작물 재배시 많은 식물병원균, 해충 및 잡초들이 작물의 생장에 저해를 일으켜, 이들에 대한 방제를 실시하지 않을 경우 작물에 따라서는 30 ~ 100%의 수확량 감소가 야기된다. 이러한 유해 생물을 방제하기 위하여 지금까지 많은 합성농약들이 개발되고 사용되어 왔으나 식물병, 해충 및 잡초방제에 오남용됨에 따라 인축에 대한 독성, 지하수 오염, 환경오염, 생태계 교란, 저항성 유해생물 증가 등 여러 가지 문제점들이 야기되고 있다. 이에 따라 우리나라를 포함한 OECD 가입국들을 중심으로 합성농약의 사용량을 40% 감축하고자 하는 친환경농업정책을 시행 중에 있다. 이러한 정책의 일환으로, 합성농약의 대안으로 떠오르는 기술이 바로 생물농약 이다.
생물농약에는 미생물농약과 생화학농약이 있으며, 생물농약은 환경친화적 작물보호제로서 합성농약과는 달리 인축 및 생태계에 안전하여 부가가치가 높은 농산물을 생산할 수 있고, 합성농약으로 방제하기 어려운 병해충을 효과적으로 방제하여 안전한 농작물의 생산을 증대시킴과 동시에 합성농약의 오남용으로 인한 문제점을 해결할 수 있다. 국내의 경우 미생물농약에 대한 연구는 많이 이루어져 등록된 미생물농약이 다수 있지만, 천연물을 이용한 생화학농약의 경우 2005년에 등록규정이 마련되었고, 현재 식물유래 azadirachtin을 이용한 살충제(제품명: 단독) 1개와 식물유래 지방산 perlagonic acid를 이용한 제초제(제품명: 싸이티)가 등록되어 시판되고 있다. 하지만 두 제품 모두 외국에서 개발한 제품을 단지 국내에 등록한 것이며, 자체 개발한 기술은 아니다.
전 세계적으로 식물 추출물들을 이용하여 상품화에 성공하여 시판되고 있는 살균제 제품은 2004년 현재 5개이며, 가장 대표적인 것이 밀사나(Milsana™)이다. 이 제품은 왕호장근(Reynouria sachalinensis)의 추출물을 이용하여 개발된 친환경살균제로서, 식물병원균을 직접 치사시키는 효과보다는 식물체에 저항성을 유도함으로써 흰가루병에 대한 방제효과를 발휘하는 것으로 나타났다. 또한, 천연물 살균제로서 등록되어 있는 신남알데하이드(cinnamaldehyde)는 카시아 식물체(Cassia tora)의 종자로부터 추출되는 오일로서 살충활성 뿐만 아니라 버티실리엄(Verticillium) 속, 리족토니아(Rhizoctonia) 속, 피티엄(Pythium) 속 및 후사리움 모니리폼(Fusarium moniliforme var. subglutinans)(근류병: canker disease) 등의 식물병원균들에 대해서도 살균활성이 있는 것으로 보고되어 있다. 또한, 호호바(jojoba) 종자로부터 추출되는 호호바 오일은 살충활성 뿐만 아니라 흰가루병에 대하여 살균활성이 있다. 마클레아이아(Macleaya) 속 추출물은 죽자초(Macleaya cordata) 추출물로서 흰가루병과 알터나리아(Alternaria) 속 잎점무늬병과 셉토리아(Septoria) 속 잎점무늬병 등에 효과가 있다. 또한, 올레산을 주성분으로 하는 지방산도 흰가루병에 효과가 있다.
백하수오(Cynanchum wilfordii)는 박주과리과(Asclepidaceae)에 속하며 강원도, 경기 북부, 중부지방을 중심으로 분포되어 자생하며, 자양, 강장, 노화방지, 혈압강화, 동맥경화의 방지, 보혈, 빈혈, 신경쇠약 등에 효과적이며, 강장제와 신장 기능증진제로 이용되었다. 백하수오의 화학적 구성성분에 대한 연구는 Hayashi 등(Aglycones from Cynanchum wilfordii Hemsley. Chem. Pharma. Bulletin 23. 1975. 139-143)과 Tsukamoto 등(The structures of six glycosides, Wilfoside C1N, C2N, C3N, C1G, C2G and C3G, with novel sugar chain containing a pair of optically isomeric sugars. Tetrahedron. 41. 1985b. 927-934)에 의해 이루어졌는데 그들은 백하수오로부터 C/D-cis-polyoxypregnane 유도체와 2,6-dideoxy-3-O-methyl sugar를 분리하였다. 또한 Lin 등(Revised structure for five acetophenones from Cynanchum taiwanianum. Phytochem. 44. 1997. 1359-1363), Hwang(Acetophenones from the roots of Cynanchum wilfordii HEMSLEY. Arch. Pharmacal Res. 22(1). 1999b. 72-74) 및 Yeo 등(A benzoquinone from Cynanchum wilfordii. Phytochem. 46(6). 1997. 1103-1105)은 시나디온 A(cynandione A), 두 개의 아세토페논(acetophenone), 벤조퀴논(benzoquinone)을 분리하였다. Lee 등(Cynandione A from Cynanchum wilfordii protects cultured cortical neurons from toxicity induced by H2O2, L-Glutamate, and Kainate. J. Neurosci. Res.. 5. 2000. 259-264)은 시나디온 A(cynandione A)가 강한 신경보호활성(neuroprotective activity)을 갖는다고 보고하였으며, Hwang 등(Pregnane glycoside multidrug-resistance modulators from Cynanchum wilfordii. J. Nat. Prod. 62. 