KR20160095721A - 발효대두를 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 치료 또는 예방용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대두 발효물(fermented soybean)을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 건강기능식품, 화장료 조성물 및 의약외품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 대두 발효물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물, 건강기능식품, 화장료 조성물 및 의약외품은 자외선에 의한 전염증성 사이토카인의 생산을 억제하고, 피부 홍반 및 염증을 개선 시키므로, 자외선에 의한 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

발효대두를 유효성분으로 포함하는 염증성 피부질환 치료 또는 예방용 조성물{A COMPOSITION FOR TREATMENT OR PREVENTION OF THE INFLAMMATORY SKIN DISEASES, COMPRISING FERMENTED SOYBEAN PRODUCTS AS AN ACTIVE GRADIENT}

본 발명은 대두 발효물(fermented soybean)을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 건강기능식품, 화장료 조성물 및 의약외품 조성물에 관한 것이다.

자외선(UV radiation)에 과다 노출은 일광흑색점(solar lentigo), 지루각화증(seborrheic keratosis), 홍반(erythema) 및 과다색소침착(hyperpigmentation)과 같은 피부 질환을 유도한다. 태양에 계속 노출되어 자외선에 지속적인 자극을 받게 되면 피부암이 발생할 수도 있다. 특히, 자외선 중 UVB는 DNA 손상 및 산화적 스트레스를 증가시키며, 이러한 UVB에 의해 유도되는 피부암은 피부염과 관련이 있다. 따라서, 진행중이거나 만성인 염증을 조절하는 것은 피부암 발생의 위험을 감소시키기 위한 하나의 접근방법이 될 수 있다. 한편, 면역력이 약한 사람은 피부암이 생길 위험이 더 크다고 알려져 있다.

자외선은 일사성피부염(dermatoheliosis)과 관련된 다양한 경로를 자극하고, 면역세포(주로 중성구)가 피부로 침투하도록 유도한다. 이 때, 중성구는 전염증성(proinflammatory) 사이토카인 및 활성산소(ROS)를 발생시키며 이러한 활성산소의 증가는 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 경로의 활성을 통해 면역반응을 조절한다.

MAPK 활성은 피부염 및 암 발생을 매개하는 것으로 알려져 있는데 ERK(extracellular signal-regulated kinase), JNK(c-Jun amino-terminal kinase) 및 p38 키나아제(kinase)를 포함하는 MAPK 경로의 활성은 AP-1(activator protein-1) 전사 인자의 활성을 유도하여, 전염증 유전자, 특히 COX-2(cyclooxygenase-2)의 발현을 이끈다. 이 중에서 특히 AP-1은 피부염에서 중요한 조절자로 알려져 있으며, AP-1의 활성은 iNOS(inducible nitric oxide synthase) 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α)의 발현을 증가시킨다.

이에 따라, 전사 인자 AP-1 및 COX-2 단백질 발현을 억제함으로써 피부염 치료가 가능할 수 있다. 자외선에 의해 유도되는 피부염에 대한 최근 연구들은 상기와 같은 경로를 억제하는 약물에 집중되어왔다. 결과적으로, 항피부염 약물로서 MAPK 신호로 알려진 피부의 분자 스위치를 끄기 위한 물질을 사용할 수 있다.

대두(Glycine max MERR.)는 중요한 식물 단백질 자원이다. 대두는 비만, 당뇨, 염증 및 심혈관계 질환을 치료할 수 있는 특성을 가지는 것으로 보고되었다. 대두는 또한 콜라겐 및 히알루로난(hyaluronan) 합성, MMP(metrix metalloproteinase) 발현 억제 및 섬유아세포 증식을 조절하는 효과를 가지고 있으며, 이를 통해 노화된 피부를 개선하는 효과를 가진다. 그리고 생체내 및 시험관내 실험을 통해 대두 산물이 일부 염증 관련 효과를 가지는 것으로 보고되어왔다. 하지만, 대부분의 대두 및 피부염에 관한 연구는 인간 AD(atopic dermatitis)를 연구하기 위한 AD 모델인 NC/Tnd 마우스 모델을 사용하여 수행되었다. 구체적으로, 자외선에 의해 유도되는 피부염 및 피부 광노화에 관한 대두의 효과에 대한 연구는 무모 마우스에 UVB를 조사하기에 앞서 아이소플라본(isoflavone) 추출물 및 안소시아닌(anthocyanin)을 국소 도포하는 것에 집중되어왔다. 대두가 우수한 식이 보충제로 알려져 있으나, 자외선을 처리한 동물 모델에서 대두를 장시간 공급했을 때 항염증 효과에 대한 보고는 없었다.

본 발명자들은 발효 대두의 섭취를 통해 염증성 질환, 특히 자외선(UVB)에 의한 피부염 증상이 완화되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 대두 발효물(fermented soybean)을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 대두 발효물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 염증성질환 예방 또는 개선용 건강기능식품, 화장료 조성물 및 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 하나의 양태로서 본 발명은 대두 발효물(fermented soybean)을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "대두(Glycine max MERR.)"는 콩과에 속하는 1년생 초본의 열매이며 식용작물로서 널리 재배된다. 콩의 단백질에는 필수 아미노산이 골고루 들어 있고, 다른 식물성 단백질에서 부족하기 쉬운 라이신(lysine)이 많이 함유되어 있다. 콩의 지방은 대부분 불포화 지방산인 리놀레산으로 혈중의 콜레스테롤의 축적을 방지하는 효과가 있다.

