JP7053887B2 - トリシン含量が増加した真菰草酵素処理抽出物の製造方法及びこれにより製造された美白、しわ改善、抗炎症、抗アレルギー、保湿用組成物 - Google Patents

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特許法第３０条第２項適用 ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｄｐｉ．ｃｏｍ／１４２０－３０４９／２３／９／２２５４ ムン ジュ ミュン，パク セ ホ，チェ カン ワン，ヤン ソン アが上記ＵＲＬにおいて、出願に係る発明を２０１８年９月４日付で公開。

本発明は、トリシン含量が増加した真菰草酵素処理抽出物の製造方法及びこれにより製造された美白、しわ改善、抗炎症、抗アレルギー及び保湿用化粧料組成物または健康機能食品組成物に関する。

真菰草（Ｚｉｚａｎｉａ ｌａｔｉｆｏｌｉａ Ｔｕｒｃｚ．）は、イネ科に属す多年草であって、菰または真菰と呼ばれる。高血圧、中風、便秘、肥満、動脈硬化など疾病に効果があると知られており、民間では、農薬中毒や化学薬品中毒、食中毒などに真菰草を煎じて飲むか、その汁を飲めば、効果があるとする。また、最近、真菰草を利用した健康食品及び液状茶などが開発されている（大韓民国公開特許１０－２０１０－０１０４３３４号、大韓民国公開特許１０－２００９－０１２７９７０号）。

真菰草に含有されている活性物質は、トリシン配糖体または誘導体の配糖体であって、これらは、親水性が高い糖分子が結合されており、腸細胞膜脂質透過率が低くて、体内吸収率が低く表われる。しかし、糖分子を除いた炭素骨格自体は疎水性が高いために、腸細胞膜脂質で溶解度が高くて、腸細胞膜透過が容易である。これにより、腸内吸収率が低くなる可能性があるトリシン配糖体及び誘導体の配糖体をトリシンに切り替えて体内吸収率を増加させれば、高い活性を期待することができる。

また、多様なフラボノイド配糖体の場合、非配糖体に切り替えれば、目的とする活性がさらに増加するという文献の内容もあって、トリシン及び誘導体も、配糖体を非配糖体に切り替えれば、美白、しわ改善、抗炎症、抗アレルギー及び保湿機能において、さらに増大する効果を示すことができる。

しかし、効能を示す有効成分を抽出する方法において、メタノール、エタノールなどの抽出溶媒を使用した常温抽出または振盪抽出などの単純抽出は、生体利用率が高い非配糖体有効成分の含量が低くて、有効成分の効能が少なく表われる恐れがある。

一方、健康機能食品の製造工程で物質配糖体の糖分解工程は、酸と高温処理または発酵及び酵素処理を通じて行う場合がほとんどである。しかし、発酵工程は、微生物の状態、生育条件などを一定に保持しなければならず、特に、微生物の状態によって分泌される酵素の変化によって抽出物の有効成分含量の偏差が大きくなるために、基準を合わせにくいという短所がある。また、酸と高温処理工程は、配糖体物質を比較的容易に非配糖体に切り替える長所を有しているが、苛酷条件を利用するために、化学的側面で物質の安定性を確保し難く、これによる再現性の確保が困難でもある。

一方、酵素処理工程は、前記提示した工程に比べて、物質安定性と工程とが比較的簡単であって、商業化に良い長所を有しているために、微生物が分泌する酵素を活用して酵素処理工程を確立すれば、最終抽出物有効成分の含量偏差を減らしながら、物質の安定性も確保可能なので、非配糖体有効成分を安定して誘導するのに役に立つと考えられる。

本発明者は、真菰草に存在するトリシンの配糖体を美白、しわ改善、抗炎症、抗アレルギー及び保湿にさらに高い効能を示し、生体利用率が増加した非配糖体の形態に効果的に転換させることができる方法を模索し、その結果、単純に単一酵素による非配糖体転換よりも特定の酵素を多様に混合して利用した酵素反応が、トリシン配糖体を非配糖体の形態に切り替えるのにさらに効果的であるということを確認し、本発明を完成した。

本発明の目的は、トリシンの含量を極大化することができる真菰草抽出物の製造方法を提供するところにある。

本発明の他の目的は、トリシンの含量が極大化されて多様な機能性が向上した化粧料組成物を提供するところにある。

本発明のさらに他の目的は、トリシンの含量が極大化されて多様な機能性が向上した健康機能食品組成物を提供するところにある。

前記目的を果たすために、本発明は、（１）真菰草に水を添加し、熱水浸漬する段階；（２）前記段階（１）で熱水浸漬後、冷却した浸漬物に、α－アミラーゼ（α－Ａｍｙｌａｓｅ）、β－ガラクトシダーゼ（β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）、キシラナーゼ（Ｘｙｌａｎａｓｅ）、ラクターゼ（Ｌａｃｔａｓｅ）、リパーゼ（Ｌｉｐａｓｅ）、タンナーゼ（Ｔａｎｎａｓｅ）、セルラーゼ（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）、ヘミセルラーゼ（Ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌａｓｅ）、ペクチナーゼ（ｐｅｃｔｉｎａｓｅ）、及びβ－グルコシダーゼ（β－Ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）からなる群から選択される１つ以上の酵素を処理して反応させた後、濾過して酵素処理抽出物を得る段階；（３）前記段階（２）で濾過し、残りの残渣に水、Ｃ１～Ｃ４の低級アルコール、及びこれらの混合からなる群から選択された何れか１つの溶媒として抽出して２次抽出物を得る段階；及び（４）前記段階（２）の酵素処理抽出物と前記段階（３）の２次抽出物とを混合した後、濃縮または乾燥する段階；を含む真菰草酵素処理抽出物の製造方法を提供する。

前記他の目的を果たすために、本発明は、前記製造方法で製造された真菰草酵素処理抽出物を有効成分として含み、前記真菰草酵素処理抽出物は、０．０１～９０重量％のトリシンを含有することを特徴とする化粧料組成物を提供する。

前記さらに他の目的を果たすために、本発明は、前記製造方法で製造された真菰草酵素処理抽出物を有効成分として含み、前記真菰草酵素処理抽出物は、０．０１～９０重量％のトリシンを含有することを特徴とする健康機能食品組成物を提供する。

本発明は、真菰草酵素処理抽出物の製造方法及びこれにより製造された真菰草酵素処理抽出物を含む組成物に関するものであって、本発明による製造方法は、多様な酵素の混合ないし複合処理段階を含むので、これにより製造された真菰草酵素処理抽出物は、収率及びトリシン含量が極大化されるので、このような方法で製造された真菰草酵素処理抽出物は、高い生体利用率と皮膚美白、保湿、抗炎症、抗アレルギー、しわ改善活性とが増大した化粧料組成物または健康機能食品組成物として有用に活用されうる。

本発明の一実施例による真菰草酵素処理抽出物の製造方法を模式的に示す工程図である。 本発明による真菰草エタノール及び酵素処理抽出物の収率を示すグラフである（^＊ｐ＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ＥｔＯＨ、^＊＊ｐ＜０．０１ ｖｅｒｓｕｓ ＥｔＯＨ、^＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｅｒｓｕｓ ＥｔＯＨ）。 本発明による真菰草エタノール及び酵素処理抽出物のトリシン含量の分析結果を示すグラフである（^＊ｐ＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ＥｔＯＨ、^＊＊ｐ＜０．０１ ｖｅｒｓｕｓ ＥｔＯＨ、^＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｅｒｓｕｓ ＥｔＯＨ）。 真菰草エタノール及び酵素処理抽出物のトリシン分析のクロマトグラムである。 真菰草エタノール及び酵素処理抽出物の収率を勘案したトリシン総量を示すグラフである（^＊ｐ＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ＥｔＯＨ、^＊＊ｐ＜０．０１ ｖｅｒｓｕｓ ＥｔＯＨ、^＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｅｒｓｕｓ ＥｔＯＨ）。 真菰草エタノール及び酵素処理抽出物の抗炎症効能を確認した結果である（^＃ｐ＜０．０１ ｖｅｒｓｕｓ ＬＰＳ、^＊ｐ＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ＥｔＯＨ、^＊＊ｐ＜０．０１ ｖｅｒｓｕｓ ＥｔＯＨ）。 トリシンの濃度による抗炎症効能を確認した結果である（^＊ｐ＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ＬＰＳ、^＊＊ｐ＜０．０１ ｖｅｒｓｕｓ ＬＰＳ、^＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｅｒｓｕｓ ＬＰＳ）。 真菰草エタノール及び酵素処理抽出物の美白効能を確認した結果である（^＃ｐ＜０．０１ ｖｅｒｓｕｓ ＣＯＮ、^＊ｐ＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ＥｔＯＨ、^＊＊ｐ＜０．０１ ｖｅｒｓｕｓ ＥｔＯＨ、^＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｅｒｓｕｓ ＥｔＯＨ）。 トリシンの濃度による美白効能を確認した結果である（^＊ｐ＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ＣＯＮ、^＊＊ｐ＜０．０１ ｖｅｒｓｕｓ ＣＯＮ、^＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｅｒｓｕｓ ＣＯＮ）。 真菰草エタノール及び酵素処理抽出物のしわ改善効能を確認した結果である（^＃ｐ＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ＵＶ、^＊ｐ＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ＥｔＯＨ、^＊＊ｐ＜０．０１ ｖｅｒｓｕｓ ＥｔＯＨ）。 トリシンの濃度によるしわ改善効能を確認した結果である（^＊ｐ＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ＣＯＮ、^＊＊ｐ＜０．０１ ｖｅｒｓｕｓ ＣＯＮ、^＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｅｒｓｕｓ ＣＯＮ）。 真菰草エタノール及び酵素処理抽出物の抗アレルギー効能を確認した結果である（^＃ｐ＜０．００１ ｖｅｒｓｕｓ ＤＮＰ－ＨＡＳ、^＊ｐ＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ＥｔＯＨ）。 トリシンの濃度による抗アレルギー効能を確認した結果である（^＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｅｒｓｕｓ ＤＮＰ－ＨＳＡ）。 動物実験デザインを示した図面である。 動物実験で実験群の体重変化を示すグラフである。 動物試験で実験群の皮膚表面水分度を示すグラフである。 動物試験で実験群の血清検査結果を示すグラフである。 動物試験で実験群の背中表面の肉眼観察結果を示す図である。 動物試験で実験群をＳＩＬＦＬＯ顕微鏡で観察した写真である。 動物試験で実験群を対象にして行ったＨ＆Ｅ染色結果を示す写真である。 動物試験で実験群のマッソントリクローム（Ｍａｓｓｏｎ´ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色結果を示す写真である。 動物試験で実験群のＵＶＢ照射時に、皮膚組織のタンパク質発現を確認した結果である。 抽出条件が確立された真菰草エタノール抽出物と真菰草酵素処理抽出物との収率を比較したグラフである。 抽出条件が確立された真菰草エタノール抽出物と真菰草酵素処理抽出物とのトリシンの含量を比較したグラフである。 抽出条件が確立された真菰草エタノール抽出物と真菰草酵素処理抽出物との抗炎症効能を比較したグラフである（^＊＊ｐ＜０．０１ ｖｅｒｓｕｓ ＬＰＳ、^＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｅｒｓｕｓ ＬＰＳ）。 抽出条件が確立された真菰草エタノール抽出物と真菰草酵素処理抽出物との美白効能を比較したグラフである（^＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｅｒｓｕｓ ＣＯＮ）。 抽出条件が確立された真菰草エタノール抽出物と真菰草酵素処理抽出物とのしわ改善効能を比較したグラフである（^＊ｐ＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ＵＶ、^＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｅｒｓｕｓ ＵＶ）。 抽出条件が確立された真菰草エタノール抽出物と真菰草酵素処理抽出物との抗アレルギー効能を比較したグラフである（^＊＊＊ｐ＜０．００１ ｖｅｒｓｕｓ ＤＮＰ－ＨＡＳ）。

