KR100514517B1 - 초석잠 유래의 항균활성 물질의 분리방법 및 항균활성조성물 - Google Patents

초석잠 유래의 항균활성 물질의 분리방법 및 항균활성조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 초석잠 유래의 항균활성 물질의 분리방법 및 상기 항균활성 물질을 유효성분으로 함유하는 항균활성 조성물에 관한 것으로서, 상기 항균활성 물질은 병원성 세균에 대해 뛰어난 항균활성을 가지며, 40 내지 180℃에서 30분간 열처리에 안정성을 가지고, pH 4 내지 10에서도 안정성을 가지므로, 상기 항균활성 물질을 유효성분으로 함유하는 항균활성 조성물은 의약용 항균제, 항균효과를 가지는 기능성 식품 또는 식품 첨가물로 널리 이용될 수 있다.

Description

초석잠 유래의 항균활성 물질의 분리방법 및 항균활성 조성물{Isolation method of antimicrobial materials obtained from Stachys sieboldii and composition containing the antimicrobial materials}
본 발명은 초석잠 유래의 항균활성 물질을 분리하는 방법 및 상기 항균활성 물질을 유효성분으로 함유하는 항균활성 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 1) 초석잠에 에탄올을 첨가하여 에탄올 추출물을 제조하는 단계, 2) 상기 에탄올 추출물 1중량부에 대해서 헥산 8∼12 중량부, 물 8∼12중량부를 첨가하여 이를 추출 분획한 후 농축하여 헥산 분획물을 제조하는 단계, 3) 상기에서 제조된 헥산 분획물을 헥산 6중량부에 대해 클로로포름 0.1∼2중량부, 에탄올 0.5∼3중량부가 혼합된 용액으로 현탁한 후 실리카겔 컬럼으로 정제하는 단계, 4) 상기 정제 후 얻은 항균활성이 있는 분획물을 헥산 10중량부에 대해 에틸아세테이트 2∼5중량부, 클로로포름 2∼5중량부, 메탄올 0.5∼2중량부, 초산 0.1∼1중량부가 혼합된 용액으로 현탁한 후 실리카겔 컬럼에 용출시키는 단계 및 4) 상기 컬럼으로부터 용출된 항균활성이 있는 분획물을 예비박층크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함하는 초석잠 유래의 항균활성물질의 분리방법 및 상기 분리방법으로부터 얻어진 병원성 세균에 대해 항균활성이 있고, 40 내지 180℃에서 30분간 열처리에 안정성을 가지고, pH 4 내지 10에서도 안정성을 갖는 초석잠 유래의 항균활성 물질을 유효성분으로 함유하는 항균활성 조성물에 관한 것이다.
초석잠(Stachys sieboldii Miq.)은 석잠풀의 뿌리를 제외한 식물체 전체를 지칭하는 약용식물이며, 석잠풀은 떡잎식물로서 통화식물목 꿀풀과의 여러해살이풀로서, 한국·중국 동북부·일본·시베리아 동부·캄차카반도 등지의 산과 들의 습지에서 널리 분포하고 크기는 보통 30-60cm이다. 초석잠의 땅속줄기는 옆으로 길게 벋고 흰색이며, 줄기는 곧게 서고 높이가 30∼60cm이며 횡단면이 사각형이고 모서리를 따라 밑을 향한 센털이 있다. 초석잠의 잎은 마주나고 길이 4∼8cm이며 끝이 뾰족하고 밑 부분이 둥글거나 수평이며 가장자리에 톱니모양이 있으며, 잎 양면에 털이 있고, 잎자루는 길이가 5∼15mm이며 줄기 윗부분의 잎은 잎자루가 없다. 초석잠의 꽃은 6∼9월에 연한 붉은 색으로 피고 가지와 줄기 윗부분의 마디마다 층층이 돌려나고 꽃받침은 길이가 6∼8mm이고 끝이 5개로 갈라지며, 갈라진 조각은 가시처럼 뾰족하다. 초석잠의 화관은 길이가 12∼15mm이고 입술 모양이며, 아랫입술은 다시 3개로 갈라진다. 초석잠의 수술은 4개 중 2개가 길고, 암술은 1개이다. 열매는 분열과에서 갈라진 각 열매이고 길이가 2mm이다.
초석잠은 한방에서 미열이 있고 배뇨가 곤란하며 몸이 붓는 증세에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 최근 연구에서 초석잠의 괴경에 뇌경색 또는 신염에 대해 효과적인 악티오사이드라는 성분이 함유되어 있는 것이 보고되어 있다(Joji Yamahara et al., a medicine magazine, 110, 932-935, 1990). 그러나, 아직까지 초석잠으로부터 유래된 항균활성 물질에 관한 보고는 전혀 없었다.
한편, 항균제 개발을 위해 현재 많은 연구가 진행되고 있으나, 이들 대부분이 미생물의 2차 대사산물이거나 합성 화합물에 관한 연구가 주를 이루고 있다. 그러나 이러한 물질들은 그 독성이 강하여 병원성 미생물뿐만 아니라 정상세포에도 영향을 주어 그 부작용이 문제가 되고 있으며 또한 기존 항균제에 대한 내성을 가지는 내성균주의 출현으로 새로운 항균제의 개발이 절실히 요구되고 있다. 이러한 부작용을 줄이기 위해서는 미생물이나 합성 화합물보다는 안정성이 뛰어난 천연약재를 사용할 수 있을 것이다.