본 발명의 상기 대두는 알파화한 것을 사용할 수 있다. 대두는 외피로 둘러싸여져 효소분해 작용을 받기 어려워 외피를 파괴하는 과정을 거쳐야 대두안의 단백질과 탄수화물을 미생물의 효소작용으로 분해할 수 있으며, 이러한 전처리 과정은 습식과 건식 방법으로 나누어진다. 증기를 사용하는 습식방법은 추후 제조공정상 외부미생물에 불안정한 원료로 제조되기 때문에 건식방법에 의한 전처리 방법이 보다 용이할 수 있다. 이러한 물리적 방법에 의한 외피의 파괴 및 열을 이용한 단백질 및 탄수화물의 변성은 효소분해 수율을 높이고, 더욱이 복잡한 구조로 이루어진 단백질의 구조를 파괴하여 효소분해가 보다 용이하게 이루어지게 할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "대두 발효물"은 대두를 효모, 세균 또는 이들의 조합을 이용하여 발효시킨 것을 의미하며, 이에 제한되는 것은 아니나, 바람직하게는 피키아 자디니(Pichia jadinii) 및 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans)의 복합 균주를 대두에 접종하고 발효배양하여 수득한 생성물일 수 있다.

상기 피키아 자디니(Pichia jadinii) 및 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans)는 2 내지 4 대 6 내지 8의 혼합비로 사용하는 것이 바람직하며, 피키아 자디니(Pichia jadinii)의 생육속도가 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans)의 생육속도 보다 2배 이상 빠르므로 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans)를 보다 많이 접종할 수 있다.

또한, 상기 대두 발효물은 복합 균주 종배양액을 발효액량 대비 1 중량% 내지 10 중량%의 양으로 대두에 접종하여 발효한 것을 사용하는 것이 바람직하다. 보다 더 바람직하게는 상기 대두 발효물은 복합 균주 종배양액을 발효액량 대비 1 중량% 내지 5 중량%의 양으로 대두에 접종하여 발효한 것을 사용할 수 있다.

또한, 상기 복합 균주로 대두를 발효 배양시킬 때, 대두는 발효조에서 배양하는 전체 함량 대비 1 중량% 내지 20 중량%로 첨가할 수 있으며, 특히 전체 함량 대비 1 중량% 내지 10 중량%의 양을 첨가할 수 있다.

또한, 상기 복합 균주를 이용하여 배양하는 것은 대두의 발효를 촉진시켜 피부에 유익한 대사산물을 다량 생성하고 배출시킬 수 있으므로 유익하다. 본 발명에서 상기 발효는 20℃ 내지 40℃에서 10 시간 내지 30 시간 발효하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 복합균주를 사용하여 대두 발효물을 제조하는 것은 균의 종류마다 그 발효 메커니즘이 상이하여 상호 보완을 통해 풍부한 발효산물을 만들 수 있기 때문이다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 피키아 자디니(Pichia jadinii, KFCC 11487P) 및 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans, KCCM 12017)의 복합 균주로 대두를 발효하여 대두 발효물을 제조하였다.

발효 과정을 통하여, 대두의 다이드진(daidzin) 및 제니스틴(genistin)은 다이드제인(daidzein) 및 제니스테인(genistein)으로 각각 전환된다.

이 때 상기 발효물에 포함된 성분의 함량을 분석한 결과, 다이드제인(daidzein)의 함량이 0.1 내지 0.3㎍/mg 이고, 제니스테인(genistein)의 함량이 0.1 내지 0.3㎍/mg이며, 발효 전 원성분인 다이드진(daidzin)과 제니스틴(genistin)의 함량이 각각 0.1㎍/mg 이하인 것을 확인하였다.

본 발명의 용어 "자외선"은 태양광의 스펙트럼을 사진으로 찍었을 때, 가시광선보다 짧은 파장으로 눈에 보이지 않는 빛을 말하는데, UVB(ultraviolet-B)는 피부에 가장 많은 영향을 주며 주로 표피까지 침투하여 피부세포에 영향을 주며, UVA(ultraviolet-A)는 피부속 진피까지 침투하여 주로 콜라겐 합성 관련 피부 세포에 영향을 준다. 또한, 이들 자외선은 직접적으로 영향을 주거나 간접적으로 활성 산소를 발생시켜 피부에 영향을 준다.

본 발명의 구체적인 일실시예에서는 HaCaT 각질세포에 대두 발효물을 전처리한 후 UVA를 처리하였을 때는 처리하지 않은 군과 세포 생존률에 별다른 차이가 없었으나, UVB를 처리하였을 때는 처리하지 않은 군에 비하여 세포 생존률이 높을 것을 확인하였다(도 1). 따라서 본 발명의 대두 발효물은 특히 UVB에 의한 세포 사멸을 방지하는 우수한 효과가 있음을 알 수 있었다.

한편, 본 발명의 대두 발효물은 자외선 자극에 의한 세포 손상을 억제하며 IL-6(interleukin-6)와 같은 전염증성 사이토카인의 분비를 억제하는 활성을 가지며, 상기 발효물의 식이 보충은 자외선에 의해 유도된 피부 홍반 및 염증 개선에 효과적이다. 따라서 본 발명의 대두 발효물을 함유하는 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 치료에 우수한 효과가 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 대두 발효물의 유효 성분인 다이드제인 및 제니스테인은 UVB로 염증이 유도된 세포에서 전염증성 사이토카인인 IL-6의 분비를 억제하였고, 면역 반응을 조절하는 것으로 알려진 MAPK 신호 경로를 억제하였다(도 7). 또한 상기 발효물을 UVB를 처리한 마우스에 식이 보충 하였을 때, 상기 마우스의 피부에서 iNOS 및 COX-2의 발현이 억제되었으며, 마우스에 유도된 홍반 및 염증이 개선되는 효과가 있음을 확인하였다(도 8 내지 도 17).

따라서, 본 발명의 대두 발효물은 자외선 등의 광원에 의한 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 활성을 갖는다.

