KR20240003399A - 고수 추출물을 포함하는 식물병 및 해충 방제용 조성물 - Google Patents
고수 추출물을 포함하는 식물병 및 해충 방제용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 고수 추출물을 포함하는 식물병 및 해충 방제용 조성물, 및 이를 이용한 식물병 및 해충 방제 방법, 농약 조성물 및 비료 첨가용 조성물에 관한 것으로, 상기 식물병 및 해충 방제용 조성물은 고수 추출물을 포함함으로써 식물체로부터 병원체 및 해충을 제거하고 식물 내 저항성을 유도하여 효과적으로 식물병 및 해충을 방제할 수 있으므로, 작물 재배 시 농약이나 비료 첨가제로 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 고수 추출물을 포함하는 식물병 및 해충 방제용 조성물, 및 이를 이용한 식물병 및 해충 방제 방법, 농약 조성물 및 비료 첨가용 조성물에 관한 것이다.
농업 분야에서는 생산량을 늘리기 위한 하나의 방법으로 식물의 성장에 영향을 미치는 식물병이나 식물의 생산량 또는 품질에 직접적인 피해를 주는 해충을 방제하기 위해 주로 유기 화합물을 기초로 한 방제 조성물을 사용하여 왔다. 하지만 화학 방제 조성물은 채소, 과일, 곡식 등에 잔류하여 체내 축적을 통해 각종 질병을 유발할 수 있고 환경 오염 및 농작물 오염 문제 또한 일으킬 수 있어, 최근에는 화학 방제 조성물 대신 유기질 방제 조성물을 사용하려는 추세이다. 그러나 유기질 방제 조성물도 토양의 오염, 연작 장해, 토양양분의 불균형, 병해충 발생 등 화학제와 비슷한 문제점을 갖고 있다. 따라서 종래 방제 조성물을 대체하는 새로운 수단을 개발하기 위한 시도가 계속되고 있다. 그 중 병해충 방제에 효과를 보이는 세균, 진균, 식물 등을 이용한 생물 제제가 큰 주목을 받고 있다. 최근에는 고삼, 백하수오, 대황 등의 한약재나 유칼립투스, 레몬그라스, 라임 등의 허브를 이용한 생물학적 방제용 조성물이 연구 및 개발되고 있다. 이러한 식물 추출물은 환경 및 인체에 무해한 것으로, 이를 이용한 생물학적 방제용 조성물은 염류 집적 등 토양 오염의 환경 문제를 일으키지 않으며, 생태계 안정성 유지에 탁월하여 작물 생산성을 지속적으로 향상시킬 수 있다는 이점이 있다. 이러한 식물종 외에도 식물 병해충에 우수한 방제 효과를 가지는 새로운 소재를 발굴하기 위해서는 여전히 많은 연구가 요구되고 있다.
본 발명은 고수 추출물을 이용한 식물병 및 해충 방제용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용한 식물병 및 해충 방제 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 농약 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 비료 첨가용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 양상은 고수 추출물을 포함하는 식물병 및 해충 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 “식물병”은 세균이나 진균, 바이러스, 기생충 등의 감염으로 인해 식물에 생기는 병을 의미하며, 특히 인간의 필요에 따라 재배되는 작물의 성장, 생산량 및 생존에 피해를 주는 병원체 감염에 의한 질병을 말한다. 본 발명에서의 식물병은 채소, 곡식 등 농작물이나 과일과 같이 열매를 맺는 과수작물에 발생하는 모든 질병을 포함한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 식물병은 세균, 진균 또는 바이러스 감염에 의한 질병인 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 세균 감염에 의한 식물병으로는 무름병균(Pectobacterium carotovorum), 벼흰빛잎마름병균(Xanthomonas oryzae), 노균(Pseudoperonospora cubensis), 벼갈색잎마름병균(Rhynchosporium oryzae), 둘레썩음병균(Clavibacter michiganensis), 풋마름병균(Pseudomonas solanacearum) 등에 의한 것이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
진균 감염에 의한 식물병으로는 탄저병균(Glomerella cingulate), 도열병균(Magnaporthe grisea), 깜부기병균(Ustilago nuda), 잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 이삭누룩병균(Ustilagionidea virens), 잎오갈병균(Taphrina deformans), 잿빛무늬병균(Monilinia fructicola), 줄기마름병균(Cryphonectria parasitica), 청고병(Verticillium dahliae) 등에 의한 것이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바이러스 감염에 의한 식물병으로는 벼위축바이러스(rice dwarf virus), 순무모자이크바이러스(turnip mosaic virus), 