그러므로, 이러한 착안하여 본 발명자들은 천연약재 중에서 항균효과가 있는 약재를 탐색하던 중 초석잠 추출물이 강력한 항균 효과를 나타내는 것을 발견하고, 항균물질로 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 초석잠을 이용하여 초석잠 유래의 항균활성 물질을 분리하는 방법 및 상기 항균활성 물질을 유효성분으로 함유하는 항균활성 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 1) 초석잠에 알콜 또는 알콜 수용액을 첨가하여 알콜 추출물을 제조하는 단계, 2) 상기 알콜 추출물 1중량부에 대해서 헥산 8∼12 중량부, 물 8∼12중량부를 첨가하여 이를 추출 분획한 후 농축하여 헥산 분획물을 제조하는 단계, 3) 상기에서 제조된 헥산 분획물을 헥산 6중량부에 대해 클로로포름 0.1∼2중량부, 에탄올 0.5∼3중량부가 혼합된 용액으로 현탁한 후 실리카겔 컬럼으로 정제하는 단계, 4) 상기 정제 후 얻은 항균활성이 있는 분획물을 헥산 10중량부에 대해 에틸아세테이트 2∼5중량부, 클로로포름 2∼5중량부, 메탄올 0.5∼2중량부, 초산 0.1∼1중량부가 혼합된 용액으로 현탁한 후 실리카겔 컬럼에 용출시키는 단계 및 4) 상기 컬럼으로부터 용출된 항균활성이 있는 분획물을 예비박층크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함하는 초석잠 유래의 항균활성물질의 분리방법을 제공한다.
상기 알콜 추출물은 시료 중량의 약 10배의 알콜을 첨가하여 제조하는 것이 바람직하고, 상기 알콜 또는 알콜 수용액은 10 내지 100%의 에틸알콜(ethyl alcohol), 10 내지 100%의 메틸알콜(methyl alcohol)로 구성된 군으로부터 선택되어 사용될 수 있으며 70~100%의 에틸알콜을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 추출 방법은 냉침, 환류 또는 초음파 등의 방법에 의할 수 있으며 초음파 추출인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기의 분리방법으로 얻어진 초석잠 유래의 항균활성 물질을 함유하는 항균활성 조성물을 제공한다.
본 발명의 항균활성 조성물은 병원성 세균에 대해 항균활성이 있고, 40 내지 180℃에서 30분간 열처리에 안정성을 가지고, pH 4 내지 10에서도 안정성을 가지는 초석잠 유래의 항균활성 물질을 유효성분으로 함유한다. 상기 항균활성 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
즉, 본 발명의 항균활성 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.
항균활성 조성물에서, 초석잠 추출물의 유효용량은 10 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 20 내지 60 mg/kg이며, 하루 1-6 회 투여될 수 있다. 단, 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
본 발명의 초석잠 추출물의 원료인 초석잠은 천연약재로서 안전성이 확보되어 있으며, 특히 본 발명의 초석잠 추출물을 랫트에 경구 투여, 복강 내 투여 및 피하 주사시의 독성 실험을 수행한 결과, 복강 내 투여 독성시험에 의한 50% 치사량(LD50)은 적어도 초석잠 추출물 10 g/kg 이상인 안전한 물질로 판명되었다.
상기 항균활성 물질을 유효성분으로 함유하는 항균활성 조성물은 의약용 항균제, 항균효과를 가지는 기능성 식품 또는 식품 첨가물로 널리 이용될 수 있다.
이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 설명하기 위하여 제시되는 것이며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다.
실시예
<실시예 1> 초석잠의 에탄올 추출물의 제조
환류 냉각관을 부착시킨 플라스크 내에 500g의 초석잠을 넣고 초석잠 중량의 10배량의 75% 에탄올을 가하여 60℃의 수욕상에서 12시간동안 2회 반복 추출한 후 감압여과장치로 여과하였다. 여액을 회전식 진공 건조기(rotary vacuum evaporator, Eyela N-N-series, Japan)를 사용하여 농축하고 이를 동결건조한 후 밀봉하여 4℃의 냉장고에 보관하면서 사용하였다.
