KR102489463B1 - 마이크로파 처리된 황칠의 추출물을 포함하는 미백용 조성물 - Google Patents
마이크로파 처리된 황칠의 추출물을 포함하는 미백용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 마이크로파 처리된 황칠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물 및 마이크로파 처리된 황칠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백 개선용 식품 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 마이크로파 처리 황칠의 추출물은 투명 추출물 또는 블랙 추출물과 비교하여, 세포 생존성, 총 생물 활성 화합물 함량, 라디칼 소거 효과, 티로시나아제 억제 효과 등이 우수한 특성을 가지고 있다.
Description
본 발명은 마이크로파 처리된 황칠의 추출물을 포함하는 미백용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 마이크로파 처리된 황칠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물 및 마이크로파 처리된 황칠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
근래에 효과적이고 생물학적으로 활성화된 물질과 피부 관리에 대한 관심이 높아짐에 따라 천연 생체 활성 물질을 화장품으로 사용하는 세계적인 추세가 형성되었다.
현재 식물 추출물에는 비타민이나 미네랄 등 생체활성 성분이 함유돼 있다는 점에서, 식물 추출물의 글로벌 도입은 부가가치가 높은 응용 분야에 집중되어 있다.
대부분의 성분은 화장품의 천연물 제조에 큰 관심을 가지고 있다. 식물 추출물의 생리활성 성분은 코스메티칼 제형으로 사용될 수 있으며, 피부 구조 또는 기능 유지와 같은 이점을 얻을 수 있다.
천연 성분의 안전성을 최적화하기 위하여서는 친환경적인 추출 방법을 선택하는 것도 중요한 역할을 한다. 마이크로파 보조 추출(Microwave-Assisted Extraction; MAE)은 녹색 접근법 뿐만 아니라 연구용 약용 식물 추출을 위한 유망한 기술로 표시되었다. MAE는 용매 소비량이 적거나 전혀 없는 효과적인 추출 성능을 제공할 뿐만 아니라, 열가소성 구성 요소에 대한 빠르고 높은 추출 수율로 보호 기능을 제공한다.
한편, MAE는 속슬렛(Soxhlet), 퍼콜레이션(percolation), 환류 추출(extraction under reflux), 초음파 처리(sonication) 등과 같은 기존의 추출 방법보다 더 효과적이고 저렴하다는 장점을 가지고 있다. 또한, MAE는 추출물의 항산화 잠재성을 변경하지 않고 더 높은 회복을 허용하였다. 따라서 MAE는 친환경 및 천연 제품에 가장 적합한 솔루션 중 하나이다.
최근에 화장품의 기능성 물질로서의 황칠에 대한 관심이 인간을 위한 균형 잡힌 건강상의 이점 덕분에 증가하였다. 황칠과 그 성분이 주름 방지, 모발 성장 및 보습 효과를 나타내고, 특히 황칠에서 분리된 α,β 시토스테롤은 보습 효과, 탈모 예방, 모발 밀도 개선 효과를 제공한다고 알려져 있다.
황칠 추출물에 관한 종래기술로는 주름제거 및 미백효과가 강화된 황칠나무 추출물 함유 화장료 조성물(특허문헌 1), 황칠 추출물을 포함하는 미백 또는 주름 개선용 조성물(특허문헌 2), 황칠 추출물을 이용한 미백 화장품 조성물 및 제조방법(특허문헌 3) 등이 개시되어 있다.
그러나, 상기 특허문헌 1은 진공증기가열 방식에 의한 황칠 추출물을 이용한 것이고, 상기 특허문헌 2는 초임계 추출 방법을 이용한 황칠 추출물이며, 상기 특허문헌 3은 증류 방법을 이용한 황칠 추출물을 이용한 것일 뿐, 마이크로파 처리된 황칠의 추출물을 이용한 미백용 조성물에 대해서는 알려져 있지 아니한 실정이다.