박과진딧물매개황화바이러스(cucurbit aphid-borne yellow virus), 오이녹반모자이크바이러스(cucumber green mottle mosaic virus), 오이모자이크바이러스(cucumber mosaic virus), 호박모자이크바이러스(squash mosaic virus), 수박모자이크바이러스(watermelon mosaic virus), 고추모틀바이러스(pepper mottle mosaic virus), 담배모자이크바이러스(tobacco mosaic virus), 토마토모자이크바이러스(tomato mosaic virus) 등에 의한 것이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 “해충”은 정상적인 식물의 성장에 직접 또는 간접적으로 해를 주는 곤충, 응애 등을 포함하는 생물종을 의미하며, 특히 병원체를 매개하거나 식물체에 직접 손상을 입히는 생물을 말한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 해충은 나비목, 매미목, 노린재목 및 총채벌레목으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 나비목으로는 호랑나비, 산호랑나비, 작은멋쟁이나비, 배추희나비, 담배거세미나방, 도둑나방, 배추종나방, 배추흰나비, 열대거세미나방, 파방나방, 담배나방, 검거세미밤나방, 목화바둑명나방 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 매미목으로는 갈색날개매미충, 말매미, 애매미, 털매미, 끝동매미충, 꽃매미, 온실가루이, 담배가루이, 복숭아혹진딧물, 검은맥알락진딧물, 무우테두리진딧물, 조팝나무진딧물, 목화진딧물, 아카시아진딧물, 감자수염진딧물, 보리두갈래진딧물, 사과혹진딧물 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 노린재목으로는 썩덩나무노린재, 알락수염노린재, 톱다리개미허리노린재, 먹노린재, 북쪽비단노린재, 담배가루이 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 총채벌레목으로는 꽃노랑총채벌레, 오이총채벌레, 볼록총채벌레, 파총채벌레, 대만총채벌레, 좀머리총채벌레 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 “방제”는 병원체나 해충에 의한 피해가 발생하지 못하도록 예방하거나 그 피해를 최소화하기 위해 제어, 기피 또는 구제하는 활동을 포함한다.
본 발명에서는 식물병 및 해충의 방제를 위해 고수를 이용할 수 있다.
상기 고수는 미나리과에 속하는 한해살이풀로, 지중해 동부 연안이 원산지이지만 아시아, 유럽, 아메리카 등 전세계적으로 널리 사용되는 항료이다.
본 발명에서 사용된 "고수 추출물”은 고수의 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액이나 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
본 발명에 따른 고수 추출물은 자연에서 채취하거나 상업적으로 재배, 판매하는 고수를 이용할 수 있으며, 이때 고수는 가공하지 않은 날 것이거나 동결, 건조 등의 가공을 거친 상태일 수 있으며, 고수의 잎, 잎자루, 줄기, 뿌리 등을 선택적으로 사용하거나 또는 이들을 모두 사용하여 얻은 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 고수 추출물의 추출은 당 업계에 공지된 추출 방법을 제한 없이 사용하여 얻은 것일 수 있다. 상기 추출 방법은 일례로, 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출, 열수 추출, 가압 추출, 용매 추출 등을 들 수 있으며, 효과적인 활성성분 추출을 위해 2종 이상의 추출 방법을 조합하여 사용할 수 있다.
상기 추출 용매로는 물, 탄소수 1 내지 4개의 알코올, 프로필렌글라이콜, 부틸렌글라이콜, 글리세린, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 클로로포름, 다이에틸에테르, 다이클로로메탄, 헥산 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되어 추출된 것일 수 있다.
본 발명에 따른 고수 추출물은 상술한 추출 방법에 의한 추출물뿐만 아니라 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예를 들어, 일정한 분자량 컷-오프(cut-off) 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시한 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 추출물에 포함될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 고수 추출물은 (S)-리날룰을 포함하는 것일 수 있다.
상기 고수 추출물은 테르펜류 화합물을 다량 함유하는 것으로 알려져 있는데, 특히 (S)-리날룰을 70% 이상의 고농도로 포함한다. 리날룰은 거울상이성질체로 (R)-리날룰과 (R)-리날룰의 형태가 있으며, 이들 형태에 따른 식물병 및 해충 방제 효능 차이에 대해 연구된 바가 없었다.
