CN114533750B - 石榴皮鞣质在制备治疗产肠毒素大肠杆菌性肠道疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于肠道细菌感染医药技术领域，公开了一种石榴皮鞣质在制备治疗产肠毒素大肠杆菌性肠道疾病药物中的应用。石榴皮鞣质可以显著改善产肠毒素大肠杆菌感染后导致的肠道炎症，修复受损的肠屏障功能，维持肠道稳态，提高石榴皮的药用价值，也可作为一种绿色安全的抗生素治疗产肠毒素大肠杆菌诱导的肠道损伤的替代方案。

Description

石榴皮鞣质在制备治疗产肠毒素大肠杆菌性肠道疾病药物中 的应用

技术领域

本发明属于肠道细菌感染医药技术领域，特别涉及石榴皮鞣质在制备治疗产肠毒素大肠杆菌性肠道疾病药物中的应用。

背景技术

产肠毒素大肠杆菌经粪-口途径传播，主要通过食物进行传播，产肠毒素大肠杆菌在清洁水和卫生条件仍然有限的地区大量存在，它是从患有感染性腹泻的旅行者中分离出来的最常见的病原体。产肠毒素大肠杆菌并不侵入肠上皮细胞，而是通过黏附素与小肠上皮细胞顶膜上的特异性受体结合，以抵抗肠道蠕动的冲刷作用在小肠黏膜上定植和大量繁殖，随后分泌不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxins,LT)和/或耐热肠毒素(heat-stable enterotoxins,ST)，打破肠黏膜更新的稳态，主要表现为肠粘膜杯状细胞数量降低，导致肠黏膜损伤，从而引起腹泻等肠道疾病。虽然引入口服补液疗法和其他措施以来，产肠毒素大肠杆菌导致的腹泻疾病死亡率显著下降，但即使是轻微的产肠毒素大肠杆菌腹泻发作也可能对幼龄儿童和动物产生持久后遗症，包括生长迟缓和营养不良，这些症状均与肠粘膜完整性受损而引起的肠道功能紊乱息息相关。尽管产肠毒素大肠杆菌和其他病原体已多次被认为与儿童的这些后遗症有关，但这些肠道疾病背后的分子事件仍然知之甚少。

产肠毒素大肠杆菌的防治多采用灭活多价苗及抗生素类药物，但是抗生素滥用不仅会导致动物机体内部的肠道菌群紊乱，免疫力下降，还会致使微生物对抗生素产生耐药性。现今世界各国均颁布了“减抗、禁抗”措施，寻找治疗产肠毒大肠杆菌感染性肠道疾病的抗生素替代药物刻不容缓。石榴皮是石榴科石榴属落叶灌木或小乔木石榴的干燥果皮，原产于阿富汗和伊朗等中亚地区，在我国的南北各地均有种植，其中安徽、江苏、河南等地的栽培面积较大。此外，石榴皮作为果汁加工业的副产品，以其有益健康和广泛的抗菌活性而闻名。石榴皮提取物中的鞣质和花色苷是益生菌，在促进益生菌特性方面具有协同作用，能够抑制病原体，刺激人体肠道有益的微生物区系生长，是食品中重要的天然添加剂。石榴皮成分的鞣质尤为丰富，含量高达15％～40％。石榴皮鞣质是一种沉淀蛋白质特性的水溶性多元酚类化合物，其具有抗菌消炎、止泻、预防应激性胃肠损伤、安全低毒等优点。与抗生素相反，石榴皮鞣质是天然物质，其毒性和副作用比较低，但是，目前尚不清楚石榴皮鞣质是否可用于治疗产肠毒素大肠杆菌引起的肠粘膜损伤和生长受阻。

发明内容

为了克服现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供石榴皮鞣质在制备治疗产肠毒素大肠杆菌性肠道疾病药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

