CN111743925B - 石榴皮黄酮在制备抑制细菌群体感应系统药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域,尤其涉及石榴皮黄酮在制备抑制细菌群体感应系统药物中的应用。本发明公开了石榴皮黄酮在制备抑制细菌群体感应系统药物中的应用、在制备抑制细菌绿脓素分泌药物中的应用、在制备抑制细菌弹性蛋白酶分泌药物中的应用和在制备抑制细菌生长药物中的应用。由实验结果可知,石榴皮黄酮能有效抑制铜绿假单胞菌中lasB信号通路和pqsA信号通路,从而抑制弹性蛋白酶以及绿脓菌素的分泌,同时还抑制了铜绿假单胞菌的生长,进而进一步降低细菌毒力及致病力,使得铜绿假单胞菌不易产生耐药性。另外,石榴皮石榴皮黄酮是天然物质,其毒性和副作用很低,石榴皮石榴皮黄酮可以单独使用,也可以作为抗生素的辅助治疗剂达到防治细菌感染的目的。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域,尤其涉及石榴皮黄酮在制备抑制细菌群体感应系统药物中的应用。
背景技术
抗生素的使用使人类许多严重的细菌感染性疾病得到有效控制,但抗生素的广泛使用甚至滥用也导致了耐药菌株的增加,降低了现有抗生素的抗菌效率。目前,抗生素耐药性已经成为全球严重的公共卫生问题。因此,能够开发出不致死病原菌细胞而仅削弱病原菌的致病毒性的药物,将能够很好地解决抗生素耐药性问题。
细菌群体感应(Quorum sensing,QS)系统是细菌细胞内或细胞间信号传递的一种方式,微生物通过释放某些特定的信号分子,并感知其浓度变化,来调控菌群生理功能,控制细菌群体行为,共同对周围环境刺激做出反应。病原菌的致病性很大程度上依赖于细菌的群体感应系统(QS)调控,群体感应系统通过介导致病基因的表达以实现其致病性。
石榴皮,又称石榴壳、酸石榴皮、酸榴皮、西榴皮、安石榴酸实壳等,系石榴科植物石榴(Punica granatum L.)的干燥果皮。味酸、涩,性温,归大肠经。广泛分布于我国,其中以江苏、河南等地较多。具有涩肠止泻,止血,驱虫之功效。常用于久泻,久痢,便血,脱肛,崩漏,带下,虫积腹痛。系统查石榴皮的文献发现,现代药理和临床研究也表明石榴皮对铜绿假单胞菌、杆菌沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等常见细菌均具有较强的抑制作用,但是其抑制细菌群体感应系统的文献报道较少。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了石榴皮黄酮在制备抑制细菌群体感应系统药物中的应用,石榴皮黄酮可以通过抑制细菌的的群体感应系统达到抑制细菌绿脓素和弹性蛋白酶的分泌和细菌生长,不易产生细菌耐药性的效果,进一步降低了细菌毒力和致病力。
其具体技术方案如下:
本发明提供了石榴皮黄酮在制备抑制细菌群体感应系统药物中的应用。
优选地,所述细菌包括铜绿假单胞菌,更优选为铜绿假单胞菌PAO1。
优选地,所述药物还包括药学上可接受的辅料。
优选地,所述药物的剂型为口服制剂,优选为颗粒剂、胶囊剂、片剂或滴丸。
优选地,所述药物中石榴皮石榴皮酮的有效剂量为10~90wt%,更优选为10~30wt%,辅料优选为10~90wt%,更优选为70~90wt%。
铜绿假单胞菌(P.aeruginosa),是一种革兰氏阴性菌,广泛分布于人体皮肤、肠道和呼吸道,是临床感染最常见条件致病菌,常引起呼吸道感染、肺炎、泌尿道感染等医院内感染。铜绿假单胞菌拥有三个相互连接的QS系统,即las,rhl和pqs,分别介导了分别介导了信号分子3-oxo-C12-HSL, C4-HSL和PQS的合成、控制着包括生物膜、外毒素、弹性蛋白酶、溶血素、绿脓菌素等几乎所有致病因子的表达。这些致病因子决定了铜绿假单胞菌对宿主的致病能力。通过抑制细菌的群体感应,就可以抑制这些细菌群体感应系统调控的毒力,降低细菌对于宿主的危害,达到预治或辅助抗生素治疗细菌感染的目的。因此细菌群体感应抑制剂是在防治细菌感染方面有广阔的应用前景。lasB是las系统的调控基因,其与毒力因子弹性蛋白酶的分泌有关,信号分子PQS的合成,需要由pqsA,pqsB、pqsC、pqsD、pqsE、phnAB以及pqsH等操纵子编码的酶参与。
