CN111840340A

CN111840340A - 石榴皮鞣质在制备抑制细菌群体感应系统药物中的应用

Info

Publication number: CN111840340A
Application number: CN202010795753.1A
Authority: CN
Inventors: 郑俊霞; 陈鸿庚; 黄智霖; 谢俊涛; 黄家晋; 王立抗; 苏亚伦; 孙平华; 黎相广; 田文月; 杨超; 朱芷韵; 李海珊; 叶威
Original assignee: Guangdong University of Technology
Current assignee: Guangdong University of Technology
Priority date: 2020-08-10
Filing date: 2020-08-10
Publication date: 2020-10-30

Abstract

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及石榴皮鞣质在制备抑制细菌群体感应系统药物中的应用。本发明公开了石榴皮鞣质在制备抑制细菌群体感应系统药物中的应用、在制备抑制细菌绿脓素分泌药物中的应用、在制备抑制细菌弹性蛋白酶分泌药物中的应用和在制备抑制细菌生长药物中的应用。由实验结果可知，石榴皮鞣质可以有效抑制铜绿假单胞菌中lasB信号通路和pqsA信号通路，从而抑制弹性蛋白酶以及绿脓菌素的分泌，同时还抑制了铜绿假单胞菌的生长，进而进一步降低细菌毒力及致病力，使得铜绿假单胞菌不易产生耐药性。另外，石榴皮鞣质是天然物质，其毒性和副作用很低，石榴皮鞣质可以单独使用，也可以作为抗生素的辅助治疗剂达到防治细菌感染的目的。

Description

石榴皮鞣质在制备抑制细菌群体感应系统药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及石榴皮鞣质在制备抑制细菌群体感应系统药物中的应用。

背景技术

随着抗生素在全球范围内的广泛使用，许多严重的细菌感染性疾病得到了有效的控制，但是抗生素也引发了细菌耐药性问题，甚至出现了对多种抗生素出现了耐药性的“超级细菌”。目前，抗生素耐药性已经成为全球严重的公共卫生问题。因此，能够开发出能够降低细菌致病能力而不杀死细菌的新型药物，将能够很好地解决抗生素耐药性问题。近年来有研究表明，很多病原菌的致病性是由一种密度依赖的群体感应系统(Quorum Sensing，QS)调控，群体感应系统通过介导致病基因的表达，包括生物膜、外毒素、弹性蛋白酶、溶血素、绿脓菌素等几乎所有致病因子的表达，对其致病性进行调控。高效的群体感应抑制剂(QSI)将有望实现对病原菌致病性和生物被膜的控制。

细菌群体感应系统是细菌根据所处环境变化调节自身群体活动的一种方式，其通过释放某些特定的信号分子，并感知其浓度变化，来调控菌群生理功能，控制细菌群体行为，共同对周围环境刺激做出反应。利用QS机制进行“细胞对细胞的交流”，微生物能够在复杂的环境中协调一致，以“团队作战能力”使整个种群更好地存活下来。病原菌的致病性很大程度上依赖于细菌的群体感应系统调控，群体感应系统通过介导致病基因的表达以实现其致病性。

石榴皮，又称石榴壳、酸石榴皮、酸榴皮、西榴皮、安石榴酸实壳等，系石榴科植物石榴(Punica granatum L.)的干燥果皮。我国南北均有种植，其中以江苏、河南等地较多。具有涩肠止泻，止血，驱虫之功效。常用于久泻，久痢，便血，脱肛，崩漏，带下，虫积腹痛。味酸、涩，性温，归大肠经。现代药理学研究表明，石榴皮在抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、增强免疫力等方面亦具有一定作用。也有研究表明石榴皮对铜绿假单胞菌、杆菌沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等常见细菌均具有较强的抑制作用，但目前尚未发现其有抑制细菌群体感应系统的作用。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了石榴皮鞣质在制备抑制细菌群体感应系统药物中的应用，石榴皮鞣质可以通过抑制细菌的的群体感应系统达到抑制细菌绿脓素和弹性蛋白酶的分泌和细菌生长，不易产生细菌耐药性的效果，进一步降低了细菌毒力和致病力。