真菰草抽出物に含まれている活性物質は、トリシン配糖体または誘導体の配糖体であって、これらは、親水性が高い糖分子が結合されており、腸細胞膜脂質に対する溶解度が低くて、体内吸収率が少ない可能性が大きい。このような問題点を解消するために、本発明の発明者らは、トリシン配糖体及び誘導体配糖体の糖を分解して生体利用率を増加させ、トリシン配糖体及び誘導体の配糖体よりも活性に優れた非配糖体に切り替えることにより、抗炎症、皮膚美白、しわ改善、抗アレルギー、保湿効能が増加する方法を研究した。

これにより、本発明の一実施例において、本発明で開示する製造方法で抽出した真菰草抽出物は、トリシン含量が増加し、これにより、抗炎症、皮膚美白、抗アレルギー、しわ改善、保湿効能が増加し、付加的に収率も、１１％から約２倍増加した２０．８％であって、商業的量産が可能であって、化粧品原料及び機能性食品として活用する価値が高い真菰草酵素処理抽出物を開発した。多様な効能が増加する理由は、真菰草抽出物が含有しているトリシン配糖体及び誘導体であるトリシン－７－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノース（Ｔｒｉｃｉｎ－７－Ｏ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）とトリシン誘導体であるトリシン－４’－Ｏ－（トレオ－β－グアイアシルグリセロール）エーテル７－ｏ－β－Ｄ－グルコピラノース（Ｔｒｉｃｉｎ－４’－Ｏ－（ｔｈｒｅｏ－β－ｇｕａｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｙｌ）ｅｔｈｅｒ７－ｏ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）、トリシン－４’－Ｏ－（エリスロ－β－グアイアシルグリセロール）エーテル７－ｏ－β－Ｄ－グルコピラノース（Ｔｒｉｃｉｎ－４’－Ｏ－（ｅｒｙｔｈｒｏ－β－ｇｕａｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｙｌ）ｅｔｈｅｒ７－ｏ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）、トリシン－４’－Ｏ－（トレオ－β－グアイアシルグリセロール）エーテル７’’－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノース（Ｔｒｉｃｉｎ－４’－Ｏ－（ｔｈｒｅｏ－β－ｇｕａｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｙｌ）ｅｔｈｅｒ７’’－ｏ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）、トリシン－４’－Ｏ－（エリスロ－β－グアイアシルグリセロール）エーテル７’’－ｏ－β－Ｄ－グルコピラノース（Ｔｒｉｃｉｎ－４’－Ｏ－（ｅｒｙｔｈｒｏ－β－ｇｕａｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｙｌ）ｅｔｈｅｒ７’’－ｏ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）及びサルコリンＡ（Ｓａｌｃｏｌｉｎ Ａ）、サルコリンＢ（Ｓａｌｃｏｌｉｎ Ｂ）、サルコリンＣ（Ｓａｌｃｏｌｉｎ Ｃ）、サルコリンＤ（Ｓａｌｃｏｌｉｎ Ｄ）などの前駆体が酵素反応を通じて高い活性を示すトリシンに切り替えられたと推定される。本発明による真菰草酵素処理抽出物の製造方法は、図１に図式化して示した。

これにより、本発明は、（１）真菰草に水を添加し、熱水浸漬する段階；（２）前記段階（１）で熱水浸漬後、冷却した浸漬物に、α－アミラーゼ［ＥＣ ３．２．１．１］、β－ガラクトシダーゼ［ＥＣ ３．２．１．２３］、キシラナーゼ［ＥＣ ３．２．１．８］、ラクターゼ［ＥＣ ３．２．１．１０８］、リパーゼ［ＥＣ ３．１．１．３］、タンナーゼ［ＥＣ ３．１．１．２０］、セルラーゼ［ＥＣ ３．２．１．４］、ヘミセルラーゼ［ＥＣ ２３２－７９９－９］、ペクチナーゼ［ＥＣ ３．２．１．１５］、及びβ－グルコシダーゼ［ＥＣ ３．２．１．２１］からなる群から選択される１つ以上の酵素を処理して反応させた後、濾過して酵素処理抽出物を得る段階；（３）前記段階（２）で濾過し、残りの残渣に水、Ｃ１～Ｃ４の低級アルコール、及びこれらの混合からなる群から選択された何れか１つの溶媒として抽出して２次抽出物を得る段階；及び（４）前記段階（２）の酵素処理抽出物と前記段階（３）の２次抽出物とを混合した後、濃縮または乾燥する段階；を含む真菰草酵素処理抽出物の製造方法を提供する。

望ましくは、前記段階（１）で、熱水浸漬は、真菰草１重量部に対して１～１００重量部の水を添加し、２０～１３０℃で５分～１００時間行われ、より望ましくは、真菰草１重量部に対して１～５０重量部の水を添加し、５０～１２０℃で３０分～１００時間行われ、最も望ましくは、真菰草に５～３０重量部の水を添加し、７０～１２０℃で３０分～４時間行われうる。

前記段階（２）で、冷却は、１０～９０℃で行われ、望ましくは、２０～４５℃で行われうる。

また、前記段階（２）で、前記浸漬物１００重量部に対して、０．１～８０重量部の酵素を処理することができるので、酵素が前記数値範囲を外れて過度に少なく処理されれば、酵素量が過度に少なくて、前記真菰草熱水浸漬物に存在するトリシンを前駆体から円滑に分離及び転換しにくく、逆に過度に多く処理されれば、トリシン前駆体以外の、活性に関与しない物質が高い含量で共に抽出されて、トリシンの含量が相対的に低くなり、効能が低下した抽出物が製造されてしまい、商業的にも製造工程コストに悪影響を与えるので、望ましくない。

この際、前記段階（２）で、酵素を処理し、１０～９０℃で５分～１２０時間反応させ、望ましくは、２０～８０℃で５分～１２０時間、より望ましくは、３０～６０℃で５分～４８時間、最も望ましくは、２０～４５℃で８～２４時間酵素を反応させることができるので、前記適正酵素の反応時間は、酵素の添加量に対して反比例するので、酵素の添加量が多いほど反応時間は短縮される。

但し、前記酵素処理後、反応時間が前記数値範囲未満である場合には、酵素処理時間が過度に短くて、真菰草熱水浸漬物に存在するトリシン前駆体からトリシンへの転換率が低くなり、逆に酵素処理反応時間が前記数値範囲を超過する場合には、商業的に製造工程コストに影響を与えるので、望ましくない。

本発明の目的を果たすために、前記酵素の複合体は、精製された単一酵素の複合または商業化された複合酵素を１個以上複合して使用することもできる。商業化された酵素の例として、常用酵素であるプランダーゼＴＬ、ラピダーゼＣ８０ ＭＡＸ、ビスコザイムＬ、スミチームＳＰＣ、スミチームＡＣ、ペクチネックスＵｌｔｒａ ＳＰ－Ｌ、ペクチネックスＵｌｔｒａ ｐｕｌｐ及びビスコフローＭＧのうちから選択される１種以上であるが、これに制限されるものではない。

本発明の一実施例において、前記段階（２）で、β－グルコシダーゼ、セルラーゼ及びヘミセルラーゼの３種の酵素を同時に処理することができるので、特に、このように３種の酵素を混合して使用する場合、各種のトリシンの含量及び収率が最も高く、その機能性も、著しく優れているので望ましい。

本発明の一実施例において、前記段階（２）で、酵素は、真菰草に含まれているフラボノイド配糖体をフラボノイド非配糖体に切り替えることができる。

トリシン配糖体及び誘導体の配糖体は、糖の結合がいずれもＲ－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノースであって、トリンシン及び誘導体の構造にブドウ糖がβの結合で結合した配糖体である。β結合を行ったブドウ糖を分解する最も代表的な酵素としては、β－グルコシダーゼ酵素があり、それを活用するために、本発明に参考にして酵素反応を進行したが、その結果、トリシン含量の増加がほとんど表われず、美白、しわ改善、炎症改善、アレルギー改善及び保湿の効能でも大きな変化が観察されていない。これは、既存にβ結合を分解する酵素としてよく知られたβ－グルコシダーゼ酵素は、一般的に果物の最終熟成段階でアントシアニンに結合した糖分子の分解に関与すると知られているが、アントシアニンは、アントシアニジン系であって、フラボン系トリシンとは分子構造が、下記化学式１に開示されたように確実な差があり、糖が結合された位置も異なって、基質特異性によって化学式２のように反応が起こらないと考えられる。

このように類似した構造を含んでいるとしても、基質特異性によって処理される酵素の活性有無が変わるように、β－グルコシダーゼ酵素の活性サイトにトリシンの構造が構造特異的に合わなくて、トリシン配糖体の糖分解を円滑に進行することができなかったと考えられる。