本发明采用PAO1-lasB-gfp、PAO1-pqsA-gfp绿色荧光蛋白报告菌株来研究石榴皮黄酮对铜绿假单胞菌群体感应系统las和pqs通路的影响。实验结果表明石榴皮黄酮对lasB-gfp和pqsA-gfp的表达具有抑制作用,同时对抑制铜绿假单胞菌的生长,从而避免铜绿假单胞菌产生耐药性。因此,本发明石榴皮黄酮在制备抑制细菌群体感应系统药物中的应用中,石榴皮黄酮用于抑制包括lasB信号通路和pqsA信号通路。
本发明还提供了石榴皮黄酮在制备抑制细菌绿脓素分泌药物中的应用。
优选地,所述细菌包括铜绿假单胞菌,更优选为铜绿假单胞菌PAO1。
优选地,所述药物还包括药学上可接受的辅料。
优选地,所述药物的剂型为口服制剂,优选为颗粒剂、胶囊剂、片剂或滴丸。
优选地,所述药物中石榴皮石榴皮酮的有效剂量为10~90wt%,更优选为 10~30wt%,辅料优选为10~90wt%,更优选为70~90wt%。
铜绿假单胞菌pqsA可调控绿脓菌素的表达,因此,本发明还研究了石榴皮黄酮对铜绿假单胞菌的绿脓菌素分泌的影响。实验结果表明石榴皮黄酮通过抑制pqsA的表达,从而抑制绿脓菌素的分泌,降低铜绿假单胞菌的毒力和致病力。
本发明还提供了石榴皮黄酮在制备抑制细菌弹性蛋白酶分泌药物中的应用。
优选地,所述细菌包括铜绿假单胞菌。
优选地,所述药物还包括药学上可接受的辅料。
优选地,所述药物的剂型为口服制剂,优选为颗粒剂、胶囊剂、片剂或滴丸。
优选地,所述药物中石榴皮石榴皮酮的有效剂量为10~90wt%,更优选为 10~30wt%,辅料优选为10~90wt%,更优选为70~90wt%。
铜绿假单胞菌LasB可调控弹性蛋白酶的表达,因此,本发明还研究了石榴皮黄酮对铜绿假单胞菌的弹性蛋白酶分泌的影响。实验结果表明石榴皮黄酮通过抑制LasB的表达,从而抑制弹性蛋白酶的分泌,降低铜绿假单胞菌的毒力和致病力。
优选地,所述药物的剂型为口服制剂,优选为颗粒剂、胶囊剂、片剂或滴丸。
优选地,所述药物中石榴皮黄酮的有效剂量为10~90wt%,更优选为 10~30wt%,辅料优选为10~90wt%,更优选为70~90wt%。
优选地,所述药物的剂型为口服制剂,优选为颗粒剂、胶囊剂、片剂或滴丸。
优选地,所述药物中石榴皮黄酮的有效剂量为10~90wt%,更优选为 10~30wt%,辅料优选为10~90wt%,更优选为70~90wt%。
本发明上述技术方案中石榴皮黄酮的制备方法包括以下步骤:
步骤1:用10~20倍石榴皮重量的乙醇水溶液或水进行超声辅助萃取;过滤或离心去除不溶物,减压干燥,得到初提物;
步骤2:将初提物分散于等体积水中,加入1~4wt%的明胶溶液至无沉淀产生,离心,除去沉淀,收集滤液;
步骤3:将滤液减压干燥,得到粗分物,然后用大孔树脂进行分离精制,得到石榴皮黄酮。
本发明步骤1中,石榴皮优选采取过夜浸泡的方式,能够提高提取效果,还能够除去提取物中的鞣质类物质。
本发明步骤2中,采用明胶溶液沉淀,从而能够除去提取物中的鞣质成分。
本发明步骤3采用大孔树脂处理,能够除去提取物中的多糖以及蛋白等杂质除去,并对黄酮部分进行富集。从以上技术方案可以看出,本发明具有以下优点:
本发明提供了石榴皮黄酮的新应用,特别是在制备抑制细菌群体感应系统药物中的应用、在制备抑制细菌绿脓素分泌药物中的应用、在制备抑制细菌弹性蛋白酶分泌药物中的应用和在制备抑制细菌生长药物中的应用。由实验结果可知,石榴皮黄酮可以有效抑制铜绿假单胞菌中lasB信号通路和pqsA 信号通路,从而抑制弹性蛋白酶以及绿脓菌素的分泌,同时还抑制了铜绿假单胞菌的生长,进而进一步降低细菌毒力及致病力,使得铜绿假单胞菌不易产生耐药性。另外,石榴皮石榴皮黄酮是天然物质,其毒性和副作用很低,石榴皮石榴皮黄酮可以单独使用,也可以作为抗生素的辅助治疗剂达到防治细菌感染的目的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例1中石榴皮黄酮的液相色谱-质谱图;