<실시예 2> 초석잠의 에탄올 추출물로부터의 항균 활성물질 분리 및 정제
초석잠의 에탄올 추출물을 헥산, 클로로포름, 에틸 아세테이트 및 부탄올로 순차 분획하여 항균 활성을 확인한 결과 헥산 분획물이 다른 순차 분획물에 비하여 항균효과가 높아 헥산 분획층으로부터 도 1의 순서에 따라 항균활성 물질을 분리하였다. 헥산 분획물(28.5g)을 실리카겔(500g, 70∼230mesh, Merck)에 헥산 : 클로로포름：에탄올( 6 : 0.5 : 1, v/v) 용매로 현탁하여 충진된 컬럼(6.0×50cm)에 흡착시킨 후 클로로포름과 에탄올의 비율을 단계적으로 증가시키면서(5:1:2(v/v) →메탄올) 용출시키고 박막 크로마토그래피(thin layer chromatography:TLC)로 확인하여 총 7개의 소획분(F1∼F7)을 얻었고 이 중에서 항균활성과 수율이 우수한 F7 획분으로부터 다시 항균 활성물질을 분리하였다. 획분 F7(7.20g)을 헥산:클로로포름:에틸아세테이트:메탄올:초산(10:3:3:1:0.5, v/v)으로 현탁하여 충진된 실리카겔 컬럼(silica gel column; 180g, 4.0×35cm)에서 메탄올 비율을 단계적으로 증가시키면서 용출시켜 총 8개의 소획분(F7-1 ∼ F7-8)을 얻었고, 이 중에서 항균효과와 수율이 높은 F7-2(2.83g) 획분을 다시 헥산:에틸아세테이트:부탄올 (10:3:2, v/v) 용매계로 예비박막 크레마토그래피(preparative thin layer chromatography: PTLC, silica gel 60, 2mm, Merck Co.)에서 5개의 소획분을 얻었다. 이중에서 항균 효과가 인정되면서 수율과 정제도가 우수한 F7-2-5(0.25g) 소획분을 얻었다. 1, 2, 3차의 컬럼 크로마토그래피의 획분들은 감압농축 한 후 TLC 상에서 전개시킨 후 UV (254nm, 365nm)의 흡수 밴드(band)와 황산(분수) 발색시 나타나는 점적을 분취하였다.
초석잠 에탄올 추출물의 활성성분에 대한 유기용매별 수율은 표 1에 도시된 바와 같이, 물로써 추출한 경우 수율이 26.42%로 가장 높고, 헥산은 9.46% 정도이고 에틸아세테이트, 부탄올의 수율은 각각 5% 정도인 반면에 클로로포름 추출물의 수율은 4.53%로 가장 낮았다.
표 1. 초석잠 에탄올 추출물로부터 획득한 용매 분획에 대한 분획수율
용매 수율(%, w/w)
헥산 9.46
클로르포름 4.53
에틸아세테이트 5.74
부탄올 5.33
물 26.42
전체 51.48
<실험예 1> 항균활성 검사
1. 항균실험에 사용된 균주 및 배지
항균시험에 사용된 균주 및 배지는 하기의 표 2와 같다.
표 2. 항균실험에 사용된 균주 및 배지의 목록
테스트용 미생물 사용된 배지
Listeria monocytogenes ATCC 15313 Listeria monocytogenes ATCC 19111 Listeria monocytogenes ATCC 19113 Listeria monocytogenes ATCC 19114 Listeria monocytogenesATCC 43256 Salmonella typhimurium ATCC 14028 Bacillus cereus ATCC 33844 Esherichia coli BHR-12 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 TSB & TSATSB & TSATSB & TSATSB & TSATSB & TSANB & NANB & NATSB & TSATSB & TSANB & NA
여기서, TSB & TSA는 Tryptic soy broth/agar(Difco)를 의미하고, NB & NA : Nuritent broth/agar(Difco)를 의미한다.
2. 페이퍼 디스크법
항균력 검사는 페이퍼 디스크법(paper disc method)을 이용하였다. 즉, 멸균된 트립틱 쏘이 아그(tryptic soy agar: TSA, Difco)배지를 페트리 디쉬(petri dish)에 15mL씩 분주하여 응고시키고, 별도로 트립틱 쏘이 브로스(tryptic soy broth)에서 35℃에서 24시간 전배양한 각종 시험균액을 무균적으로 첨가하여 잘 혼합한 중층용 배지를 5mL씩 기층용 배지 위에 분주하여 2중의 평판배지를 만들었다. 각 추출물을 멸균된 페이퍼 디스크(paper disc)에 일정량씩 흡수시킨 후, TSA배지에 올려놓고 난 다음, 35℃의 배양기(incubator)에서 24~48시간 배양하여 디스크 주변의 클리어 존(clear zone, mm)을 측정하였다.
그 결과, 초석잠 에탄올 추출물의 각종 미생물별 항균활성이 표 3에 나타나 있다. 초석잠 에탄올 추출물은 1000 ㎍/disc의 농도에서 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) ATCC 13720와 스트렙토코커스 아우레우스(Streptococcus aureus) ATCC 25923에 대해 19mm의 생육억제대를 나타내었고, 리스테리아 모노사이토제네스스(Listeria monocytogenes)에 대해서는 균주별로 18∼21mm의 생육억제대를 나타내었다. 그리고 대장균(Escherichia coli)BHR-12 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) ATCC 27853 에 대하여 각각 15mm, 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella enteritidis) ATCC 14028의 경우 18mm의 생육억제대를 나타내어 초석잠 에탄올 추출물은 그람 양성 및 음성균에 대한 뛰어난 항균활성이 있는 것으로 확인되었다.
표 3. 초석잠 에탄올 추출물의 미생물에 대한 항균활성
테스트용 미생물1) 클리어 존(mm)
Listeria monocytogenes ATCC 19111 Listeria monocytogenes ATCC 43256 Listeria monocytogenes ATCC 15313 Listeria monocytogenes ATCC 19113 Listeria monocytogenes ATCC 15114 Salmonella typhimurium ATCC 14028 Bacillus cereus ATCC 13720 Esherichia coli BHR-12 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 202118201819151515
1) 각 박테리아의 최종 세포 농도는 대략 1.0x106세포/mL
또, 초석잠 에탄올 추출물로부터 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 층으로 순차 분획한 후 각 분획물에 대하여 항균활성을 실험한 결과가 표 4에 나타나 있다. 헥산 분획물에서 강한 항균활성을 나타내었으나 클로로포름 분획물에서는 약간의 항균활성을 나타낸 반면, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 분획물의 경우 모든 대상 균주에서 항균활성이 나타나지 않았다.