前記段階（３）で、前記残渣１重量部に対して１～１００重量部の水またはアルコール水溶液を溶媒として、２０～１３０℃で１０分～１００時間抽出し、望ましくは、２０～１００℃で２～１２時間抽出し、または、前記残渣１重量部に対して１～３０重量部の水またはアルコール水溶液を溶媒として、５０～１００℃で３０分～１０時間抽出することができるので、前記抽出温度が前記範囲未満であれば、活性にトリシン及び有効成分の抽出収率が低くなり、抽出温度が前記範囲を超過すれば、有効成分が破壊されるか、活性に関与しない物質が高い含量で共に抽出されて、効能が低下した抽出物が製造されてしまい、望ましくない。

本発明の一実施例において、前記アルコールは、５～９５重量％のエタノール水溶液、望ましくは、２０～８０重量％のエタノール水溶液、より望ましくは、５０～７０重量％のエタノール水溶液であり、最も望ましくは、７０重量％のエタノール水溶液である。

すなわち、最も望ましくは、前記段階（３）で、抽出は、７０％エタノールを溶媒として、８０℃で６時間行われるので、このような抽出条件から抽出される時、トリシンの含量、収率ないし機能性が全部極大化されるので望ましい。

また、前記段階（４）で混合物を濃縮して濃縮液を得るか、濃縮液を乾燥して粉末状の抽出物が得られる。

本発明の一実施例によれば、前記段階（３）の抽出前に超音波またはマイクロ波を照射する前処理段階をさらに行い、超音波とマイクロ波とを併用して照射することもできる。前記真菰草酵素処理抽出物に超音波または／及びマイクロ波を照射する場合、そうではない場合に比べて、炎症改善、皮膚美白、しわ改善、アレルギー改善、保湿の機能性が向上した抽出物が得られて望ましい。

前記超音波は、１５～２５ｋＨｚ及び５００～８００ワットで２～３０分間照射され、前記マイクロ波は、２０００～３０００ＭＨｚ及び５０～４００ワットで５～６０秒間照射されるので、超音波またはマイクロ波の照射エネルギー及び照射時間が前記範囲未満であれば、照射による効果が微小であり、前記範囲を超過すれば、活性に関与しない物質の抽出率が増加して望ましくない。

一方、前記真菰草酵素処理抽出物を対象にして、通常の濾過方法または装置を用いて不純物を除去し、例えば、遠心分離方法を利用するか、濾過体またはミクロフィルターを用いて濾過して不純物が除去された抽出物が得られる。この際、前記濾過体は、１～２００μｍ、ミクロフィルターは、０．２～０．８μｍのフィルターであるが、これに制限されるものではない。

前記の真菰草酵素処理抽出物は、減圧蒸留、凍結乾燥または噴霧乾燥のような追加的な過程を経た粉末状に製造されることもあり、酵素固定化方式による連続工程方式によって製造されることもある。前記方法によれば、固形分の収率が２０重量％以上である真菰草酵素処理抽出物を提供することができる。

このように製造された抽出物は、以後濾過するか、濃縮または乾燥過程を行って溶媒を除去し、濾過、濃縮及び乾燥をいずれも行うことができる。例えば、濾過紙を利用するか、減圧濾過器を利用し、濃縮は、減圧濃縮機、乾燥は、熱風乾燥、噴霧乾燥、低温乾燥、凍結乾燥法などを行うことができるが、明示した方法で制限されるものではない。

前述したように、前記製造方法で製造された前記真菰草酵素処理抽出物は、０．０１～９０重量％のトリシンを含んでいるので、美白、しわ改善、炎症改善、アレルギー改善及び保湿用組成物として活用されうる。

本発明において、前記トリシンは、下記化学式３で表示されるものである：

また、前記トリシンの前駆体として、酵素処理後、トリシン含量増加に影響を及ぼす物質は、次の通りであり、これらの化学式を下記化学式４に示した：

１．トリシン（化学式４の１）

２．トリシン－７－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノース（化学式４の２）

３．サルコリンＡ（化学式４の３）

４．サルコリンＢ（化学式４の４）

５．トリシン－４’－Ｏ－（トレオ－β－グアイアシルグリセロール）エーテル７－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノース（化学式４の５）

６．トリシン－４’－Ｏ－（エリスロ－β－グアイアシルグリセロール）エーテル７－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノース（化学式４の６）

７．トリシン－４’－Ｏ－（トレオ－β－グアイアシルグリセロール）エーテル７’’－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノース（化学式４の７）

８．トリシン－４’－Ｏ－（エリスロ－β－グアイアシルグリセロール）エーテル７’’－Ｏ－β－Ｄ－グルコピラノース（化学式４の８）

９．サルコリンＣ（化学式４の９）

１０．サルコリンＤ（化学式４の１０）

したがって、本発明は、前記製造方法で製造された真菰草酵素処理抽出物を有効成分として含み、前記真菰草酵素処理抽出物は、０．０１～９０重量％のトリシンを含有することを特徴とする化粧料組成物を提供する。

前記化粧料組成物は、用途が美白用、しわ改善用、炎症改善用、アレルギー改善用または保湿用であるので、高含量のトリシンを含有しているので、優れた美白、しわ改善、炎症改善、アレルギー改善及び保湿効果を示すことができる。

本明細書において、「化粧料」とは、化粧品または医薬部外品になる物質を言う。化粧品とは、人体を清潔・美化して魅力を加え、容貌を明るく変化させるか、皮膚・毛髪の健康を保持または増進するために人体に使われる物品であって、人体に対する作用が軽微なものを指称する。また、機能性化粧品とは、皮膚の美白に役に立つか、皮膚のしわ改善に役に立つか、紫外線から皮膚の保護に役に立つ製品であって、保健福祉家族部令が定めたものを含み、皮膚を改善するあらゆるものを通称する。医薬部外品は、疾病を治療するか、予防するために使う医薬品よりは人体に対する作用が軽微な物品に対して保健福祉部が別途に定めた分類基準による薬品を指称する。薬事法によれば、医薬品の用途として使われる物品を除いたものであって、ヒト・動物の疾病治療や予防に使われる繊維・ゴム製品、人体に対する作用が軽微であるか、直接作用せず、器具または機械ではないものとそれと類似したもの、感染病を防ぐための殺菌・殺虫剤などが含まれる。医薬部外品の代表的な例としては、歯磨き粉、機能性石鹸、機能性シャンプーなどがある。

すなわち、本発明の化粧料組成物は、皮膚美白、老化防止、しわ改善または皮膚弾力増進のための化粧品（エッセンス、クリームなど）または皮膚美白、老化防止、しわ改善または皮膚弾力増進のための機能性石鹸またはクレンジングフォーム、クレンジングクリーム、クレンジングウォーターなどの医薬部外品として使われる。

本発明の一実施例において、前記真菰草抽出物は、組成物総重量に対して０．００１～１００重量％に含有されるが、これに制限されるものではない。

前記化粧料組成物は、前記成分と共に必要に応じて通常化粧料に配合される他の成分と配合される。それ以外に添加しても良い配合成分としては、油脂成分、保湿剤、エモリエント剤、界面活性剤、有機及び無機顔料、有機粉体、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、植物抽出物、ｐＨ調整剤、アルコール、色素、香料、血行促進剤、冷感剤、制汗剤、精製水、紫外線遮断剤などが挙げられる。

前記化粧料組成物に含まれる成分は、前記化合物の以外に、化粧料組成物に通用される成分をさらに含み、例えば、安定化剤、溶解化剤、ビタミン、顔料及び香料のような通常の補助剤、担体及び保湿剤を含みうる。

また、前記化粧料組成物は、当業者にとって、通常製造される如何なる剤型にも製造可能であり、例えば、乳液、懸濁液、クリーム、化粧水、エッセンス、パック、ゲル、パウダー、リップスティック、メイクアップベース、ファンデーション、ローション、軟膏、パッチ、美容液、クレンジングフォーム、クレンジングクリーム、クレンジングウォーター、ボディローション、ボディクリーム、ボディオイル、ボディエッセンス、シャンプー、リンス、ボディ洗浄剤、石鹸及び噴霧剤から選択された剤型であるものである。これら剤型の製造方法は、通常の化粧料剤型の製造方法によって製造可能である。

また、本発明は、前記製造方法で製造された真菰草酵素処理抽出物を有効成分として含み、前記真菰草酵素処理抽出物は、０．０１～９０重量％のトリシンを含有することを特徴とする健康機能食品組成物を提供する。

前記健康機能食品組成物は、用途が美白用、しわ改善用、炎症改善用、アレルギー改善用または保湿用であるので、高含量のトリシンを含有しているので、優れた美白、しわ改善、炎症改善、アレルギー改善及び保湿効果を示すことができる。

本発明において、「健康機能食品」とは、健康機能食品に関する法律第６７２７号による人体に有用な機能性を有した原料や成分を使用して製造及び加工した食品を意味し、「機能性」とは、人体の構造及び機能に対して栄養素を調節するか、生理学的作用のような保健用途に有用な効果を得る目的として摂取することを意味する。

前記健康機能食品組成物は、通常の食品添加物を含み、「食品添加物」としての適合有無は、他の規定がない限り、食品医薬品安全庁に承認された食品添加物公典の総則及び一般試験法などによって当該品目に関する規格及び基準によって判定する。

前記「食品添加物公典」に記載された品目としては、例えば、ケトン類、グリシン、クエン酸カリウム、ニコチン酸、ケイ皮酸などの化学的合成物、紺色素、甘草抽出物、結晶セルロース、コウリャン色素、グアーガムなどの天然添加物、Ｌ－グルタミン酸ナトリウム製剤、麺類添加アルカリ剤、保存料製剤、タール色素製剤などの混合製剤類が挙げられる。

本発明の組成物は、皮膚美白、保湿、抗アレルギー、しわの改善のための食品及び飲料などに多様に用いられ、例えば、各種の食品類、飲料、ガム、お茶、ビタミン複合剤、健康機能性補助食品、食品添加剤などに使われ、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、丸または飲料である形態で使用し、前記記載したものの以外にも、あらゆる食品形態である。

本発明の食品組成物の剤型は、通常の方法によって製造し、担体と共に乾燥した後、カプセル化するか、その他の錠剤、顆粒、粉末、飲料、かゆなどの形態で剤形化し、前記記載したものの以外にも、あらゆる食品形態で製造可能である。

本発明の食品組成物は、組成物１００重量部に対して有効成分を０．００１～１００重量部で含みうる。しかし、有効成分の含量は、これに制限されず、適切に調整され、前記範囲以上の量としても使われる。