본 발명에서 사용되는 용어 "염증성 질환"은 염증을 주병변으로 하는 질병을 총칭하는 의미로서, 본 발명의 목적상 특히 상기 IL-6에 의하여 매개되는 염증성 질환일 수 있다. 상기 염증성 질환은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 ssRNA 및 dsRNA 바이러스 감염증, 패혈증, 다발성 연골염, 알레르기, 형질구 증가증, 초면역 글로불린 혈증, 빈혈, 악액질, 목축업자 질병, 맥관증식신염, 포도막염, 크론병, 연소성 특발형 위축증, 알츠하이머, 경피증, 피부염, 습진, 통풍, 치주질환, 베체트 증후군, 부종, 맥관염, 가와사키병, 당뇨병성 망막염, 급성 및 만성 췌장염, 혈관염, 사구체 신염, 세균 및 진균의 급성 및 만성 감염, 급성 및 만성 기관지염 및 인플루엔자 감염증 등이 포함될 수 있다. 본 발명의 대두 발효물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 염증 반응을 억제함으로써 자외선에 의해 유도된 상기 염증성 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에서 용어, "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 염증성 질환의 발생, 확산 또는 재발을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료" 또는 "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 상기 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 용어, "약학 조성물"은 질병의 예방 또는 치료를 목적으로 제조된 것을 의미하며, 각각 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예컨대, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 경구형 제형으로 제형화할 수 있고, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

또한, 각각의 제형에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 예컨대 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제, 기제, 부형제, 윤활제, 자연적 담체 또는 비자연적 담체 등 당업계에 공지된 담체를 추가로 포함하여 제조할 수 있다.

한편, 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하고 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 내혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 대두 발효물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 대두 발효물 및 자외선에 의한 염증성 질환의 예방 또는 개선에 대하여는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 대두 발효물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 자외선에 의한 염증성 질환의 예방 또는 개선에 효과적인 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 대두 발효물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 대두 발효물은 세포 생존성 실험에서 그의 안정성, 독성 및 부작용에 문제가 없는 것으로 확인되었으므로(도 1 및 도 5), 질환의 예방 및 개선목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 물질이다.

본 발명의 대두 발효물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 자외선에 의한 염증성 질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중에 상기 조성물의 양은 일반적으로 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강음료 조성물은 100g을 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 조성물을 함유하는 것 외에 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제, 예컨대 다양한 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예에는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토스, 수크로스 등의 이당류 및 덱스트린, 시클로덱스트린 등의 다당류와 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리롤 등의 당알코올이 있다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예컨대, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강기능식품 100㎖ 당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 대두 발효물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 염증성 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 대두 발효물 및 자외선에 의한 염증성 질환의 예방 또는 개선에 대하여는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 조성물이 화장품으로 제제화되는 경우, 본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 대두 발효물 및 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체(자연적 담체 및/또는 비자연적 담체)를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 대두 발효물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 염증성 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공한다.

상기 대두 발효물 및 자외선에 의한 염증성 질환의 예방 또는 개선에 대하여는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 용어, "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 섬유, 고무제품 또는 이와 유사한 것, 인체에 대한 작용이 약하거나 인체에 직접 작용하지 않으며, 기구 또는 기계가 아닌 것과 이와 유사한 것, 감염 예방을 위하여 살균, 살충 및 이와 유사한 용도로 사용되는 제제 중 하나에 해당하는 물품으로서, 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것 및 사람이나 동물의 구조와 기능에 약리학적 영향을 줄 목적으로 사용하는 물품 중 기구, 기계 또는 장치가 아닌 것을 제외한 물품을 의미하며, 피부 외용제 및 개인위생용품도 포함한다.

본 발명의 조성물을 자외선에 의한 염증성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물에 첨가할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.

상기 피부외용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 연고제, 로션제, 스프레이제, 패치제, 크림제, 산제, 현탁제, 젤제 또는 젤의 형태로 제조되어 사용될 수 있다. 상기 개인위생용품에는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 비누, 화장품, 물티슈, 휴지, 샴푸, 피부 크림, 얼굴 크림, 치약, 립스틱, 향수, 메이크업, 파운데이션, 볼터치, 마스카라, 아이섀도우, 선크림 로션, 모발손질 제품, 에어프레쉬너 젤 또는 세정 젤일 수 있다. 또한, 본 발명의 의약외품 조성물의 또 다른 예로 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제가 있다.