본 발명자들은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 연구를 수행하여, 마이크로파 처리된 황칠의 추출물이 항산화, 주름 방지, 미백 및 보습 효과를 나타냄을 알아내고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 마이크로파 처리된 황칠의 추출물의 용도로서, 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 마이크로파 처리된 황칠의 추출물의 또 다른 용도로서, 미백 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 마이크로파 처리된 황칠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로 상기 마이크로파 처리는 700~900W의 마이크로파를 8~12분 동안 조사할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 마이크로파 처리된 황칠의 추출물은 비스쿰네오사이드 III(Viscumneoside III)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 마이크로파 처리된 황칠의 추출물은 50~100 μg/mL 농도에서, 황칠의 증류 추출에 의한 투명 추출물에 비하여 1.4~1.6배, 또한 코지산에 비하여 1.5~3배의 티로시나제 억제 활성을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 황칠은 황칠나무의 수피, 목재, 잎, 꽃, 줄기, 열매, 가지 종자 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 마이크로파 처리된 황칠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로 상기 마이크로파 처리는 700~900W의 마이크로파를 8~12분 동안 조사할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 마이크로파 처리된 황칠의 추출물은 비스쿰네오사이드 III(Viscumneoside III)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 마이크로파 처리된 황칠의 추출물은 50~100 μg/mL 농도에서, 황칠의 증류 추출에 의한 투명 추출물에 비하여 1.4~1.6배, 또한 코지산에 비하여 1.5~3배의 티로시나제 억제 활성을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구현예로 상기 황칠은 황칠나무의 수피, 목재, 잎, 꽃, 줄기, 열매, 가지 종자 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 마이크로파 처리 황칠의 추출물(MA-DME)은 황칠의 생체 활성을 향상시켰으며, 마이크로파 처리 황칠의 추출물(MA-DME)은 생체 적합성, 항산화 활성, 미백 효과가 높은 장점이 있다.
또한, 본 발명에 따른 마이크로파 처리 황칠의 추출물은 투명 추출물 또는 블랙 추출물과 비교하여 세포 생존성, 총 생물 활성 화합물 함량, 라디칼 소거 효과, 티로시나아제 억제 효과 등이 우수한 특성을 가지고 있기 때문에, 미백용 화장료 조성물 및 미백 개선용 식품 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로파 처리된 황칠(MA-DME)의 추출 겅정을 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2b는 마이크로파 처리된 황칠(MA-DME)에 대한 고해상도 추출 이온 크로마토그램을 나타낸 것으로서, 도 2a는 양이온 모드, 도 2b는 음이온 모드를 나타낸 것이다.
도 3a는 24시간 동안 블랙 추출물 및 투명 추출물과 비교하여 HaCaT 세포의 생존력에 대한 마이크로파 처리된 황칠(MA-DME)의 영향을 나타낸 것이고. 도 3b는 48시간 동안 블랙 추출물 및 투명 추출물과 비교하여 HaCaT 세포의 생존력에 대한 MA-DME의 영향을 나타낸 것이다. MA-DME(10~300μg/mL)의 생존 가능성은 MTT assay를 통해 측정되었다(n = 3).
도 4a는 24시간 동안 블랙 추출물 및 투명 추출물과 비교하여 마이크로파 처리된 황칠(MA-DME)가 ROS에 미치는 영향, 도 4b는 24시간 동안 블랙 추출물 및 투명 추출물과 비교하여 마이크로파 처리된 황칠(MA-DME)가 ROS에 미치는 영향을 나타냔 것이다(n=3).
도 5는 ABTS MA-DME 및 투명 추출물의 라디칼 소거 활성을 나타낸 것이다.
도 6은 마이크로파 처리된 황칠(MA-DME), 투명 추출물 및 양성 대조군의 티로시나아제 억제 효과를 나타낸 것이다(n=3).
도 2a 및 도 2b는 마이크로파 처리된 황칠(MA-DME)에 대한 고해상도 추출 이온 크로마토그램을 나타낸 것으로서, 도 2a는 양이온 모드, 도 2b는 음이온 모드를 나타낸 것이다.
도 3a는 24시간 동안 블랙 추출물 및 투명 추출물과 비교하여 HaCaT 세포의 생존력에 대한 마이크로파 처리된 황칠(MA-DME)의 영향을 나타낸 것이고. 도 3b는 48시간 동안 블랙 추출물 및 투명 추출물과 비교하여 HaCaT 세포의 생존력에 대한 MA-DME의 영향을 나타낸 것이다. MA-DME(10~300μg/mL)의 생존 가능성은 MTT assay를 통해 측정되었다(n = 3).
도 4a는 24시간 동안 블랙 추출물 및 투명 추출물과 비교하여 마이크로파 처리된 황칠(MA-DME)가 ROS에 미치는 영향, 도 4b는 24시간 동안 블랙 추출물 및 투명 추출물과 비교하여 마이크로파 처리된 황칠(MA-DME)가 ROS에 미치는 영향을 나타냔 것이다(n=3).
도 5는 ABTS MA-DME 및 투명 추출물의 라디칼 소거 활성을 나타낸 것이다.
도 6은 마이크로파 처리된 황칠(MA-DME), 투명 추출물 및 양성 대조군의 티로시나아제 억제 효과를 나타낸 것이다(n=3).