以下、本発明の理解を助けるために、実施例を挙げて詳細に説明する。但し、下記の実施例は、当業者に本発明をより完全に説明するために提供されるものであり、本発明の内容を例示するものであり、本発明の範囲が、下記の実施例に限定されるものではない。

［予備実験］

＜予備実験１＞真菰草エタノール抽出工程の最適化

１．１）販売されている真菰草５０ｇを秤量した後、２０倍数重量の１０、３０、５０、７０、９０ｗ／ｗ％の発酵酒精を投入して、８０℃で６時間抽出を進行し、濾過して、真菰草エタノール抽出液を得た。

前記真菰草エタノール抽出液を濃縮及び乾燥を進行して、真菰草エタノール抽出粉末を得て、エタノール濃度比率による抽出物固形分の重量を測定し、トリシン含量及びＮＯ生成の抑制効果を確認した。

具体的に、トリシンの含量は、次のように確認した：分析機器としてＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０）を使用し、分析カラムは、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃ１８、Ｃ－１８、５μｍ、２５０ｘ４．６ｍｍ（ＳＵＰＥＬＣＯ）を使用した。標準品の調剤時には、トリシン標準品２ｍｇを秤量し、ＨＰＬＣ用メタノールを加えて２０ｍＬにしたものを標準原液とし、標準原液を活用して、１、３、５、１０、２０ｐｐｍの濃度で直線性区間の標準品を製造した。

試験溶液の調剤時には、予備実験１及び予備実験２で製造した真菰草抽出物を１００ｍｇ秤量して、５０ｍＬ体積フラスコに入れ、メタノールを半分入れて超音波処理（ｓｏｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を３０分間行った。処理完了後、標線を合わせ、ボルテックシングした後、０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過して試験溶液とした。

この際、分析方法は、下記表１に示されたようである。

ＮＯの生成は、ＮＯアッセイを通じて確認したが、具体的な過程は、次の通りであった：大食細胞株ＲＡＷ２６４．７は、韓国細胞株バンク（ＫＣＬＢ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）から分譲されて、１０％ ＦＢＳと１％抗生剤（ペニシリン／ストレプトマイシン）とを添加したＤＭＥＭ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ、Ｇｙｅｏｎｇｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）を用いて５％ ＣＯ_２が存在する３７℃インキュベーターで２～３回継代培養した後、使用した。

ＲＡＷ２６４．７細胞を９６ウェルプレートに１ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように分注して、５％ ＣＯ_２インキュベーターで２０～２４時間予備培養し、各抽出物試料を処理して、２４時間培養した。ここで、大食細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞の炎症を誘発するために、１ｍｇ／ｍＬの濃度のリポポリサッカライド（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）１０μＬを各ウェルに注入した。次いで、上澄み液１００μＬを９６ウェルプレートに移して、２．５％リン酸、１％スルファニルアミド、０．１％ Ｎ－（１－ナフチル）エチレンジアミンが含まれたグリース試藥（ｇｒｉｅｓｓ ｒｅａｇｅｎｔ ｗｉｔｈ ２．５％ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ、１％ ｓｕｌｆａｎｉｌａｍｉｄｅ、０．１％ Ｎ－（１－Ｎａｐｈｔｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）１００μＬを各ウェルに入れて反応させた。反応が完了した後、５４０ｎｍの波長でＥＬＩＳＡリーダー機で光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ；Ｏ．Ｄ）を測定した。この際、測定したＯ．Ｄは、リポポリサッカライドを加えた細胞でのＯ．Ｄ値と比較して百分率（％）で表示した。

その結果を下記表２に示した。

前記表２を参照すれば、収率は、７０％エタノール抽出物が最も高いことを確認することができた。トリシンは、１０％エタノール抽出物では表われず、最も含量が高いものは、７０％エタノール抽出物であった。ＮＯ生成量の確認結果は、１００、２５０μｇ／ｍｌでは、７０％エタノール抽出物のＮＯ生成の抑制効果が最も優れ、５００μｇ／ｍｌでは、５０％エタノール抽出物がさらに良い結果を示した。前記結果を集めて、収率とトリシン含量とが高く、かつ低濃度で高い活性を示す７０％エタノール溶媒を最適の抽出溶媒として決定した。

１．２）抽出時間の変化による効果を確認するために、真菰草５０ｇを秤量した後、２０倍数重量の７０ｗ／ｗ％の発酵酒精を投入して、８０℃で２、４、６、８時間抽出を進行し、濾過して、真菰草エタノール抽出液を得た。

前記真菰草エタノール抽出液を濃縮及び乾燥を進行して、真菰草エタノール抽出粉末を得て、前記のようにトリシンの含量及びＮＯ生成抑制量を確認して、下記表３に結果を示した。

前記表３を参照すれば、８時間抽出時の収率が最も高く調査されたが、トリシン含量は、６時間抽出で最も高く測定された。ＮＯ生成の抑制効果では、６時間抽出時に、あらゆる濃度で高く表われた。

前記結果を集めれば、収率は８時間が高かったが、６時間との差が微小であったので、トリシン含量がさらに高く、あらゆる濃度で高い活性を示す６時間抽出を最適の抽出時間として決定した。

１．３）温度による効果を確認するために、真菰草５０ｇを秤量した後、２０倍数重量の７０ｗ／ｗ％の発酵酒精を投入して、６０、８０℃で６時間抽出を進行し、濾過して、真菰草エタノール抽出液を得た。前記真菰草エタノール抽出液を濃縮及び乾燥を進行して、真菰草エタノール抽出粉末を得た。以後、前記のような方法で抽出物固形分、トリシン含量及びＮＯ生成の抑制効果を確認し、その結果を下記表４に示した。

前記表４を参照すれば、８０℃抽出収率及びトリシン含量が６０℃から抽出したものよりも高いことを確認することができた。また、ＮＯ生成の抑制効果を確認した結果、１００、２５０、５００μｇ／ｍｌいずれもで８０℃抽出物が高く測定された。このような結果を集めて、収率とトリシン含量とが高く、あらゆる濃度で高い活性を示す８０℃抽出を最適の抽出温度として決定した。

前記の抽出溶媒、抽出時間、抽出温度のあらゆる結果を集めて、最終抽出工程は、７０％エタノール、６時間、８０℃として決定した。

＜予備実験２＞真菰草エタノール抽出物の製造

真菰草１ｋｇを秤量した後、２０倍数重量の７０ｗ／ｗ％の発酵酒精を投入して、８０℃で６時間抽出を進行した後、濾過して、真菰草エタノール抽出液を得た。前記真菰草エタノール抽出液を濃縮及び乾燥を進行して、真菰草エタノール抽出粉末を得た。

＜予備実験３＞真菰草酵素処理抽出物の酵素選定実験

真菰草１００ｇを秤量した後、２０倍数重量の精製水を投入して、８０℃で１時間抽出した。これにペクチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、タンナーゼ、α－アミラーゼ、β－グルコシダーゼを下記表５に開示されたような条件で酵素処理後、１次濾過して、１次真菰草酵素処理抽出液を得た。各条件は、当該酵素の最適の条件として設定した。

１次濾過後、残りの残渣に１０倍数の７０ｗ／ｗ％の発酵酒精を投入して、８０℃で４時間エタノール抽出を進行し、２次濾過して、２次真菰草エタノール抽出液を得た。前記１次真菰草酵素処理抽出液と２次真菰草エタノール抽出液とを混合して、濃縮及び乾燥を進行して、最終的に真菰草酵素処理抽出粉末を得た。

＜予備実験４＞真菰草混合酵素処理抽出物の製造

β－グルコシダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼの４種の酵素で２種以上の酵素を混合して処理した後、酵素処理抽出物を製造した。真菰草１００ｇを秤量した後、２０倍数重量の精製水を投入して、８０℃で１時間熱水抽出した。多様な比率の酵素を真菰草原物投入量に比べて、下記に明示されている比率で混合して添加し、下記表６に開示された条件通りに酵素処理後、１次濾過して、１次真菰草酵素処理抽出液を得た。

１）ペクチナーゼ０．５重量％：セルラーゼ０．５重量％

２）ペクチナーゼ０．５重量％：ヘミセルラーゼ０．５重量％

３）セルラーゼ０．５重量％：ヘミセルラーゼ０．５重量％

４）ペクチナーゼ０．３３重量％：セルラーゼ０．３３重量％：ヘミセルラーゼ０．３３重量％

５）β－グルコシダーゼ０．３３重量％：セルラーゼ０．３３重量％：ヘミセルラーゼ０．３３重量％

この際、各酵素の投入量は、真菰草原物投入量に対する対比量である。

前記１次フィルター後、残りの残渣に重量の１０倍数の７０ｗ／ｗ％の発酵酒精を投入して、８０℃で４時間エタノール抽出を進行し、２次濾過して、２次真菰草エタノール抽出液を得た。前記１次真菰草酵素処理抽出液と２次真菰草エタノール抽出液とを混合して、濃縮及び乾燥を進行して、最終的に真菰草酵素処理抽出粉末を得た。

＜予備実験５＞真菰草抽出物の収率及びトリシン含量の確認

前記予備実験２ないし予備実験４で製造した真菰草抽出物のトリシン含量を比較分析した。分析機器としては、ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０）を使用し、分析カラムは、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｃ１８、Ｃ－１８、５μｍ、２５０ｘ４．６ｍｍ（ＳＵＰＥＬＣＯ）を使用した。

標準品の調剤時には、トリシン標準品２ｍｇを秤量し、ＨＰＬＣ用メタノールを加えて２０ｍＬにしたものを標準原液とし、標準原液を活用して、１、３、５、１０、２０ｐｐｍの濃度で直線性区間の標準品を製造した。

試験溶液の調剤時には、前記予備実験１及び予備実験２で製造した真菰草抽出物を１００ｍｇ秤量して、５０ｍＬ体積フラスコに入れ、メタノールを半分入れて超音波処理（ｓｏｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を３０分間行った。処理完了後、標線を合わせ、ボルテックシングした後、０．４５μｍのメンブレンフィルターで濾過して、試験溶液とした。

この際、分析方法は、前記表１に示されたようである。

その結果、図２に開示されたように、それぞれの酵素処理抽出物の収率がエタノール抽出物に比べてさらに高くなることを確認した。

また、図３に開示されたように、真菰草エタノール抽出物よりもβ－グルコシダーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼを混合で処理した抽出物のトリシン含量がさらに高い含量を有することを確認した。