본 발명에 따른 고수 추출물을 포함하는 조성물은 식물병을 일으키는 병원체 및 해충에 직접 작용하거나 식물 내 저항성을 유도하여 병원체의 감염을 예방하고 해충에 의한 식물체 손상을 최소화할 수 있다.
식물 저항성에 관여하는 물질로는 크게 살리실산(salicylic acid)과 자스몬산(jasmonic acid)이 있으며, 식물이 병원체에 감염되거나 해충에 의해 손상되면 살리실산이나 자스몬산을 형성하여 방어기작에 관여하는 유전자의 발현을 촉발한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 고수 추출물은 (R)-리날룰에 비해 담배, 당근, 감자, 토마토, 박과작물 등 다양한 식물체에 무름병을 일으키는 세균 Pectobacterium carotovorum에 대해 담배에서의 질병 발생률을 현저히 감소시키며, 자스몬산-의존적 신호 경로에 관여하는 리포옥시제나아제(lipooxygenase, LOX) 유전자 및 상처 유도 단백질 키나아제(wound-induced protein kinase, WIPK) 유전자의 발현을 현저히 증가시켜 식물 저항성을 유도함을 확인하였다. 또한, 고수 추출물은 (R)-리날룰에 비해 복숭아혹진딧물(Myzus persicae) 및 검은맥알락진딧물(Calaphis similis)에 대해 우수한 살충효과를 나타내며 진딧물에 의한 섭식이나 흡즙에 의해 살리실산-의존적 신호 경로에 관여하는 발병 관련 단백질 1(pathogenesis-related protein 1, PR1) 유전자의 발현이 증가한 것을 확인하였고, 담배거세미나방(Spodoptera litura) 유충에 대해 섭식 작용을 현저히 감소시키면서 자스몬산-의존적 신호 경로에 관여하는 리포옥시제나아제(LOX) 유전자 및 상처 유도 단백질 키나아제(WIPK) 유전자의 발현을 현저히 증가시켜 식물 저항성을 유도함을 확인하였다.
즉, (R)-리날룰은 병원체 및 해충에 영향을 미치지 못하는 반면, (S)-리날룰을 고농도로 함유하는 고수 추출물은 병원체 감염을 현저히 감소시키며 살리실산 또는 자스몬산-의존적 신호 경로에 관여하는 유전자의 발현을 증가시켜 병원체 또는 해충에 대한 저항성을 유도할 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 고수 추출물을 포함하는 조성물은 (S)-리날룰을 유효성분으로 포함함으로써 식물병 및 해충 방제 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 방제용 조성물은 고수 추출물의 제형 그대로 제조되거나, 또는 농약학적으로 허용 가능한 담체와 혼합되어 유제, 용액제, 현탁제, 수화제, 유동제, 분제, 과립제, 분산제 등으로 제형화될 수 있다
상기 농약학적으로 허용 가능한 담체는 본 발명의 방제용 조성물의 유효성분과 배합되어 그 유효성분의 활성을 저해하지 않으면서 그 유효성분의 살포, 저장 및/또는 운반을 촉진시키고 식물에 허용 가능한 이상의 독성을 나타내지 않는 물질을 말한다.
상기 담체는 토양 천연 광물 (예를 들면, 카올린, 점토, 활석, 초크), 토양 합성 광물 (예를 들면, 고분산 실리카, 실리케이트), 탄소 기재 물질 (예를 들면, 목탄, 역청), 황, 천연 또는 합성 수지, 비료, 셀룰로스 기재 물질 (예를 들면, 톱밥, 옥수수 속대), 물, 방향족 용매 (예를 들면, 톨루렌, 자일렌), 파라핀 (예를 들면, 광유 분획), 알코올 (예를 들면, 메탄올, 부탄올, 펜탄올, 벤질알코올), 케톤 (예를 들면, 시클로헥사논, 메틸히드록시부틸케톤, 디아세톤알코올, 메시틸옥사이드, 이소포론), 락톤 (예를 들면, 감마-부티로락톤), 피롤리돈 (예를 들면, 피롤리돈, N-메틸피롤리돈, N-에틸피롤리돈, n-옥틸피롤리돈), 아세테이트 (예를 들면, 글리콜 디아세테이트), 글리콜, 디메틸 지방산 아미드, 지방산, 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 방제용 조성물은 제형화를 위해 계면활성제 또는 보조제를 더 포함할 수 있다.