其具体技术方案如下：

本发明提供了石榴皮鞣质在制备抑制细菌群体感应系统药物中的应用。

优选地，所述细菌包括铜绿假单胞菌。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

优选地，所述药物的剂型为口服制剂，优选为颗粒剂、胶囊剂、片剂或滴丸。

优选地，所述药物中石榴皮鞣质的有效剂量为10～90wt％，更优选为10～30wt％，辅料优选为10～90wt％，更优选为70～90wt％。

铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)是最常见的与医院感染有关的革兰氏阴性菌，主要导致呼吸道、泌尿道和血流感染。铜绿假单胞菌广泛分布于自然界中，可通过内源性感染、交叉感染、医源性感染、环境感染等途径传播。近年来由铜绿假单胞菌引起的医院感染逐年上升，当宿主免疫功能低下、长期使用广谱抗菌药物时，极易发生铜绿假单胞菌感染。其群体感应系统包pqsA，LasB和rhlA三大系统，分别介导了分别介导了信号分子3-oxo-C12-HSL，C4-HSL和PQS的合成、调控铜绿假单胞菌弹性蛋白酶、绿脓菌素、鼠李糖脂、等致病因子的表达，并与生物膜的形成具有密切的关系。lasB是las系统的调控基因，其与毒力因子弹性蛋白酶的分泌有关，信号分子PQS的合成，需要由pqsA，pqsB、pqsC、pqsD、pqsE、phnAB以及pqsH等操纵子编码的酶参与。通过抑制细菌的群体感应，就可以抑制这些细菌群体感应系统调控的毒力，降低细菌对于宿主的危害，达到预治或辅助抗生素治疗细菌感染的目的。因此细菌群体感应抑制剂是在防治细菌感染方面有广阔的应用前景。

本发明采用PAO1-lasB-gfp、PAO1-pqsA-gfp绿色荧光蛋白报告菌株来研究石榴皮鞣质对铜绿假单胞菌群体感应系统las和pqs通路的影响。实验结果表明石榴皮鞣质对lasB-gfp和pqsA-gfp的表达具有抑制作用，同时对抑制铜绿假单胞菌的生长，从而避免铜绿假单胞菌产生耐药性。因此，本发明石榴皮鞣质在制备抑制细菌群体感应系统药物中的应用中，石榴皮鞣质用于抑制括lasB信号通路和pqsA信号通路。

本发明还提供了石榴皮鞣质在制备抑制细菌绿脓素分泌药物中的应用。

优选地，所述细菌包括铜绿假单胞菌，更优选为铜绿假单胞菌PAO1。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

铜绿假单胞菌pqsA可调控绿脓菌素的表达，因此，本发明还研究了石榴皮鞣质对铜绿假单胞菌的绿脓菌素分泌的影响。实验结果表明石榴皮鞣质通过抑制pqsA的表达，从而抑制绿脓菌素的分泌，降低铜绿假单胞菌的毒力和致病力。

本发明还提供了石榴皮鞣质在制备抑制细菌弹性蛋白酶分泌药物中的应用。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

铜绿假单胞菌LasB可调控弹性蛋白酶的表达，因此，本发明还研究了石榴皮鞣质对铜绿假单胞菌的弹性蛋白酶分泌的影响。实验结果表明石榴皮鞣质通过抑制LasB的表达，从而抑制弹性蛋白酶的分泌，降低铜绿假单胞菌的毒力和致病力。