본 발명에 따른 대두 발효물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물, 건강기능식품, 화장료 조성물 및 의약외품 조성물은 자외선에 의한 전염증성 사이토카인의 생산을 억제하고, 피부 홍반 및 염증을 개선 시키므로, 자외선에 의한 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 HaCaT 각질 세포에 대두 발효물을 전처리한 후 UVA 또는 UVB 처리에 대한 세포 생존률을 확인한 것이다.
도 2는 발효 과정에 의한 대두 아이소플라본의 생전환을 나타낸다.
도 3은 대두의 대표적인 HPLC 크로마토그램이다: 표준(a); 대두(b); 발효 대두(c).
도 4는 UV를 조사한 HaCaT 및 NHDF 공배양에서 다이드진, 다이드제인, 제니스틴 및 제니스테인을 각각 처리했을 때 세포의 모양을 보여준다. NHDF 세포 및 HaCaT 세포는 동일한 디쉬에서 배양하였다(1:1 세포 혼합물). 10μM의 각 네 개의 화합물을 72시간 동안 처리 후, 세포를 Olympus CKX-41 현미경(명시야, 100×)을 이용하여 관찰한 것이다.
도 5는 UV를 조사한 HaCaT 및 NHDF 공배양(1:1)에서 다이드진, 다이드제인, 제니스틴 및 제니스테인을 각각 처리(10μM, 72시간)했을 때 세포의 생존률을 보여준다. 세포 생존율은 MTT 분석으로 측정하였다.
도 6은 UV를 조사한 HaCaT 및 NHDF 공배양(1:1)에서 다이드진, 다이드제인, 제니스틴 및 제니스테인을 각각 처리(10μM, 72시간)하며 세포를 배양한 배지에서 IL-6의 농도를 측정한 것이다.
도 7은 UV를 조사한 HaCaT 및 NHDF 공배양(1:1)에서 다이드진, 다이드제인, 제니스틴 및 제니스테인을 각각 처리했을 때, MAPK 신호 관련 단백질의 발현 정도를 확인하기 위해 웨스턴블랏 분석을 수행한 것이다. 상기 세포 혼합물에 100mJ/cm²의 UVB 조사 및 상기 네 개의 화합물 중 하나(10μM)를 동시에 처리하였으며, 1시간 경과 후, 상기 혼합된 세포를 회수하고 단백질 수준을 측정하였다. 통계적 유의성은 *P < 0.05, **P < 0.01, 및 ***P < 0.001이다.
도 8a는 동물 연구 절차의 실험 설계, 도 8b는 식이 성분, 도 8c는 8주 간의 식이 효율을 나타낸다. ^aN군: 무모 마우스에 대조군 사료만 준 것; C군: UVB를 처리한 무모 마우스에 대조군 사료를 준 것; S군: UVB를 처리한 무모 마우스에 2.5% 대두를 함유한 사료를 준 것; FS군: UVB를 처리한 무모 마우스에 2.5% 발효 대두를 함유한 사료를 준 것. ^bFER (food efficiency rate) = 증가된 체중(g)/사료 섭취량(g). 각 값은 평균 ± SEM이다(n=2).
도 9는 UVB를 처리한 무모 마우스 피부 조직에서의 S 및 FS의 효과를 보여준다: UVB 처리를 하지 않은 N군(a), UVB 처리를 한 C군(b), UVB 처리 및 대두를 공급한 S군(c) 및 UVB 처리 및 발효 대두를 공급한 FS군(d)을 디지털 카메라(삼성, 한국)를 이용하여 기록하였다.
도 10은 무모 마우스 등쪽 피부의 대표적 특징부를 보여준다. H&E 염색(200 배율).
도 11은 UVB를 처리한 무모 마우스 피부 조직에서 표피 두께를 측정한 것이다: (N) UVB 처리하지 않음; (C) UVB 처리; (S) UVB 처리 및 대두 공급; (FS) UVB 처리 및 발효 대두 공급. 통계적 유의성은 ***P < 0.001이다.
도 12는 UVB 처리 후 무모 마우스 피부에 마커 CD11b를 이용한 대식세포의 염증 침투 분석을 보여준다. 흰 화살표는 H&E 염색한 조직에서 염증 세포의 침투를 나타낸다(200x 배율). 검은 화살표 및 화살표 머리는 CD11b⁺ 대식 세포를 나타낸다(200x 배율). UVB를 처리하지 않은 N군(a, e), UVB를 처리한 C군(b, f), UVB 처리 및 대두를 공급한 S군(c, g), UVB 처리 및 발효 대두를 공급한 FS군(d, h).
도 13은 피부에서 iNOS 발현에 대한 S 및 FS의 효과를 보여주는 사진으로 iNOS(갈색)가 발현되는 것을 보여준다. 핵은 헤마톡실린(hematoxylin)으로 카운터염색하였다(200x 배율). 검은 화살표는 iNOS가 발현되는 세포를 나타낸다: N군(a), C군(b), S군(c) 및 FS군(d).
도 14는 피부 용해물에서 iNOS의 웨스턴블랏 분석을 보여준다.
도 15는 iNOS의 단백질 발현을 α-튜불린에 대응하는 밴드로 표준화시킨 것이다. 통계적 유의성은 **P < 0.01 및 ***P < 0.001이다.
도 16은 피부에서 COX-2 발현에 대한 S 및 FS의 효과를 확인한 면역조직화학 사진으로, COX-2(녹색 염색)가 발현되는 것을 보여준다. 핵은 DAPI(파란색 염색)를 이용하여 카운터염색하였다(400x 배율). 흰 화살표는 COX-2 발현을 나타낸다; N군(a), C군(b), S군(c) 및 FS군(d).
도 17은 피부 용해물에서 COX-2의 웨스턴블랏 분석을 보여준다. 하단의 그래프는 COX-2 단백질 발현을 α-튜불린에 대응하는 밴드로 표준화시킨 것이다. 통계적 유의성은 ***P < 0.001이다.
도 18은 웨스턴블랏 및 농도계 분석을 통해 피부 용해물에서 UVB로 유도된 MAPK 신호에 대한 S 및 FS의 효과를 확인한 것이다. 조직 용해물로부터 추출한 전체 단백질 40㎍을 웨스턴블랏 분석에 사용하였다. 유의성은 단방향 ANOVA 다음에 Tukeys 다중 비교 시험을 사용하여 결정하였다. 통계적 유의성은 *P < 0.05, **P < 0.01 및 ***P < 0.001이다.

실험예 1: 화학약품

본 발명에서 사용한 DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium), FBS(fetal bovine serum) 및 페니실린/스트렙토마이신은 Gibco BRL(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. 또한, MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide), DMSO(dimethyl sulfoxide) 및 메이슨의 트리크롬 염색 키트(Massons trichrome stain kit)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 아울러, IL-16의 수준을 측정하기 위한 ELISA 분석 키트는 R&D 시스템(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다.

실험예 2: 표준 및 표본 제조

다이드진(Daidzin), 다이드제인(Daidzein), 제니스틴(Genistin) 및 제니스테인(Genistein)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입하였다. 표준 스톡(stock) 용액은 1mL의 메탄올에 각 화합물 1mg을 용해시켜 제조하였고 20℃에서 저장하였다. 대두는 2012년 2월에 Aqua Green Technology Co., Ltd(Jeju, South Korea)로부터 공급받았다. 대두는 제조과정 동안 4℃에서 저장하였다. 대두를 동결 건조(lyophilization)하기에 앞서 100℃에서 볶고 갈았다. 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans, KCCM 12017)는 한국 미생물 보존센터(Seoul, South Korea)에서 구입하였고 피키아 자디니(Pichia jadinii , KFCC 11487P)는 SEMPIO Food Company로부터 얻었다.

