이에 본 발명자들은 구절초 추출물 또는 특정 분획물이 헬리코박터 파일로리의 생육저해 활성, 우레아제 분해효소 저해활성 및 자유라디칼 제거 효과가 탁월함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 헬리코박터 파일로리 생육 저해 활성을 갖는 구절초 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 위장관 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 수행하기 위하여, 본 발명은 헬리코박터 파일로리 생육 저해 활성을 갖는 구절초 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 위장관 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용하는 생약인 구절초는 한국의 전지역, 중국 북부, 몽고, 일본 규슈에 분포하는 야생식물로 국화과에 속하는 다년생 초본으로 키는 50-100cm이고 뿌리를 옆으로 길게 뻗으며 번식하고 뿌리에서 나온 잎은 달걀형이며 밑이 수평이거나 심장형이고 가장자리는 앝게 갈라지고 끝이 둔하며 줄기에 달린 잎은 아주 작고 약간 깊게 갈라지고 꽃은 흰색 또는 분홍빛이 도는 흰색으로 8-10월에 핀다. 민간에서 전초와 꽃은 폐렴, 기관지염, 기침, 감기, 방광질환 부인병, 냉증, 위장병 및 고혈압 등에 사용되며 대한민국 식품공전에 식품의 원료로 등재된 인체에 안전한 식물로 알려져 있다.
본 발명의 추출물은 구절초(Chrysanthemu zawadskii var. latilobum), 포천구절초 (Chrysanthemum zawadskii var. tenuisectum), 한라구절초 (Chrysanthemum zawadskii subsp. coreanum ), 낙동구절초 (Chrysanthemum zawadskii subsp. Naktongense) 또는 바위구절초 (Chrysanthemum zawadskii var. alpinum)의 추출물을 포함한다.
본원에서 정의되는 추출물은 구절초의 극성용매 가용추출물 또는 비극성용매 가용추출물을 포함한다.
상기 구절초의 극성용매 가용 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물, 메탄올, 에탄올, 물 및 메탄올의 혼합용매 또는 물 및 에탄올의 혼합 용매, 보다 바람직하게는 20내지 100% 메탄올 또는 20 내지 100% 에탄올 용매에 가용한 추출물을 포함한다.
상기 구절초의 비극성용매 가용 추출물은 에틸아세테이트, 클로로포름, 헥산 또는 메틸렌클로라이드, 바람직하게는 에틸아세테이트 또는 클로로포름에 가용한 추출물을 포함한다.
상기 위장관 질환은 위염, 위궤양, 위궤양 장염, 십이지장궤양, 위암, 장폐색증, 급성 위장관 출혈, 크론씨병 또는 궤양성 대장염, 바람직하게는 위염, 위궤양 또는 십이지장궤양을 포함한다.
이하, 본 발명의 구절초 추출물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.
본 발명의 구절초 추출물은, 건조된 구절초를 세절하여 무게(㎏)의 약 2 배 내지 20 배, 바람직하게는 약 9 배 내지 14배의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코 올 또는 이들의 혼합용매 등의 극성 용매나, 헥산, 클로로포름, 메틸렌클로라이드 또는 에틸아세테이트 등의 비극성 용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물, 에탄올, 메탄올, 물 및 에탄올의 혼합용매, 물 및 메탄올의 혼합용매, 에틸아세테이트 또는 클로로포름으로, 0℃ 내지 80℃, 바람직하게는 20 ℃ 내지 30℃의 추출온도에서 약 1 내지 24 시간, 바람직하게는 약 9 내지 15 시간 동안 교반 추출, 초음파 추출 또는 환류 냉각 추출방법, 바람직하게는 교반 추출의 방법을 이용하여 수득한 추출액을 여과, 감압농축 또는 건조하여 수득할 수 있다
또한, 상기 본 발명의 위장관 질환의 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 1 내지 90 중량%로 포함할 수 있다. 그러나, 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.