상기 계면활성제로는 에틸렌옥사이계, 다이에탄올아민계, 솔비톨계, 글리세린계 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 보조제로는 습윤제, 분산제, 증량제, 부동제, 증점제, 보존제, 전착제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 방제용 조성물에 포함되는 유효성분의 농도는 식물체의 생육 정도, 경작지 환경, 식물병의 발병 정도, 해충 개체수 등을 고려하여 당업자에 의해 적절하게 조절할 수 있다.
본 발명에 따른 방제용 조성물은 관주용, 침지용, 엽면 살포용, 종자 소독용, 농기구 소독용 등으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 전술한 식물병 및 해충 방제용 조성물을 식물체 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 및 해충 방제 방법을 제공한다.
상기 처리 방법으로는 종자처리, 경엽처리, 가지처리, 관주처리, 침지처리, 토양처리, 농기구소독 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 고수 추출물을 포함하는 식물병 및 해충 방제 활성을 가지는 농약 조성물을 제공한다.
상기 농약 조성물은 병원체, 해충, 잡초 등을 없애거나 작물이 잘 자라게 하는 약품으로, 살균제, 살균제, 발아제, 생장촉진제 등으로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양상은 고수 추출물을 포함하는 식물병 및 해충 방제 활성을 가지는 비료 첨가용 조성물을 제공한다.
상기 비료 첨가용 조성물은 토지의 생산력을 높이고 식물의 촉진하기 위한 비료의 보조제로 이용가능한 물질이다.
본 발명에 따른 농약 조성물 및 비료 첨가용 조성물은 유효성분으로 고수 추출물 또는 이를 포함하는 조성물을 포함하며, 고수 추출물에 의한 활성이 나타날 수 있도록 적절한 농도로 포함할 수 있다.
상기 농약 조성물 및 비료 첨가용 조성물은 유효성분 이외에 당업계에 공지된 일반적인 성분 (예를 들면, 용매, 담체, 유화제, 분산제, 보조제 등)이 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 식물병 및 해충 방제용 조성물은 고수 추출물을 포함함으로써 식물체로부터 병원체 및 해충을 제거하고 식물 내 저항성을 유도하여 효과적으로 식물병 및 해충을 방제할 수 있으므로, 작물 재배 시 농약이나 비료 첨가제로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 (A) 담배 및 (B) 자작나무를 이용하여 세균성 병원체 및 식엽성 곤충에 대한 ISR 생물검정 시스템을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 담배에서 세균성 병원체 Pcc에 대한 고수 오일의 ISR 생물검정 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 세균성 병원체 Pcc가 처리된 담배에서 고수 오일에 의한 (A) NtLOX 및 (B) NtWIPK 유전자의 발현 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 고수 오일에 의한 진딧물 개체 수 감소를 나타낸 것이다. A는 M. persicae에 대한 담배에서의 ISR 생물검정 결과이고, B는 C. similis에 대한 자작나무에서의 ISR 생물검정 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 고수 오일에 의한 (A) S. litura 유충의 체중 감소 및 (B) S. litura 유충으로부터의 식물 잎 피해 감소를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 고수 오일에 의한 식물 방어 유전자 발현 유도를 나타낸 것이다. A 및 B는 각각 S. litura 유충 및 진딧물 M. persicae 에 대한 식물 방어 유전자 발현 변화를 보여준다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 담배에서 세균성 병원체 Pcc에 대한 고수 오일의 ISR 생물검정 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 세균성 병원체 Pcc가 처리된 담배에서 고수 오일에 의한 (A) NtLOX 및 (B) NtWIPK 유전자의 발현 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 고수 오일에 의한 진딧물 개체 수 감소를 나타낸 것이다. A는 M. persicae에 대한 담배에서의 ISR 생물검정 결과이고, B는 C. similis에 대한 자작나무에서의 ISR 생물검정 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 고수 오일에 의한 (A) S. litura 유충의 체중 감소 및 (B) S. litura 유충으로부터의 식물 잎 피해 감소를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 고수 오일에 의한 식물 방어 유전자 발현 유도를 나타낸 것이다. A 및 B는 각각 S. litura 유충 및 진딧물 M. persicae 에 대한 식물 방어 유전자 발현 변화를 보여준다.