본 발명의 제1 구현예는 마이크로파 처리된 황칠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제2 구현예는 마이크로파 처리된 황칠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 "황칠(Dendropanax morbifera)"은 한국의 토착 식물로서, 고혈당, 탈모, 피부 질환과 같은 인간의 질병을 포괄적으로 치료하기 위하여 사용되는 약초이다. 덴드로파낙스(Dendropanax) 식물 종에는 많은 생물학적 활성 화합물이 포함되어 있는 것으로 보고되었는데, 황칠의 주요 생물학적 활성 화합물은 퀘르세틴, 클로로제닌산, 루틴, 카르노졸, 덱스트로메토르판, 칸나비디올, 브레마조신, 독사프람 등이고, 또한 황칠은 항산화, 항염증, 신경보호, 골육종, 항당뇨병, 간 보호, 면역 조절, 항균 및 항진균 등의 기능을 가지고 있다고 알려져 있다.
본 발명에서, 상기 "유효성분"이라 함은 내재된 활성성분의 작용에 의하여 그 화장료 또는 식품의 효능·효과를 직접 또는 간접적으로 발현한다고 기대되는 물질 또는 물질군을 일컫는다.
본 발명의 상기 제1 구현예 및 제2 구현에에서, 상기 마이크로파 처리는 700~900W, 바람직하게는 750~850W, 보다 바람직하게는 800W의 마이크로파를 8~12분, 바람직하게는 9~11분, 보다 바람직하게는 10분 동안 조사할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 제1 구현예 및 제2 구현에에서, 상기 마이크로파 처리 활칠의 추출물(MA- DME)은 상기 마이크로파 처리된 황칠을 냉각한 후 분쇄하고, 상기 분쇄물에 탈이온수를 첨가하고 여과한 다음 동결 건조하여 수득할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 제1 구현예 및 제2 구현에에서, 상기 마이크로파 처리된 황칠의 추출물은 비스쿰네오사이드 III(Viscumneoside III)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 제1 구현예 및 제2 구현에에서, 상기 마이크로파 처리된 황칠의 추출물은 50~100 μg/mL 농도에서, 황칠의 증류 추출에 의한 투명 추출물에 비하여 1.4~1.6배, 또한 코지산에 비하여 1.5~3배의 티로시나제 억제 활성을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 제1 구현예 및 제2 구현예에서, 상기 황칠은 황칠나무의 수피, 목재, 잎, 꽃, 줄기, 열매, 가지 종자 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상, 바람직하게는 수피, 목재 및 잎으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상, 보다 바람직하게는 목재 및/또는 잎일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 제1 구현예에 따른 상기 화장료 조성물은 화장수, 영양로션, 영양크림, 수분크림, 마사지크림, 에센스, 페이스트, 마스 크팩, 패치, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 클렌저, 오일, 파운데이션, 메이크업 베이스, 왁스 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 화장료 조성물은, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 오일, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 화장료 조성물은 본 발명의 상기 마이크로파 처리된 황기의 추출물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염 료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있는데, 이들 보조제는 화장품학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 포함될 수 있다.
본 발명의 상기 화장료 조성물에 있어서, 통상적으로 함유되는 화장료 조성물에 본 발명의 상기 마이크로파 처리 황칠의 추출물이 0.1 내지 50 중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 마이크로파 처리 황칠의 추출물을 피부 외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화 제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비 이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성 분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 단독 또는 중복하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용 횟수를 달리할 수 있다.
본 발명의 제1 구현예에 따른 상기 식품 조성물은 상기 마이크로파 처리 황칠의 추출물을 그대로 각종 식품에 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 건강기능식품 조성물의 형태로 사용할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다.
첨가할 수 있는 식품의 예로는 설렁탕, 곰탕, 미역국, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌 류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물을 주성분으로 하여 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.
본 발명에서, 상기 "건강기능식품"은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅 셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 "기능성"이라 함은 인체의 구 조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품은 통상의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의해 제조 가능하며, 상기 제조시에는 통상의 기술분야에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 항산화제의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
본 발명의 상기 식품 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있으며, 유효성분의 혼합량은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "식품보조첨가제"이라 함은 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품 또는 건강식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정 화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 건강기능식품 또는 건강식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 상기 추출물을 활성성분으로 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하지만, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 재료 및 방법
(1). 재료
황칠은 한국의 완도에서 재배되고 수확되었다. 메탄올과 아세토니트릴은 Honeywell Burdic Jackson(Morristown,NJ,미국)에서 구입하였다. 포름산, 탄산나트륨(Na2CO3), 염화알루미늄 육수화물(AlCl3-6H2O)은 대중화학(한국, 시흥시)에서 구입하였다. EZ-cytox 용액은 도젠바이오(한국, 구로구)에서 구매하였다.