한편, 본 발명은 또한, 구절초를 물 및 알코올의 혼합 용매로 추출하는 단계; 및 상기 추출물을 물 및 아세테이트의 혼합 용매를 이용하여 분획하는 단계를 통해 얻어지는 분획물을 유효성분으로 함유하는 위장관 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
상기 약학조성물에서, 알코올은 에탄올을 포함할 수 있으며, 아세테이트는 에틸아세테이트를 포함할 수 있다.
또한, 상술한 분획물을 함유하는 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 분획물을 1 내지 90 중량%로 포함할 수 있다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.
상술한 바와 같은, 본 발명의 추출물 또는 분획물을 포함하는 약학조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물 또는 분획물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 또는 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 추출물 또는 분획물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물 또는 분획물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 구절초 추출물 또는 분획물은 헬리코박터 파일로리의 생육 억제 활성, 헬리코박터 파일로리 우레아제 저해 활성 및 자유라디컬 소거 활성을 나타냄 을 확인하였고, 특히 기존 항생제와 유사한 항균 활성을 가졌으면서도 식품 공전에 수재된 안전한 천연물에서 유래됨으로써 안전하고 항생제 남용에 의한 내성균의 발생 등을 억제하는 위장관 질환의 치료 및 예방용 약학 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 구절초 추출물의 제조
대한민국 제천지역에서 채취하여 음지에서 건조하여 분쇄한 구절초 0.1kg을 추출용매인 99.5%의 메탄올 0.9L를 가하여 하룻밤 동안 실온에서 교반하여 추출한 후, 어드반텍 번호 2 종이여지로 여과 후 여액을 수욕 온도 40 ℃에서 완전감압 농축하여 진한 녹색의 점액상의 구절초 추출물 6g을 제조하여 하기 실험예의 시료로 사용하였다. 또한, 포천 구절초, 한라구절초, 낙동구절초 및 바위구절초 추출물은 대한민국에서 채취한 식물을 음지에서 건조하여 분쇄한 것을 위 구절초와 마찬가지 방법으로 메탄올로 추출한 후 메탄올 추출분획 만을 모아서 감압 하에서 메탄올을 제거하여 제조한 추출물을 한국자생식물사업단으로부터 분양 받아서 사용하였다.
실험예 1. 구절초 추출물의 헬리코박터 파일로리 생육저해 활성
상기 실시예 1에서 제조한 각 구절초 추출물(구절초, 포천 구절초, 한라구절초, 낙동구절초 및 바위구절초에서 각 추출한 것)들의 헬리코박터 파일로리 생육저해 활성을 측정하기 위해, 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(한국바이오벤처협회 단체표준 시험법, 유산균의 헬리코박터 파일로리 사멸기능 측정 방법).
헬리코박터 파일로리 ATCC26695 (Helicobacter pylori; ATCC26695)와 헬리코박터 파일로리 ATCC43504 (Helicobacter pylori; ATCC43504) 각각을 말 혈청을 10% 포함한 Brucella 한천배지에 도말 후 CO2 인큐베이터에서 37℃, 10% CO2 농도 조건에서 3일 배양한 다음 균체를 모아 멸균된 Brucella 액체 배지에 현탁하여 600nm에서 흡광도 1.0의 균체 현탁액을 제조하였다.
Brucella 배지 14g을 정제수 450 ml에 용해 후, 한천 6 g을 넣어 현탁 후 121℃에서 15분간 멸균한 다음 약 40℃에서 말혈청 50㎖ 혼합 후 지름 90mm의 페트리디쉬에 각각 25ml씩 분주하였고 한천을 굳힌 다음 상기의 균체 현탁액 0.2㎖을 도말하여 수분을 제거한 후 한천을 지름 6mm로 천공하였다. 천공된 구멍에 각각 상기 실시예 1의 구절초추출물, 포천구절초 추출물, 한라구절초 추출물, 낙동구절초 추출물, 바위구절초 추출물을 메탄올을 사용하여 각각 20mg/ml 농도로 용해하여 0.2㎛ 제균 여과를 한 후, 각각 20㎕씩 주입하였고, CO2 인큐베이터에서 37℃, 10% CO2 농도의 조건아래 3일간 배양한 다음 생성된 투명환의 지름을 측정하였으며, 천공지름을 뺀 순수저지환의 지름은 하기 표 1에 나타내었다.