1999a. 640-643)은 백하수오에서 분리한 프레그난 배당체(pregnane glycoside)인 gagaminin 3-O-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-oleandropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranoside, 월포사이드 K1N(wilfoside K1N), 월포사이드 C1N(wilfoside C1N), 시나우리코사이드 A(cynauricuoside A)의 다제내성극복활성(Multidrug-resistance reversing activity)을 조사하였는데, gagaminin 3-O-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-oleandropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranoside만이 활성을 보이며, 본 발명에서 분리한 물질과 동일한 월포사이드 K1N(wilfoside K1N), 월포사이드 C1N(wilfoside C1N), 시나우리코사이드 A(cynauricuoside A)는 활성을 나타내지 않았다고 보고하였다. 뿐만 아니라 월포사이드 K1N(wilfoside K1N)와 같은 폴리옥시프레그난 배당체(polyoxypregnane glycoside)는 암세포에서 세포질 면역, 항암효과, 많은 항암제의 세포독성 증가와 연관되어 있으며, Kim 등(Wilfoside K1N isolated from Cynanchum wilfordii inhibits angiogenesis and tumor cell invasion. Intl. J. Oncol. 26. 2005. 1533-1539)은 백하수오에서 분리 한 월포사이드 K1N(wilfoside K1N)이 높은 혈관형성억제활성(anti-angiogenic activity), anti-invasion활성 및 항종양활성을 보인다고 보고한 바 있다. 월포사이드 K1N(wilfoside K1N)과 같은 폴리옥시프레그난 배당체(polyoxypregnane glycosides)는 암세포에서 세포질 면역, 항암효과 및 세포독성활성과 연관되어 있다고 알려져 있다.
상기에 언급한 바와 같이 백하수오로부터 분리한 천연물의 의약활성에 대해서는 많은 연구가 되어 있지만, 식물병에 대한 항진균 활성에 대해서는 아직 보고된 바 없다. 이에 본 발명자들은 천연추출물 및 물질을 이용하여 인체에 무해하면서 환경친화적인 천연물 살균제를 개발하기 위하여 연구 노력한 결과, 백하수오 추출물 및 이로부터 분리한 플리옥시프레그난 배당체 화합물이 다양한 식물병에 대하여 높은 방제활성을 나타냄을 발견하고, 이들을 식물병 방제를 위한 천연물 살균제로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 천연물로부터 유래하여 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으면서 보리 흰가루병, 밀 붉은녹병, 토마토 역병 또는 토마토 잿빛곰팡이병 등 다양한 식물병에 대해 우수한 방제활성을 나타내는 신규한 폴리옥시프레그난 배당체(pregnane glycoside) 화합물 및 환경친화적인 식물병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 상기 방제용 조성물을 이용한 식물병의 방제방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 신규한 폴리옥시프레그난 배당체(polyoxypregnane glycosides) 화합물을 제공한다.
본 발명은 하기 화학식 2로부터 선택되는 화합물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방제용 조성물을 작물 또는 토양에 처리하여 다양한 식물병을 방제하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 사용되는 식물재료로는 상기 화학식 2의 방제활성성분을 생산하는 백하수오(Cynanchum wilfordii)으로부터 추출되는 것으로, 상기 백하수오의 추출물은 백하수오의 뿌리 건조물을 유기용매로 추출함으로써 제조될 수 있다. 본 발명에서 추출용 유기용매로는 탄소수 1 내지 7의 저급알코올 및 이의 수용액, 헥산, 아세톤, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택된 용매를 사용하여 추출되는 것으로 바람직하게는 아세톤을 사용한다.
예를 들어 백하수오 뿌리의 건조시료 3kg에 80% 메탄올을 가한 후 상온에서 1일간 추출하여 얻은 메탄올 추출물을 여과지를 사용하여 여과한 다음 여과액을 감압 농축하여 수득된 메탄올 추출물을 다른 유기용매로 추가로 추출하여 유기용매 추출물을 수득한다. 본 발명에서는 당분야에서 통상적으로 사용되는 분획공정을 수행할 수도 있다.
상기 화학식 2로부터 선택되는 화합물, 바람직하게는 윌포사이드 C1N(wilfoside C1N), 윌포사이드 K1N(wilfoside K1N), 시나우리코사이드 A(cynauricuoside A), 윌포사이드 C1G(wilfoside C1G), 신물질인 윌포사이드 K1GG(wilfoside K1GG)와 윌포사이드 C1GG(wilfoside C1GG)를 백하수오로부터 분리, 정제할 수 있다.