Tris-HCl 버퍼, PBS, Tris 용액 버퍼는 Thermo Fisher Scientific(Waltham, MA, 미국)에서 구입하였다. 폴린-데니스 시약, 코지산, 엘라스타제, 버섯 티로시나제, 2,2'-아지노-비스(3'-에틸벤조티아졸린-6'-술포산) (ABTS), 세포증식 키트 I(MTTT), DMSO, L-아스코르브산, 갈릭산, 퀘르세틴은 Sigma-Aldrich(St.Louis,MO, 미국)로부터 구입하였다.
(2). 마이크로파 처리 황칠 추출물(MA-DME)
생 황칠(raw Dendropanax morbifera)을 조제하기 위하여 황칠의 마른 잎과 나무(wood)를 물에 완전히 담갔다가 잘게 썰었다. 다음으로, 20g의 얇게 썬 원료를 믹서를 사용하여 균질한 혼합물로 갈아냈다.
황칠 분말은 동결건조기를 이용하여 탈이온수(deionized water)로 다양한 농도로 희석하여 얻었다. 탈이온수는 전도도가 <18.2 MΩ·cm2인 Milli-Q Millipore filter system(Millipore Co., Billerica, MA, USA)을 이용하여 얻었다.
이 작업에는 전자레인지(Magic MMO-20M7, 한국 종로구 SK Magic)가 활용되었다. MA-DME의 추출은 Alvand et al.의 방법(도 1)을 참고하여 수행하였다. 생 황칠은 마이크로파(800 W) 하에서 10분간 조사(탄화 처리)되었다.
조사된 황칠은 주변 온도에서 냉각되어 분말로 분쇄되었다. 시료가 냉각된 후, 탈이온수 20 mL를 첨가하고 0.22μm 필터를 통해 여과하였다. 마이크로파 처리 황칠의 추출물(MA- DME)을 동결 건조하여 추출물 분말을 얻었다.
MA-DME의 추출 수율 Y(%)는 하기 수학식 1과 같은 식으로 표현되었다.
상기 수학식 1에서, W1은 순수한 마이크로파 처리 황칠 추출물(MA- DME) 분말의 중량(g)이고, W2는 초기 황칠 분말의 중량(g)이다. 계산된 추출 수율은 약 33.5%이었다.
상기 마이크로파 처리 황칠의 추출물의 추출 효율성을 기존 추출과 비교하기 위하여, 대조 검체로는 블랙(black) 추출물 5%, 투명(transparent) 추출물 5%를 준비하였다.
여기서 상기 블랙 추출물 5%는 황칠의 비탄화 블랙 추출물로서, 분쇄물을 얻은 후 마이크로파 처리 황칠의 추출물(MA-DME)과 같은 황칠 입자를 100°C에서 물에 침지시켜 블랙 추출물을 얻었다. 또한 상기 투명 추출물 5%는 황칠의 비탄화 투명 추출물로서, 마이크로파 처리 황칠의 추출물(MA-DME)과 같이 분쇄된 황칠 입자를 수득한 후, 100°C에서 탈이온수를 이용하여 증류 추출하여 냉각기를 통해 액체 추출물을 얻었다.
(3). 마이크로파 처리 황칠 추출물(MA-DME)의 성분 분석
상기 황칠의 활성 화합물은 전기분사 이온화원(ESI)이 장착된 질량분석기(UHPLC-MS)를 탑재한 초고성능 액체 크로마토그래피 시스템을 특징으로 하였다. HPLC 분리는 ACQUITY UPLC HSS T3 column(1.8μm)에서 하기 와 같은 파라미터로 수행되었다.
런 타임: 25분, 용매 A: 포름산, 용매 B: 아세토니트릴, 유량: 0.5 mL/분, 그래이디언트 프로그램: 0분: 97% A, 0~1분, 97% A, 1~15분: 100% B, 15-16분: 100% B, 16-19분:97%A,19-25분: 97% A; 파장: 265 nm;컬럼 온도: 35℃; 시료 온도:12℃; 주입부피: 5μL.
질량 분석기는 모세관 전압: 3.0 kV(양) 및 2.8 kV(음); 분해능: 20,000; 스캔 질량 범위: 50-1200 m/z; 네불라이저(nebulizer) 압력: 6.4 Bar; 건조 가스 온도: 500°C, 건조 가스 유량: 800 L/h로 작동하였다.