石榴皮鞣质在制备治疗产肠毒素大肠杆菌性肠道疾病药物中的应用。

所述石榴皮鞣质按照以下方法制备得到：将石榴皮充分粉碎后采用超声辅助乙醇浸泡提取，所得提取液减压浓缩后用明胶溶液进行沉淀；取沉淀经丙酮溶液溶解提取，所得提取液浓缩得胶状物，再经过多次水溶浓缩，最终干燥得到石榴皮鞣质。

优选地，所述石榴皮鞣质具体按照以下方法制备得到：

1)将石榴皮用粉碎机充分粉碎；

2)提取：称取步骤(1)所得石榴皮粉末，按料液比1g：25mL加入体积百分浓度60％的乙醇溶液，先浸泡2h以上，然后置于超声仪中，超声辅助提取50min，抽滤后收集滤液，重复3次；合并滤液，于旋转蒸发仪中减压浓缩，再加入体积百分数浓度3％明胶溶液，至无沉淀产生，过滤，收集沉淀；

3)富集：收集步骤(2)所得沉淀，按料液比1g：2mL加入体积百分数浓度60％丙酮溶液，置于50℃水浴锅中，在搅拌条件下提取5min，离心，取上清液，减压浓缩至胶状，重复多次用热水溶解除去不溶物，收集最后的上清液，浓缩后冷冻干燥，得到石榴皮鞣质。

所述药物中石榴皮鞣质的有效剂量为10～90wt％。

所述药物还包括药学上可接受的辅料。

所述药物为口服制剂。

本发明为了验证石榴皮鞣质能应用于制备治疗产肠毒素大肠杆菌性肠道疾病药物，首先建立了产肠毒素大肠杆菌诱导的动物肠道损伤模型，并验证石榴皮鞣质对动物产肠毒素大肠杆菌感染后的治疗效果，以小鼠为例，主要实验步骤如下：

1)建立产肠毒素大肠杆菌诱导小鼠肠道损伤模型：实验周期为7天，在实验中期灌胃定量产肠毒素大肠杆菌菌液，观察小鼠的生存状况；

2)实验期间给予小鼠物定量石榴皮鞣质溶液，每天一次，实验期每天记录生长性能；

3)通过HE染色、AB-PAS染色、免疫荧光、免疫组织化学、ELISA和Western-blot，评价石榴皮鞣质对产肠毒素大肠杆菌诱导的动物肠道损伤的治疗效果，及其在降低细胞凋亡水平以及改善肠道屏障功能的作用。

本发明的原理是：

肠绒毛上皮的表面是由肠上皮细胞、杯状细胞、簇状细胞和肠内分泌细胞组成，这些细胞从肠干细胞和潘氏细胞所在的隐窝中的祖细胞向绒毛表面向上增殖。肠细胞是肠上皮细胞中含量最丰富的细胞，也是营养物质吸收的主要场所。在超微结构水平上，肠道“刷状缘”通常是由致密排列的微绒毛排列在肠细胞表面形成的。微绒毛是围绕着肌动蛋白微丝中心核心的肠细胞顶端质膜的延伸。这些突起极大地增加了肠腔表面的有效表面积，允许最大限度地吸收营养。因此，干扰微绒毛发育可能会导致营养不良。而产肠毒素大肠杆菌感染后造成的绒毛受损变短，破坏了肠道的绒毛-隐窝结构，会导致肠道营养吸收障碍。杯状细胞产生大量的粘蛋白，能够保护肠道屏障，产肠毒素大肠杆菌感染后会破坏肠道细胞杯状细胞的相互作用，破坏肠道的屏障以及肠道稳态。

与应激性胃肠损伤不同的是，产肠毒素大肠杆菌导致的肠道疾病并不是因为应激因素如病原微生物因素、物理因素、化学因素、机械性因素等引起肠道黏膜损伤，而是通过菌毛上的黏附素与肠上皮细胞刷状缘膜的受体结合而定植，然后分泌LT和/或ST，引起黏膜受损、屏障破坏、肠粘膜更新紊乱、分泌性腹泻等肠道疾病，甚至会导致死亡。产肠毒素大肠杆菌分泌的一种或两种毒素除了引起腹泻外，还影响着多种细胞途径，这些途径控制着小肠的正常稳态和最终的吸收能力。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：