一方、図４は、エタノール抽出物のトリシンクロマトグラムと真菰草β－グルコシダーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼの混合酵素処理抽出物のクロマトグラムとを示したものであって、混合酵素処理時に、トリシン含量が増加することが分かり、前部のトリシン配糖体のピーク（ｐｅａｋ）がエタノール抽出物に比べて減少することを確認することができる。これは、トリシン配糖体及び誘導体の減少でトリシンの含量が増加することを間接的に確認することができる部分である。

前記結果に基づいて、真菰草エタノール及び酵素処理抽出物の収率を勘案したトリシン総量を図５にグラフで示した。

＜予備実験６＞真菰草抽出物の抗炎症効能の確認

前記予備実験２ないし予備実験４で製造した真菰草抽出物の抗炎症効能を確認した。大食細胞株ＲＡＷ２６４．７は、韓国細胞株バンク（ＫＣＬＢ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）から分譲されて、１０％ ＦＢＳと１％抗生剤（ペニシリン／ストレプトマイシン）とを添加したＤＭＥＭ培地（Ｗｅｌｇｅｎｅ、Ｇｙｅｏｎｇｓａｎ、Ｋｏｒｅａ）を用いて５％ ＣＯ_２が存在する３７℃インキュベーターで２～３回継代培養した後、使用した。

以後、ＲＡＷ２６４．７の試料に対する細胞生存率を測定するために、ＭＴＴアッセイを実施した。ＲＡＷ２６４．７細胞を９６ウェルプレートに１ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように分注して、５％ ＣＯ_２インキュベーターで２０～２４時間予備培養し、各抽出物試料を処理して、再び２４時間培養した後、ＰＢＳに溶かしたＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ）溶液１０μＬを各ウェルに入れ、インキュベーターで４時間反応させた。次いで、上澄み液を除去し、各ウェルに１００μＬのＤＭＳＯを添加して、生成されたホルマザンクリスタルを溶解させて、５５０ｎｍの波長でＥＬＩＳＡリーダー機で吸光度を測定した。このように測定したホルマザン生成程度は、正常な細胞の値と比較して百分率（％）で表示した。

二番目に、ＲＡＷ２６４．７を利用した真菰草抽出物及びトリシンの抗炎症効果を測定するために、ＮＯアッセイを実施した。まず、ＲＡＷ２６４．７細胞を９６ウェルプレートに１ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように分注して、５％ ＣＯ_２インキュベーターで２０～２４時間予備培養し、各抽出物試料を処理して、２４時間培養した。ここで、大食細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞の炎症を誘発するために、１ｍｇ／ｍＬの濃度のリポポリサッカライド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）１０μＬを各ウェルに注入した。次いで、上澄み液１００μＬを９６ウェルプレートに移して、２．５％リン酸、１％スルファニルアミド、０．１％ Ｎ－（１－ナフチル）エチレンジアミンが含まれたグリース試藥（ｇｒｉｅｓｓ ｒｅａｇｅｎｔ ｗｉｔｈ ２．５％ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ ａｃｉｄ、１％ ｓｕｌｆａｎｉｌａｍｉｄｅ、０．１％ Ｎ－（１－Ｎａｐｈｔｙｌ）ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）１００μＬを各ウェルに入れて反応させた。反応が完了した後、５４０ｎｍの波長でＥＬＩＳＡリーダー機で光学密度（Ｏ．Ｄ）を測定した。この際、測定したＯ．Ｄは、リポポリサッカライドを加えた細胞でのＯ．Ｄ値と比較して百分率（％）で表示した。

陽性対照群としては、リポポリサッカライドを加えていないＲＡＷ２６４．７細胞を使用し、陰性対照群としては、ＮＯ抑制剤として作用するＬω－ニトロ－Ｌ－アルギニンメチルエステル（Ｌ－ＮＡＭＥ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を加えた細胞を利用した。

その結果、図６に示されたように、試料処理濃度５００μｇ／ｍｌで真菰草エタノール抽出物よりもβ－グルコシダーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼを混合で処理した抽出物の抗炎症効能がさらに優れていることを確認した。

＜予備実験７＞真菰草抽出物の美白効能の確認

前記予備実験２ないし予備実験４で製造した真菰草抽出物の美白効能を確認した。まず、ラット由来メラニン細胞株Ｂ１６－Ｆ０細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）から分譲され、１０％ ＦＢＳと１％抗生剤（ペニシリン／ストレプトマイシン）とを添加したＤＭＥＭ培地（ＡＴＣＣ、ＡＴＣＣ ３０－２００２、ＵＳＡ）を用いて５％ ＣＯ_２が存在する３７℃インキュベーターで２～３回継代培養した後、使用した。

以後、Ｂ１６－Ｆ０細胞の試料に対する細胞生存率を測定するために、ＭＴＴアッセイを実施した。Ｂ１６－Ｆ０細胞を２４ウェルプレートに５ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように分注して、５％ ＣＯ_２インキュベーターで２０～２４時間予備培養し、各抽出物試料を処理して、４８時間培養した後、ＰＢＳに溶かしたＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ）溶液１００μＬを各ウェルに入れ、インキュベーターで４時間反応させた。次いで、上澄み液を除去し、各ウェルに５００μＬのＤＭＳＯを添加して、生成されたホルマザンクリスタルを溶解させて、５５０ｎｍの波長でＥＬＩＳＡリーダー機で吸光度を測定した。測定したホルマザン生成程度は、正常な細胞の値と比較して百分率（％）で表示した。

二番目に、ラット由来メラニン細胞株Ｂ１６－Ｆ０で真菰草抽出物及びトリシンのメラニン生成抑制能を測定した。Ｂ１６－Ｆ０細胞を６ウェルプレートに５ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように分注して、５％ ＣＯ_２インキュベーターで２０～２４時間予備培養し、以後、各抽出物試料を処理して、４８時間培養した。この際、試料処理と共にメラニン生成を促進させるために、１μＭ α－メラニン細胞刺激ホルモン（α－Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）と１００μＭ ３－イソブチル－１－メチルキサンチン（３－Ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）とを混合させたＤＭＥＭ培地を使用した。培養完了後、上澄み液を除去し、暖かいＰＢＳ溶液を各ウェル当たり１，０００μＬずつ添加した後、１０分間３７℃で培養した。

培養された細胞を対象にして６ウェルプレート表面に貼り付いているメラノーマ細胞を取り外し、１．５ｍＬのチューブに分注した後、４℃に保持された遠心分離機を用いて１３，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離した。遠心分離後、上澄み液を気をつけて除去し、溶解溶液（ｌｙｓｉｓ ｓｏｌｕｔｉｏｎ；１．０ Ｎ ＮａＯＨ：Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ＝９：１）１５０μＬを入れて、メラニンを溶かした。オーブンで６０℃条件下に１時間反応させた後、９６ウェルプレートに各ウェル当たり１００μＬずつ分注して、ＥＬＩＳＡリーダー機（４０５ｎｍ）でＯ．Ｄを測定した。対照群としては、試料と反応させていないメラノーマ細胞でのＯ．Ｄを使用した。また、陰性対照群としては、チロシナーゼ生成抑制を通じたメラニン抑制能を有する２５０μＭアルブチン（ａｒｂｕｔｉｎ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を使用した。

その結果、図８に開示されたように、試料処理濃度５００μｇ／ｍｌで真菰草エタノール抽出物よりもβ－グルコシダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼを混合で処理した抽出物の美白効能がさらに優れていることを確認した。

＜予備実験８＞真菰草抽出物のしわ改善効能の確認

前記予備実験２ないし予備実験４で製造した真菰草抽出物のしわ改善効能を確認した。まず、ヒト由来ＣＣＤ－９８６ｓｋ線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ）は、Ｋｏｒｅａ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＫＣＴＣ、Ｋｏｒｅａ）から分譲され、ヒト真皮線維芽細胞（Ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ；ＨＤＦ）は、ＳｅｏｕＬｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから分譲された。そして、ＣＣＤ－９８６ｓｋ線維芽細胞は、１０％ ＦＢＳと１％抗生剤（ペニシリン／ストレプトマイシン）とを添加したＩＭＤＭ培地（ＡＴＣＣ、ＡＴＣＣ ３０－２００５、ＵＳＡ）を用いて５％ ＣＯ_２が存在する３７℃インキュベーターで２～３回継代培養した後、使用し、ＨＤＦは、１０％ ＦＢＳと１％抗生剤（ペニシリン／ストレプトマイシン）とを添加したＨＤＦ特殊培地（ｃｅｆｏｂｉｏ、Ｋｏｒｅａ）を用いて２～３回継代培養後、使用した。

以後、ＣＣＤ－９８６ｓｋ細胞とＨＤＦの試料に対する細胞生存率を測定するために、ＭＴＴアッセイを実施した。具体的に、ＣＣＤ－９８６ｓｋ細胞とＨＤＦを９６ウェルプレートに１ｘ１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように分注して、５％ ＣＯ_２インキュベーターで２０～２４時間予備培養した後、各抽出物試料を処理して、２４時間培養した後、ＰＢＳに溶かしたＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ）溶液１０μＬを各ウェルに入れ、インキュベーターで４時間反応させた。次いで、上澄み液を除去し、各ウェルに１００μＬのＤＭＳＯを添加して、生成されたホルマザンクリスタルを溶解させて、５５０ｎｍの波長でＥＬＩＳＡリーダー機で吸光度を測定した。測定したホルマザン生成程度は、正常な細胞の値と比較して百分率（％）で表示した。

二番目に、プロコラーゲンとＭＭＰファミリー（ＭＭＰ－１、２、３、９、１３）は、細胞培養液の外部に排出される因子であって、試料と反応した細胞培養液を回収して使用した。すなわち、真菰草酵素処理（標準試料）とトリシンに対するプロコラーゲン合成能を測定するために、Ｔａｋａｒａ製品のプロコラーゲンタイプＩ Ｃ－ペプチドＥＩＡキット（Ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉ Ｃ－ｐｅｐｔｉｄｅ ＥＩＡ ｋｉｔ）を使用し、ＰＩＰを使用して定量曲線を測定し、試料別のコラーゲン合成量を計算した。また、しわに影響を与える因子であるメタロプロテアーゼ－１（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－１；ＭＭＰ－１）、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－９、ＭＭＰ－１３の抑制能を測定することにより、真菰草酵素処理（標準試料）及びトリシンのしわ改善効果を評価した。ＭＭＰ－１、２、３、９、１３の抑制能は、Ａｂｃａｍ会社の製品を使用して測定した。