图2为本发明实施例1中石榴皮黄酮对绿假单胞菌PAO1-lasB-gfp表达影响的结果图;
图3为本发明实施例2中石榴皮黄酮对铜绿假单胞菌PAO1-lasB-gfp生长影响的结果图;
图4为本发明实施例3中石榴皮黄酮铜绿假单胞菌PAO1-pqsA-gfp表达影响的结果图;
图5为本发明实施例3中石榴皮黄酮对铜绿假单胞菌PAO1-pqsA-gfp生长影响的结果图;
图6为本发明实施例4中石榴皮黄酮对铜绿假单胞菌弹性蛋白酶分泌影响的结果图;
图7为本发明实施例5中石榴皮黄酮对铜绿假单胞菌绿脓菌素分泌影响的结果图。
具体实施方式
为使得本发明的发明目的、特征、优点能够更加的明显和易懂,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而非全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中所用原料均为市售或自制,其中PAO1-lasB-gfp绿色荧光蛋白报告菌株、PAO1-pqsA-gfp绿色荧光蛋白报告菌株和铜绿假单胞菌 PAO1均从南洋理工大学获得。
实施例1:石榴皮黄酮的制备
(1)取石榴皮100g,用20倍量70%(v/v)的乙醇浸泡过夜后超声辅助萃取3次,超声功率150W,提取温度为50℃,每次60min,得到初提物;
(2)过滤除去不溶物,滤液减压干燥至无醇味,备用;
(3)往(2)得到的浓缩液中,加入1%明胶溶液至无沉淀产生,过滤除去沉淀;
(4)将(3)中的滤液减压浓缩至一定浓度(100mL以内)后,备用;
(5)取适量D101大孔树脂,加入1~2倍体积无水乙醇浸泡过夜后,湿法填装树脂,并用无水乙醇洗涤至流出液1:1加入蒸馏水无浑浊,用蒸馏水洗涤至流出液无醇味,备用;
(5)将(4)中溶液上样,先用5~10BV蒸馏水洗脱杂质,用5~10BV 60%乙醇洗脱黄酮,流速为2BV/h收集洗脱液。
(6)将(5)洗脱液减压干燥后,冷冻干燥为石榴皮黄酮化合物样品。
从图1石榴皮黄酮液相质谱图的数据可知,本实施例成功制得石榴皮黄酮。
实施例2:石榴皮黄酮对铜绿假单胞菌PAO1-lasB通路的影响
测试样品:取实施例1石榴皮黄酮(GP-OF)用100%DMSO配制成100 mg/mL的储备液。
实验方法:将本发明的石榴皮黄酮化合物在96孔微量滴定板中与 ABTGC培养基混合用二倍稀释法混合最终每孔中有100μL含药的ABTGC培养基。取PAO1-lasB-gpf菌株的在37℃,200rpm的LB培养基中生长在 ABTGC培养基中稀释至600nm(OD600)的最终光学密度为0.02(2.5×108CFU /mL)。接着,在96孔微量滴定板的每孔中加入100μL的细菌悬浮液,以使最终每孔中本发明化合物的最终浓度为100、50、25、12.5、6.25 3.125、 1.5625μg/mL。并在同一个96孔板上设置10μM/mL异硫氰酸酯类化合物 Iberin阳性对照组(Positive)、0.1%DMSO溶剂对照组、以及200μL均为 PAO1菌株的过夜培养物的细菌对照组(Bacteria)。将96孔微量滴定板在37℃的Tecan Infinate 200Pro读板仪中孵育至少16小时,其中每隔15分钟测量以下参数:OD600,GFP荧光信号(激发485nm,发射535nm)。所有测试样品和对照的抑制测定均一式三份进行。
实验结果:由图2石榴皮黄酮抑制PAO1-lasB通路实验结果表明,实施例1石榴皮黄酮对lasB-gfp报告菌株基因的表达具有抑制作用。经过4h的培养,各组lasB-gfp的表达水平开始增大,直到培养时间到10h,各组的 lasB-gfp水平开始稳定;在菌株对数生长期的5-8h,石榴皮黄酮对菌株 lasB-gfp的荧光有显著的抑制作用,且呈现量效关系,浓度越高,石榴皮黄酮对菌株lasB-gfp荧光的抑制作用越强。高浓度的石榴皮黄酮对lasB-gfp报告基因的表达具有较好的的抑制效果,接近阳性药对lasB-gfp报告基因的抑制作用。由图3可知,石榴皮黄酮在对铜绿假单胞菌生长有微弱抑制作用。