(4). 마이크로파 처리 황칠 추출물(MA-DME)의 항산화물질 함량 분석
총 폴리페놀 함량 측정에 폴린-데니스 시약을 사용하였다. 100μL의 MA-DME와 900μL의 탈이온수를 원뿔형 튜브에 혼합하였다. 그 후, 100 μL의 폴린-데니스 시약을 첨가하고 상온에서 3분간 배양하였다.
반응 후 Na2CO3 10%의 200 μL를 첨가하고, 용액을 탈이온수로 2 mL까지 토핑하였다. 상기 용액은 암실에서 1시간 동안 반응하도록 허용하였으며, 용액의 흡광도는 UV-Vis 분광 광도계(Varian Cary 50 UVvis 분광 광도계, Agilent Technologies Inc., Sant Clara, USA)를 사용하여 760 nm에서 측정하였다. 총 폴리페놀 함량을 계산하기 위하여 갈릭산(GA)의 표준 검량선을 사용하였다.
총 플라보노이드 함량은 또한 Woisky와 Salatino의 변형된 방법을 사용하여 평가되었다. 본 연구에서는 다양한 농도(5-50 μg/mL)를 갖는 퀘르세틴의 메타놀성 용액을 기준으로 사용하였다.
기준용액 0.6 mL와 MA-DME 추출물 50 mg/mL를 2% AlCl3 0.6 mL로 혼합하였다. 혼합 용액은 상온에서 1시간 동안 배양하였으며, 배양 후 420 nm에서 UV-Vis 분광 광도계로 흡광도 측정을 수행하였다. 총 플라보노이드 함량의 측정은 퀘르세틴 표준 곡선으로 수행되었다.
(5). 세포 생존력 측정
마이크로파 처리 황칠 추출물(MA-DME), 블랙 추출물 및 투명 추출물이 세포 생존에 미치는 영향은 96-웰 플레이트 MTT 분석을 통해 평가되었다.
HaCaT 세포는 1 x 105개 세포의 밀도로 시딩하여 37°C에서 배양하고, 5% CO2 조건으로 24시간 동안 배양하였다. 그 후 다양한 농도의 MA-DME(0~300 μg/mL)를 24시간 또는 48시간 동안 처리하여 배양하였다.
각 웰에 EZ-cytox 용액 10μL를 첨가하고, 웰 플레이트를 4시간 동안 배양하였다. 마지막으로 플레이트 리더(Multi-label plate reader, PerkinElmer, Boston, MA, USA)를 이용하여 450 nm 파장에서의 흡광도 측정을 수행하였다.
(6). 세포내 활성산소종(ROS) 평가
디클로로-디히드로-플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA) 분석을 수행하여 세포 내 활성산소 종의 생성을 측정하였다. HaCaT(2.5 x 105 cells/mL) 씨딩 블랙 96-웰 플레이트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 0-300 μg/mL 농도로 테스트 화합물에 처리하여 24시간 및 48시간 동안 배양하였다.
DMSO에 희석된 10μM DCFH-DA를 암실에서 1시간 동안 염색하고, PBS 버퍼로 2회 세척하였다. 문헌에서 DCFH-DA는 내부 세포에 침투한 다음 에스테르에 의해 DCFH로 가수분해된다. 디피리다몰(Dipyridamole)은 상대 ROS 수준이 100%인 대조군으로 사용되었다. ROS 생성은 하기 수학식 2와 같은 공식으로 표현되었다.
상기 수학식 2에서, F는 MA-DME로 전처리된 세포의 형광 강도이고, F0는 디피리다몰의 형광 강도이다.
(7). ABTS 라디칼 조제 프로토콜
항산화 용량은 약간 변형된 최신 방법을 사용하여 ABTS 분석을 통해 측정되었다. 블랙 추출물과 MA-DME는 디메틸설폭사이드(DMSO)에 현탁되었으며, DMSO 단독으로는 음성 대조군으로 사용하였다.
L-아스코르브산(Vitamin C)과 퀘르세틴을 항산화 표준으로 사용하고, DMSO로 10 mg/mL로 희석하였다. 96-웰 플레이트에 테스트 화합물 50 μL/웰을 첨가한 후 각 웰에 ABTS 라디칼 150 μL를 첨가하였다.
그 후, 상온에서 734 nm에서 5, 15, 30분 동안 흡광도를 판독하였으며, 초기 흡광도는 0.7이었다(CLARIOstar Microplate Reader, BMG Labtech Inc., Cary, NC, USA). 시험 화합물의 라디칼 소거 활성은 하기 수학식 3의 공식을 사용하여 흡광도 억제(Ia, %)로 표현되었다.
상기 수학식 3에서, μExtract absorbance는 시험 화합물의 흡광도, μDMSO absorbance는 DMSO의 흡광도이다.