その結果、図１０に開示されたように、各試料処理濃度５００μｇ／ｍｌで真菰草エタノール抽出物よりβ－グルコシダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼを混合で処理した抽出物のしわ改善効能がさらに優れていることを確認した。

＜予備実験９＞真菰草抽出物の抗アレルギー効能の確認

前記予備実験２ないし予備実験４で製造した真菰草抽出物の抗アレルギー効能を確認した。まず、ラット好塩基球性白血病細胞株であるＲＢＬ－２Ｈ３細胞を韓国細胞株バンク（ＫＣＬＢ、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）から購入した。ＲＢＬ－２Ｈ３細胞は、１０％ ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンが含まれたＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、ＮＹ、ＵＳＡ）培地で、３７℃、５％ ＣＯ条件の培養器で培養させた。

まず、試料の細胞毒性を確認するために、浸透したホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）染料をＭＴＴに還元させる活性ミトコンドリアを分析するＭＴＴ分析を行って、細胞生存能を確認した。ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を９６ウェルプレートにウェル当たり３×１０^４細胞に分注し、その翌日、３７℃条件で真菰草抽出物を処理した。４８時間後、各ウェルにＭＴＴ（５ｍｇ／ｍＬ）１００μＬを添加し、３７℃で４時間培養した。次いで、１００μＬのＤＭＳＯを各ウェルに添加して細胞を溶解させた。プレートを室温で５分間保持させ、マルチウェル分光光度計（ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて５５０ｎｍで吸光度を測定した。

二番目に、ＲＢＬ－２Ｈ３細胞で抽出物のβ－ヘキソサミニダーゼ（ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）放出抑制効果を確認した。ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を２４ウェルプレートにウェル当たり２×１０^５細胞に分注し、抗ＤＮＰ ＩｇＥ（４５０ｎｇ／ｍＬ）で３７℃で一晩刺激させた。次いで、細胞をＳｉｒａｇａｎｉａｎバッファで洗浄し、インキュベートバッファ１６０μＬを添加して、３７℃で２０分間インキュベートした後、抽出物試料２０μＬを１０分間細胞に処理し、抗原（ＤＮＰ－ＢＳＡ、１０μｇ／ｍＬ）２０μＬを添加して、３７℃で１０分間細胞が顆粒を形成するように刺激した。次いで、氷水槽に１０分間浸して反応を中断させた。上澄み液２５μＬを９６ウェルプレートに移し、基質（１ｍＭ ｐ－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ－Ｎａｃｅｔｙｌ－β－Ｄ－ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄｅ）が溶けている０．１Ｍクエン酸塩（ｃｉｔｒａｔｅ）バッファ（ｐＨ４．５）２５μＬを添加して、３７℃で１時間反応させた。次いで、停止液（０．１Ｍ Ｎａ_２ＣＯ_３／ＮａＨＣＯ_３、ｐＨ１０．０）２００μＬを添加して、反応を中断させ、マイクロプレートリーダー機（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）を用いて４０５ｎｍで吸光度を測定した。

三番目に、ＩＬ－４とＴＮＦ－αは、細胞の外部に放出されるサイトカインであって、同じ実験方法後、細胞培養液を回収して使用し、ＩＬ－４とＴＮＦ－α測定は、ＥＬＩＳＡ技法であって、ＡｂｃａｍとＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓキットとを使用してマニュアル通りに測定した。

その結果、図１２に示されたように、処理濃度５００μｇ／ｍｌで真菰草エタノール抽出物よりもβ－グルコシダーゼ、ペクチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼを混合で処理した抽出物の抗アレルギー効能がさらに優れていることを確認した。

[実施例]

＜実施例１＞真菰草混合酵素処理抽出物の製造

真菰草１ｋｇを秤量した後、２０倍数重量の精製水を投入して、８０℃で１時間熱水抽出した。これに、真菰草重量の１．０ｗ／ｗ％の重量の市販中であるβ－グルコシダーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ酵素を添加し、３５℃で２４時間酵素処理した後、１次濾過して、１次真菰草酵素処理抽出液を得た。

前記１次濾過後、残りの残渣に１０倍数の７０ｗ／ｗ％の発酵酒精を投入して、８０℃で４時間エタノール抽出を進行し、２次濾過して、２次真菰草エタノール抽出液を得た。前記１次真菰草酵素処理抽出液と２次真菰草エタノール抽出液とを混合して、濃縮及び乾燥を進行して、最終的に真菰草酵素処理抽出粉末を得た。前記酵素処理抽出工程は、予備実験３ないし予備実験１０の過程を経て本発明者が実験を通じて最適の条件を設定したものである。

[比較例]

＜比較例１＞真菰草エタノール抽出物の製造

真菰草１ｋｇを秤量した後、２０倍数重量の７０ｗ／ｗ％の発酵酒精を投入して、８０℃で６時間抽出を進行し、濾過して、真菰草エタノール抽出液を得た。前記真菰草エタノール抽出液を濃縮及び乾燥を進行して、真菰草エタノール抽出粉末を得た。

前記エタノール抽出工程は、多様な論文や特許に言及されている真菰草エタノール抽出方法であって、予備実験１を通じて最適の条件を設定したものである。

[試験例]

＜試験例１＞物質の分離及びトリシン確認

ＨＰＬＣ分析によれば、真菰草酵素処理抽出物は、多量のトリシンを含有していると把握された。これにより、真菰草酵素処理抽出物内にトリシンが含有されているかを確認するために、物質の分離及び構造を究明して、実際トリシンが含有されていることを明らかにするために、次の実験を行った。

トリシン物質の分離方法は、下記のようであった：１）乾燥された真菰草酵素処理抽出粉末５ｋｇを８０％メタノール４５Ｌに常温抽出した。２）前記１）の濃縮液を対象にしてＥｔＯＡｃ ３Ｌ ３回、ｎ－ＢｕＯＨ ３Ｌ ３回の分画を進行した。３）前記２）のＥｔＯＡｃ分画物をＺＬＥ、ｎ－ＢｕＯＨ分画物をＺＬＢ、分画後、残りの抽出物をＺＬＷと名付けた。４）ＺＬＥ抽出物をシリカゲルが充填された順相カラムを活用して、ＣＨＣｌ_３：ＭｅＯＨ ５０：１から１：１までそれぞれの溶媒条件で分画を実施して、ＺＬＥ－１からＺＬＥ－１３までの分画物を得た。５）４）の分画物でＺＬＥ－８をｐｒｅｐ－ＬＣを活用して、それぞれの分画を実施し、分離された分画物をＺＬＥ－８－１からＺＬＥ－８－１４と名付けた。６）前記５）の分画物でＺＬＥ－８－４の分画物をｐｒｅｐ－ＬＣを活用して、次のような条件で物質の分離を進行した。

移動相＝Ａ：水と０．１％ギ酸

Ｂ：アセトニトリルと０．１％ギ酸

濃度勾配＝Ｂ １０％からＢ ３５％まで０．５％／ｍｉｎ

Ｂ ３５％からＢ ６０％まで０．６ ％／ｍｉｎ

７）前記６）の条件でそれぞれの単一物質を獲得し、構造分析の結果、トリシンであることが確認された。

＜試験例２＞トリシンの抗炎症効能の確認

前記予備実験７での抗炎症効能の実験方法と同様の方法で実験を進行した。

その結果、図７に開示されたように、トリシン単一物質の濃度によるＮＯ生成は、濃度依存的に減少することを確認することができ、これは、真菰草酵素処理抽出物でトリシンの含量による効能変化であることを示唆する。

＜試験例３＞トリシンの美白効能の確認

前記予備実験８での美白効能の実験方法と同じ方法で実験を進行した。

その結果、図９に開示されたように、トリシン単一物質の濃度によるメラニン生成量が濃度依存的に減少することを確認することができ、これは、真菰草酵素処理抽出物でトリシンの含有による効能変化であることを示唆する。

＜試験例４＞トリシンのしわ改善効能の確認

前記予備実験９でのしわ改善効能の実験方法と同じ方法で実験を進行した。

その結果、図１１に開示されたように、トリシン単一物質の濃度によるコラーゲン生成が濃度依存的に増加することを確認することができ、これは、真菰草酵素処理抽出物でトリシンの含量による効能変化であることを示唆する。

＜試験例５＞トリシンの抗アレルギー効能の確認

前記予備実験１０でのしわ改善効能の実験方法と同じ方法で実験を進行した。

その結果、図１３に開示されたように、トリシン単一物質の濃度によるβ－ヘキソサミニダーゼ放出率を確認した結果、濃度依存的に減少することを確認することができ、これは、真菰草酵素処理抽出物でトリシンの含量による効能変化であることを示唆する。

＜試験例６＞真菰草エタノール抽出物と酵素処理抽出物との収率及びトリシン含量比較

前記実施例１と比較例１とから製造された抽出物の収率を比較した結果を図２３に示した。

抽出物の収率の比較結果、図２３に示されたように、β－グルコシダーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼの混合酵素として抽出した抽出物の収率は、２１．３７％であって、既存の真菰草エタノール抽出物の１０．９６％に比べて２倍以上増加したために、商業的活用価値がさらに高くなったことを確認することができた。

前記実施例１と比較例１とから製造された抽出物のトリシンの含量分析を進行した。この際、前記予備実験６でのトリシン含量分析法と同じ方法で実験を進行した。

その結果、図２４に示されたように、β－グルコシダーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼの混合酵素を処理した真菰草抽出物のトリシン含量は、真菰草エタノール抽出物の１．２７ｍｇ／ｇから３．３１ｍｇ／ｇに約２．６倍増加することを確認することができた。

以上の結果を真菰草原材料に比べて、トリシン回収率の側面で比較した時、酒精単純抽出物の場合、トリシン回収率は、１３９．２ｍｇ／ｋｇであり、複合酵素処理時に、トリシン回収率は、７０７．３ｍｇ／ｋｇであって、５．０８倍増加することを確認した。

＜試験例７＞真菰草エタノール抽出物と酵素処理抽出物との抗炎症効能の確認

前記実施例１と比較例１とから製造された抽出物の抗炎症効能評価を進行した。この際、前記予備実験７での抗炎症効能の実験方法と同じ方法で実験を進行した。

その結果、図２５に示されたように、β－グルコシダーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼの混合酵素を処理した真菰草抽出物のＮＯ生成量は、２６．３μＭ（真菰草エタノール抽出物）から１７．８９μＭに８．４１μＭほどさらに減少することを確認することができた。