本发明提供了一种有效缓解产肠毒素大肠杆菌诱导的肠道损伤的石榴皮鞣质药物，研究结果显示石榴皮鞣质可以显著改善产肠毒素大肠杆菌感染后导致的肠黏膜受损和更新紊乱，石榴皮鞣质作用于增殖细胞，提高增殖细胞的表达水平，使肠道绒毛受损减轻，保持吸收营养的功能；促进粘蛋白的分泌，保护紧密连接蛋白，维持肠上皮紧密连接结构，修复受损的肠屏障功能，维持肠道稳态，促进机体生长。将石榴皮鞣质作为制备治疗产肠毒素大肠杆菌性肠道疾病药物中的应用，能搞提高石榴皮的药用价值，也能作为一种绿色安全的抗生素治疗产肠毒素大肠杆菌诱导的肠道损伤和生长受阻的替代方案。

附图说明

图1为实验流程设计；

图2为小鼠实验体重变化图，其中(a)为小鼠日增重，(b)为小鼠相对体重变化；

图3为小鼠回肠组织HE染色，其中(a)为小鼠回肠组织HE染色(40×)，(b)为小鼠回肠组织HE染色(100×)，(c)为小鼠回肠组织HE染色(200×)；

图4为小鼠回肠组织AB-PAS染色图，其中(a)为小鼠回肠组织AB-PAS染色(40×)，(b)为小鼠回肠组织AB-PAS染色(100×)，(c)为小鼠回肠组织AB-PAS染色(200×)；

图5为小鼠回肠绒毛和隐窝统计分析图，其中(a)为小鼠回肠绒毛长度，(b)为小鼠回肠隐窝深度，(c)为小鼠回肠绒毛长度与隐窝深度之比；

图6为小鼠血清DAO活力；

图7为小鼠回肠组织免疫组化Ki67靶标图，其中(a)为小鼠回肠组织免疫组化Ki67靶标(40×)，(b)为小鼠回肠组织免疫组化Ki67靶标(100×)，(c)为小鼠回肠组织免疫组化Ki67靶标(200×)；

图8为小鼠回肠组织免疫组化MUC2靶标图，其中(a)为小鼠回肠组织免疫组化MUC2靶标(40×)，(b)为小鼠回肠组织免疫组化MUC2靶标(100×)，(c)为小鼠回肠组织免疫组化MUC2靶标(200×)；

图9为小鼠回肠组织免疫组化E-cadherin靶标图，其中(a)为小鼠回肠组织免疫组化E-cadherin靶标(40×)，(b)为小鼠回肠组织免疫组化E-cadherin靶标(100×)，(c)为小鼠回肠组织免疫组化E-cadherin靶标(200×)；

图10为小鼠回肠组织免疫组化ZO-1靶标图，其中(a)为小鼠回肠组织免疫组化ZO-1靶标(40×)，(b)为小鼠回肠组织免疫组化ZO-1靶标(100×)，(c)为小鼠回肠组织免疫组化ZO-1靶标(200×)；

图11为小鼠回肠组织免疫组化靶标统计分析图，其中(a)为小鼠回肠组织隐窝Ki67水平，(b)为小鼠回肠组织绒毛MUC2水平，(c)为小鼠回肠组织隐窝MUC2水平，(d)为小鼠回肠组织E-cadherin平均光密度，(e)为小鼠回肠组织ZO-1平均光密度；