이하, 첨부된 도면을 참조하며 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이러한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시적으로 제시된 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이러한 예시적인 설명에 의하여 제한되는 것은 아니다.
1. 재료 및 방법
1-1. 식물 성장 조건
1-1-1. 담배 재배
담배(Nicotiana tabacum cv. Xanthi-nc) 씨앗을 1.5% (v/v) 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite)으로 15분간 멸균한 후 10분간 증류수로 3회 세척하였다. 멸균된 씨앗을 1/2 MS (Duchefa Biochemie) 배지 (1.5% 수크로스 및 1.5% 식물성 한천)에 심어 식물 챔버 (25℃, 명암 14시간/10시간) 내에서 1주일간 배양하였다.
세균성 병원체에 대한 ISR 생물검정(bioassay)을 위해 식물 배양 접시(Plant culture dish) (SPL)에 1/2 MS 배지 40 ml를 넣어 굳힌 뒤, 35 mm 페트리 접시 (petri dish) 뚜껑을 한쪽 편에 넣어 식물배양용 배지를 준비하였다. 1주일 된 담배 실생(seedling)을 이식하여 식물 챔버에서 2주간 배양하였다.
진딧물에 대한 ISR 생물검정을 위해 세균성 오염을 최소화하고 외부 요인을 줄이기 위해 수경재배 방식으로 수행되었다. 먼저 페트리 접시 (60 × 15 ㎜, SPL)에 1/2 MS 액체배지 18 ml를 붓고 페트리 접시를 폴리머 필름 (3MTM TegadermTM film)으로 감쌌다. 그리고 준비된 페트리 접시에 1주일 된 담배 실생을 이식하고 무균 상태를 유지하기 위해 식물 배양 접시 (100 × 50 mm, SPL)에서 배양하였다. 모든 식물 배양 접시는 식물 챔버에서 3주간 배양되었다.
1-1-2. 자작나무 재배
자작나무(Betula utilis) 씨앗을 1.5% (v/v) 차아염소산나트륨으로 30분간 멸균한 후 10분간 증류수로 3회 세척하였다. 멸균 후 씨앗을 1/2 MS 한천 배지에 심어 식물 챔버 (25℃, 명암 14시간/10시간) 내에서 1주일간 배양하였다.
자작나무 이식을 위해 100 ml 키 큰 비커에 1/2 MS (1.5% 수크로스 및 0.4% 젤라이트) 130 ml를 붓고 비커에 폴리머 필름을 씌웠다. 그리고 준비된 비커에 1주일 된 자작나무를 이식하고 조직 배양 용기 (Incu Tissue culture container, SPL)에서 배양하였다. 모든 조직 배양 용기는 식물 챔버에서 5주 동안 배양되었다.
1-2. 세균성 병원체 및 식엽성 곤충 접종 준비
담배에 무름병(soft rot disease)을 일으키는 세균성 병원체 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum SCC1(Pcc)는 한국생명공학연구원에서 제공받았다. Pcc는 암피실린 100 μg/ml을 보충한 LB 한천 배지에서 30℃, 2일간 배양되었다. Pcc의 세포는 장기 보존을 위해 사용하기 전까지 -70℃에서 15% 글리세롤에 보관되었다.
Myzus persicae (반시목 진딧물과)의 집락(colony) 및 Spodoptera litura (인시목 밤나방과)의 알은 경북대학교 곤충분자생리학 실험실에서 얻었고, Calaphis similis (반시목 진딧물과)는 대한민국 진안 지역의 자작나무 농장에서 수집하였다. S. litura의 알은 식물 챔버 (25℃, 40% 상대습도, 명암 14시간/10시간)에서 사육되었으며, 2일령 유충을 ISR 생물검정에 사용하였다. M. persicae 집락은 후추식물에서, C. similis는 어린 자작나무에서 길러졌다. 안정적인 집락을 유지하기 위해 모든 진딧물은 새로운 어린 식물로 옮겨 식물 챔버 (25℃, 40% 상대습도, 명암 14시간/10시간)에서 배양하였다.