구체적으로 6종의 방제활성 성분들은 백하수오의 유기용매 추출물을 컬럼 크로마토그래피로 분리, 정제하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 도 1을 참조한다. 이때, 사용가능한 컬럼은 실리카겔 컬럼, C18 칼럼 또는 세파덱스 컬럼 등이 있고, 용출액으로는 헥산, 에틸아세테이트, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 저급알콜 등과 같은 유기용매를 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는, 건조된 백하수오 뿌리를 메탄올로 추출하고 감압 농축하여 얻은 메탄올 추출물을 70% 메탄올에 용해시킨 후 동량의 n-헥산으로 추출한 후 n-헥산층과 수용액층을 감압 농축하고 농축한 수용액층을 증류수로 용해한 후 동량의 에틸아세테이트(EtOAc)와 부탄올과 같은 유기용매로 순차적으로 추출한 추출물 및 수용액층을 감압 농축한 다음 반복적인 실리카겔 컬럼, Sep-Pak C18 카트리쥐, C18 컬럼 또는 세파덱스 컬럼과 분리용 HPLC로 분리 정제하여 윌포사이드 C1N(wilfoside C1N), 윌포사이드 K1N(wilfoside K1N), 시나우리코사이드 A(cynauricuoside A), 윌포사이드 C1G(wilfoside C1G)와 신물질인 윌포사이드 K1GG(wilfoside K1GG)와 윌포사이드 C1GG(wilfoside C1GG)를 순수하게 분리한다.
본 발명에 따른 백하수오의 메탄올 추출물로부터 분리, 정제된 상기 분리한 6개의 물질을 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병 및 고추 탄저병 등의 총 7가지 식물병에 대하여 방제활성을 조사한 결과, 윌포사이드 C1N(wilfoside C1N)은 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병, 보리 흰가루병과 밀 붉은녹병에 대하여; 윌포사이드 K1N(wilfoside K1N)의 경우 토마토 역병, 토마토 잿빛곰팡이병과 밀 붉은녹병에 대하여; 시나우리코사이드 A(cynauricuoside A)는 토마토 역병에 대하여; 윌포사이드 C1G(wilfoside C1G)는 보리 흰가루병, 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병에 대하여 활성을 나타내었다. 그리고 신물질로 동정된 윌포사이드 K1GG(wilfoside K1GG)의 경우 토마토 역병에 대하여; 신물질로 동정된 윌포사이드 C1GG(wilfoside C1GG)는 7가지 식물병 중 토마토 역병, 토마토 잿빛곰팡이병과 보리 흰가루병에 대하여 활성을 나타내었다. 표 1 내지 3을 참조한다.
상기 백하수오로부터 분리한 상기 화학식 2로부터 선택되는 화합물들은 흰가루병 이외에 다른 식물병, 즉 토마토 역병, 밀 붉은녹병 및 토마토 잿빛곰팡이병에도 효과가 있다는 장점이 있다. 따라서 이들 천연물질들을 이용하여 천연물 살균제 개발에 성공할 경우 시장성은 더 클 것으로 사료된다.
상기와 같은 특성을 나타내는 6종의 방제활성물질을 포함하는 백하수오 추출물은 식물 진균병을 효과적으로 방제할 수 있으며, 식물 진균병은 바람직하게는 보리 흰가루병, 밀 붉은녹병, 토마토 역병 또는 토마토 잿빛곰팡이병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
따라서, 상기 화학식 2로부터 선택되는 화합물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 식물 추출물을 유효성분으로 함유하는 보리 흰가루병, 밀 붉은녹병, 토마토 역병 및 토마토 잿빛곰팡이병 방제용 조성물 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 방제용 조성물은 통상적으로 이용되는 살충제 또는 살균제에 함유되는 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 활성성분 이외에 부형제로 약제학적으로 허용 가능한 고체 담체, 액체 담체, 액체 희석제, 액화된 기체 희석제, 고체 희석제, 또는 기타 적당한 보조제, 예를 들면 유화제, 분산제 또는 기포제 등의 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 활성성분과 상기 부형제를 혼합한 방제용 조성물을 농약분야에 공지된 다양한 제형으로 제제화시켜 사용할 수 있으며, 제제화를 위 해서는 농약분야에서 통상적으로 사용되는 제제화 방법을 어느 것이나 사용할 수 있다.
본 발명의 방제용 조성물은 바람직하게는 수화제, 입제, 분제, 유제, 스프레이상, 연막제, 캅셀형 및 젤상의 제형으로 제제화될 수 있고, 제제의 부력을 위해 도넛형과 같은 제형을 통한 접촉제로서 제공되는 것이 바람직하다.
본 발명의 방제용 조성물은 보리 흰가루병, 밀 붉은녹병, 토마토 역병 및 토마토 잿빛곰팡이병을 효과적으로 방제하기 위하여 백하수오 추출물은 식물병 방제용 조성물에 50 내지 3,000㎍/㎖의 농도로 포함하며, 본 발명의 유효성분인 상기 화학식 2로부터 선택되는 화합물 또는 이들의 혼합물은 식물병 방제용 조성물에 100 내지 1000㎍/㎖ 농도로 포함하는 것이 바람직하나, 이는 작물의 종류, 생육 정도, 경작지 환경, 식물병의 발병 정도 등을 고려하여 적절하게 조절할 수 있다.