本发明上述技术方案中石榴皮鞣质的制备方法包括以下步骤：

步骤1：用10～20倍石榴皮重量的乙醇水溶液或水进行超声辅助萃取；过滤或离心去除不溶物，减压干燥，得到初提物；

步骤2：将初提物分散于等体积水中，加入1～4wt％的明胶溶液至无沉淀产生，离心，除去滤液，收集沉淀；

步骤3：将沉淀加入丙酮水溶液复溶后，除去不溶物后得到的溶液减压浓缩至膏状物；

步骤4：将胶状物用蒸馏水溶解后，除去不溶物，然后减压浓缩后，冷冻干燥为粉末，即为石榴皮鞣质。

本发明步骤1中，超声辅助萃取反应温度较低，条件温和，溶剂不易与鞣质发生化学反应，鞣质极性较大，乙醇水溶液对鞣质具有良好的溶解力。

本发明步骤2中，鞣质易与大分子蛋白质或生物碱结合发生反应并生成沉淀，因此利用明胶溶液与提取液中的鞣质反应生成沉淀，将鞣质粗分离出来。

本发明步骤3中，丙酮-水体系对鞣质溶解能力很强，能够打开鞣质-蛋白质的连接键，减压蒸发除去溶液中的丙酮也较容易。

本发明步骤4中，丙酮水溶液萃取的鞣质中仍含有其他杂质，鞣质水溶性较好，采用水溶液复溶，能够除去部分不溶于水的杂质。

从以上技术方案可以看出，本发明具有以下优点：

本发明提供了石榴皮鞣质的新应用，特别是在制备抑制细菌群体感应系统药物中的应用、在制备抑制细菌绿脓素分泌药物中的应用、在制备抑制细菌弹性蛋白酶分泌药物中的应用和在制备抑制细菌生长药物中的应用。由实验结果可知，石榴皮鞣质可以有效抑制铜绿假单胞菌中lasB信号通路和pqsA信号通路，从而抑制弹性蛋白酶以及绿脓菌素的分泌，同时还抑制了铜绿假单胞菌的生长，进而进一步降低细菌毒力及致病力，使得铜绿假单胞菌不易产生耐药性。另外，石榴皮鞣质是天然物质，其毒性和副作用很低，石榴皮鞣质可以单独使用，也可以作为抗生素的辅助治疗剂达到防治细菌感染的目的。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明实施例1中石榴皮鞣质的液相色谱-质谱图；

图2为本发明实施例1中石榴皮鞣质对绿假单胞菌PAO1-lasB-gfp表达影响的结果图；

图3为本发明实施例2中石榴皮鞣质对铜绿假单胞菌PAO1-lasB-gfp生长影响的结果图；

图4为本发明实施例3中石榴皮鞣质铜绿假单胞菌PAO1-pqsA-gfp表达影响的结果图；

图5为本发明实施例3中石榴皮鞣质对铜绿假单胞菌PAO1-pqsA-gfp生长影响的结果图；

图6为本发明实施例4中石榴皮鞣质对铜绿假单胞菌弹性蛋白酶分泌影响的结果图；

图7为本发明实施例5中石榴皮鞣质对铜绿假单胞菌绿脓菌素分泌影响的结果图。

具体实施方式

为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而非全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中所用原料均为市售或自制，其中PAO1-lasB-gfp绿色荧光蛋白报告菌株、PAO1-pqsA-gfp绿色荧光蛋白报告菌株和铜绿假单胞菌PAO1均从南洋理工大学获得。