실험예 3: 발효 조건

간략하게, 대두(40g/L), 1.0 g/L 암모니움 나이트레이트(ammonium nitrate), 0.5 g/L 다이포타슘 포스페이트(dipotassium phosphate), 0.1 g/L 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate) 및 1.0 g/L 소듐 클로라이드(sodium chloride)를 함유하는 합성 배지를 121℃에서 15분간 가압처리하였다. 5L 바이오리액터에서 두 효모(A. pulluans 및 P. jadinii)를 상기 대두를 함유한 합성 배지에 접종하였다. 상기 합성 배지는 20g로 48시간동안 흔들면서 30℃에서 배양하였다. 그 후 오염을 막기 위해 표본을 121℃에서 10분간 멸균시키고, 동결 건조시킨 후 18℃에 저장하였다. 발효 표본의 수율은 90%였다.

실험예 4: HPLC 분석

HPLC 분석은 통합 컬럼 히터(integrated column heater), 오토샘플러(autosampler) 및 광다이오드 분석 검출기(2998)를 가진 분리 모듈(e2695)로 이루어진 Waters 시스템(Waters Corp., Milford, MA)에서 수행하였다. UV 흡수는 200-400nm에서 관찰하였다. 정량화는 254nm에서 피크(peak) 영역의 통합에 의해 수행하였다. 주사 부피는 10㎕이다. 컬럼(Jshpere ODS-H80, 250mm 4.6mm; 입자 크기, 4㎛; YMC Co. Ltd., Japan)은 컬럼 오븐(column oven)에 설치하고 40℃로 유지하였다. 이동상은 1% 아세트산(용매 A) 및 아세토나이트릴(용매 B)을 함유하는 물로 하였다. 유속은 1.0mL/분으로, 농도구배는 0.0 min, 8% B; 3.5 min, 15% B; 12.0 min, 17% B; 23.0 min, 24% B; 28.0 min, 50% B; 33.0 min, 100% B; 38.0 min, 100% B; 및 40.0 min, 8% B 로 하였다. 작동 사이에 재평형(re-equilibration) 시간을 20분간 주었다.

실험예 5: 세포 배양

정상 인간 피부섬유모세포는 ScienCell Research Laboratories(CA, USA)에서 구입하였다. 간 각질세포(HaCaT)는 김태윤 교수(카톨릭대학교 의과대학 피부과학교실)로부터 공급받았다. 상기 세포들은 10% FBS, 100 U/mL 페니실린 및 100 U/mL 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM에서 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다.

실험예 6: NHDF 및 HaCaT 세포의 공배양 및 UVA 또는 UVB 처리

NHDF 세포는 40mm 세포 배양 디쉬에 6×10⁴ 세포/mL 로 접종하고 DMEM 배지에서 배양하였다. 24시간 후, HaCaT 세포(6×10⁴ 세포/mL)를 DMEM 배지에서 배양되고 있는 NHDF 배양 디쉬에 접종하였다. 24시간 후, 상기 세포 혼합물을 PBS로 세척하고 신선한 혈청-불포함 배지로 교체한 뒤, 상기 세포 혼합물을 100μg/ml의 대두 발효물로 1시간동안 전처리하였다. 그 다음, BLX-312 UV 조사 시스템(Vilber Lourmat, Marne-La-Vallee, France)에서 0, 8, 16 및 24 J/cm²의 UVA 또는 0, 8, 16, 24, 32, 48 및 64 mJ/cm²의 UVB를 48시간 처리하고 세포 생존률을 측정하였다.

실험예 7: NHDF 및 HaCaT 세포의 공배양 및 UVB 처리

NHDF 세포는 40mm 세포 배양 디쉬에 6×10⁴ 세포/mL 로 접종하고 DMEM 배지에서 배양하였다. 24시간 후, HaCaT 세포(6×10⁴ 세포/mL)를 DMEM 배지에서 배양되고 있는 NHDF 배양 디쉬에 접종하였다. 24시간 후, 상기 세포 혼합물을 PBS로 세척하고 BLX-312 UV 조사 시스템(Vilber Lourmat, Marne-La-Vallee, France)에서 100 mJ/cm²의 UVB를 처리하였다. 세포 혼합물을 PBS로 세척하고 신선한 혈청-불포함 배지로 교체하였다. 그 후 상기 세포 혼합물을 10μM의 다이드진, 다이드제인, 제니스틴 및 제니스테인으로 처리하고 72시간 동안 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 마지막으로 세포를 배양한 배지 및 세포를 ELISA 분석 및 웨스턴블랏 분석을 위해 회수하였다.

실험예 8: 동물

7주령의 알비노 및 무모 수컷 마우스(SKH:HR-1)(20-27g; n=40)는 Japan SLC, Inc(Hamamatsu, Japan)에서 얻었다. 본 발명을 위한 실험 프로토콜은 경희대학교의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 얻었다(KHUASP (SU)-12-09). 마우스는 온도 및 습도가 조절되는 방(22 ± 1℃ , 60 ± 5% 습도)에서 12시간 명/암 주기로 사육하였다. 격리 일주일 후, 마우스를 우리당 10마리로 무작위로 네 그룹으로 나누고 적응시켰다. 실험 기간 동안, 사료와 물은 임의로 제공하였다.

실험예 9: 무모 마우스에 UVB 노출

자원은 310nm에 방사 조도 피크(irradiance peak)를 가지는 다섯 개의 Sankyo Denki 태양등의 밀착 공간 어레이(closely spaced array)에 의해 공급되었다. 전구는 마우스의 15cm 위에 위치시켰다. 방사 조도(0.1 mW/cm²)는 UVB 센서가 장착된 IL1700 Research Radiometer(International Light, Inc., Newburyport, MA)로 측정하였다. 마우스는 첫 주에는 매일 100mJ/cm² UVB 조사(최소 홍반 용량)에 노출시키고, 그로부터 11주 동안 일주일에 3번 200mJ/cm²에 노출시켰다. UVB 조사는 마우스의 등쪽 피부에 실시하였다.