＜試験例８＞真菰草エタノール抽出物と酵素処理抽出物との美白効能の確認

前記実施例１と比較例１とから製造された抽出物の美白効能評価を進行した。前記予備実験８での美白効能の実験方法と同じ方法で実験を行った。

その結果、図２６に示されたように、β－グルコシダーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼの混合酵素を処理した真菰草抽出物のメラニン生成率は、真菰草エタノール抽出物の６８．３２３％から４７．９８９％に２０．３３４％ポイントがさらに減少することを確認することができた。

＜試験例９＞真菰草エタノール抽出物と酵素処理抽出物とのしわ改善効能の確認

前記実施例１と比較例１とから製造された抽出物のしわ改善効能評価を進行した。前記予備実験９でのしわ改善効能の実験方法と同じ方法で実験を行った。

その結果、図２７に示されたように、β－グルコシダーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼの混合酵素を処理した真菰草抽出物のコラーゲン合成量は、真菰草エタノール抽出物の７４０２．１０９７ｎｇ／ｍｌから９８０３．６０９３ｎｇ／ｍｌに２４０１．４９９６ｎｇ／ｍｌがさらに増加することを確認することができた。

＜試験例１０＞真菰草エタノール抽出物と酵素処理抽出物との抗アレルギー効能の確認

前記実施例１と比較例１とから製造された抽出物の抗アレルギー効能評価を進行した。前記予備実験１０での抗アレルギー効能の実験方法と同じ方法で実験を行った。

その結果、図２８に開示されたように、β－グルコシダーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼの混合酵素を処理した真菰草抽出物のβ－ヘキソサミニダーゼ放出率は、真菰草エタノール抽出物の１９．０２％から７．４５％に１１．５７％ポイントがさらに減少することを確認することができた。

＜試験例１１＞真菰草混合酵素処理抽出物の動物実験を通じたしわ改善及び保湿効能の確認

１．実験方法

前記実施例１で製造した真菰草酵素処理抽出物に対して動物実験を通じてしわ改善及び保湿効能を確認した。実験のために、生化学分析装備（Ｒｏｃｈｅ Ｌｔｄ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ガラステフロン均質器（ｇｌａｓｓ ｔｅｆｌｏｎ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ；Ｃｈａｎｇ ｓｈｉｎ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．，Ｋｏｒｅａ）、マイクロプレートリーダー機（Ｂｉｏ－ＴＥＫ、ＵＳＡ）、タンパク質定量装備（Ｃｈｅｍｉ－Ｄｏｃ；ＢＩＯＲＡＤ、ＵＳＡ）、遠心分離機（Ｈａｎｉｌ ＦＬＥＴＡ５、Ｋｏｒｅａ）、ウォーターバス（ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ；Ｔｈｅｒｍｏ ｍｉｎｄｅｒ ｔａｉｔｅｃ、Ｊａｐａｎ）、ディープフリーザー（ｄｅｅｐ ｆｒｅｅｚｅｒ；Ｓａｎｙｏ、Ｊａｐａｎ）を使用した。また、ガラステフロン均質器（大韓科学、Ｋｏｒｅａ）、ＵＶ－分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ－１２０１、Ｊａｐａｎ）、高速遠心分離機（Ｈｉｇｈ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ；Ｈａｎｉｌ ＨＭＲ－１６１０Ｖ、Ｋｏｒｅａ）、医薬用冷凍庫（Ｍｅｄｉｃａｌ ｆｒｅｅｚｅｒ；Ｓａｎｙｏ、Ｊａｐａｎ）、マイクロプレートリーダー機（Ｂｉｏ－ＴＥＫ）、タンパク質定量装備（Ｃｈｅｍｉ－Ｄｏｃ；ＢＩＯＲＡＤ）を使用した。

本実験に使用したＳＫＨ－１ヘアレスマウス（ｈａｉｒｌｅｓｓ ｍｏｕｓｅ）系、６週齢モデル（雌）をオリエントバイオ（京畿道城南、大韓民国）から輸入、分譲されて、（株）東南医化学研究院動物舎（動物施設登録証：第４１２号）で一週間検疫と順化飼育とを経た後、元気な動物を対象にして特定の飼育環境（温度（２６．２５±０．５９）℃、相対湿度（５０．０７±３．４８）％、照明時間１２時間（０７：００～１９：００））を設定して実施した。この際、各群当たり９匹ずつ総７群に分けて実験した。

図１４に示されたように、正常群（Ｎ群）を除いた残りのしわ誘導群は、ＵＶＢ照射を１０週間段階別照射し、ＵＶＢ照射群は、Ｃ群（対照群）、本発明の予備実験５の方法で製造した真菰草混合酵素処理抽出物試料を体重当たり５０ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ経口投与した群は、それぞれＺ５０群、Ｚ１５０群、Ｚ３００群、真菰草指標物質であるトリシンを０．３ｍｇ／ｋｇ経口投与した群は、Ｔ群及びレチノイン酸０．０５％、皮膚塗布群をＲ群と名付けた。この際、試料の経口投与ないし皮膚塗布は、１４週間行われ、Ｒ群では、Ｂｒａｈｉｍ Ｃｈａｑｏｕｒ方法を参考にして、レチノイン酸０．０５％を、５０ｕｌずつ一週間に３回皮膚に塗布した。飼料は、実験動物用固形飼料（サムタコＢＩＯＫＯＲＥＡ、大韓民国）を使用し、飮水は、自由摂取させた。解剖前、１５時間には水のみ与え、節食した。この際、酵素活性の日中変動を考慮して、実験動物を一定時間（午前１０：００－１２：００）内に処置した。本研究は、（株）東南医化学研究院動物実験委員会（ＳＥＭＩ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の方針及び法規によって進行した（倫理承認番号：ＳＥＭＩ－１６－１３）。

紫外線照射装置（東西科学、ＵＶ－１０００）は、キャビネット内にＵＶＢを放出する太陽灯（Ｓｕｎｌａｍｐ）で紫外線を放出し、光源は３０２ｎｍに、ＵＶＢ強度が０．３ｍＷ／ｃｍ^２になる高さから照射させた。紫外線照射量は、ＵＶ放射計で測定し、マウスを紫外線照射用ケージに閉じこめた後、背中部位に隔日間隔で１週間に３回、総１０週間［０週：６０ｍＪ／ｍ^２（１ Ｍ．Ｅ．Ｄ）、１週：１２０ｍＪ／ｍ^２（２ Ｍ．Ｅ．Ｄ）、２～３週：１８０ｍＪ／ｍ^２（３ Ｍ．Ｅ．Ｄ）、４～５週：２４０ｍＪ／ｍ^２（４ Ｍ．Ｅ．Ｄ）５週～１０週：２４０ｍＪ／ｍ^２（４ Ｍ．Ｅ．Ｄ）］照射した。

最も先は、各動物の体重を測定して、体重変化を観察した。

皮膚しわの態様の観察のために、実験動物を５週～１４週目にデジタルカメラで背中表面を写真撮影を行った後、ＳＩＬＦＬＯ（Ｆｌｅｘｉｃｏ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ＬＴＤ．Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）シリコンゴム印象材（ｓｉｌｃｏｎｅ ｒｕｂｂｅｒ ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍａｔｅｒｉａｌ）で個体の同一背中部位の皮膚しわの模型（ｒｅｐｌｉｃａ）を製作して顕微鏡で撮影した後、しわの態様を実験群別に比較観察した。また、皮膚しわと密接な関連がある保湿効能も確認するために、皮膚表面水分度をチェックした。

より具体的に、飼育期間が終了した実験動物は、１５時間節食させ、ＣＯ_２で麻酔させて開腹した後、１ｍＬ注射器を用いて腹部大動脈から採血した。この際、得た血清のアスパラギン酸アミノ基転移酵素（Ａｓｐａｒｔａｔｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡＳＴ）及びアラニンアミノ基転移酵素（Ａｌａｎｉｎｅ ａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡＬＴ）を検査した。具体的な実験方法は、次の通りであった：

腹部大動脈から採血した血液を約３０分間室温で放置させた後、３，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して血清を得て、血清生化学分析に使用し、分離された血液上澄み液は、血清生化学器（Ｒｏｃｈｕ Ｌｔｄ．，Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でＡＳＴ及びＡＬＴを分析した。

皮膚及び臓器は、摘出して生理食塩水に洗浄した後、濾紙で水分を除去し、組織染色及びウェスタンブロット実験に使用した。また、Ｈ＆Ｅ染色の実験を次のように進行した。切り取った皮膚組織を１０％ホルマリンに入れて組織を固定した後、水洗し、６０％から１００％アルコールに順次に脱水してパラフィンに包埋し、ブロックを作った。それを回転組織拍節器（ｒｏｔａｒｙ ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を使用して５μｍの厚さに組織切片を作って、ヘマトキシリン＆エオシンで染色した後、光学顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で観察した。

次いで、マッソントリクローム実験を次のように進行した。切り取った皮膚組織を室温で１０％中性ホルマリン溶液に２４時間固定した後、通常の方法で水洗、脱水、透明、浸透過程を経た後、パラフィンで包埋し、４μｍの厚さに切片を作って、室温でＢｏｕｉｎ溶液に一晩浸し、マッソントリクローム染色後、真皮層内膠原線維（ｃｏｌｌａｇｅｎ ｆｉｂｅｒ）の量と形態とを光学顕微鏡で観察した。

以後、皮膚組織のウェスタンブロット実験を次のように進行した。タンパク質分析のために、皮膚組織２０ｍｇを細胞溶血バッファ（ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）２００μＬに入れた後、均質機を用いて組織を破砕した後、８００ｒｐｍ、１０ｓｅｃ遠心分離して上澄み液のみ使用した。２４時間アイスインキュベーションした後、１４，０００ｒｐｍ、４℃、２０ｍｉｎ遠心分離した。以後、ブラッドフォードアッセイを用いてタンパク質を定量し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動；Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を用いてサイズ別に分離した。Ｓｅｍｉ－ｄｒｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、ＵＳＡ）を用いてＰＶＤＦ（フッ化ポリビニリデン）メンブレンに移動させた後、５％脱脂乳を含有したブロッキングバッファ（５％脱脂乳、１Ｘ ＴＢＳＴバッファ）を１時間処理した。以後、１Ｘ ＴＢＳＴバッファで１０分、３回洗浄後、１次抗体であるコラーゲン１Ａ、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－１３（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ＵＳＡ）を処理した後、４℃で一晩中反応させて、１Ｘ ＴＢＳＴバッファで１０ｍｉｎ、３回洗浄した。ウェスタンブロットディテクションキット（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ；Ａｂｆｒｏｎｔｉｅｒ、ＷＥＳＴ ＳＡＶＥ ＧＯＬＤ、Ｋｏｒｅａ）を用いてメンブレンと反応させた後、Ｃｈｅｍｉ－Ｄｏｃ（ＢＩＯＲＡＤ ＸＲＳ ｓｙｓｔｅｍ、ＵＳＡ）装備を用いて発現程度を観察し、β－アクチン（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、ＵＳＡ）で補正して比較した。