图12为仔猪平均日采食量；

图13为仔猪平均日增重；

图14为仔猪料重比；

图15为仔猪腹泻率；

图16为仔猪腹泻指数；

图17为仔猪血清DAO活力。

具体实施方式

实施例1：石榴皮鞣质的提取与富集

石榴皮鞣质的提取与制备由以下几个步骤完成：

(1)样品准备：

将石榴皮用粉碎机充分粉碎；

(2)提取：

称取步骤(1)所得石榴皮粉末，按料液比1g：25mL加入体积百分浓度60％的乙醇溶液，先浸泡2h以上，然后置于超声仪中，超声辅助提取50min，抽滤后收集滤液，重复3次；合并滤液，于旋转蒸发仪中减压浓缩，再加入体积百分数浓度3％明胶溶液，至无沉淀产生，过滤，收集沉淀；

(3)富集：

收集步骤(2)所得沉淀，按料液比1g：2mL加入体积百分数浓度60％丙酮溶液，置于50℃水浴锅中，在搅拌条件下提取5min，离心，取上清液，减压浓缩至胶状，重复多次用热水溶解除去不溶物，收集最后的上清液，浓缩后冷冻干燥，得到石榴皮鞣质。

实施例2：石榴皮鞣质在治疗产肠毒素大肠杆菌诱导的小鼠肠道损伤的应用

我们首先建立产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)感染小鼠模型，实验流程设计如图1。

石榴皮鞣质(Pomegranate Peel Tannins,PPT)治疗产肠毒素大肠杆菌诱导的小鼠肠道损伤模型，具体步骤如下：

1)取6周龄，C57BL/6小鼠，随机分成4个处理组，处理组分别为Ctr组、PPT组、ETEC组、ETEC+PPT组，各处理组的小鼠数量及处理方法如下：

对照组(n＝6)：每天灌胃100μL PBS；

PPT组(n＝6)：每天灌胃100μL浓度为200mg/mL的实施例1所得石榴皮鞣质，使石榴皮鞣质的最终剂量为20mg/mouse；

ETEC组(n＝6)：每天灌胃100μL PBS，同时在第5天灌胃5×10⁸CFU/mouse ETEC；

ETEC+PPT组(n＝6)：每天灌胃100μL浓度为200mg/mL的实施例1所得石榴皮鞣质，同时在第5天灌胃5×10⁸CFU/mouse ETEC。

2)实验期每天称重记录体重数据，并观察小鼠粪便成型情况，精神状态。

3)从产肠毒素大肠杆菌诱导处理24h后开始，每天收集各小鼠新鲜的粪便样品，整体摆放在白纸上并做好标记，然后拍照留存。

4)第8天小鼠处死，采集小鼠的血液和小肠样品。

5)采集的肠道样本，置于4％多聚甲醛固定12小时，用60％、75％、90％、无水乙醇逐级脱水，最后在4℃条件下置于无水乙醇中保存，石蜡包埋，对切片进行HE染色和AB-PAS染色。

实验结果：

1)小鼠日增重情况(图2中的(a))；体重变化率(图2中的(b))

由图2中的(a)所得，在实验过程中，Ctr组、PPT组、ETEC组、ETEC+PPT组的初始体重基本均在26～28g之间，无显著性差异。Ctr组与ETEC+PPT组小鼠的体重在第5天时显示出显著差异(##，P<0.01)，之后均无差异，说明产肠毒素大肠杆菌诱导处理有效；而Ctr组与ETEC组在第5天显示出显著性差异(+++，P<0.001)，此后均显示出了极显著差异(++++，P<0.0001)；而ETEC组与ETEC+PPT组在第6天显示出显著性差异(***，P<0.001)，此后均无极显著差异(****，P<0.0001)。

由图2中的(b)可得，Ctr组与ETEC+PPT组小鼠的体重，在第5天时显示出显著差异(###，P<0.001)，在第六天显示出显著差异(#，P<0.05)，此后均无差异；而Ctr组与ETEC组在第5天显示出显著性差异(+++，P<0.001)，此后均显示出了极显著差异(++++，P<0.0001)；而ETEC组与ETEC+PPT组在第6天显示出显著性差异(**，P<0.01)，此后均显示出了极显著差异(****，P<0.0001)。