실험예 10: 급식

40 마리의 무모 수컷 마우스를 우리 당 10마리의 네 개의 군으로 무작위로 배치시켰다: (a) 정상(N)(대조 급식만 줌), (b) 대조군 (C)(UVB 조사 + 대조 급식), (c) 대두(S) 2.5%(UVB 조사 + 2.5% 대두를 함유한 급식) 및 (d) 발효 대두(FS) 2.5%(UVB 조사 + 2.5% 발효 대두를 함유한 급식). 모든 마우스는 고형 사료를 주었다. 각 군의 마우스에 UVB 조사와 동시에 8주 동안 해당되는 사료를 먹였으며, 상기 사료는 매주 제공되었다(500g/우리). 사료 섭취를 계산하기 위해, 매주 남은 사료의 중량을 측정하였다. 마우스들에게 사료 및 물에 자유로이 접근할 수 있도록 허용하였고, 마우스의 체중은 일주일에 한번 측정하였다.

실험예 11: 조직학적 피부 분석

마우스를 최종 UVB 노출 이후에 안락사시키고, 등쪽 피부로부터 조직을 얻었다. 4% 파라포름알데히드로 24시간 동안 조직을 고정시키고 파라핀에 끼워 넣었다. 4㎛ 두께의 절편을 10분 동안 헤마톡실린(hematoxylin)으로 염색하고 세척한 후, 2분 동안 에오신(eosin)으로 염색하였다. 물로 세척한 후, 슬라이드를 50%, 70%, 90% 및 100% 에탄올로 점차적으로 탈수시켰다. 면역조직화학 분석을 수행하기 위해, 상기 절편을 항체 회수(antigen retrieval) 목적으로 0.1% 단백질분해효소가 첨가된 PBS에 방치시켰다. 그 후 내인성 페록시다아제 활성을 막기위해 상기 절편을 3% H₂O₂가 첨가된 PBS에 방치시켰다. 그 후 이차 면역글로불린의 비특이적 결합을 막기 위해 20분 동안 2% 표준 말 혈청이 첨가된 PBS에 절편을 방치시켰다. 블록킹 후, 절편을 CD11b 및 iNOS 일차 항체(Cell Signaling Technology, Danvers, MA)와 함께 방치시켰다. PBS로 세척한 후, 슬라이드를 1시간 동안 Vectastain ABC 시약(Vector Laboratory, Piscataway, NJ)에서 방치시켰다. 색은 DAB(3,3-diaminobenzidine)으로 현상하였으며, 사진은 디지털 CCD 카메라(Axiocam, Zeiss, Oberko, Germany)와 연결된 Zeiss 도립 현미경을 이용해 찍었다. 면역조직형광 분석을 위한 방법은 상기 기술한 블록킹 단계와 동일하다. 그 후 슬라이드를 COX-2 항체(Cell signaling Technology, Danvers, MA)와 함께 4℃에서 밤새 방치하였다. PBS로 세척한 후, 절편을 FITC가 결합된 이차 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc., CA)와 함께 방치시키고, 핵은 DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)로 카운터염색하였다. 그 후 상기 절편을 Zeiss LSM 700 콘포칼 현미경(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)로 관찰하였다.

실험예 12: 웨스턴블랏 분석

세포 및 피부 조직 용해물을 이용하여 웨스턴블랏을 수행하였다. 세포와 조직을 회수하여 PBS로 세척하였다. 50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 0.1% SDS, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.02% 쇼듐 아자이드, 0.5% 소듐 디옥시콜레이트(deoxycholate), 100 pg/mL PMSF, 1 pg/mL 아프로티닌(aprotinin) 및 포스파타아제 억제제(phosphatase inhibitor)를 함유하는 용해 완충액으로 조직 표본을 균질화시켰다. 그 후 용해물을 12,000g에서 20분 동안 원심분리하고, 상기 세포 및 조직 용해물을 각각 세 번씩 분석하였다. 단백질 농도는 Bradford 시약(Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 측정하였으며, 표준으로 BSA(bovine serum albumin)를 사용하였다. 동량의 단백질을 함유하는 세포 및 피부 조직 용해물을 10% 또는 12% SDS-PAGE 겔에서 분리시키고 니트로셀룰로스 막(Amersham Pharmacia Biotech, UK)으로 이동시켰다. 다음으로 상기 막을 상온에서 1시간동안 5% 무지방 우유를 함유하는 TBST 용액으로 블록킹하고 4℃에서 일차 항체와 함께 밤새 방치시켰다. 그 후 상기 막을 TBST로 3회 세척하고 상온에서 1시간 동안 이차 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc., CA)와 함께 방치시켰다. 마지막으로, Chemidoc XRS+ 이미징 시스템(Bio-Rad, CA)으로 면역 복합체를 검출하였다. 밴드의 정량 분석은 이미지퀀트(imagequant) TL 버전 8.1(GE Healthcare, Madison, WI)을 이용하여 수행하였다.

실험예 13: 통계 분석

모든 실험은 세 번씩 반복하여 수행하였고, 데이터는 평균 ± 표준편차(SD) 값으로 표현하였다. 다른 처리군 사이의 통계적 비교는 Tukey 다중비교와 함께 ANOVA(one-way analysis of variance)를 이용하여 수행하였다. 통계적 유의성 수준은 *P<0.05, **P<0.01 및 ***P<0.001이다.

실시예 1: 대두 발효물의 UVB 에 의한 세포 사멸 억제효과 확인

본 발명의 대두 발효물은 대두를 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) 및 피키아 자디니(Pichia jadinii) 복합 균주를 이용해 발효시켜 제조하였다. 상기 대두 발효물이 자외선에 의한 세포 사멸을 억제할 수 있는지를 확인하기 위하여, HaCaT 각질세포에 대두 발효물을 전처리한 후 UVA 또는 UVB를 처리하고 각각의 세포 생존률을 확인하였다(도 1).