각종 구절초 추출물의 헬리코박터 파일로리 저해 활성
샘플명 |
Clear zone (mm) |
|
HP ATCC 43504 |
HP ATCC 26695 |
공용매(메탄올) |
생성안됨 |
생성안됨 |
구절초 (Chrysanthemu zawadskii var. latilobum) |
10 |
12 |
포천구절초 (Chrysanthemum zawadskii var. tenuisectum) |
10 |
13 |
한라구절초 (Chrysanthemum zawadskii subsp. Coreanum) |
9 |
13 |
낙동구절초 (Chrysanthemum zawadskii subsp. Naktongense) |
6 |
8 |
바위구절초 (Chrysanthemum zawadskii var. alpinum) |
8 |
12 |
실험결과, 상기 표 1에서 나타나는 바와 같이, 실시예 1의 구절초 추출물들의 헬리코박터 파일로리 생육저해 활성이 우수함을 확인할 수 있었고, 또한, 오랜 동안 식품으로 사용하여 온 구절초 류의 추출물을 이용해, 인체에 안전하게 헬리코박터 파일로리 예방 및 제균 효과와 함께 천연물을 사용하여 항생제 남용에 의한 내성균 발생 등의 억제 효과를 나타낼 것으로 예상되었다.
실험예 2. 구절초 추출물의 헬리코박터 파일로리 우레아제 저해 활성
상기 실시예 1의 구절초 추출물들의 헬리코박터 파일로리 우레아제 저해 활성을 측정하기 위해, 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Odake S., Biol. Pharm. Bull., 17, pp. 1329-1322, 1994).
헬리코박터 파일로리 ATCC43504 (Helicobacter pylori; ATCC43504)를 10% 말혈청을 포함하는 Brucella 한천 배지에 37℃, 10% CO2 조건하에서 3일 배양한 후, 균체를 1ml 증류수에 현탁하였고, 실온에서 10분간 강하게 혼합하여 효소를 추출한 다음 15,000rpm으로 5분간 원심 분리하여 무색 투명한 상등액을 얻었으며, 이를 증류수로 200배 희석하여 사용하였다. 상기 실시예 1에서 제조한 각 구절초 추출물, 대조군인 아세톡시 하이드록사민산(Acetoxy hydroxamic acid), 메탄올을 0.1 몰 인산칼륨완충액(pH7.0)에 10배 희석한 각각의 희석액 50㎕와 상기와 같이 제조한 우레아제 추출물 50㎕를 섞은 후, 상온에서 10분 동안 방치하였다. 상기 구절초 추출물은 메탄올에 10mg/ml 농도로 용해된 것을, 아세톡시 하이드록사믹산은 0.32mg/ml 의 농도로 메탄올에 용해된 것을 사용하였다.
상기 혼합액에 300㎕의 0.1 몰 인산칼륨완충액(pH7.0)에 용해한 0.4몰 요소 용액을 첨가하여 37℃에서 20분 동안 반응시킨 후, 100ul의 0.1M 황산을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 그 후에 하기 표 2에 기재된 조성으로 제조한 페놀시액 300ul 와 알카리시액 300ul을 넣어 37℃에서 10분 동안 반응시킨 후, 흡광도(ABS 620nm)를 측정하여 우레아제 저해능을 측정하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
하기 수학식 1에서, 시료대신 메탄올을 사용한 것을 포지티브 흡광도, 효소액 대신 증류수를 사용한 것을 블랭크로 나타내었다.