2)在此基础上，我们采取了回肠末端组织进行HE染色(图3)和AB-PAS(图4)染色观察

在100倍光镜下(图3中的(b))观察回肠上皮结构形态发现经过产肠毒素大肠杆菌诱导处理后回肠的绒毛形态结构破坏严重，绒毛—隐窝组织完整性遭到严重破坏，隐窝数量和杯状细胞数目均明显减少，而加入石榴皮鞣质治疗后回肠上皮形态结构得到一定程度的恢复，绒毛形态完整，隐窝数量增加，杯状细胞数量明显增多，明显提高了小肠屏障功能。

同样，我们采取了回肠末端进行固定AB-PAS染色观察。能从100倍光镜下(图4中的(b))观察得到回肠上皮结构形态发现经过产肠毒素大肠杆菌诱导处理后回肠的绒毛形态结构破坏严重，且其绒毛和隐窝上的黏蛋白分泌较少，而加入石榴皮鞣质治疗后回肠上皮形态结构得到一定程度的恢复，绒毛形态完整，隐窝数量增加，黏蛋白的分泌增加。

3)各组切片的绒毛和隐窝统计结果(图5)

从图5中的(a)中，我们发现对比于其他三组处理组，ETEC组的回肠绒毛长度明显变短，与ETEC+PPT组和Ctr组均有显著性差异(****，P<0.0001)，可以判断产肠毒素大肠杆菌诱导处理后，对小鼠肠上皮机构有明显的不良影响，导致了严重绒毛的损伤。此外，统计学分析后，可见PPT组与Ctr组和ETEC+PPT组的回肠绒毛长度均无显著差异。

从图5中的(b)中，我们发现对比于其他三组处理组，ETEC组的回肠隐窝深度明显变短，与ETEC+PPT组和Ctr组均有显著性差异(*，P<0.05)，可以判断在产肠毒素大肠杆菌诱导处理后，隐窝深度变短，严重破坏了小鼠肠上皮结构。此外，可见PPT组与Ctr组和ETEC+PPT组的回肠隐窝深度均无显著差异。

从图5中的(c)中，我们发现对比于其他三组处理组，ETEC组的回肠绒毛长度与隐窝深度之比明显变小，与ETEC+PPT组和Ctr组的回肠绒毛长度与隐窝深度之比均有显著性差异(*，P<0.05)，可以判断产肠毒素大肠杆菌诱导处理后，严重破坏了小鼠肠上皮结构，对回肠绒毛-隐窝结构造成了严重损伤，产肠毒素大肠杆菌诱导肠道损伤模型造模成功。此外，可见PPT组与Ctr组和ETEC+PPT组的回肠绒毛长度与隐窝深度之比均无显著差异。

由上所述，PPT组与Ctr组和ETEC+PPT组的回肠绒毛长度、隐窝深度、以及绒毛长度与隐窝深度之比均无显著差异，能够推断石榴皮鞣质对小鼠肠道无毒害作用，具有安全性。

4)DAO活力(图6)

进一步，我们对小鼠进行眼眶取血，全血去除红细胞后进行DAO试剂盒测定，分析发现产肠毒素大肠杆菌诱导处理后的血清DAO活力显著增高，ETEC组与Ctr组和ETEC+PPT组均有显著差异(*，P<0.05)，而经过石榴皮鞣质治疗后的小鼠血清DAO活力明显低于ETEC组的，与Ctr组的DAO活力值相近，说明产肠毒素大肠杆菌诱导处理后破坏了小鼠肠道机械屏障的完整性，导致肠道屏障受损，而石榴皮鞣质的加入能够缓解对肠道屏障的损伤。

5)免疫组化(图7-11)

通过对小鼠回肠组织进行免疫组化，进行了四个靶标的分析，分别是Ki67靶标(图7)、MUC2靶标(图8)、E-cadherin靶标(图9)、ZO-1靶标染色(图10)。