상기와 같이 제형화된 본 발명의 방제용 조성물을 방제가 필요한 식물체 또는 지역에 처리함으로써 보리 흰가루병, 밀 붉은녹병, 토마토 역병 및 토마토 잿빛곰팡이병을 방제할 수 있다. 바람직한 방법은 상기 방제용 조성물을 식물 병원균과 직접 접촉할 수 있도록 적용하여 방제하는 것으로, 토양에 혼화 처리하거나 작물에 직접 분무하는 방법이 가장 바람직하다.
본 발명에 따르면, 백하수오 뿌리 추출물을 유효성분으로 하는 본 발명의 방제용 조성물은 천연물로부터 유래하여 인체에 무해하고 환경오염을 유발하지 않으면서 보리 흰가루병, 밀 붉은녹병, 토마토 역병 및 토마토 잿빛곰팡이병 등의 식물 진균병에 대한 방제활성을 나타내므로 환경친화적인 천연물 살균제의 개발 및 고부가가치의 유기농산물 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 백하수오 추출물의 식물병에 대한 방제활성
백하수오 추출물과 분획들 그리고 분리한 물질의 벼 도열병(Magnaporthe grisea), 벼 잎집무늬마름병(Rhizoctonia solani), 토마토 잿빛곰팡이병(Botrytis cinerea), 보리 흰가루병(Erysiphe graminis f. sp. hordei), 토마토 역병(Phytophthora infestans), 밀 붉은녹병(Puccinia recondita) 및 고추 탄저병(Colletotrichum coccodes)의 7가지 식물병에 대한 in vivo 항균활성을 조사하였다. 각각의 물질을 메탄올(최종농도, 5%)로 용해한 후 계면활성제 트윈 20을 250 ㎍/㎖ 수준으로 포함하는 증류수에 희석하였다. 이때 대조구는 5% 메탄올과 250㎍/㎖의 트윈 20을 함유하는 증류수를 사용하였다. 각 식물병당 2개의 포트를 이용하였고, 활성성분 시료를 엽면에 분무 살포한 후 24시간 동안 풍건한 다음 각각의 식물 병원균을 접종하였다.
실험에 사용한 벼, 토마토, 보리 및 밀은 지름 4.5㎝의 플라스틱 포트에 수도용 상토 또는 원예용 상토를 70% 정도 채운 후, 종자를 파종하여 25±5℃의 온실에서 1주 내지 4주간 재배하였다. 벼 도열병은 3 ~ 4엽기의 유묘에 도열병의 원인 균인 마그나포르테 그리세아(Magnaporthe grisea, 한국화학연구원)의 포자 현탁액(5×105 spores/㎖)을 분무 접종하고, 25℃의 습실상에서 하루 동안 습실처리한 후, 25℃의 항온실에서 5일간 배양하여 발병을 유도하였다. 벼 잎집무늬마름병은 잎집무늬마름병의 원인균인 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani, 한국화학연구원)를 배지(밀기울 90g, 왕겨 15g 및 증류수 100㎖)에서 7일간 배양하여 얻은 배양물을 5엽기 유묘에 접종하고 25℃의 습실상에서 4일간 습실처리한 후, 25℃의 항온실에서 4일간 배양하여 발병을 유도하였다. 토마토 역병은 3 ~ 4엽기 토마토 유묘에 역병의 원인균인 파이토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans, 강릉대학교)의 유주자낭(105 sporangia/㎖)에서 나출된 유주자 현탁액을 분무 접종한 후 25℃의 습실상에서 2일간 습실처리하고 25℃의 항온항습실에서 1일간 배양하여 발병을 유도하였다. 토마토 잿빛곰팡이병은 토마토 3 ~ 4엽기 유묘에 잿빛곰팡이병의 원인균인 보트라이티스 시네리아(Botrytis cinerea, 한국화학연구원)의 포자 현탁액(106 spores/㎖)을 처리한 후, 20℃의 습실상에서 3일간 배양하여 발병을 유도하였다. 밀 붉은녹병은 1엽기 유묘에 활물기생균으로 알려진 녹병의 원인균인 퍽시니아 리콘디타(Puccinia recondita, 인천대학교)의 포자를 250 ㎍/㎖의 트윈 20 용액에 0.67 g spores/ℓ의 양으로 현탁하여 분무 처리하고 20℃의 습실상에서 하루 동안 습실처리한 후 20℃의 항온실로 옮겨 6일간 배양하여 발병을 유도하였다. 보리 흰가루병은 보리의 1엽기 유묘에 숙주 식물에서 계대배양된 흰가루병의 원인균인 에리시페 그래미니스 폼 스피시스 호르데이(Erysiphe graminis f. sp. hordei, 한 국화학연구원)의 포자를 털어서 접종하고 20℃의 항온실에서 7일간 배양하여 발병을 유도하였다. 벼 도열병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병은 접종 7일 후, 벼 잎집무늬마름병은 접종 8일 후, 그리고 토마토 잿빛곰팡이병과 토마토 역병은 접종 3일 후에 병반 면적율을 조사하였다.