实施例1：石榴皮鞣质的制备

(1)取石榴皮100g，用20倍量70％(v/v)的乙醇浸泡过夜后超声辅助萃取3次，超声功率150W，提取温度为50℃，每次60min，得到初提物；

(2)过滤除去不溶物，滤液减压干燥至无醇味，备用；

(3)往(2)中的溶液加入1％的明胶溶液至无沉淀产生，过滤，收集沉淀；

(4)用50％丙酮溶液溶解沉淀，离心除去不溶部分，收集上清液减压浓缩至膏状；

(5)将膏状物用蒸馏水溶解，除去不溶物，然后减压浓缩后，冷冻干燥为粉末，即为石榴皮鞣质。

从图1石榴皮鞣质液相质谱图的数据可知，本实施例成功制得石榴皮鞣质。

实施例2：石榴皮鞣质对铜绿假单胞菌PAO1-lasB通路的影响

测试样品：取实施例1石榴皮鞣质(GP-WR)用100％DMSO配制成100mg/mL的储备液。

实验方法：将本发明的石榴皮鞣质化合物在96孔微量滴定板中与ABTGC培养基混合用二倍稀释法混合最终每孔中有100μL含药的ABTGC培养基。取PAO1-lasB-gfp菌株在37℃，200rpm的LB培养基中生长12～16h的培养物，在ABTGC培养基中稀释至600nm(OD600)的最终光学密度为0.02(2.5×10⁸CFU/mL)。接着，在96孔微量滴定板的每孔中加入100μL的细菌悬浮液，以使最终每孔中本发明化合物的最终浓度为100、50、25、12.5、6.25 3.125、1.5625μg/mL。并在同一个96孔板上设置10μM/mL异硫氰酸酯类化合物Iberin阳性对照组(Positive)、0.2％DMSO溶剂对照组、以及200μL均为PAO1菌株的细菌对照组(Bacteria)。将96孔微量滴定板在37℃的Tecan Infinate 200Pro读板仪中孵育至少16小时，其中每隔15分钟测量以下参数：OD600，GFP荧光信号(激发485nm，发射535nm)。所有测试样品和对照的抑制测定均一式三份进行。

实验结果：由图2石榴皮鞣质抑制PAO1-lasB通路实验结果表明，实施例1石榴皮鞣质对lasB-gfp报告菌株基因的表达具有抑制作用。经过4h的培养，各组lasB-gfp的表达水平开始增大，直到培养时间到10h，各组的lasB-gfp水平开始稳定；在菌株对数生长期的5-8h，石榴皮鞣质对菌株lasB-gfp的荧光有显著的抑制作用，浓度越高，石榴皮鞣质对菌株lasB-gfp荧光的抑制作用越强。高浓度的石榴皮鞣质对lasB-gfp报告基因的表达具有较好的的抑制效果。由图3可知，石榴皮鞣质在对铜绿假单胞菌生长有抑制作用。

实施例3：石榴皮对铜绿假单胞菌pqsA通路的影响

测试样品：取实施例1石榴皮鞣质，用100％DMSO配制成100mg/mL的储备液。

实验方法：取培养好的PAO1-pqsA-gfp绿色荧光蛋白报告菌株，实施实施例2实验方法。

实验结果：由图4石榴皮鞣质抑制PAO1-pqsA通路实验结果表明，各组pqsA-gfp的表达水平随培养时间增大呈现先增后降，然后逐渐稳定的趋势；在对数生长期的2-6h内，石榴皮鞣质对菌株pqsA-gfp的荧光有显著的抑制作用，且呈现量效关系，高浓度石榴皮鞣质对pqsA-gfp报告基因的表达具有更强的抑制效果高，接近阳性药对lasB-gfp报告基因的抑制作用，说明本发明所述的石榴皮鞣质能够抑制细菌群体感应系统的pqsA通路。由图5可知，实施例1石榴皮鞣质对铜绿假单胞菌的生长具有良好的抑制效果，且浓度越高，其效果更强。

综合本发明实施例2和实施例3的实验结果，说明实施例1石榴皮鞣质在抑制细菌生长的同时，可以抑制细菌群体感应系统的两种信号通路，进一步降低细菌的毒力和致病力，从而进一步抑制细菌产生耐药性。

实施例4：石榴皮鞣质对铜绿假单胞菌弹性蛋白酶分泌的影响

测试样品：取实施例1石榴皮鞣质(GP-WR)，用100％DMSO配制成100mg/mL的储备液。

实验方法：取培养好之后的铜绿假单胞菌PAO1，于100mL锥形瓶，内含已经灭菌好的30mL培养基，向其中加入石榴皮鞣质至所需浓度，并将过夜的细菌标定在OD₆₀₀＝0.01加入到锥形瓶中，放入37℃摇床，200r/min，培养24小时。细菌生长24小时以后，均全部混匀先测OD600，细菌培养24小时之后，取5mL菌液，10000rpm/min，4℃离心10min。并用0.22μm过滤器过滤一次，遵照试剂盒EnzChekfi Protease Assay Kit E6638操作步骤，用1×reactionbuffer配置弹性蛋白浓度到50μg/mL，细菌上清液和已经配好的底物各加100μL，稍稍混匀之后，立马放入酶标仪，每隔10min，连续4小时测荧光(激发波长400nm，发射波长450nm)，荧光含量的高低表示弹性蛋白酶含量的多少，其中检测所得OD值均除以OD600以除去细菌密度的影响。