헥산 분획물은 상기 에탄올 추출물의 항균력 검사시 항균효과가 있었던 대상 균주에 모두에 대하여 항균활성을 나타내었으며 비교적 그람 음성세균보다 그람 양성세균에 대하여 더 강한 항균 활성을 나타내었다. 그리고 모든 대상 균주들 중에서 비교적 항균활성이 높게 나타난 리스테리아 모노시토제네스(Listeria monocytogenes)는 균종별로 항균활성의 차이는 보였으나 생육 억제대(inhibition zone)가 14mm 이상이 되는 균주는 ATCC 19111, 43256 및 15114으로 나타났다. 그람 음성세균에 대한 항균 활성은 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) ATCC 14028 및 대장균(Escherichia coli) BHR-12 균에 대하여 생육 억제대가 12mm로 나타나 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) ATCC 27853에 비해 다소 항균 활성이 높은 것으로 나타났다. 클로로포름 분획물의 경우 그람 음성세균의 경우 헥산 분획물에 비하여 비교적 항균 활성이 떨어짐을 보여주고 있다. 그러나 핵산 분획물이 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)의 모든 균종별에 따른 항균 활성을 나타내었으나, 클로로포름 분획물에서는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 균주 중 3개의 균주에 대해서만 약간의 항균 활성을 나타내었다. 따라서, 초석잠의 각종 유기용매 추출물이 초석잠 에탄올 추출물보다 상대적으로 항균활성이 낮게 나타난 것은 추출 분획 과정에서 항균활성 성분이 핵산과 클로로포름 층으로 이동했기 때문으로 추정된다.
표 4. 초석잠에서 얻은 다양한 용매 분획의 테스트용 미생물에 대한 항균활성
SolventsMicroorganisms Inhibition zone (mm)
Hexane Chloroform Ethylacetate Butanol Water
B. cereusATCC 13720 S. cereus ATCC 25923 L. monocytogenes ATCC 19111 L. monocytogenes ATCC 43256 L. monocytogenes ATCC 15113 L. monocytogenes ATCC 15114 L. monocytogenes ATCC 15313 S. typhimurium ATCC 14028 E. coliBHR-12 P. aeruginosaATCC 27853 14141414121413121210 9ND1010NDND9NDNDND NDNDNDNDNDNDNDNDNDND NDNDNDNDNDNDNDNDNDND NDNDNDNDNDNDNDNDNDND
1) 500㎍의 용매 추출물이 페이퍼 디스크에 흡수되었고 클리어 존의 직경이 측정되었다.
3. 미생물에 대한 최소저해 농도측정
1) 초석잠 헥산 추출물의 최소저해 농도
최소저해 농도(minimum inhibitory concentration, MIC)는 한천배지 확산 평판법으로 측정하였다. 항균물질을 농도별로 각각 조절한 TSA 혹은 NA를 샤아레에 넣어 응고시킨 후 미리 활성화시킨 각 실험균의 배양액을 접종한 다음 37℃에서 24∼48시간 동안 배양하여 증식이 관찰되지 않은 농도로 결정하였다.
초석잠의 용매 분획물에 대한 대상 균주의 최소저해 농도는 표 5에서 도시된 바와 같고, 이는 페이퍼 디스크법을 사용한 결과와 일치하였다.
에탄올 추출물로부터 얻은 헥산 분획물에서는 바실러스 세레우스(B. cereus) ATCC 13720와 리스테리아 모노사이토게네스(L. monocytogenes)균 중에서 ATCC 43256, ATCC 15113, ATCC 19111 균이 250 ㎍/mL 농도에서 생육 억제를 위한 최소 저해농도를 나타내고 있으나 리스테리아 모노사이토게네스(L. monocytogenes) 15313, 15313, 및 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) ATCC 25923 및 살모넬라 티피뮤리움(S. typhimurium) ATCC 14028, E. coli BHR-12 및 슈도모나스 아우레기노사(P. aureginosa) ATCC 27853 균의 최소저해농도는 500 ㎍/mL 이었다. 클로로포름의 획분인 경우 리스테리아 모노사이토게네스(L. monocytogenes) ATCC 43256 및 리스테리아 모노사이토게네스(L. monocytogenes) ATCC 15113 균에서는 500 ㎍/mL 의 농도로서 최소 저해 농도를 나타내었다. 그 외 에틸 아세테이트, 부탄올 분획물에서는 500㎍/mL 이하의 농도에서는 항균활성이 전혀 나타나지 않았다.