1-3. 화합물 준비
(RS)-리날룰 및 (R)-리날룰은 시그마알드리치(Sigma-Aldrich)에서 구매하였고, 74.7% (S)-리날룰을 함유하는 고수 오일(coriander oil)은 머크(Merck)에서 구매하였다. 모든 화학 물질은 멸균 증류수로 희석하여 농도를 100 μM로 맞추어 실험에 사용되었다.
1-4. 세균성 병원체에 대한 ISR 생물검정
식물에서는 병원체 감염에 의해 식물의 방어 작용이 활성화되어 나타나는 저항성 반응을 유도 저항성이라 하며, 살리실산의 신호전달을 통해 활성화되어 감염 부위에 감염되지 않는 부위로 신호가 이동하여 저항성 반응이 나타나는 경우를 전신획득저항성(systemic acquired resistance, SAR), 식물 생장을 촉진하는 근권세균에 의한 뿌리 감염을 통해 에틸렌과 자스몬산에 의해 지상부 식물부위에 저항성이 유도되는 것을 유도전신저항성(induced systemic resistance, ISR)이라 한다.
ISR 생물검정은 3주 된 담배를 사용하여 수행되었다. 식물에 리날룰을 노출시키기 위해 페트리 접시 뚜껑에 코튼볼을 위치시킨 뒤, 100 μM (RS)-리날룰, (R)-리날룰 또는 고수 오일 100 μl을 처리하였다. 상기 페트리 접시 뚜껑에 각 물질을 처리한 뒤, 식물 배양 접시를 파라필름으로 감싼 후 7일간 배양하였다.
세균성 병원체를 처리하기 위해, Pcc 세포를 한천 플레이트에서 채취하여 1 × 108 CFU/ml의 농도로 멸균 식염수 (0.85% NaCl)에 현탁하였다. 준비된 PCC 현탁액 중 3 μl를 담배 실생당 2개의 잎에 떨어뜨리고 2일간 식물 챔버에서 배양하였다. 질병 중증도(Disease severity value, DSV)는 병원체 접종 후 48시간 지나서 검사하였으며, '0 = 무증상'에서 '5 = 괴사 증상을 동반하여 매우 심각함'으로 나타냈다 (Ryu et al., Plant physiology 2004).
1-5. 식엽성 곤충에 대한 ISR 생물검정
환경 인자의 영향을 최소화하기 위해 진딧물 M. persicae 및 C. similis와 S. litura 유충에 대한 ISR 생물검정을 멸균된 조직 배양 용기에서 실시하였다. 100 μM의 (RS)-리날룰, (R)-리날룰 및 고수 오일을 3주 된 담배와 5주 된 자작나무 식물에 처리하였다. 모든 용기는 파라필름으로 단단히 밀봉하여 식물 챔버에서 7일간 배양하였다.
진딧물 2종에 대한 ISR 생물검정에서는 미세한 붓을 이용해 성체 진딧물 10마리를 식물 잎으로 옮긴 뒤 1, 3, 5일 후에 진딧물 수를 집계하여 진딧물 증식을 확인하였다.
S. litura 유충에 대한 ISR 생물검정에서는 미세한 붓을 이용해 2일령 유충을 식물 잎으로 옮기고, 1주일 후 유충의 체중을 측정하였다.
1-6. RNA 추출 및 qRT-PCR
N. tabacum 잎은 Pcc 접종 후 0 및 12시간이 지나서, S. litura 처리 후 24시간 지나서 회수하였다. 잎 샘플은 액체 질소를 이용하여 분쇄하고 제조사 지침에 따라 TRIzolTM 시약 (Invitrogen)을 사용하여 담배 잎 0.2 g에서 총 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA는 DNA freeTM (Invitrogen)을 사용하여 정제하여 유전체 DNA 오염을 제거하였다. cDNA는 M-MLV 역전사 키트 ((주)엔지노믹스)를 사용하여 DNase가 처리된 RNA (1 μg)로 합성되었다. 이후 정량 PCR은 Eco Real-Time PCR 시스템을 사용하여 Quantinova SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen)로 수행되었다. 방어 관련 유전자 NtPR1, NtNPR1, NtPAR, NtLOX, NtSIPK 및 NtWIPK의 전사 수준을 측정하였고, 내부 기준(internal reference)으로 EF-1α를 사용하였다. 여기서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다. PCR 수행 조건은 95℃에서 2분 반응 후 95℃에서 15초 및 56℃에서 30초를 40주기로 반응시켰다. 상대 전사 수준은 3회 반복 실험을 바탕으로 2-ΔΔCT 방법을 통해 계산되었다 (Livak and Schmittgen, 2001).