그 결과, 대두 발효물을 전처리한 후, UVA를 24시간 처리했을 때는 무처리 대조군과 비교하여 세포 생존률의 유의적인 차이를 확인할 수 없었으나, UVB를 24시간 처리한 경우에는 무처리 대조군에서는 UVB 조사량이 증가할수록 세포 생존률이 감소하는 반면 대두 발효물을 전처리한 군에서는 세포 생존률이 100%에 근접한 것을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명의 대두 발효물은 UVB에 의해 야기되는 세포사멸을 억제하는 우수한 효능이 있음을 알 수 있었다.

실시예 2: 대두 및 발효 대두 아이소플라보노이드 ( isoflavonoid ) 함량

본 발명의 대두 발효물을 제조하기 위해, 대두를 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) 및 피키아 자디니(Pichia jadinii) 복합 균주를 이용하여 발효시켰을 때, 대두에 함유되어있는 다이드진 및 제니스틴은 발효 과정에 의해 다이드제인 및 제니스테인으로 전환되었다(도 2). 구체적으로 대두 및 발효 대두에서 다이드진, 다이드제인, 제니스틴 및 제니스테인 함량을 HPLC로 측정하였으며, 각 화합물의 보존시간을 도 3에 나타냈다. 각 화합물의 직선성을 각 특정 화합물의 세 농도를 이용하여 계산한 결과, 대두에서 다이드진, 다이드제인, 제니스틴 및 제니스테인 함량은 각각 0.1197, 0.0053, 0.2220 및 0.0170μg/mg이고, 발효 대두에서 다이드제인 및 제니스테인 함량은 각각 0.1870 및 0.2083 μg/mg이다(표 1).

	r2	대두(μg/mg)	대두 발효물(μg/mg)
다이드진(Daidzin)	0.9997	0.1197 ± 0.0008	-
다이드제인(Daidzein)	0.9997	0.0053 ± 0.0003	0.1870 ± 0.0020
제니스틴(Genistin)	0.9997	0.2220 ± 0.0002	-
제니스테인(Genistein)	0.9998	0.0170 ± 0.0001	0.2083 ± 0.0021

결과적으로 다이드진 및 제니스틴 피크는 발효 대두에서 검출되지 않았는데(도 3), 상기 HPLC 결과를 통해 발효 대두에서 아이소플라보노이드 글리코시드가 대응하는 어글리콘 형으로 상당한 양이 전환된다는 것을 확인하였다.

실시예 3: HaCaT 각질세포 및 NHDF 섬유아세포 공배양 시스템에서 다이드제인 및 제니스테인의 IL -6 및 MAPK 신호 인산화 억제 효과 확인

상기 실시예 2에서 확인한 바와 같이, 본 발명자들은 다이드제인 및 제니스테인이 발효 대두의 주요 아이소플라본이라는 것을 확인하였다(표 1 및 도 3). 이러한 두 화합물의 항염증 효과를 확인하기 위해, 각질세포 및 섬유아세포의 공배양 시스템을 사용하였다.

먼저 다이드진, 다이드제인, 제니스틴 및 제니스테인의 세포 독성을 확인하였다. 세포 혼합물에 100mJ/cm²의 UVB를 처리하였을 때, 세포가 약간 손상되었는데, UVB를 처리한 세포의 생존률은 UVB를 처리하지 않은 보통 세포와 비교하여 76.6% ± 1.3%까지 감소하였다. 이 때 UVB를 처리한 세포 혼합물에 10μM의 다이드진, 다이드제인, 제니스틴 및 제니스테인을 처리한 경우, 생존률에는 별다른 효과가 없는 것을 확인하였으며(도 4 및 도 5), 이에 따라 상기 화합물들이 세포 독성을 나타내지 않는다는 것을 알 수 있었다.

한편, UVB 조사는 세포의 염증반응을 자극하여, 결과적으로 전염증성 사이토카인의 분비를 증가시키는데, 이에 본 발명자들은 UVB를 처리한 세포 혼합물에서 전염증성 사이토카인인 IL-6(interleukin-6)의 농도를 측정하였다. IL-6의 농도는 정상군과 비교하여 UVB를 처리한 세포를 배양한 배지에서 더 높게 나타났으며, 이에 대한 다이드제인 및 제니스테인의 억제효과를 확인하였다(도 6). 나아가 본 발명자들은 염증을 조절하는 것으로 알려진 MAPK 신호 캐스캐이드(signaling cascade)를 조사하였다. 그 결과, 모든 화합물(다이드진, 다이드제인, 제니스틴 및 제니스테인)이 UVB에 의해 유도된 ERK의 인산화를 억제하였다. 특히, 제니스테인은 p38, ERK 및 JNK의 인산화를 억제하였으며, 더욱이 이러한 제니스테인의 억제 활성은 제니스틴보다 상당히 뛰어났다(도 7). 결론적으로 본 발명의 대두 발효물은 다이드제인 및 제니스테인을 함유하며, 상기 화합물은 세포 독성이 없고, IL-6의 생산을 억제하며, MAPK 신호 캐스캐이드를 막아 염증성 질환 치료 및 예방에 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 4: 식이효율 ( food efficiency ratio ) 측정

12주 경과 후 네 군의 마우스 사이에서 평균 체중은 별다른 차이가 없었다. 결론적으로 상기 군들의 식이효율에는 상당한 차이가 존재하지 않는다는 것을 확인하였다(도 8).