표 5. 초석잠으로부터 얻은 각종 용매 분획의 테스트용 미생물에 대한 최소저해 농도
Solvents fractionMicroorganisms MICs(㎍/mL)
Hexane Chloroform Ethylacetate Butanol
B. cereusATCC 13720 S. cereus ATCC 25923 L. monocytogenes ATCC 19111 L. monocytogenes ATCC 43256 L. monocytogenes ATCC 15113 L. monocytogenes ATCC 15114 L. monocytogenes ATCC 15313 S. typhimurium ATCC 14028 E. coliBHR-12 P. aeruginosaATCC 27853 250500250250500500250500500500 500500<500500500<500<500<500<500<500< 500<500<500<500<500<500<500<500<500<500< 500<500<500<500<500<500<500<500<500<500<
1) 최소저해 농도는 35℃에서 24시간 배양한 후 성장을 나타내지 않는 항균활성의 최저농도로 나타낸다
2) 초석잠 헥산 분획물의 1차 컬럼 크로마토그래피 소분획들의 최소저해 농도
항균활성이 가장 좋은 초석잠 헥산 분획물로부터 항균활성 물질을 분리하기 위하여 먼저 TLC 상에서 분리능이 우수한 용매조건을 탐색한 후에 선택된 용매조건인 헥산:클로로포름:에탄올 (5:0.5:1 및 5:1:2)에서 실리카겔 컬럼 크래마토그래피를 실시한 결과 총 7개의 소획분(F1- F7)을 얻었고, 각각의 소획분을 50 및 100 ㎍/mL 농도로 배지에 첨가하여 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes) 5개 균주에 대하여 항균효과를 실험한 결과는 표 6과 같다.
소획분 F3, F4, F5, F6은 50 ㎍/mL 농도 수준에서 5개 균주 모두 증식억제 효과가 우수하였으며, F6, F7 획분을 50 ㎍/mL에서 완전 증식억제 효과가 있었고, F6 획분의 경우 전개용매 (핵산:클로로포름:에탄올, 5:1:2)로 전개하여 황산용액을 분무하여 발색시 3∼4개의 반점으로 분리되었고, 발색시 색깔이 진하게 보이는 주요 분리물질이 없이 3∼4개의 반점이 고르게 분포되어 있었다. 그러나 F7 획분의 경우 Rf 0∼0.1 사이에 뚜렷한 갈색물질이 나타나면서, 그 수율도 우수하였으므로 F7획분을 2차 분리용 시료로 분취하였다.
표 6. 리스테리아 모노사이토제네스에 대한 초석잠의 헥산 추출물로부터 분획한 1차 칼럼 크래마토그래피의 최소저해농도
Fraction No. Yield(g) Listeria monocytogenes
ATCC 15313 ATCC 19111 ATCC 19113 ATCC 19114 ATCC 43256
F1 2.18 100< 100< 100< 100< 100<
F2 5.45 100< 100< 100< 100< 100<
F3 6.80 50<100 50<100 50<100 50<100 50<100
F4 2.00 50<100 50<100 50<100 50<100 50<100
F5 0.41 50<100 50<100 50<100 50<100 50<100
F6 1.00 50 50 50 50 50
F7 7.20 50 50 50 50 50
3) 초석잠 헥산 분획물의 2차 컬럼 크로마토그래피 소분획들의 최소저해 농도
초석잠 헥산 분획물들을 1차 컬럼 크로마토그래피하여 얻은 소획분을 헥산:클로로포름:에틸아세테이트:메탄올:초산 (10 : 3 : 3 : 1 : 0.5 )의 혼합용매계로 2차 컬럼 크로마토그래피를 실시한 결과, F7-1 ∼ F7-8 각각의 소획분을 얻었고 각각의 소획분을 25 및 50 ㎍/mL 농도로 배지에 첨가하여 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes) 5개 균주의 증식에 대하여 항균효과를 실험한 결과는 표 7에 나타내었다.
소획분 F7-1∼F7-5는 50㎍/mL에서 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes) 5개 균주 모두에 대하여 완전증식억제 효과가 있었으며, 25 ㎍/mL에서는 5개 균주 모두 12시간까지 균 증식 억제를 보이다가 그 이후에는 균이 증식되는 것을 볼 수 있었다.
항균효과가 비슷한 4개의 소획분 중 F7-2 획분은 수율이 높고, Rf 0.5에서 뚜렷한 밴드가 형성되어 황산분무 발색시 갈색의 물질이 나타났으므로 F7-2획분을 3차 분리용 시료로 분취하였다.
표 7. 리스테리아 모노사이토제네스에 대한 초석잠의 헥산 추출물로부터 획득한 2차 컬럼 크래마토그래피 분획의 최소저해농도
Fraction No. Yield(g) Listeria monocytogenes
ATCC 15313 ATCC 19111 ATCC 19113 ATCC 19114 ATCC 43256
F7-1 0.38 25<50 25<50 25<50 25<50 25<50
F7-2 2.83 25<50 25<50 25<50 25<50 25<50
F7-3 0.46 25<50 25<50 25<50 25<50 25<50
F7-4 0.45 25<50 25<50 25<50 25<50 25<50
F7-5 0.42 25<50 25<50 25<50 25<50 25<50
F7-6 0.14 50< 50< 50< 50< 50<
F7-7 0.35 50< 50< 50< 50< 50<
F7-8 0.40 50< 50< 50< 50< 50<
4) 초석잠 헥산 분획물의 3차 PTLC 후 얻은 소획분들의 최소저해 농도
초석잠 헥산 분획물을 2차 컬럼 크로마토그라피하여 얻은 F7-2 획분을 헥산 : 에틸 아세테이트 : 부탄올 ( 10 : 3 : 2)의 용매계로 PTLC를 실시한 결과 F7-2-1 ∼ F7-2-5등 총 5개의 소획분이 나타났으며 각각의 소획분 10 및 20㎍/mL 농도로 배지에 첨가하여 항균효과를 조사한 결과는 표 8과 같다.