| 유전자 | 프라이머 서열 (5'-3') | 서열번호 | |
| NtPR1 | 정방향 | GCT GAG GGA AGT GGC GAT TTC | 1 |
| 역방향 | CCT AGC ACA TCC AAC ACG AAC C | 2 | |
| NtNPR1 | 정방향 | GAA TGA TAC GGC AGA AGA | 3 |
| 역방향 | AGA TGA GGA GAT GTT GTT AG | 4 | |
| NtLOX | 정방향 | ATC GCC CTA CAT TAA GCC GA | 5 |
| 역방향 | GCT TCT TTC CAA ACC TCG CA | 6 | |
| NtPAL | 정방향 | GAG GCT GCT GCT ATT ATG GA | 7 |
| 역방향 | ATC AAA GGG TTA TCG TTC ACT | 8 | |
| NtWIPK | 정방향 | CCA AGT ATC GTC CTC CTA TTA TG | 9 |
| 역방향 | TCA CGG AGA GTC CTC TTA GC | 10 | |
| NtSIPK | 정방향 | GAT TGT TGT CAG TTT GAT CTC CA | 11 |
| 역방향 | GCG ATC CAC CTC ATC AGA TAC | 12 | |
| EF-1α | 정방향 | CTT GCT TAC ATT GCT CTC | 13 |
| 역방향 | TCA TAG TTC TTC TCC ACA G | 14 | |
1-7. 통계 분석
ISR 생물검정 및 qRT-PCR 데이터는 분산 분석에 의해 통계적으로 분석되었으며 각 값을 평균±SEM로 나타내고, 처리군 (n = 6)에 대한 평균은 SPSS 버전 21.0 (SPSS)을 사용하여 p = 0.05에서 LSD 테스트로 분리되었다.
2. 결과
2-1. 세균성 병원체에 대한 고수 오일의 ISR 유도
고수 오일과 리날룰에 의한 ISR 유도를 비교하기 위해 담배(N. tabacum)와 세균성 무름병 병원체 Pcc를 사용한 ISR 생물검정 시스템을 시도하였다. 담배 실생에 (RS)- 및 (R)-리날룰과 고수 오일을 100 μM씩 7일가 노출한 후 Pcc 현탁액 3 μl를 각 담배 식물체의 잎 두개에 떨어뜨렸다. 음성 대조군으로는 멸균 증류수를 사용하였다. 그 결과, 도 2를 참조하면, (RS)-리날룰 및 고수 오일은 질병 중증도를 각각 54.4% 및 51.1%까지 유의미하게 감소시킨 반면, ( R )-리날룰에 의한 질병 발생률은 음성 대조군과 유사하였다. 이러한 결과를 통해 (R)-리날룰은 ISR-유도에 관여하지 않으며, (S)-리날룰이 ISR을 유도함을 알 수 있었다.
2-2. 담배에서 세균성 병원체에 대한 방어 유전자 발현을 유도하는 고수 오일
고수 오일에 의한 방어 유전자 발현을 확인하기 위해 qRT-PCR을 사용하였다. RNA 추출을 위한 샘플 준비에서는 담배 식물을 리날룰 또는 고수 오일에 7시간 노출하고 Pcc를 ISR 생물검정과 동일한 방법으로 잎 두개에 접종하였다. 리날룰 또는 고수 오일에 0 및 12시간 노출 후 총 RNA를 추출하여 살리실산(SA) 및 자스몬산(JA)-의존적 신호 경로와 관련된 유전자 발현을 측정하였다. 그 결과, 도 3을 참조하면, JA 경로와 관련된 유전자 NtLOX 및 NtWIPK는 (RS)-리날룰 및 고수 오일에 12시간 노출된 후 발현이 유의미하게 증가하였으나, (R)-리날룰 노출에서는 유전자 발현 변화가 없었다. 한편, SA 경로 관련 유전자의 경우 리날룰 또는 고수 오일에 의한 발현 변화가 없었다. 이러한 결과는 고수 오일 내 (S)-리날툴이 ISR 유도인자임을 제시한다.