한편, 고추 탄저병에 대한 방제활성 실험을 위해서는, 지름 7.0㎝의 플라스틱 포트에 원예용 상토를 70% 정도 채운 후 최아된 고추 종자를 파종하고, 이를 온실에서 3 ~ 4엽기까지 키운 다음 상기에서 준비된 천속단의 메탄올 추출물 시료를 엽면 살포하였다. 시료 살포 후 24시간 동안 상온에서 건조시킨 다음 고추 탄저병원균인 콜레토트리쿰 코코데스(Colletotrichum coccodes, 고려대학교)의 포자 현탁액(4×105 포자/㎖)을 분무 접종하였다. 습실상에서 2일간 발병시킨 후 25℃의 항온실에 1일간 방치하였고, 접종 3일 후에 병반면적율을 조사하였다.
상기로부터 얻은 병반면적율을 이용하여 다음과 같은 식에 따라 방제가를 계산하였다.
상기 표 1에 나타난 바와 같이, 백하수오 뿌리의 메탄올 추출물은 7가지 식물병 중 특히 보리 흰가루병에 88%의 강한 항균효과를 보여주었고 밀 붉은녹병에 대해서도 방제활성을 나타내었다.
[실시예 2] 방제 활성성분의 분리, 정제
백하수오 뿌리의 건조시료 3kg에 7ℓ의 80% 메탄올을 가한 후 상온에서 1일간 추출하여 얻은 메탄올 추출물을 여과지를 사용하여 여과한 다음 여과액을 감압 농축하여 600g의 추출물을 얻었다. 이 메탄올 추출물을 2ℓ의 70% 메탄올에 용해시킨 후 동량의 n-헥산으로 2회 추출한 후 n-헥산층과 수용액층을 감압 농축하였다. 농축한 수용액층을 다시 2ℓ의 증류수로 용해한 후 동량의 에틸아세테이트(EtOAc)와 부탄올로 2회씩 각각 순차적으로 추출하였고 유기용매 추출물 및 수용액층을 감압 농축한 후 실시예 1과 동일한 방법으로 7가지 식물병에 대한 방제활성을 조사하였다.
그 결과 상기 표 2에 나타난 바와 같이, 에틸아세테이트(EtOAc)층이 7가지 식물병에 대해 전반적으로 가장 높은 방제활성을 보여 에틸아세테이트(EtOAc)층을 각각 별도로 방제 활성성분의 분리 및 정제에 사용하였다.
에틸아세테이트(EtOAc)층(41g)으로부터 활성성분을 분리하기 위하여 클로로프롬:메탄올 혼합액(95:5, v/v)을 전개용매로 하는 실라카겔 컬럼 크로마토그래피(5×60㎝, Kiesel gel 60, 70-230 mesh, 500g: Merck)를 실시하였다. 이로부터 얻은 용출액을 분취한 후 씬 레이어 크로마토그래피(TLC: Kiesel gel 60 F254, 0.25㎜; Merck)로 분석하였다. TLC의 패턴에 따라 크게 8개 분획물로 나누고 그 중 활성이 비슷하고 알에프 값(Rf value)이 동일한 F1 내지 F3의 3개 분획을 다시 n-헥산층:아세톤 혼합액(3:2, v/v)을 전개용매로 하는 실라카겔 컬럼 크로마토그래 피(5.7×50㎝, Kiesel gel 60, 230-400 mesh, 600g: Merck)로 분석하여 6개의 분획물로 나누었다. 그 중 F13을 메틸렌클로라이드:n-헥산:메탄올(5:5:1, v/v/v)을 전개용매로 하는 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 실시하고 70% 메탄올로 C18 컬럼 크로마토그래피(50g, 2×30㎝)를 실시하였고, Sep-Pak C18 카트리쥐(35 cc(10g), Waters사; 2.5×5.5㎝)와 70% 메탄올을 이용하여 2회 실시하여 물질 1 (160㎎)을 순수하게 분리하였다. F14도 동일한 과정을 거쳐 물질 2(475㎎)를 순수하게 분리하였다. F6(2.89g)은 C18 컬럼 크로마토그래피(50g, 2×30㎝)를 70% 메탄올을 용출용매로 사용하여 분리한 다음, 100% 메탄올로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피(50g, Sigma사; 2×30㎝)를 실시하여 422㎎의 물질을 얻었다. 이 분획의 경우 더 순화하기 위하여 분리용 HPLC를 실시하였으며, 그 조건은 다음과 같다. 컬럼은 Capcell Pak C18(20mm×250mm), 용출용매로는 증류수-아세토나이트릴 그래디언트 시스템, 유속은 10ml/min, 검출파장은 220nm과 275nm의 조건에서 물질 3은 29.2분과 29.8분 사이에서, 물질 4는 31.2분에서 31.8분 사이에서 용출되었고 용출액을 감압농축하여 물질 3(99㎎)과 물질 4(107㎎)를 순수하게 분리하였다.
분리한 물질의 순도를 조사하기 위하여 컬럼은 Cosmosil C18(2) (150 mm× 4.6mm), 용출용매로는 증류수-아세토나이트릴 그래디언트 시스템, 유속은 1㎖/min으로 주입량 10㎕, 검출파장은 220nm과 275nm의 조건으로 HPLC 분석을 실시하였다.