표 8에서 보면 F7-2-4와 F7-2-5 획분을 20 ㎍/mL 첨가시킨 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes) 5개 균주 모두 균증식을 완전히 억제됨을 알 수 있었고 F7-2-4 획분의 경우 10㎍/mL 첨가시 5개 균주 모두 증식억제 효과가 없었다. F7-2-5획분은 10 ㎍/mL 첨가시 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes) ATCC 19113, ATCC 19114의 증식을 24시간 동안 억제하였으며, 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes) ATCC 19111은 36시간, 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes) ATCC 19112와 ATCC 15313에 대해서는 48시간 동안 균증식을 억제하였다.
이러한 결과로부터 초석잠에서 분리한 F7-2-5 획분의 항균활성은 용해성이 높기 때문에 식품보존제 또는 산화제로서 가장 많이 사용되는 유기산 중에서 초산와 프로피온산을 2,000㎍/mL 농도 첨가시 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes)의 성장을 완전히 억제하였다는 결과와 영귤 과즙 아세톤 추출물을 1,500 ㎍/mL 첨가시 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes) ATCC 19111의 성장을 완전히 억제하였다는 결과와 비교해 볼 때 항균활성이 월등하다는 것을 알 수 있었다. 소획분 F7-2-5를 헥산:에틸아세테이트:부탄올 (6:3:2)의 용매로 TLC 상에서 전개시킨 후 UV상에서 관찰해 본 결과, Rf 0.42인 단일 반점으로 나타났었고, 황산분무 발색시 동일 Rf 상에서 단일반점의 갈색 물질이 나타났으므로, 순수 분리된 물질로 추정된다.
표 8. 리스테리아 모노사이토제네스에 대한 초석잠의 헥산 추출물로부터 얻은 예비 박막 그래마토그래피 분획의 최소저해농도
Fraction No. Yield(g) Listeria monocytogenes
ATCC 15313 ATCC 19111 ATCC 19113 ATCC 19114 ATCC 43256
F7-2-1 5.1 25 25 25 25 25
F7-2-2 5.4 25 25 25 25 25
F7-2-3 4.0 25 25 25 25 25
F7-2-4 5.3 25 25 25 25 25
F7-2-5 18.0 25 25 25 25 25
<실험예 2> 시험 대상균주의 생육저해 스펙트럼
초석잠의 헥산 분획물이 최소 저해농도를 경시적으로 억제하는 스펙트럼을 도 2 에 나타내었다. 생육저해 스펙트럼을 보면 헥산 분획물을 100, 150, 250 및 500 ㎍/mL씩 각각 첨가하여 시간경과에 따른 생육 저해도를 보면 그람 양성균 중 500 ㎍/mL의 핵산 분획물을 첨가한 결과 바실러스 세레우스(B. cereus) ATCC 13720의 경우 균을 접종한 다음 배양시간의 경과에 따른 억제효과를 보면 100, 150 ㎍/mL 첨가시 8시간 경과 후 서서히 증식하다가 16시간 이후 부터는 증식억제 효과가 없었으나 250 ㎍/mL 첨가시에는 48시간 경과후까지 생육이 억제되었으며 500 ㎍/mL 첨가시에는 48시간 경과시까지 증식억제 효과가 있었다.
스타필로코커스 아우레우스(Stophylococcus aureus) ATCC 25923의 경우 핵산 추출물을 100 및 150 ㎍/mL 첨가시 배양 8 시간 경과시까지는 증식억제 효과가 있었으나 배양시간이 길어질수록 증식억제 효과는 찾아 볼수 없었다. 그리고 헥산 추출물은 250 ㎍/mL 첨가시에는 배양 16시간 경과시까지 상당한 증식억제효과를 나타내었으나, 배양 40시간 경과시에는 다소 증식하는 것을 볼 수 있었다. 그러나 핵산 추출물을 500㎍/mL 첨가했을 경우 우수한 항균활성을 나타내었다. 또한 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes) ATCC 19111의 경우에는 핵산 추출물을 100 및 150 ㎍/mL씩 각각 첨가하였을때 배양 16시간 경과후부터 증식억제 효과가 없었으나 핵산추출물을 250 및 500 ㎍/mL 씩 각각 첨가하여 배양한 경우 48시간까지 생육이 완전히 억제됨을 알 수 있었다. 그람 음성 세균의 경우 우선 살모넬라 티피무리움(S. typhimurium) ATCC 14028 에 대한 핵산 추출물을 50, 100 및 150 ㎍/mL 씩 각각 첨가하여 첨가 농도별에 따른 증식 억제 효과는 매우 미약하였으나 핵산 추출물 250 ㎍/mL을 첨가하여 배양한 경우 배양 24시간 까지는 항균 억제효과를 나타내었으나 40시간 이후부터는 억제효과를 찾아볼 수 없었다.
대장균 BHR-12 의 경우에도 핵산 추출물을 100 및 150㎍/mL 첨가하였을 때는 증식억제 효과가 없었으나 핵산 추출물 250, 500 ㎍/mL을 각각 첨가하여 실험한 결과 배양경과 48시간까지는 거의 완전한 생육억제효과를 나타냈었다. 또한 슈도모나스 애루기노사(P. aerugionsa) ATCC 27853 의 경우는 핵산 추출물을 100, 150 및 250 ㎍/mL 씩 각각 첨가하였을 때 항균활성이 없었으나, 핵산 추출물을 500 ㎍/mL 첨가한 경우 배양 48시간 경과시까지 항균억제 효과가 있었다. 이러한 결과는 초석잠 핵산 추출물 500 ㎍/mL의 농도에서 강한 항균력을 가지고 있으므로 향후 상업적으로 새로운 천연 보존재료의 가능성을 시사하고 있다.