(8). 티로시나아제 억제 활성 분석
티로시나아제 억제 활성은 이전에 보고된 방법을 참조하여 측정되었다. L-DOPA는 이 분석에서 기질로 사용되었다. 40 μL의 10 mM L-DOPA를 96-웰 플레이트에서 80 μL의 인산염 완충액(0.1 M, pH 6.8)과 혼합하여 37°C에서 10분간 배양하였다.
MA-DME 또는 블랙 또는 투명 추출물(50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL) 40 μL와 버섯 티로시나아제(250 U/mL, PBS) 40 μL를 각각의 웰에 첨가하였다.
혼합물의 흡광도는 마이크로플레이트 판독기(Multi-label plate reader, PerkinElmer, Boston, MA, USA)를 사용하여 120분 동안 1분 간격으로 475nm에서 판독하였다. 블랭크 대조군으로 PBS를 사용하였고, 양성 대조군으로 코지산(50 μg/mL)과 L-아스코르브산(50 μg/mL)를 사용하였다. 각 효소 분석에 대한 억제는 하기 수학식 4와 같이 표현되었다.
상기 수학식 4에서, Control OD는 배양 시간 간의 대조군 흡광도의 차이를 나타내며, 시료(sample) OD는 배양 시간 간의 시료 흡광도의 차이를 나타낸다.
각 실험은 3회(n=3)로 수행되었으며 IC50 값은 GraphPad Prism 소프트웨어 버전 5.0(GraphPad 소프트웨어 Inc., San Diego, CA, USA)을 사용한 비선형 회귀 분석에 의한 선량-반응 곡선으로부터 계산되었다.
(9). 엘라스타아제 억제 효과 분석
엘라스타아제 억제 평가는 Tu 및 Tawata의 방법(Molecules 2015, 20, 16723-16740)을 참조하여 용액 색 분석의 강도로 수행하였다. N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-o-nitroanilide(AAAVN) 엘라스타아제 기질을 0.1232 M Tris-HCl 완충액(pH8)으로 희석하여 1.0 mM의 농도를 조제하였다. 그런 다음, 엘라스타아제 기재를 96-웰 플레이트 내에 10μL의 시료와 혼합하고, 25°C에서 10분 동안 사전 인큐베이팅하였다.
사전 배양(pre-incubatrion) 후, 반응은 트리스 용액 완충액에서 돼지 췌장(7.5 유니트/mL)의 엘라스타아제 10μL를 사전 배양 혼합물에 첨가함으로써 개시되었다. 마지막으로 마이크로플레이트 리더(Multiα label plate reader, Perkin Elmer, Boston, MA, USA)를 사용하여 410 nm에서 흡광도를 측정하였다.
2. 실험 결과
(1). MA-DME의 특성 분석
UHPLC-MS 크로마토그램은 황칠 추출물에서 33개의 주요 화합물을 식별하였다(도 2, 표 1 및 표 2). 하기 표 1 및 표 2에 열거된 바와 같이, 황칠 추출물은 1-O-카페오일퀴닌산(1-O-Caffeoylquinic acid), 4-O---카페오일퀴닌산(4-O-Caffeoylquinic acid), 코르코이오Corchoionoside,3,7,8,3,4’Pentahy roxyflavone과 같은 천연 항산화젤 로 알려진 많은 페놀 및 플라보노이드 화합물을 함유하고, 반면에 아포시노사이드 I(apocynoside I)는 노화를 유발하고 질병 저항성을 낮추는 CYP2C9를 억제하고, 비스쿰네오사이드 III(Viscumneoside III)은 피부 미백을 저해하는 티로시나제를 억제한다.
르세틴(Quercetin)은 자외선 조사 피부에서 콜라겐 분자의 불균형 또는 붕괴를 촉진하는 MMPα1을 억제하는 것으로 알려져 있다.
(2). 페놀 및 플라보노이드의 총 함량
놀의 총량은 수정된 Folin-Ciocalteu 방법을 통해 평가되었으며, 식물 추출물의 건조 중량(GAE μg-1 DW)당 갈릭산 당량으로 표현되었다. 시료 내 페놀 화합물의 정량화를 위한 검정곡선은 50 내지 500 μg/mL의 농도로 갈릭산을 사용하여 제조하였다. 검정곡선은 y = 0.02992 + 0.00112x (R2 = 0.9969)의 그래프로 형성하였다.
A-DME 내의 페놀 함량 및 플라보노이드의 함량 합계는 하기 표 3에서 보는 바와 같이, 페놀계 화합물은 MA-DME에서 313.03 GA μg-1 DW, 블랙 추출물 5%에서 252.25 GAE μg-1 DW, 투명 추출물 5%에서 30.57 GAE μg-1 DW의 함량으로 포함되어 있음을 알 수 있다.