从图11中能看到，产肠毒素大肠杆菌诱导处理后隐窝处的Ki67细胞数量明显显著降低，与Ctr组和ETEC+PPT组均有显著差异(**，P<0.01)，说明产肠毒素大肠杆菌诱导处理后小肠细胞增殖活力下降，肠道机械屏障能力将会大大降低，而经过石榴皮鞣质治疗显著提高了回肠组织的隐窝的Ki67细胞数量，与Ctr组以及PPT组均无显著差异，说明石榴皮鞣质能有效缓解产肠毒素大肠杆菌带来的肠道损伤。

根据统计学分析MUC2靶标的免疫组化结果显示，产肠毒素大肠杆菌诱导处理后的绒毛的MUC2水平与Ctr组有显著差异(*，P<0.05)，与ETEC+PPT组有显著差异(**，P<0.01)；而产肠毒素大肠杆菌诱导处理后的隐窝的MUC2水平与Ctr组和ETEC+PPT组均有显著差异(*，P<0.05)。产肠毒素大肠杆菌诱导处理后回肠组织分泌MUC2水平显著降低，不管是绒毛还是隐窝分泌的MUC2均大大降低，说明肠杯状细胞减少，而经过石榴皮鞣质治疗显著提高了回肠MUC2水平，与Ctr组以及PPT组均无显著差异。

经过产肠毒素大肠杆菌诱导处理的小鼠回肠组织E-cadherin平均光密度下降，ETEC组的E-cadherin水平与Ctr组差异显著(*，P<0.05)，与ETEC+PPT组差异极显著(****，P<0.0001)。而E-cadherin水平下调会导致细胞粘附强度下降，促使炎症发生，证明产肠毒素大肠杆菌诱导处理使得回肠的肠上皮结构遭到破坏，细胞粘附强度下降，促使肠道炎症发生，肠道受损。经过石榴皮鞣质治疗显著提高了回肠组织E-cadherin水平，与Ctr组以及PPT组均无显著差异。

小鼠经过产肠毒素大肠杆菌诱导处理后ZO-1蛋白的平均光密度下降，ETEC组的ZO-1蛋白水平与Ctr组差异极显著(****，P<0.0001)，与ETEC+PPT组差异极显著(****，P<0.0001)。而ZO-1蛋白水平下调意味着肠上皮细胞紧密连接结构损害，造成机械屏障功能受损，证明产肠毒素大肠杆菌诱导处理使得回肠的肠上皮结构遭到破坏，促使肠道炎症发生，肠道受损。经过石榴皮鞣质治疗显著提高了回肠ZO-1蛋白水平，与Ctr组以及PPT组均无显著差异。

实施例3：石榴皮鞣质在治疗产肠毒素大肠杆菌诱导的仔猪肠道损伤的应用

我们首先建立产石榴皮鞣质治疗产肠毒素大肠杆菌诱导的仔猪肠道损伤模型，具体步骤如下：

1)选取平均体重(7.48±0.37)kg健康的(21±2)日龄“杜×长×大”断奶仔猪，按体重相近原则，随机分成4个处理组，处理组分别为Ctr组、PPT组、ETEC组、ETEC+PPT组，各处理组的仔猪数量及处理方法如下：

Ctr组(n＝6)：饲喂基础饲粮，仔猪灌服相同剂量的无菌培养液；

PPT组(n＝6)：饲喂在基础饲粮中添加1000g/t实施例1所得石榴皮鞣质的实验饲粮，仔猪灌服相同剂量的无菌培养液；

ETEC组(n＝6)：饲喂基础饲粮，第5天空腹称重后每头仔猪灌服5×10⁸CFU产肠毒素大肠杆菌菌液；

ETEC+PPT组(n＝6)：饲喂在基础饲粮中添加1000g/t实施例1所得石榴皮鞣质的实验饲粮，第5天空腹称重后每头仔猪灌服5×10⁸CFU产肠毒素大肠杆菌菌液。