<실험예 3> 세포의 형태변화 관찰
초석잠의 분획물인 F7-2-5 획분의 항균에 관여하는 기전을 확인하고자 공시균주로 대장균 및 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes)의 세포에 F7-2-5 획분을 각각 20㎍/mL 농도로 첨가하여 32℃에서 12시간 증식시킨 균체의 표면을 투과형 전자현미경(TEM, Transmission electron microscope, HitachiH-600, Japan)으로 관찰하였다. 즉, 배양하여 동결한 미생물 세포의 절취한 부위를 2.5% 파라포름알데히드 글루타르알데히드(paraformaldehyde glutaraldehyde, 4℃, 인산염 완충액, pH 7.2) 고정액에서 2시간 전 고정하고, 완충액(0.1 M 인산염 완충액, pH 7.2)으로 10분씩 3회 세척한 후, 1% OsO4(25℃, 0.1 M 인산염 완충액, pH 7.2)에서 2시간동안 고정하였다. 고정이 끝난 시료는 동일 완충용액으로 수회 세척한 후 에탄올 농도 상승순으로 탈수했고, 프로필렌 옥사이드(propylene oxide)로 치환하여 Epon-812로 포매한 다음, 60℃ 오븐(oven)에서 36시간 중합반응시켰다. 포매된 조직은 초박절편기(ultramicrotome:ULTRACUTE, Leica)로 초박절편을 제작하여 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)와 구연산 납(lead citrate)로 이중염색하여 투과형 전자현미경(TEM, transmission electron microscope, Hitach H600, Japan)으로 관찰하였다.
그 결과는 도 2 및 도 3에 도시된 바와 같다. 즉, 도 2A에 도시된 바와 같이, F7-2-5 획분을 처리하지 않은 정상적인 대장균의 세포를 관찰한 결과 균체의 표면의 본래 형태를 볼 수 있고 세포내부의 내용물도 정상적으로 차있는 형태를 관찰 할 수 있었으나 F7-2-5 획분으로 처리한 세포를 전자현미경으로 관찰한 결과 도 2B에 도시된 바와 같이 세포의 세포막 구조가 흩트러지면서 세포내 내용물이 유출된 것을 관찰 할 수 있었다. 또한, 도 3에 도시된 바와 같이, 분획물을 처리하지 않은 정상적인 세포에서는 세포의 형태가 그대로 유지되고 있으나, F7-2-5를 첨가하여 배양시킨 처리군의 경우에는 세포의 형태가 깨어지면서 세포 내용물들이 유출된 것을 볼 수 있는데 이는 초석잠 추출획분의 처리로 인한 세포막이 파괴되어 일어나는 현상으로 추정할 수 있다.
<실험예 4> β-갈락토시다아제 활성 측정
초석잠 추출물을 미생물 세포에 처리하였을 때, 세포막 손상정도를 알아보기 위하여 초석잠 추출물의 존재하에서 대장균의 세포질에 존재하는 β-갈락토시다아제(β-D-갈락토시다아제 갈락토하이드롤라아제; EC3.2.1.23, 이하, β-갈락토시다아제)활성을 측정하였다. 공시균주로는 대장균을 이용하였으며, 세포를 파쇄하지 않고, 톨루엔, 클로로포름과 초석잠 추출물을 같은 농도로 처리하였고, 기질로써 ONPG(o-니트로페닐-β-D-갈락토피라노사이드, 4mg/mL)를 첨가하여 반응을 시킨 후 420nm에서 흡광도를 측정하였다. 증류수를 넣은 경우를 0으로 하고 톨루엔을 넣어준 경우를 100으로 하여 초석잠 추출물이 세포막 손상정도를 측정하였다.
그 결과, 도 4에 도시된 바와 같이 초석잠 추출물 처리군은 68%의 활성을 나타내었고 헥산을 처리하여 얻은 β-갈락토시다아제는 12% 의 활성을 나타내었다. 이러한 결과로부터 초석잠 추출물은 핵산보다 세포막 손상효과가 더 강하며, 톨루엔 처리군과 비교되는 세포막의 기능파괴가 초래된 것으로 판단되었다. 이 결과는 전자현미경 실험결과와도 일치하고 초석잠 추출물이 이와 같은 항균기전에 의해 항균작용을 가지는 것으로 추정된다.
<실험예 5> 열 및 pH 안정성 측정
초석잠 분획물에 대해서 열 안정성을 측정하기 위하여 초석잠 분획물인 F7-2-5을 500 ㎍/mL농도로 40, 60, 80, 100, 120 및 180℃에서 30분간 열처리 한 후 페이퍼 디스크법으로 생육저해 여부를 측정하였다. 그 결과, 도 5A에서 도시된 바와 같이 시험균주인 대장균의 생육저해를 검사한 결과 모든 처리군에서 온도와 관계없이 생육저해환이 17∼19mm이였다.