F8(870㎎)은 100% 메탄올로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피(2×30㎝)를 실시하였고, 얻어진 590㎎을 클로로프롬:메탄올(5:1, v/v)조건으로 실라카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 더 순화하기 위하여 분리용 HPLC를 이용하여 분리하 였으며, HPLC 조건은 F6분획과 동일한 방법으로 실시하였다. 그 결과 27.8분과 28.8분 사이에서 물질 5가 용출되었고, 29.7분에서 30.2분 사이에서 물질 6이 용출되었으며 용출액을 감압농축 후 각각의 무게를 측정한 결과 물질 5는 74㎎, 물질 6은 85㎎이었다.
[실시예 3] 방제 활성성분의 구조 결정
상기 실시예 2에서 분리된 6개의 방제 활성성분 물질의 구조를 동정하기 위하여 ESI-MS(양이온 mode) 분석을 실시하여 분석한 결과 물질 1은 [M+Na]+ 이온이 m/z 1090.1에서 나타나, 분자량이 1067로 추정되었으며, 상기 물질 1의 정확한 구조를 확인하기 위하여 13C-NMR, 1H-NMR, DEPT135°, 1H-13C COSY 및 1H-1H COSY 분석을 실시한 결과, 분자량이 1067이며, 분자식은 C56H90O19로 결정하였다. 또한 각각의 탄소와 수소의 위치를 결정하였고, 이 NMR data는 Tsukamoto(The structures of six glycosides, Wilfoside C1N, C2N, C3N, C1G, C2G and C3G, with novel sugar chain containing a pair of optically isomeric sugars. Tetrahedron. 41. 1985b. 927-934) 등이 보고한 월포사이드 C1N(wilfoside C1N), 즉 caudatin 3-O-α-L-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-α-L-diginopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranoside과 일치하였다.
물질 2의 분자량을 추정하고자 양이온 mode의 ESI-MS분석을 실시하였다. 그 결과 [M+NH4]+ 이온이 m/z 1105.2에서 나타나 분자량이 1087로 추정되었다. 상기 물 질 2의 정확한 구조를 결정하기 위하여 13C-NMR과 1H-NMR를 포함하여 다양한 1D와 2D NMR 분석 결과 물질 2의 분자량은 1087이며, 분자식은 C58H86O19로 결정되었다. 이러한 기기분석 데이터를 기존에 보고된 물질들과 비교한 결과, 이 NMR data는 Tsukamoto(The structures of six glycosides, Wilfoside C1N, C2N, C3N, C1G, C2G and C3G, with novel sugar chain containing a pair of optically isomeric sugars. Tetrahedron. 41. 1985b. 927-934) 등이 보고한 월포사이드 K1N(wilfoside K1N), 즉 kidjoranine 3-O-α-L-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-α-L-diginopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranoside와 일치하였다. 상기 물질 1(Wilfoside C1N)과 물질 2(wilfoside K1N)의 구조를 비교할 때 글리코시드 일부는 일치하는 데 비하여 단지 C12의 구조에서 차이를 보였다.
물질 3의 양이온 mode의 ESI-MS분석을 실시한 결과, [M+NH4]+ 이온은 m/z 1267.2에서 나타남에 따라 분자량이 1249로 추정되었다. 물질 3의 정확한 구조를 확인하기 위하여 13C-NMR, 1H-NMR, DEPT135° 및 다양한 mode의 2D NMR 분석을 실시한 결과, 분자량이 1248.9이며 분자식이 C64H96O24로 결정되었다. 이들 기기분석 데이터를 기존에 나와 있는 문헌과 비교한 결과 물질 3의 구조는 Chen(Cynauricuoside A, B, and C, steroid glycosides from the root of cynanchum auriculatum. Acta Botanica Yunnanica 12. 1990. 197-210.) 등이 Cynanchum auriculatum에서 분리하 여 보고한 시나우리코사이드 A(cynauricuoside A), 즉 kidjoranine 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-α-L-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-α-L-diginopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranoside와 일치하는 것으로 나타났다. 또한 시나우리코사이드 A(cynauricuoside A)는 월포사이드 K1N(wilfoside K1N)과 유사한 구조를 갖고 있었으며, 글루코실피라노사이드(glucosylpyranoside)기가 하나 더 붙은 사포닌(saponin)이었다.
물질 4는 양이온 mode로 ESI-질량분석을 실시한 결과, [M+NH4]+ 이온이 m/z 1247.3에서 나타나 분자량이 1229로 추정되었다. 물질 4를 13C-NMR, 1H-NMR, DEPT135°, 1H-13C COSY 및 1H-1H COSY 분석을 통하여 분자량이 1229이며, 분자식이 C62H100O24임을 결정하였고, 물질 4의 기기분석 결과는 Tsukamoto(The structures of six glycosides, Wilfoside C1N, C2N, C3N, C1G, C2G and C3G, with novel sugar chain containing a pair of optically isomeric sugars. Tetrahedron. 41. 1985b. 927-934) 등이 보고한 월포사이드 C1G(wilfoside C1G), 즉 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-α-L-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-α-L-diginopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranoside과 일치하는 것으로 나타났다. 월포사이드 C1G(Wilfoside ClG)는 글루코피라노사이드(glucopyranoside)기가 하나 더 있는 것을 제외하고는 월포사이 드 C1N(wilfoside C1N)의 구조와 유사하였다.