前記実験の結果は、統計処理して平均値と標準偏差とを計算し、各群の有意性検定は、Ｓｔａｔｖｉｅｗ ｐｒｏｇｒａｍで分散分析ｔ－検定（Ａｎｏｖａ ｔ－ｔｅｓ）を用いて統計分析した。

２．実験の結果

まず、各実験群に真菰草抽出物及びトリシンを１４週間経口投与した後、ＵＶＢ照射装置で１０週間しわを誘導したＳＫＨ－１マウスの体重変化を図１５に示した。その結果、実験期間Ｎ群、Ｃ群、残りの試料処理群で体重変化は、いずれも正常範囲で表われた。

皮膚表面水分度のチェック結果、図１６に示されたように、Ｃ群は、皮膚表面の水分が確実に減少するが、一方、１４週間試料を投与したＰ群、Ｚ５０群、Ｚ１５０群、Ｚ３００群、Ｔ群の場合は、皮膚表面の水分を保持していることを確認した。

血清のＡＳＴ及びＡＬＴ検査結果、図１７に示されたように、１４週間試料投与にも拘わらず、群間有意差が発生せず、いずれも正常範囲と確認された。

背中表面の肉眼観察結果、図１８に示されたように、Ｃ群は、皮膚表面が乾燥し、紅斑反応を経て次第に皮膚表面に小じわが太いしわにその数が増加することを観察することができた。一方、１０週間真菰草５０ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ投与したＺ５０、Ｚ１５０群の背中表面は、ＵＶＢ照射にも拘わらず、紅斑現象及び角質形成がＣ群よりも著しく減り、しわの数が少なく生成または保持されることを確認することができた。

ＳＩＬＦＬＯ顕微鏡の観察結果、図１９に示されたように、Ｃ群は、しわの厚さが太く、間隔が狭く、しわが深く形成され、１４週間真菰草抽出物５０ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇを投与したＺ５０、Ｚ１５０群は、Ｃ群に比べて、相対的にしわが不十分に形成されるか、しわの厚さが薄く、線が細いことを確認することができた。一方、レチノイン酸０．０５％を皮膚塗布したＰ群とトリシン２ｍｇ／ｋｇを投与したＴ群との場合、ＵＶＢ照射８週目までＣ群に比べて、相対的にしわが不十分に形成されたが、ＵＶＢ照射１０週目に至って、Ｒ群はしわが太くなり、しわの数も多くなることを確認することができた。また、真菰草抽出物３００ｍｇ／ｋｇ投与群（Ｚ３００群）では、前記背中表面の観察結果のようにＳＩＬＦＬＯ顕微鏡観察でも太いしわが観察された。

それを考慮すれば、ＵＶＢ １０週照射にも拘わらず、真菰草５０ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ試料投与は、ＳＫＨ－１ヘアレスマウス表皮角質形成細胞に効果的に作用して、皮膚しわの形成予防に役に立つと考えられる。

Ｈ＆Ｅ染色結果、図２０に示されたように、Ｃ群は、１０週間ＵＶＢ処理で表皮の上皮細胞層が非常に厚くなり（矢印表示）、表皮及び真皮層いずれも乾燥が誘導され、弾力線維層が変性されたことを確認することができた。一方、１４週間真菰草５０ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ処理したＺ５０群、Ｚ１５０群は、Ｃ群に比べて上皮細胞層が著しく減少したことを確認することができた。また、真皮層内弾力線維がＣ群に比べて、稠密な形状を確認することができた。これは、前記背中表面及びＳＩＬＦＬＯで皮膚表面の形態学的観察結果と一致する結果であって、一定濃度の真菰草抽出物投与は、表皮層及び上皮細胞に肯定的な影響を及ぼすことが分かる。

マッソントリクローム染色結果、図２１に示されたように、Ｎ群の真皮層でアニリンブルーに強く染色された膠原線維が観察されたが、ＵＶＢを１０週間照射したＣ群の膠原線維は、アニリンブルーに微弱に染色された。一方、ＵＶＢを照射しながら１４週間真菰草抽出物を投与した結果、真菰草抽出物投与群で、特に、Ｚ５０群の真皮層でＣ群に比べてアニリンブルーに強く染色された膠原線維が観察された。これは、１４週間真菰草抽出物投与（真菰草５０ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ投与）で長期間過量のＵＶＢ照射にも拘わらず、皮膚組織内コラーゲン層を保持させ、皮膚しわの形成を効果的に遮断して、膠原質線維構造の形態を稠密に保持させたためである。

ＵＶＢ照射皮膚組織のタンパク質発現の確認結果、図２２に示されたように、ＵＶＢ照射にも拘わらず、真菰草抽出物投与群では、コラーゲン１Ａの発現量がＣ群に比べて、いずれも増加したことを確認することができた。特に、真菰草抽出物１５０ｍｇ／ｋｇを投与したＺ１５０群は、ｐ＜０．００１有意レベルにコラーゲン１Ａの発現量が増加することを確認することができた。また、コラーゲンを分解する酵素として知られたＭＭＰ－１、ＭＭＰ－１３のタンパク質発現を確認した結果、ＵＶＢを照射したＣ群でＭＭＰ－１、ＭＭＰ－１３の発現量が増加したが、ＭＭＰ－１の発現量は、Ｚ５０群でｐ＜０．０５有意レベルに減少し、ＭＭＰ－１３の発現量も、Ｚ５０群、Ｚ１５０群でいずれもｐ＜０．０５有意レベルに減少した。一方、Ｒ群は、Ｃ群よりもＭＭＰ－１、１３の発現量が著しく増加して、レチノイン酸を一週間３回塗ることにより、コラーゲン合成及び分解酵素機転に影響を及ぼすことができないことを確認することができた。

前記結果を総合してみる時、過量の紫外線照射でコラーゲン分解酵素であるＭＭＰ－１、ＭＭＰ－１３タンパク質発現が増加し、コラーゲン合成酵素であるコラーゲン１Ａの発現が減少したものが、１４週間の真菰草抽出物（Ｚ５０群、Ｚ１５０群）処理によってコラーゲン１Ａの発現量は増加し、ＭＭＰ－１、ＭＭＰ－１３の発現を減少させて、皮膚しわの形成抑制に役に立つことが分かった。

以上、本発明の内容の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者にとって、このような具体的な記述は、単に望ましい実施形態に過ぎず、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。すなわち、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲とそれらの等価物とによって定義される。

Claims (13)

1. （１）真菰草に水を添加し、５０℃以上で熱水浸漬する段階と、
   （２）前記段階（１）で熱水浸漬後、冷却した浸漬物に、α－アミラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、キシラナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、タンナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペクチナーゼ、及びβ－グルコシダーゼからなる群から選択される１つ以上の酵素を処理して反応させた後、濾過して酵素処理抽出物を得る段階と、
   （３）前記段階（２）で濾過し、残りの残渣に水、Ｃ１～Ｃ４の低級アルコール、及びこれらの混合からなる群から選択された何れか１つの溶媒として抽出して２次抽出物を得る段階と、
   （４）前記段階（２）の酵素処理抽出物と前記段階（３）の２次抽出物とを混合した後、濃縮または乾燥する段階と、
   を含む真菰草酵素処理抽出物の製造方法。
2. 前記段階（１）で、熱水浸漬は、真菰草１重量部に対して１～１００重量部の水を添加し、５０～１３０℃で行われることを特徴とする請求項１に記載の真菰草酵素処理抽出物の製造方法。
3. 前記段階（２）で、前記浸漬物１００重量部に対して、０．１～８０重量部の酵素を処理することを特徴とする請求項１に記載の真菰草酵素処理抽出物の製造方法。
4. 前記段階（２）で、酵素を処理し、１０～９０℃で５分～１２０時間反応させることを特徴とする請求項１に記載の真菰草酵素処理抽出物の製造方法。
5. 前記段階（２）で、β－グルコシダーゼ、セルラーゼ及びヘミセルラーゼの３種の酵素を同時に処理することを特徴とする請求項１に記載の真菰草酵素処理抽出物の製造方法。
6. 前記段階（２）で、酵素は、真菰草に含まれているフラボノイド配糖体をフラボノイド非配糖体に切り替えることを特徴とする請求項１に記載の真菰草酵素処理抽出物の製造方法。
7. 前記段階（３）で、前記残渣１重量部に対して１～１００重量部の水またはアルコール水溶液を溶媒として、２０～１３０℃で１０分～１００時間抽出することを特徴とする請求項１に記載の真菰草酵素処理抽出物の製造方法。
8. 前記段階（４）で、混合物を濃縮して濃縮液を得るか、濃縮液を乾燥して粉末状の抽出物を得ることを特徴とする請求項１に記載の真菰草酵素処理抽出物の製造方法。
9. 前記真菰草酵素処理抽出物は、０．０１～９０重量％のトリシンを含むことを特徴とする請求項１に記載の真菰草酵素処理抽出物の製造方法。
10. 請求項１から請求項９のうち何れか一項に記載の製造方法で製造された真菰草酵素処理抽出物を有効成分として含み、前記真菰草酵素処理抽出物は、０．０１～９０重量％のトリシンを含有することを特徴とする化粧料組成物。
11. 前記化粧料組成物は、用途が美白用、しわ改善用、炎症改善用、アレルギー改善用または保湿用であることを特徴とする請求項１０に記載の化粧料組成物。
12. 請求項１から請求項９のうち何れか一項に記載の製造方法で製造された真菰草酵素処理抽出物を有効成分として含み、前記真菰草酵素処理抽出物は、０．０１～９０重量％のトリシンを含有することを特徴とする健康機能食品組成物。
13. 前記健康機能食品組成物は、用途が美白用、しわ改善用、炎症改善用、アレルギー改善用または保湿用であることを特徴とする請求項１２に記載の健康機能食品組成物。

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