한편, pH 안정성을 확인하기 위하여 초석잠 분획물을 500 ㎍/mL을 pH 4. 6. 7. 8 및 10으로 처리한 후 1시간 방치한 후 pH 7로 중화한 다음 24시간 배양한 후 생육 저해환을 조사한 결과 생육 저해환이 17∼19mm정도이어서 분획물로써 처리하지 않는 대조군과 차이를 찾아 볼 수 없었다. 이러한 결과는 초석잠 분획물이 열이나 pH에 안정하므로 식품의 조리, 가공시 첨가하여도 항균성분이 그대로 유지 될 것으로 판단되며 천연 식품용 항균제로써 이용할 수 있음을 시사한다.
<실험예 6> 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험
6주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 5 마리씩의 동물에 실시예 1에 따라 조제된 초석잠 추출물을 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1 g/㎏, 5 g/㎏ 및 10 g/㎏의 용량으로 1회 단회 경구투여 하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.
그 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과, 본 발명의 초석잠 추출물은 랫트에서 10 g/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 따라서, 경구 투여 중간치사량(LD50)은 실시예 1에 따라 조제된 초석잠 추출물 10 g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.
<제제예 1> 정제의 제조
실시예 1에 따라 제조된 초석잠 에탄올 추출물 100.0 mg, 옥수수전분 90.0 mg, 유당 175.0 mg, 엘-하이드록시프로필셀룰로오스 15.0 mg, 폴리비닐피롤리돈90 5.0 mg 및 에탄올 적량의 원료를 균질하게 혼합하여 습식과립법으로 과립화하고 스테아린산 마그네슘 1.8 mg을 가하여 혼합한 후 1정이 400mg이 되도록 타정하였다.
<제제예 2> 캅셀제의 제조
실시예 1에 따라 제조된 초석잠 에탄올 추출물 100.0 mg, 옥수수전분 83.2 mg, 유당 175.0 mg 및 스테아린산 마그네슘 1.8 mg의 원료를 균질하게 혼합하여 1캅셀에 360mg이 함유되도록 충전하였다.
이상에서 상술한 바와 같이 본 발명은 초석잠 유래의 항균활성을 지니는 물질을 분리할 수 있고, 상기 분리방법에 의해 얻어진 초석잠 유래의 항균활성 물질을 함유하는 항균활성 조성물은 각종 병원성 진균과 병원성 세균에 강한 항균효과를 나타내므로 의약용 항균제 및 식품 첨가물로 이용될 수 있으며, 상기 조성물은 천연약재의 추출물이므로 그 안정성이 매우 높다.
도 1은 초석잠으로부터 얻은 항균화합물의 분리흐름도를 나타내고,
도 2는 대장균 BHR-12의 투과형 전자현미경 분석을 나타낸 것으로, A는 정상세포(대조군), B는 초석잠으로부터 얻은 F-72-5로 처리한 세포이고,
도 3은 리스테리아 모노사이토제네스 ATCC의 투과형 전자현미경 분석을 나타낸 것으로, A는 정상세포(대조군), B는 초석잠으로부터 얻은 F-72-5로 처리한 세포이고,
도 4는 대장균 세포에 대한 초석잠 추출물의 세포막 손상 효과를 나타내고,
도 5는 대장균 플레이트에 관한 초석잠 추출물의 열 안정성 및 pH 안정성을 나타낸 것으로,
A는 다양한 온도 즉, a:40℃, b:60℃, c:80℃, d:100℃, e:120℃ f:180℃에 관한 것이고, B는 다양한 pH 즉, a:pH4, b:pH6, c:pH7, d:pH8, e:pH9에 관한 것이다.

Claims (2)

  1. 초석잠에 에탄올을 첨가하여 에탄올 추출물을 제조하는 단계;
    상기 에탄올 추출물 1중량부에 대해서 헥산 8∼12 중량부, 물 8∼12중량부를 첨가하여 이를 추출 분획한 후 농축하여 헥산 분획물을 제조하는 단계;
    핵산 6중량부에 대해 클로로포름 0.1∼2중량부, 에탄올 0.5∼3중량부가 혼합된 용액으로 상기에서 제조된 헥산 분획물을 현탁한 후 실리카겔 컬럼으로 정제하는 단계;
    헥산 10중량부에 대해 에틸아세테이트 2∼5중량부, 클로로포름 2∼5중량부, 메탄올 0.5∼2중량부, 초산 0.1∼1중량부가 혼합된 용액으로 상기 정제 후 얻은 항균활성이 있는 분획물을 현탁한 후 실리카겔 컬럼에 용출시키는 단계; 및
    상기 컬럼으로부터 용출된 항균활성이 있는 분획물을 예비박층크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 초석잠 유래의 정제분획물인 항균활성물질의 분리방법.
  2. 병원성 세균에 대해 항균활성이 있고, 40 내지 180℃에서 30분간 열처리에 안정성을 가지고, pH 4 내지 10에서도 안정성을 갖는 초석잠 유래의 정제분획물인 항균활성물질을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 항균제 조성물.
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Title
Book 1990 : Hyangyak Encyclopedia, Yeongrimsa, 867 pages *
Jpn J Pharmacol 1994 65(2) 143-151, Hayashi *
Paper 2002 : Journal of Life Sciences, 12(6) 803-811, Ryu Byung-ho *

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KR20040025182A (ko) 2004-03-24

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