실시예 5: UVB 에 의해 유도된 피부 홍반 및 염증을 개선시키는 FS 식이 보충 효과 확인

대두 발효물을 장기간 섭취하였을 때 항염증 효과를 확인하기 위하여, 무모 마우스에 UVB를 처리하고 대두(S) 또는 대두 발효물(FS)로 식이 보충을 하며 12주 경과 후 마우스의 등쪽 피부의 생리학적 변화를 기록하였다. UVB에 장기적인 피부 노출은 피부 염증 홍반을 나타나게 하고 표피를 두껍게 하였는데, FS군은 UVB에 의해 유도된 홍반을 감소시켰다(도 9). 게다가, UVB를 처리한 대조군에서 표피의 두께는 정상군에 비해 상당히 증가하였으나 표피 두께의 증가는 S(79.4 ± 0.8%) 및 FS(83.4 ± 0.8%)군에서 줄어드는 것을 확인하였다(도 10 및 도 11). 조직학적 분석으로 무모 마우스에서 UVB 조사가 통상적인 피부염을 유도한다는 것을 확인하였는데, 장기간 UVB에 노출은 상부 진피(upper dermis) 및 표피(epidermis)에서 대식세포 집단을 증가시켰다. H&E 염색 분석을 기반으로 한 네 군의 점수는 대한민국 SMC의 병리학자인 오영련 박사에 의해 매겨졌다. 염증 점수는 0, +, ++ 또는 +++로 분류했다. 상기 점수 0은 염증이 없는 것을 나타내며, + 심볼의 수는 염증 정도를 나타낸다. 따라서 +++는 심각한 피부 염증을 나타낸다. N 군은 0점, C군은 +++점, S군은 +점, 그리고 FS군은 0-+점으로 분류되었다. 인트라호른(intrahorn) 및 상피하 공포형성(subepithelial vacuolization)과 같은 염증 증상은 C군에서 관찰되었으나, 이러한 증상은 다른 군에서는 관찰되지 않았다. 면역조직화학적 분석으로 CD11b+ 대식세포는 대조군과 비교하여 FS 군에서 상당히 감소하였다는 것을 확인하였는데(도 12), 특히 항염증 효과는 S군에 비하여 FS군에서 더 강하게 나타났다. 따라서 FS는 염증성 질환 치료용도로 사용될 수 있음을 확인하였다.

실시예 6: iNOS 및 COX -2 발현을 억제하는 FS 의 효과 확인

FS의 장기간 식이보충에서 항염증 효과에 대한 작용기전을 확인하기 위하여, UVB를 처리한 마우스 조직에서 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현 수준을 확인하였다. 면역조직학적 분석에서, C군은 특히 표피에서 iNOS 발현을 상당히 증가시켰고(도 13), 또한 웨스턴블랏 분석을 통해서도 C군에서 iNOS 발현 증가를 확인하였다. 이에 반해 S 또는 FS로 식이 보충은 iNOS의 단백질 발현을 각각 70.3% ± 7.0% 및 7.7% ± 0.4%로 감소시켰다(p<0.05)(도 14 및 도 15). 또한, C군에서 COX-2 발현의 증가는 S 또는 FS의 장기 식이 보충에 의해 각각 26.9% ± 0.4% 및 21.2% ± 0.3%로 억제되었다(p<0.05)(도 16 내지 도 17). 결론적으로 FS의 장기 식이보충은 마우스 피부에서 UVB로 유도된 iNOS 및 COX-2 발현의 감소를 야기함으로써, 염증성 질환을 예방 또는 치료하는데 효과가 있음을 확인하였다.

실시예 7: UVB 를 조사한 마우스의 피부 진피에서 MAPK 신호를 조절하는 FS 의 효과 확인

상기 실시예 5에서 확인한 바와 같이 UVB로 유도된 염증 반응은 FS의 장기 처리에 의해 눈에 띄게 감소했다. UVB에 의해 유도된 피부 염증에서 FS 항염증 기전을 평가하기 위해, 본 발명자들은 웨스턴블랏 분석에 의해 피부 진피에서 MAPK 신호 경로를 조사하였다. UVB 조사는 피부에서 p38, ERK, JNK 및 c-JUN의 인산화를 증가시켰다. 도 18에서 보이는 바와 같이, p38, ERK, JNK 및 c-Jun의 인산화는 UVB를 조사한 피부 진피에서 증가하였다. 대조적으로, 장기 FS 처리는 MAPK의 인산화를 상당히 억제하였다(p-p38, 61.3 ± 0.5%; p-ERK, 78.9 ± 3.3%; p-JNK, 14.4 ± 0.5%; 및 p-c-Jun, 37.6 ± 0.6%). 결론적으로 FS 처리에 의해 MAPK 신호 경로가 억제됨으로써 항염증 효과가 나타난다는 것을 확인할 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

1. 대두 발효물(fermented soybean)을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 자외선은 UVB(Ultraviolet-B)인 것인, 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 발효는 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) 및 피키아 자디니(Pichia jadinii) 미생물을 이용하여 발효된 것인, 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 발효물은 다이드제인(Daidzein) 및 제니스테인(Genistein)을 포함하는 것인, 조성물.
   
5. 제3항에 있어서, 상기 발효물은 다이드제인(Daidzein)의 함량이 0.1 내지 0.3㎍/mg 이고, 제니스테인(Genistein)의 함량이 0.1 내지 0.3㎍/mg이며, 다이드진(Daidzin)과 제니스틴(Genistin)의 함량이 각각 0.1㎍/mg 이하인 것인, 조성물.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 ssRNA 및 dsRNA 바이러스 감염증, 패혈증, 다발성 연골염, 알레르기, 형질구 증가증, 초면역 글로불린 혈증, 빈혈, 악액질, 목축업자 질병, 맥관증식신염, 포도막염, 크론병, 연소성 특발형 위축증, 알츠하이머, 경피증, 피부염, 습진, 통풍, 치주질환, 베체트 증후군, 부종, 맥관염, 가와사키병, 당뇨병성 망막염, 급성 및 만성 췌장염, 혈관염, 사구체 신염, 세균 및 진균의 급성 및 만성 감염, 급성 및 만성 기관지염 및 인플루엔자 감염증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 조성물.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
   
8. 대두 발효물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
   
9. 대두 발효물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 염증성 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
   
10. 대두 발효물을 유효성분으로 포함하는 자외선에 의한 염증성 질환의 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.

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