实验结果：从图6可以看出，石榴皮鞣质抑制铜绿假单胞菌的弹性蛋白酶的分泌，并呈现浓度依赖性，随着浓度增加，抑制效果逐渐上升，浓度为100μg/mL时，效果最佳，从而证明实施例1鞣质具有抗铜绿假单胞菌作用，通过抑制LasB系统，抑制细菌的弹性蛋白酶分泌，从而降低细菌的致病力，能够作为新型的群体感应抑制剂。

实施例5：石榴皮鞣质对铜绿假单胞菌绿脓菌素分泌的影响

测试样品：取实施例1石榴皮鞣质(GP-WR)，用100％DMSO配制成100mg/mL的储备液，以10μM/mL阿奇霉素作为阳性对照(AQ)，以0.2％的DMSO作为溶剂对照(DMSO+Blank)。

实验方法：取培养好之后的铜绿假单胞菌PAO1，于100mL锥形瓶，内含已经灭菌好的50mL LB培养基，加入相应浓度的石榴皮鞣质以及等量的铜绿假单胞菌至最终OD600＝0.01，放入37℃摇床，200r/min，培养24小时。细菌生长24小时以后，均全部混匀先测OD600，将锥形瓶中的细菌转移至50mL离心管中，10000r/min，4℃离心10min。离心后取上清液40mL加入3mL氯仿提取，后将氯仿层(下层)移至新管，加入0.3倍氯仿的0.2M HCL，离心后取上层测OD520。

实验结果：图7的实验结果表明实施例1石榴皮鞣质抑制铜绿假单胞菌的绿脓菌素的分泌，并且随着石榴皮鞣质浓度的增加，其效果越强，当石榴皮鞣质浓度达到100μg/mL时，其效果明显高于阳性药物阿奇霉素，证实本实施例1石榴皮鞣质具有抗铜绿假单胞菌作用，通过抑制pqsA系统，抑制细菌的绿脓菌素的分泌，从而降低细菌的致病力，能够作为新型的群体感应抑制剂。

实施例6：抗铜绿假单胞菌群体感应颗粒剂

本实施例提供一种抗铜绿假单胞菌群体感应颗粒，配方如下：

抗铜绿假单胞菌颗粒剂的制备步骤为：

(1)首先将石榴皮鞣质样品与乳糖、甘露醇及CMS-Na混合均匀；

(2)然后将配制好的10％淀粉浆加入上述混合物中，过16目筛制软材；

(3)在真空干燥箱中，60℃烘干，整粒，即得抗铜绿假单胞菌群体感应颗粒剂。

实施例7：抗铜绿假单胞菌群体感应胶囊

本发明实施例提供一种抗铜绿假单胞菌胶囊剂，配方如下：

抗铜绿假单胞菌胶囊剂的制备步骤为：

(1)首先将石榴皮鞣质与乳糖混合5-15分钟；

(2)再加入微晶纤维素后混合5-15分钟；

(3)再加入滑石粉后混合3-6分钟；

(4)将混合物装入明胶胶囊壳，即抗铜绿假单胞菌胶囊剂。

以上所述，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.石榴皮鞣质在制备抑制细菌群体感应系统药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述石榴皮鞣质用于抑制细菌群体感应系统的las信号通路。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述石榴皮鞣质用于抑制细菌群体感应系统的pqs信号通路。

4.石榴皮鞣质在制备抑制细菌绿脓素分泌药物中的应用。

5.石榴皮鞣质在制备抑制细菌弹性蛋白酶分泌药物中的应用。

6.根据权利要求1～5任意一项所述的应用，其特征在于，所述细菌包括绿假单胞菌。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细菌为铜绿假单胞菌PAO1。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为口服制剂。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物中石榴皮鞣质的有效剂量为10～90wt％。