(시료 흡광도 ― 시료 Blank) * 100
저해능(%) = 100 - --------------------------------
Positive 흡광도 ― 메탄올 Blank
페놀시액 조성 |
함량 |
Phenol |
10g/L |
Sodium nitroprusside |
0.05g/L |
알카리 시액 조성 |
함량 |
Sodium hydroxide |
5g/L |
Sodium hypochlorite |
0.42g/L |
각종 구절초의 헬리코박터 파일로리 우레아제 저해 활성
샘플 |
Conc (mg/ml) |
HP ATCC 43504 우레아제 저해율(%) |
Acetoxy hydroxamic acid |
0.32 |
79 |
구절초 (Chrysanthemu zawadskii var. latilobum) |
10 |
63 |
포천구절초 (Chrysanthemum zawadskii var. tenuisectum) |
10 |
57 |
한라구절초 (Chrysanthemum zawadskii subsp. Coreanum) |
10 |
62 |
낙동구절초 (Chrysanthemum zawadskii subsp. Naktongense) |
10 |
62 |
바위구절초 (Chrysanthemum zawadskii var. alpinum) |
10 |
60 |
실험결과, 상기 표 3에서 나타나는 바와 같이, 실시예 1의 구절초 추출물들은 이미 상술한 바와 같은 우수한 헬리코박터 파일로리의 생육저해 활성을 나타내면서도 헬리코박터 파일로리 우레아제 저해 활성은 기존 우레아제저해제인, 아세톡시 하이드록사믹산과 유사한 활성을 나타냄을 확인할 수 있었고, 또한 오랜 동안 식품으로 사용하여온 구절초 류의 추출물로서 인체에 안전하게 헬리코박터 파일로리 예방 및 제균 효과와 함께 천연물을 사용하여 항생제 남용에 의한 내성균 발생 등의 억제 효과를 나타낼 것으로 예상되었다.
실험예 3. 구절초 추출물의 자유라디칼 소거 활성
상기 실시예 1의 구절초 추출물의 자유라디칼 소거 활성을 측정하기 위해, 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다(Lee, Kor. J. Med. Crop Sci, 11, pp. 127, 2003).
에탄올에 녹인 1.5×10-4M 2,2-디페닐-1-피크릴히드라질(2.2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, DPPH) 746㎕에 시험액인 상기 실시예 1의 각 구절초 추출물(20mg/ml in MeOH) 또는 대조군인 비타민 씨(10mg/ml in H2O)용액 4ul 첨가한 후 10분 동안 상온에서 반응시킨 후에 흡광도(ABS 517nm)를 측정하였고, 블랭크 컨트롤은 시험액 대신 메탄올을 사용하여 흡광도를 측정하였으며, 하기 수학식 2를 이용하여 DPPH 자유라디칼 소거 활성을 측정하여 하기 표 4에 나타내었다.
(블랭크컨트롤- 시험흡광도)
디피피에취 자유라디칼 소거율 (%) = ---------------------- * 100
블랭크 컨트롤
각종 구절초 추출물의 디피피에취 자유라디칼 소거 활성
샘플 |
Conc (mg/ml) |
DPPH radical 소거율(%) |
비타민 씨 |
10 |
96 |
구절초 (Chrysanthemu zawadskii var. latilobum) |
20 |
84 |
포천구절초 (Chrysanthemum zawadskii var. tenuisectum) |
20 |
75 |
한라구절초 (Chrysanthemum zawadskii subsp. Coreanum) |
20 |
82 |
낙동구절초 (Chrysanthemum zawadskii subsp. Naktongense) |
20 |
50 |
바위구절초 (Chrysanthemum zawadskii var. alpinum) |
20 |
30 |
실험결과, 상기 표 4에서 나타나는 바와 같이, 실시예의 구절초 추출물들은 이미 상술한 바와 같은 우수한 헬리코박터 파일로리의 생육저해 활성을 나타냄과 동시에 헬리코박터 파일로리의 우레아제 활성을 저해하면서도 디피피에취 자유라디칼 소거 활성이 대조군인 비타민 씨와 유사한 수준으로 확인되었다.
실시예 2. 추출 용매에 따른 구절초 추출물의 제조
충청북도 제천 지역에서 채취하여 음건한 구절초를 분쇄하여 사용하였다. 250ml 삼각플라스크에 분쇄된 구절초 10 g과 추출 용매인 99.5%, 80%, 60%, 40%, 20%의 메탄올, 95%, 80%, 60, 40%, 20% 에탄올, 에틸아세테이트, 클로로포름을 각각 90ml를 가하고, 밀봉한 다음 25℃에서 14 시간 동안 240 rpm으로 회전 진탕 교반한 다음, 어드반텍 여지 번호 2를 이용하여, 여과 후 여액을 감압 농축하여 수득한 각각의 용매별 구절초 추출물을 하기 실험예의 시료로 사용하였다.