물질 5를 양이온 mode의 ESI-질량분석을 실시한 결과, 도 2에서와 같이 [M+NH
4]
+ 이온이 m/z 1428.9에서 나타나 분자량이 1411로 추정되었다. 정확한 구조를 결정하기 위하여
13C-NMR(도 3),
1H-NMR(도 4), DEPT135°,
1H-
13C COSY 및
1H-
1H COSY 분석을 수행하였다. 질량분석과 핵자기공명분석 결과를 바탕으로 분자량은 1411.6이며, 분자식은 C
70H
106O
29라 결정되었다. 물질 5의 경우 시나우리코사이드 A(cynauricuoside A)와 비교할 때 분자량은 약 162(C
6H
10O
5) 정도 차이가 나는데, 이는 한 개의 피라노사이드(pyranoside)가 더 붙어 있는 것을 의미한다. 실제 NMR 분석 결과 물질 5에는 시나우리코사이드 A(cynauricuoside A)와 비교할 때 한 개의 글루코피라노사이드(glucopyranoside)가 더 붙어 있는 것으로 나타나 최종적으로 물질 5는 kidjoranine 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-α-L-cymaropyranosyl-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-α-L-diginopyransyl-(1→4)-β-D-cymaropyranoside로 구조가 결정되었으며, 화학식은 화학식 1로 R
1기가
이었다. 이 물질의 구조는 지금까지 보고되지 않은 신물질이며, 이 물질을 월포사이드 K1GG(wilfoside K1GG)로 명명하였다.
물질 6의 양이온 mode의 ESI 질량분석을 실시한 결과, 도 5에서와 같이 [M+NH
4]
+ 이온이 m/z 1410.1에서 나타나 분자량이 1391.6으로 추정되었다. 정확한 구조를 결정하기 위하여
13C-NMR(도 6),
1H-NMR(도 7), DEPT135°,
1H-
13C COSY 및
1H-
1H COSY 분석을 수행하였다. 질량분석과 핵자기공명분석 결과를 바탕으로 분자량은 1391.6이며, 분자식은 C
68H
110O
29라 결정되었다. 물질 6의 경우 월포사이드 C1G(wilfoside C1G)와 비교할 때 분자량은 약 162(C
6H
10O
5) 정도 차이나는 것으로 보아 한 개의 피라노사이드(pyranoside)가 더 붙어 있음을 알 수 있었고, 실제 NMR 분석 결과 물질 6은 월포사이드 C1G(wilfoside C1G)에 한 개의 글루코피라노사이드(glucopyranoside)가 더 붙어 있는 것으로 나타났다. 이와 같이 물질 6은 caudatin 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-α-L-cymaropyranosyl-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-α-L-diginopyransyl-(1→4)-β-D-cymaropyranoside로 구조가 결정되었으며, 화학식은 화학식 1로 R
1기가
이었다. 이 물질은 지금까지 전혀 보고되지 않은 신물질로서 이 물질을 월포사이드 C1GG(wilfoside C1GG)로 명명하였다.
[실시예 4] 백하수오 추출물 유래의 방제 활성성분의 식물병에 대한 방제활성
상기 실시예 2 및 3에서 백하수오 추출물로부터 분리, 동정된 윌포사이드 C1N(wilfoside C1N), 윌포사이드 K1N(wilfoside K1N), 시나우리코사이드 A(cynauricuoside A), 윌포사이드 C1G(wilfoside C1G), 윌포사이드 K1GG(wilfoside K1GG) 및 윌포사이드 C1GG(wilfoside C1GG)의 생체 내(in vivo) 방제활성을 조사하기 위하여, 벼 도열병, 벼 잎집무늬마름병, 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 붉은녹병, 보리 흰가루병 및 고추 탄저병 등의 총 7가지 식물병에 대하여 하기와 같이 방제활성 실험을 수행하였다.