또한, 황칠의 총 플라보노이드 농도는 수정된 Woisky 및 Salatino 방법에 의해 결정되었으며, 식물 추출물의 건조 중량(QE μg-1 DW) 당 퀘르세틴 당량으로 표시되었다. 검정곡선은 y = 0.005 + 0.0298x (R2 = 0.9841)의 그래프로 형성하였다.
측정 결과, 상기 표 3에서 보는 바와 같이, MA-DME에서는 플라보노이드가 32.37 QE μg-1 DW, 블랙 추출물 5%에서는 21.04 QE μg-1 DW, 투명 추출물 5%에서는 0 QE μg-1 DW로 함유되어 있음을 알 수 있다.
일반적으로 MA-DME 추출물은 블랙 및 투명 추출물에 비해 페놀과 플라보노이드의 함량이 매우 높은 것으로 나타났다. 종래의 가열 공정이 재료의 외부로부터 가열되어 뜨거운 외부 표면과의 접촉이 필요한 반면, 마이크로파 처리는 재료를 부피 방향으로 가열한다고 설명할 수 있다. 따라서 짧은 시간 내에 내부 변화가 일어나면 식물 세포 내부의 압력이 증가하게 되고, 이는 세포벽을 더 파괴하고 원하는 분자를 방출하게 된다.
(3). 세포 생존력 측정
MA-DME는 24시간 및 48시간 이후 모두 최대 100 μg/mL의 농도에서는 HaCaT 세포 생존율을 감소시키지 않았으나, 48시간 이후에는 200 μg/mL에서 생존율을 약간 감소시켰다(도 3a 및 도 3b).
이러한 결과는 다양한 농도(10~300 μg/mL)에서 MAμDME를 처리한 인간 각질세포 HaCaT 세포의 생존을 결정지었다. 투명 추출물은 저농도(μ200 μg/mL)에서 HaCaT 세포에 무독성이고, 고농도(300 μg/mL)에서는 무시할 수 있는 독성을 유발하였다.
(3). MA-DME가 활성산소에 미치는 영향(ROS)
ROS 측정은 투명 추출물이 단기 또는 장기 처리에서 ROS 라디칼을 생성하지 않는다는 것을 보여주었으며, 이는 이 추출물이 많은 양의 산화 방지 화합물을 포함하고 있다는 것을 설명할 수 있다.
블랙 추출물이 투명 추출물 및 MA-DME보다 약간 높은 독성을 보였지만, 60% 이상의 세포가 고농도(300 g/mL)에서 생존할 수 있기 때문에, HaCaT 세포에 대한 독성이 낮은 것으로 간주될 수 있다(도 4a 및 도 4b).
게다가, 이 추출물은 또한 소량의 ROS 라디칼을 생성하였고, 제어하기 위한 상대적인 DCF-형광의 증가를 초래하였다. 요약하자면, 블랙 추출물과 투명 추출물이 아닌 MA-DME가 화장품에 적용될 수 있다.
(5). ABTS 자유 라디칼 소거 활성
MA-DME 및 투명 추출물의 라디칼 소거 활성은 L-아스코르브산 및 퀘르세틴과 비교하여 ABTS 라디칼 소거 효율에 의해 측정되었다(도 5).
MA-DME 및 투명 추출물의 라디칼 소거 활성은 농도-의존 관계를 보여주었다. MA-DME는 L-아스코르브산 및 퀘르세틴보다 약간 낮은 ABTS 라디칼 소거 활성을 보였다. 반면, 투명 추출물의 라디칼 소거 활성은 MA-DME에 비해 매우 낮았으며, 투명 추출물은 약간의 농도 의존적 활성 증가만을 보였다.
가장 바깥쪽 피부 부분인 세포외 매트릭스(ECM)는 콜라겐과 엘라스틴을 포함한 섬유아세포와 단백질로 구성되어 있다. 콜라겐과 엘라스틴은 피부를 젊고 건강하게 유지하기 위하여 풍부한 피부와 탄력을 유지하는데 필수적이다. 광노화 인자에 노출되어 축적된 ROS는 콜라게나아제 및 엘라스테이스와 같은 피부 효소를 간접적으로 활성화시킬 수 있으며, 이는 기본적으로 각각 엘라스틴 뿐만 아니라 콜라겐을 분해하고 분해한다.