2-3. 고수 오일에 의한 진딧물 생장 억제
식엽성 곤충을 고수 오일로 통제하기 위해, 진딧물 M. persicae 및 C. similis과 S. litura 유충을 대상으로 담배 및 자작나무의 수경재배를 이용하여 ISR 생물검정을 수행하였다. 7일간 고수 오일에 노출시킨 후 진딧물 10마리를 식물 잎에 옮겨 1일, 3일 및 5일차에 진딧물 수를 집계하였고, S. litura 유충 (2일령) 1마리를 식물 잎에 옮겨 7일 후 체중을 측정하였다.
그 결과, 도 4를 참조하면, 진딧물의 개체수는 고수 오일에 노출된 경우 점차 감소하였으며, 3 및 5일차에 진딧물 수가 대조군 대비 유의미하게 감소하였으나, (R)-리날룰이 처리된 경우에는 진딧물 수가 감소하지 않았다. 이 결과는 고수 오일 내 (S)-리날룰이 식엽성 곤충에 대한 식물 ISR을 촉발시켰음을 나타낸다.
또한 (RS)-리날룰 및 고수 오일에 노출된 담배 식물에서는 S. litura 유충의 체중이 유의미하게 감소하였으나, (R)-리날룰로 처리된 식물에서는 체중 변화가 없었다 (도 5A). (RS)-리날룰 및 고수 오일에 노출된 식물 잎 손상은 음성 대조군과 비교하여 유의하게 감소되었다 (도 5B). 이러한 결과를 통해 고수 오일은 식물의 ISR을 유발하고 S. litura의 잎 섭식을 억제하여 유충의 무게를 감소시킨다고 추측할 수 있다.
2-5. 식엽성 곤충에 대한 고수 오일의 식물 방어 유전자 발현 유도
고수 오일에 의해 유도된 식물 방어 반응을 확인하기 위해 qRT-PCR을 사용하였다. 그 결과, 세균성 병원체에 대한 결과와 일관되게, (RS)-리날룰 및 고수 오일에 노출된 식물들은 S. litura에 대항하는 JA 경로의 마커 유전자인 NtWIPK 및 NtLOX의 발현을 촉진하였다 (도 6A). 이는 고수 오일 내 (S)-리날룰이 식물 내 자스몬산의 축적을 준비시키고 식물에 S. litura에 대한 저항성을 부여함을 나타낸다.
한편, 고수 오일은 진딧물 M. persicae에 대한 JA 경로 관련 NtLOX 유전자의 발현에서 유의미한 변화를 나타내지 않았으나, SA 경로의 마커 유전자인 PR1 유전자의 발현을 증가시켰다 (도 6B). 이는 진딧물의 섭식 또는 흡식에 대한 반응으로 식물 내 살리실산이 축적되어 진딧물에 대한 저항성을 부여함을 나타낸다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Composition for preventing plant diseases and pest comprising
coriander extract
<130> BPN221002
<160> 14
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Claims (7)
- 고수 추출물을 포함하는 식물병 및 해충 방제용 조성물.
- 청구항 1에 있어서,
상기 식물병은 세균, 진균 및 바이러스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 감염으로 인한 질병인 것인 식물병 및 해충 방제용 조성물. - 청구항 1에 있어서,
상기 해충은 나비목, 매미목, 노린재목 및 총채벌레목으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인 식물병 및 해충 방제용 조성물. - 청구항 1에 있어서,
상기 고수 추출물은 (S)-리날룰을 포함하는 것인 식물병 및 해충 방제용 조성물. - 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 조성물을 식물체 또는 토양에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 및 해충 방제 방법.
- 고수 추출물을 포함하는 식물병 및 해충 방제 활성을 가지는 농약 조성물.
- 고수 추출물을 포함하는 식물병 및 해충 방제 활성을 가지는 비료 첨가용 조성물.
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| KR101008318B1 (ko) | 2009-01-21 | 2011-01-14 | 한국화학연구원 | 백하수오 추출물을 유효성분으로 함유하는 식물병 방제용 조성물 및 이를 이용한 식물병 방제방법 |
| KR102021550B1 (ko) | 2017-11-30 | 2019-09-16 | (주)현농 | 대황을 이용한 식물 바이러스 방제제 |
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2022
- 2022-06-30 KR KR1020220080698A patent/KR20240003399A/ko not_active Application Discontinuation
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