실시예 3. 제균 여과 추출물의 메탄올 양 및 온도에 따른 구절초 추출물의 제조
충청북도 제천 지역에서 채취하여 음건한 구절초를 분쇄하여 사용하였다. 250ml 둥근플라스크에 분쇄된 구절초 10 g과 추출 용매인 99.5% 메탄올을 각각 40, 90, 140, 190ml을 사용하여 실온에서 마그네틱 교반기로 교반하며 14시간 추출하였다. 한편, 90ml의 99.5% 메탄올을 사용하여 가열 환류하며 마그네틱 교반기로 교반하며 14시간 추출하였다. 추출액을 어드반텍 여지 번호 2를 이용하여, 각각 여과 후 여액을 감압 농축하여 제조한 메탄올 사용량 별 구절초 추출물 및 메탄올 가열 환류 추출한 구절초 추출물을 제조하여 하기 실험예의 시료로 사용하였다.
실험예 4. 추출용매에 따른 항균 활성의 측정
상기 실시예 2에서 추출 용매 별로 제조한 구절초 추출물의 헬리코박터 파일로리 ATCC 43504 생육저해활성을 측정하기 위하여 각각의 추출물에 100ml의 메탄올을 가하여 용해 후 0.2㎛의 제균 여과를 한 다음 실험예 1에 기재된 방법을 사용하여 생육저해 시험을 수행하였으며 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
추출용매별 구절초 추출물의 추출량 및 항균활성
추출용매 |
추출물의 양(g) |
항균활성(Clear zone의 지름-천공지름) |
99.5% 메탄올 |
1.02 |
13mm |
80% 메탄올 |
1.32 |
11mm |
60% 메탄올 |
2.10 |
9mm |
40% 메탄올 |
2.71 |
8mm |
20% 메탄올 |
1.95 |
4mm |
95% 에탄올 |
0.97 |
12mm |
80% 에탄올 |
1.21 |
10mm |
60% 에탄올 |
1.33 |
8mm |
40% 에탄올 |
1.82 |
6mm |
20% 에탄올 |
1.61 |
3mm |
에틸아세테이트 |
0.45 |
13mm |
클로로포름 |
0.52 |
13mm |
실험결과, 상기 표 5에서 나타나는 바와 같이, 실시예의 구절초 추출물은 다양한 용매 중에서도, 에틸아세테이트, 클로로포름의 비극성 용매 또는 메탄올 또는 에탄올 등의 알코올계 추출 용매를 사용하는 것이 알코올계 용매에 물을 혼합하여 추출하는 것 보다 추출물의 양은 적지만 보다 우수한 헬리코박터 파일로리 생육저해활성을 나타냄을 확인할 수 있었다.
실험예 5. 메탄올 양 및 추출온도별 구절초 추출물의 헬리코박터 파일로리 생육저해활성 측정
상기 실시예 3에서 추출 메탄올 양 및 추출 온도별로 제조한 구절초 추출물의 헬리코박터 파일로리 ATCC 43504 (Helicobacter pylori; ATCC 43504) 생육저해활성을 측정하기 위하여 각각의 추출물에 100ml의 메탄올을 가하여 용해 후 0.2㎛의 제균 여과를 한 다음 상기 실험예 1과 동일한 공정으로 생육저해활성 측정을 수행하였으며 그 결과는 하기 표 6에 나타내었다.