또한 외부 산화 공격 인자는 피부에 영향을 미치며, 세포 대사 동안 지속적으로 생성되는 ROS 및 기타 활성 라디칼의 내인성 생성에 대처해야 한다. 따라서, MA-DME의 높은 라디칼 소거 활성과 ROS 억제가 피부 노화를 방지하는 데 유용할 수 있다.
(6). 티로시나아제 억제 활성 분석
표피층에 멜라닌이 축적되면 원치 않는 멜라닌 생성 또는 피부 색소 침착을 유발할 수 있다. 멜라닌 생성은 티로시나아제 또는 다른 관련 효소의 활성을 억제함으로써 조절될 수 있다.
멜라닌 생성 효소 중 하나인 티로시나제는 멜라닌의 생성을 제어하는 속도 제한 효소(rate-limiting enzyme)이다. 따라서 티로시나아제 억제제를 사용하는 것은 흑색종(melanogenesis)을 억제하는 유망한 방법이다.
50~1000 μg/mL 농도에서 버섯 티로시나아제를 억제하는 MA-DME의 잠재력은 투명 추출물보다 높았다(도 6). 50, 100 μg/mL 농도에서 MA-DME는 미백제로 알려진 코지산(kojic acid)보다 더 좋은 티로시나아제 억제 효과(약 1.5배~3배)를 보였다. 따라서, MA-DME는 화장품 응용에 있어 유망한 미백 성분임을 알 수 있다.
(7). 엘라스타아제 억제 분석
엘라스틴은 특히 엘라스틴의 분해를 담당하며, 엘라스틴은 ECM에 존재하는 특히 중요한 단백질이다. 엘라스틴은 특유의 탄력적인 반동 특성으로 인해 피부에 탄력을 부여하기 위한 중요한 단백질이다. 항노화와 관련하여 엘라스타제 효소를 억제하는 것은 피부 노화와 피부 탄력의 상실을 방지하기 위하여 중요하다.
MA-DME가 엘라스타제 효과에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 다양한 농도의 시료 추출물을 사용한 처리에 대한 돼지 엘라스타제 활성을 측정하한 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 하기 표 4는 돼지 췌장 엘라스타아제 활성을 표적으로 하는 MA-DME의 억제 활성(%) (0.4 U/mL)을 나타낸 것이다.
상기 표 4에서는 상기 엘라스타제 저해율(elastase inhibition ratio)은 하기 수학식 5에 의해 구하였다.
상기 수학식 5에서, Absorbance of sample은 시료의 흡광도, Absorbance of sample은 대조군의 흡광도를 의미한다.
상기 표 4에서 보는 바와 같이, MA-DME는 특정 농도 범위에서 높은 엘라스타아제 억제 활성을 보였다. 또한, 고농도(100~400 μg/mL)에서의 MA-DME는 레티놀 및 아데노신의 효과에 비해 활성 엘라스타아제 억제 활성이 향상되었다.
따라서, MA-DME는 피부 탄력을 개선하고 피부 주름을 줄이는 데 잠재적인 역할을 할 수 있다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다.
따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
Claims (10)
- 마이크로파 처리된 황칠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물로서,
상기 마이크로파 처리는 800W의 마이크로파를 10분 동안 조사하고,
상기 마이크로파 처리된 황칠의 추출물은 50~100 μg/mL 농도에서, 황칠의 증류 추출에 의한 투명 추출물에 비하여 1.4~1.6배, 또한 코지산에 비하여 1.5~3배의 티로시나제 억제 활성을 가지는 미백용 화장료 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 마이크로파 처리된 황칠의 추출물은 비스쿰네오사이드 III(Viscumneoside III)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 황칠은 황칠나무의 수피, 목재, 잎, 꽃, 줄기, 열매, 가지 종자 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 미백용 화장료 조성물.
- 마이크로파 처리된 황칠의 추출물을 유효성분으로 포함하는 미백 개선용 식품 조성물로서,
상기 마이크로파 처리는 800W의 마이크로파를 10분 동안 조사하고,
상기 마이크로파 처리된 황칠의 추출물은 50~100 μg/mL 농도에서, 황칠의 증류 추출에 의한 투명 추출물에 비하여 1.4~1.6배, 또한 코지산에 비하여 1.5~3배의 티로시나제 억제 활성을 가지는 미백 개선용 식품 조성물.
- 삭제
- 제6항에 있어서, 상기 마이크로파 처리된 황칠의 추출물은 비스쿰네오사이드 III(Viscumneoside III)를 포함하는 것을 특징으로 하는 미백 개선용 식품 조성물.
- 삭제
- 제6항에 있어서, 상기 황칠은 황칠나무의 수피, 목재, 잎, 꽃, 줄기, 열매, 가지 종자 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 미백 개선용 식품 조성물.
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