2)实验周期为7天，仔猪实行单笼饲养，并按是否用产肠毒素大肠杆菌诱导处理分别饲养于两个不同的区域，防止交叉感染。畜舍温度控制在25～28℃，相对湿度60％～70％。仔猪的基础饲粮为玉米-豆粕型饲粮，参照NRC(2012)7～25kg断奶仔猪营养需要配制而成。实验期间，仔猪自由饮水，每日饲喂4次，饲喂量以仔猪采食完后料槽内略有剩余为宜。

3)在产肠毒素大肠杆菌诱导处理后，每日观察仔猪的精神状况，并记录每组仔猪腹泻情况，当粪便评分≥2时，定义为腹泻，腹泻评分标准参见表1。根据观察所得的腹泻情况计算腹泻率及腹泻指数。腹泻率的计算公式如下：腹泻率(％)＝[试验期腹泻头次/(试验仔猪头数×试验天数)]×100。腹泻指数的计算公式如下：腹泻指数＝总腹泻评分/(试验仔猪头数×试验天数)。

4)实验结束后，称量仔猪的空腹，前腔静脉采血10mL，制备血清，置于-20℃保存，待测血清DAO指标。

实验结果：

1)仔猪生长性能(图12-14)

从图12中可知，实验全期各组仔猪平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)均无显著差异(P>0.05)。从图13-14可知，与Ctr组相比，ETEC组仔猪平均日增重(average daily gain，ADG)极显著降低(**，P<0.01)，料重比(feed/gain，F/G)显著增加(*，P<0.05)。与ETEC+PPT组相比，ETEC组仔猪ADG极显著降低(**，P<0.01)，F/G极显著降低(**，P<0.01)。

2)仔猪腹泻率(图15-16)

从图15-16中可知，在产肠毒素大肠杆菌诱导处理后，与Ctr组相比，ETEC组仔猪的腹泻率和腹泻指数均极显著提高(****，P<0.0001)。与ETEC+PPT组相比，ETEC组仔猪腹泻率和腹泻指数均极显著提高(****，P<0.0001)。说明石榴皮鞣质能够缓解产肠毒素大肠杆菌诱导处理后带来的腹泻症状，其中腹泻评分标准如表1所示。

表1为腹泻评分标准。

3)仔猪DAO活力(图17)

1)对仔猪血清进行DAO活力试剂盒测定，分析发现产肠毒素大肠杆菌诱导处理后仔猪的血清DAO活力显著增高，与Ctr组相比，ETEC组仔猪的DAO活力极显著增高(***，P<0.001)，而经过石榴皮鞣质治疗后的仔猪血清DAO活力极显著降低(**，P<0.01)。说明产肠毒素大肠杆菌诱导处理后导致肠道损伤，而石榴皮鞣质的加入能降低产肠毒素大肠杆菌毒力及致病力，从而缓解产肠毒素大肠杆菌对肠道屏障的损伤。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.石榴皮鞣质在制备治疗产肠毒素大肠杆菌性肠道疾病药物中的应用，其特征在于：所述石榴皮鞣质具体按照以下方法制备得到：

1）将石榴皮用粉碎机充分粉碎；

2）提取：称取步骤（1）所得石榴皮粉末，按料液比 1g：25mL加入体积百分浓度60%的乙醇溶液，先浸泡2h以上，然后置于超声仪中，超声辅助提取50 min，抽滤后收集滤液，重复3次；合并滤液，于旋转蒸发仪中减压浓缩，再加入体积百分数浓度3 %明胶溶液，至无沉淀产生，过滤，收集沉淀；

3）富集：收集步骤（2）所得沉淀，按料液比 1g：2mL加入体积百分数浓度60 %丙酮溶液，置于 50℃水浴锅中，在搅拌条件下提取5min，离心，取上清液，减压浓缩至胶状，重复多次用热水溶解除去不溶物，收集最后的上清液，浓缩后冷冻干燥，得到石榴皮鞣质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物中石榴皮鞣质的有效剂量为10～90wt%。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物还包括药学上可接受的辅料。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物为口服制剂。