상기 6가지 활성성분 각각을 메탄올에 용해시킨 후 250㎍/㎖의 트윈 20 용액을 가하여 최종 농도를 125, 250, 500㎍/㎖로 조절하였으며, 모든 시료의 최종 메탄올 농도는 5%로 맞추었다. 이때, 대조군으로는 5% 메탄올과 250 ㎍/㎖의 트윈 20을 함유하는 용액을 사용하였다. 각 식물병당 2개의 포트를 이용하였고, 활성성분 시료를 엽면에 분무 살포한 후 24시간 동안 풍건한 다음 각각의 식물 병원균을 접종하였다. 이들 7가지 식물병에 대한 방제활성은 실시예 1에 기재된 방법에 따라 조사하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
상기 표 3에서 나타난 바와 같이, 분리한 6개의 물질들은 보리 흰가루병과 토마토 역병, 밀 붉은녹병 그리고 토마토 잿빛곰팡이병에 대한 항균 활성을 보였으며, 6가지 물질 중 윌포사이드 C1N(wilfoside C1N)이 가장 높은 활성을 나타내었다. 윌포사이드 C1N(wilfoside C1N)은 토마토 역병과 보리 흰가루병에 대해서 높은 방제 활성을 보였으며 토마토 잿빛곰팡이병과 밀 붉은녹병에 대해서도 방제활성을 나타냈다. 500㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때 토마토 역병과 보리 흰가루병에 94%, 92%의 효과를 보였고, 250㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때에도 토마토 역병과 보리 흰가루병에 각각 85%, 97%의 효과를 보여주었다. 또한 125㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때에도 보리 흰가루병에 대해서는 93%의 높은 방제효과를 보였다. 도 8은 윌포사이드 C1N(wilfoside C1N)과 윌포사이드 C1G(wilfoside C1G)에 의한 보리 흰가루병이 효과적으로 방제된 것을 보여준다. 한편, 월포사이드 K1N(wilfoside K1N)은 보리 흰가루병 보다 토마토 역병에 대해서 더 높은 방제 효과를 보였으며 500㎍/㎖, 250㎍/㎖, 125㎍/㎖의 농도에서 각각 94%, 86%, 75%의 방제효과를 보였다.
윌포사이드 C1G(wilfoside C1G) 역시 토마토 역병과 보리 흰가루병에 높은 활성을 보였는데 500㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때 토마토 역병과 보리 흰가루병에 80%, 92%의 효과를 보였고, 250㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때에도 각각 77%, 88%의 효과를 보여주었다. 또한 125㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때에도 토마토 역병과 보리 흰가루병에 각각 77%, 80%의 높은 방제효과를 보였다. 윌포사이드 C1GG(Wilfoside C1GG)은 보리 흰가루병에 대해서 500㎍/㎖, 250㎍/㎖, 125㎍/㎖의 농도에서 각각 80%, 72%, 42%로 높은 방제효과를 보였다. 하지만 시나우리코사이드 A(cynauricuoside A), 윌포사이드 K1GG(wilfoside K1GG)는 다른 물질들에 비해 보리 흰가루병에 대한 활성이 낮았으며 토마토 역병에 대해서만 중간정도의 활성을 보였다.
이상의 결과를 종합할 때, 카우다틴 글리코시드(caudatin glycoside)계열의 물질들 즉, 윌포사이드 C1N(wilfoside C1N), 윌포사이드 C1G(wilfoside C1G) 및 윌 포사이드 C1GG(wilfoside C1GG)는 보리 흰가루병에 대하여 높은 활성을 보인 반면에 kidjoranine glycoside 계열의 물질들은 흰가루병에 대하여 거의 효과가 없는 것으로 나타났다. 이것은 당 부분보다는 프레그네인(pregnane) 부분의 구조가 흰가루병의 억제에 매우 중요하다는 것을 확인하였으며, 다른 식물병, 즉 토마토 잿빛곰팡이병, 토마토 역병 및 밀 붉은녹병에 대해서는 프레그네인(pregnane) 부분의 구조 보다는 당의 구조가 활성이 깊이 관련되어 있는 것을 확인하였다.
[실시예 5] 추출용매에 따른 방제가의 비교
백하수오 추출물을 살균제로 개발하기 위한 최적 제제를 선발하기 위해서는 시간적인 면이나 경제적인 면을 고려해봤을 때 순수 분리된 물질을 이용하는 것보다는 용매 추출물을 이용하는 것이 더 효율적이기 때문에 최적의 추출용매를 선발하기 위하여 여러 가지 유기 용매로 백사수오를 추출하여 그 용매 추출물의 식물병 방제효과를 조사하였다.
백사수오 뿌리 시료(10g)를 마쇄하여 100㎖의 n-헥산, 에틸아세테이트, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세톤 및 메탄올에 각각 침지시켜 하루 동안 진탕한 다음 여과한 후 감압농축하였다. 각각의 추출물을 메탄올(최종농도 5%)로 용해하여 7가지 식물병에 대하여 처리한 후 방제효과를 측정하였다. 그 결과 n-헥산, 에틸아세테이트, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 메탄올 추출물의 양은 각각 71㎎, 195㎎, 152㎎, 173㎎ 및 1.8g 이었다. 6가지 활성성분 각각을 메탄올에 용해시킨 후 250㎍/㎖의 트윈 20 용액을 가하여 최종 농도를 500과 1,500㎍/㎖로 조절하였으며, 모든 시료의 최종 메탄올 농도는 5%로 맞추었다. 이때, 대조군으로는 5% 메탄올과 250㎍/ ㎖의 트윈 20을 함유하는 용액을 사용하여 추출물들을 7가지 식물병에 대한 방제활성을 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 조사를 하였다.
그 결과, 상기 표 4에 나타난 바와 같이, 에틸아세테이트 추출물이 토마토 역병과 보리 흰가루병에 상대적으로 높은 활성을 보였다. 1,500㎍/㎖에서 토마토 역병과 보리 흰가루병에 대해 각각 85%, 92%의 높은 방제효과를 보였고, 500㎍/㎖에서 보리 흰가루병에 67%의 방제활성이 보였다. 따라서 백하수오의 최적 추출 용매로는 에틸아세테이트가 가장 적합하였다.