均具有极显著差异，表明这两部分萃取物是香根草中的主要抑菌活性成分。

实施例5：(石油醚和乙酸乙酯萃取物对供试植物病原真菌的半数抑制浓度测试)

1.供试病原真菌：水稻纹枯病菌，香蕉炭疽病菌，葡萄炭疽病菌，黄瓜立枯丝核菌，黄瓜枯萎病菌，番茄早疫病菌。

2、石油醚和乙酸乙酯萃取物：采用实施例1、2或3的提取物；

3.试验方法：

采用菌丝生长速率法测定石油醚和乙酸乙酯萃取物对供试植物病原真菌的半数抑菌浓度。试验方法同上，分别称取石油醚和乙酸乙酯萃取物及百菌清(Chlorothalonil，先正达作物保护有限公司，有效成分含量为75％)重量为22.5mg、45mg、90mg、180mg和360mg的样品共15样，并分别用0.5ml乙醇和蒸馏水溶解后，分别加入到45ml已灭菌并冷却至50℃左右的PDA培养基中充分摇匀，配成浓度梯度为0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml、4.0mg/ml和8.0mg/ml的带药培养基。每个培养皿(直径9cm)中加入15ml培养基，静止冷凝后接入供试菌菌饼(直径0.5cm)。每个处理设三次重复。设百菌清为阳性对照，含0.5ml乙醇的45ml PDA培养基和纯PDA培养基为空白对照。将各处理组置于28℃恒温培养箱中培养。待对照组菌丝即将长满整个培养皿时，采用十字交叉法测量菌落直径。利用DPS数据分析软件，建立毒力回归方程确定各萃取物对供试菌株的半数抑制浓度(EC₅₀)。

3.试验结果：

石油醚和乙酸乙酯萃取物对上述6种植物病原真菌菌丝生长的半数抑制浓度见表3。由表3可知石油醚萃取物对黄瓜立枯丝核菌的抑制效果最好，EC₅₀为1.061mg/ml；对水稻纹枯病菌的抑制效果次之，EC₅₀为1.844mg/ml。同样乙酸乙酯萃取物对黄瓜立枯丝核菌和水稻纹枯病菌的抑制效果最好，EC₅₀值分别为3.122mg/ml和3.470mg/ml。这两部分萃取物对其它四种供试植物病原真菌也有较好抑制作用，表明其有广谱的抑菌活性。虽然其抑菌效果不如化学农药百菌清，但因其毒性低，不易于产生耐药性等优点值得进一步的开发利用。试验结果显示香根草中的抑菌活性物质主要集中于石油醚和乙酸乙酯萃取物部分，本发明将为从中分离抗菌活性物质奠定基础。

表3石油醚和乙酸乙酯萃取物对供试植物病原真菌的半数抑制浓度EC₅₀(mg/ml)

实施例6：(香根草提取物对水稻纹枯病的防治效果)

1.试验方法

采用盆栽法测定香根草石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物对水稻纹枯病的防治效果。供试水稻品种为TN1，三叶一心时供试验用，每盆10株，每处理三盆。石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物为实施例1、2或3的提取物；用少量乙醇溶解，然后加蒸馏水稀释到所需浓度；以75％百菌清WP作为阳性对照；以乙醇代替植物提取液的处理为溶剂对照。每处理三盆，每盆留水稻苗10株。保护作用和治疗作用分别在接菌前后24h进行喷药处理，每盆施药3ml。在28℃±1℃，RH≥85％条件下培养，18d后根据病害发生情况分级调查，计算各处理病情指数和防治效果。

2、试验结果

香根草提取物对水稻纹枯病防治效果的盆栽试验表明(表4)，石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物在测试浓度下具有明显的保护作用和微弱的治疗作用。与杀菌剂百菌清相比，该提取物对水稻纹枯病有较好的保护作用，且对环境无污染，因此通过剂型研究有望进一步开发成无公害水稻纹枯病的保护剂。

表4香根草提取物对水稻纹枯病的防效

实施例7：(香根草提取物对黄瓜枯萎病的防治效果)

1.试验方法

采用盆栽法测定香根草石油醚萃取物和乙酸乙酯萃取物对黄瓜枯萎病的防治效果。供试黄瓜品种为冠军(北京燕禾金农业科技发展中心)，幼苗长至三叶一心时，选取长势一致的幼苗进行处理，每盆3株，每处理5盆。提取物药液配制方法同实施例6。伤根法接种黄瓜枯萎菌(孢子悬浮液浓度6×10⁶cfu/ml)，保护作用和治疗作用分别在接菌前后48h进行药液灌根处理，每盆10ml。20d调查病情指数和防效。

2.试验结果

香根草提取物对黄瓜枯萎病防治效果的盆栽试验表明(表5)，石油醚和乙酸乙酯萃取物对该病具有一定的防治效果，其治疗作用比保护作用明显，具有潜在的开发应用价值。

表5香根草提取物对黄瓜枯萎病的防效

Claims

1.从香根草中提取防治植物病原真菌活性物质的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

(4)乙酸乙酯萃取物的制备：将石油醚萃取物母液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，每次4h；乙酸乙酯层过滤后在40℃-50℃水浴中减压浓缩得深褐色无定型物即为香根草乙酸乙酯萃取物。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于所述香根草提取物是指从香根草植物茎叶中提取的提取物。

3.香根草提取物在防治植物真菌病害中的应用，其特征在于按权利要求1提取的香根草石油醚萃取物和香根草乙酸乙酯萃取物，对水稻纹枯病菌，香蕉炭疽病菌，葡萄炭疽菌，黄瓜立枯丝核菌，黄瓜枯萎病菌及番茄早疫病菌具有抑菌活性；并能用于对水稻纹枯病，香蕉炭疽病，葡萄炭疽病，黄瓜立枯丝核菌病，黄瓜枯萎病及番茄早疫病病害的防治。