实施例3:石榴皮对铜绿假单胞菌pqsA通路的影响
测试样品:取实施例1石榴皮黄酮,用100%DMSO配制成100mg/mL 的储备液。
实验方法:取培养好的PAO1-pqsA-gfp绿色荧光蛋白报告菌株,实施实施例2实验方法。
实验结果:由图4石榴皮黄酮抑制PAO1-pqsA通路实验结果表明,各组 pqsA-gfp的表达水平随培养时间增大呈现先增后降,然后逐渐稳定的趋势;在对数生长期的2-6h内,石榴皮黄酮对菌株pqsA-gfp的荧光有显著的抑制作用,且呈现量效关系,高浓度石榴皮黄酮对pqsA-gfp报告基因的表达具有更强的抑制效果高,接近阳性药对lasB-gfp报告基因的抑制作用,说明本发明所述的石榴皮黄酮能够抑制细菌群体感应系统的pqsA通路。由图5可知,实施例1石榴皮黄酮对铜绿假单胞菌的生长具有微弱的抑制效果,且浓度越高,其效果更强。
综合本发明实施例2和实施例3的实验结果,说明实施例1石榴皮黄酮在抑制细菌生长的同时,可以抑制细菌群体感应系统的两种信号通路,进一步降低细菌的毒力,从而进一步抑制细菌产生耐药性。
实施例4:石榴皮黄酮对铜绿假单胞菌弹性蛋白酶分泌的影响
测试样品:取实施例1石榴皮黄酮(GP-OF),用100%DMSO配制成 100mg/mL的储备液。
实验方法:取培养好之后的铜绿假单胞菌PAO1,于100mL锥形瓶,内含已经灭菌好的30mL培养基,向其中加入石榴皮黄酮至所需浓度,并将过夜的细菌标定在OD600=0.01加入到锥形瓶中,放入37℃摇床,200r/min,培养24小时。细菌生长24小时以后,均全部混匀先测OD600,细菌培养24小时之后,取5mL菌液,10000rpm/min,4℃离心10min。并用0.22μm过滤器过滤一次,遵照试剂盒EnzChekfi Protease Assay Kit E6638操作步骤,用1×reactionbuffer配置弹性蛋白浓度到50μg/mL,细菌上清液和已经配好的底物各加100μL,稍稍混匀之后,立马放入酶标仪,每隔10min,连续4小时测荧光(激发波长400nm,发射波长450nm),荧光含量的高低表示弹性蛋白酶含量的多少,其中检测所得OD值均除以OD600以除去细菌密度的影响。
实验结果:从图6可以看出,石榴皮黄酮抑制铜绿假单胞菌的弹性蛋白酶的分泌,并呈现浓度依赖性,随着浓度增加,抑制效果逐渐上升,浓度为 100μg/mL时,效果最佳,从而证明实施例1鞣质具有抗铜绿假单胞菌作用,通过抑制LasB系统,抑制细菌的弹性蛋白酶分泌,从而降低细菌的致病力,能够作为新型的群体感应抑制剂。
实施例5:石榴皮黄酮对铜绿假单胞菌绿脓菌素分泌的影响
测试样品:取实施例1石榴皮黄酮(GP-WR),用100%DMSO配制成100 mg/mL的储备液,以红霉素作为阳性对照(Positive),以0.2%的DMSO作为溶剂对照(DMSO+Blank)。
实验方法:取培养好之后的铜绿假单胞菌PAO1,于100mL锥形瓶,内含已经灭菌好的30mL培养基,加入相应浓度的石榴皮黄酮以及等量的铜绿假单胞菌至最终OD600=0.01,放入37℃摇床,200r/min,培养24小时。细菌生长24小时以后,均全部混匀先测OD600,细菌培养24小时之后,取5 mL菌液,10000rpm/min,4℃离心10min,上清液取200μL于96孔板中,测OD695。
实验结果:图7的实验结果表明实施例1石榴皮黄酮抑制铜绿假单胞菌的绿脓菌素的分泌,其效果明接近红霉素,证实本实施例1石榴皮黄酮具有抗铜绿假单胞菌作用,通过抑制pqsA系统,抑制细菌的绿脓菌素的分泌,从而降低细菌的致病力,能够作为新型的群体感应抑制剂。
实施例6:抗铜绿假单胞菌群体感应颗粒剂
本实施例提供一种抗铜绿假单胞菌群体感应颗粒,配方如下:
抗铜绿假单胞菌颗粒剂的制备步骤为:
(1)首先将石榴皮黄酮样品与乳糖、甘露醇及CMS-Na混合均匀;
(2)然后将配制好的10%淀粉浆加入上述混合物中,过16目筛制软材;
(3)在真空干燥箱中,60℃烘干,整粒,即得抗铜绿假单胞菌群体感应颗粒剂。
实施例7:抗铜绿假单胞菌群体感应胶囊
本发明实施例提供一种抗铜绿假单胞菌胶囊剂,配方如下:
抗铜绿假单胞菌胶囊剂的制备步骤为:
(1)首先将石榴皮黄酮与乳糖混合5-15分钟;
(2)再加入微晶纤维素后混合5-15分钟;
(3)再加入滑石粉后混合3-6分钟;
(4)将混合物装入明胶胶囊壳,即抗铜绿假单胞菌胶囊剂。
实施例8:抗铜绿假单胞菌群体感应滴丸
本发明实施例提供一种抗铜绿假单胞菌群体感应滴丸,包括:
石榴皮黄酮 10mg;
聚乙二醇 50mg;
抗铜绿假单胞菌滴丸的制备步骤为:
(1)分别称取石榴皮黄酮和聚乙二醇,将聚乙二醇加热至熔融后,搅拌下加入莲子心挥发油,混匀得到混合液;
(2)滴丸:将混合液加入于滴丸机的滴制装置内,通过滴头滴入冷凝液中,调整滴丸机的温度控制系统,滴丸机的滴头温度保持在80℃,冷凝液的梯度温度保持在35℃,滴管口内径3mm;
(3)擦丸:取出药丸,除去表面冷凝液,即得抗铜绿假单胞菌滴丸。
以上所述,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (4)
1.石榴皮黄酮在制备抑制铜绿假单胞菌群体感应系统药物、抑制铜绿假单胞菌绿脓素分泌药物和抑制铜绿假单胞菌弹性蛋白酶分泌药物中的应用;
所述石榴皮黄酮的制备方法包括以下步骤:
(1)取石榴皮100 g,用20倍量v/v 70% 的乙醇浸泡过夜后超声辅助萃取3次,超声功率150W,提取温度为50℃,每次60min,得到初提物;
(2)过滤除去不溶物,滤液减压干燥至无醇味,备用;
(3)往步骤(2)得到的浓缩液中,加入1%明胶溶液至无沉淀产生,过滤除去沉淀;
(4)将步骤(3)中的滤液减压浓缩至100 mL以内后,备用;
(5)取D101大孔树脂,加入1~2倍体积无水乙醇浸泡过夜后,湿法填装树脂,并用无水乙醇洗涤至流出液加入蒸馏水无浑浊,用蒸馏水洗涤至流出液无醇味,备用;
(5)将步骤(4)中溶液上样,先用5~10 BV蒸馏水洗脱杂质,用5~10 BV 60%乙醇洗脱黄酮,流速为2BV/h 收集洗脱液;
(6)将步骤(5)洗脱液减压干燥后,冷冻干燥为石榴皮黄酮化合物。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述石榴皮黄酮用于抑制铜绿假单胞菌群体感应系统的las信号通路。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述石榴皮黄酮用于抑制铜绿假单胞菌群体感应系统的pqs信号通路。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌PAO1。
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Identification of allelochemicals from pomegranate peel and their effects on Microcystis aeruginosa growth;Linfeng Chen,等;《Environmental Science and Pollution Research》;20190601;第26卷(第22期);第22389-22399页 * |
石榴皮与诃子联合制剂对铜绿假单胞菌抑菌作用的研究;牟菁,等;《广东化工》;20181130(第22期);第25-26页 * |
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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