추출 메탄올 양 및 온도별 구절초 추출물의 추출량 및 항균활성
메탄올 사용량 |
메탄올 양 /구절초 무게 |
추출온도 |
추출물의 양(g) |
항균활성(Clear zone지름-천공지름) |
40ml |
4 |
20-30℃ |
0.81 |
11mm |
90ml |
9 |
20-30℃ |
1.05 |
13mm |
140ml |
14 |
20-30℃ |
1.18 |
13mm |
190ml |
19 |
20-30℃ |
1.25 |
12mm |
90ml |
9 |
64℃ |
2.22 |
13mm |
실험 결과, 상기 표 6에서 나타난 바와 같이, 9배 이상의 메탄올을 사용한 경우에 추출되는 추출물의 헬리코박터 파일로리에 대한 항균활성은 유사하며 환류 가열을 하여 추출하여도 추출된 물질의 항균 활성은 유사함을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 메탄올 추출 구절초 분획물의 제조
제천지역에서 채취 후, 음지에서 건조하여 분쇄한 구절초 50g과 추출용매인 99.5%의 메탄올 0.45L를 1L 삼각플라스크에 가하여 하룻밤 동안 실온에서 마그네틱 교반기로 교반하여 추출하였고, 어드반텍 번호 2 종이여지로 여과 후, 여액을 수욕 온도 40 ℃에서 완전감압 농축하여 진한 녹색의 점액상의 구절초 메탄올 추출물 5.4g을 제조하였다. 상기 메탄올 추출물에 100ml의 정제수와 100ml의 에틸아세테이트를 가하여 구절초 추출물을 녹인 후, 액-액 층분리를 하여 에틸아세테이트 유기층을 모은 다음 다시 100ml 정제수로 세척 후, 유기층을 모아 수욕온도 40 ℃에서 완전감압 농축하여 진한녹색의 점액상의 구절초 추출물의 에틸아세테이트 분획물 1.54g을 수득하였다.
실시예 5. 에탄올 추출 구절초 분획물의 제조
제천지역에서 채취 후, 음지에서 건조하여 분쇄한 구절초 50g과 추출용매인 95%의 에탄올 0.45L를 1L 삼각플라스크에 가하여 하룻밤 동안 실온에서 마그네틱 교반기로 교반하여 추출하였고, 어드반텍 번호 2 종이여지로 여과 후, 여액을 수욕 온도 40 ℃에서 완전감압 농축하여 진한 녹색의 점액상의 구절초 에탄올 추출물 5.2g을 제조하였다. 상기 에탄올 추출물에 100ml의 정제수와 100ml의 에틸아세테이트를 가하여 구절초 추출물을 녹인 후, 액-액 층분리를 하여 에틸아세테이트 유기층을 모은 다음 다시 100ml 정제수로 세척 후, 유기층을 모아 수욕온도 40 ℃에서 완전감압 농축하여 진한녹색의 점액상의 구절초 추출물의 에틸아세테이트 분획물 1.5g을 수득하였고, 하기 실험예의 시료로 사용하였다.
실험예 5. 구절초 분획물의 항균 활성
상기 실시예 5의 구절초 추출물과 에틸아세테이트 분획물을 각각 메탄올로 10mg/ml와 2.9mg/ml의 농도로 용해 후, 0.2㎛의 제균 여과를 하였고, 유효성분의 분포를 확인하기 위하여 사용된 시료는 에틸아세테이트 유기층을 농축 후, 5배 용량의 메탄올로 치환 후 사용하였고, 수층은 그대로 실험예 1과 동일한 공정으로 헬리코박터 파일로리 생육저해 측정을 수행하였으며, 그 결과는 하기 표 7에 나타내었다.
구절초 추출물과 에틸아세테이트 분획물의 항균 활성
샘플 |
추출물의 양(g) |
항균활성(Clear zone지름 ―천공지름) |
메탄올 |
해당없음 |
0mm |
구절초 추출물(에탄올 추출물) |
5.2g |
12mm |
에틸아세테이트 유기층 |
해당없음 |
12mm |
수층 |
해당없음 |
0mm |
에틸아세테이트 분획 |
1.50g |
12mm |
실험 결과, 상기 표 7에서 나타난 바와 같이, 구절초 추출물의 헬리코박터 파일로리 생육저해활성은 에틸아세테이트와 물로 액-액 추출하여 분획 시, 에틸아세테이트 층으로 모두 이동함을 확인하였다.
하기에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
구절초 추출물 (실시예 1) 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
구절초 분획물 (실시예 4) 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
구절초 추출물 (실시예 1) 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
구절초 분획물 (실시예 5) 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4,12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
구절초 추출물 (실시예 1) 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.