KR20130058926A

KR20130058926A - 옥시레스베라트롤과 디오스신을 포함하는 피부미백용 조성물

Info

Publication number: KR20130058926A
Application number: KR1020110124929A
Authority: KR
Inventors: 김동선; 마진열; 춘 량; 노주환
Original assignee: 한국 한의학 연구원
Priority date: 2011-11-28
Filing date: 2011-11-28
Publication date: 2013-06-05
Also published as: KR101590965B1

Abstract

본 발명은 토복령 추출물로부터 유래된 옥시레스베라트롤(Oxyresveratrol)과 디오스신(Dioscin)을 포함하는 피부미백용 조성물, 상기 옥시레스베라트롤과 디오스신을 함유한 토복령 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 조성물, 옥시레스베라트롤(Oxyresveratrol)과 디오스신(Dioscin)을 포함하는 타이로시나제 활성 억제용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 피부미백용 기능성 화장품에 관한 것이다. 본 발명의 피부미백용 조성물은 피부미백효과를 나타내는 옥시레스베라트롤 및 상기 옥시레스베라트롤의 피부미백효과를 증폭시킬 수 있는 디오스신을 포함하여, 보다 향상된 피부미백효과를 나타낼 수 있으므로, 피부미백용 기능성 화장품의 개발 및 제조에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

옥시레스베라트롤과 디오스신을 포함하는 피부미백용 조성물{Composition for skin-whitening comprising oxyresveratrol and dioscin}

본 발명은 옥시레스베라트롤과 디오스신을 포함하는 피부미백용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 토복령 추출물로부터 유래된 옥시레스베라트롤(Oxyresveratrol)과 디오스신(Dioscin)을 포함하는 피부미백용 조성물, 상기 옥시레스베라트롤과 디오스신을 함유한 토복령 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 조성물, 옥시레스베라트롤(Oxyresveratrol)과 디오스신(Dioscin)을 포함하는 타이로시나제 활성 억제용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 피부미백용 기능성 화장품에 관한 것이다.

일반적으로 환경공해의 심화와 함께 자외선에 의한 피부손상 등으로 하얀피부에 대한 선호도가 높아지고 있고 투명 화장으로 보다 맑고 깨끗한 피부를 추구함에 따라 피부미백효과를 얻을 수 있는 방법에 대한 관심이 고조되고 있다. 인간의 피부 색깔은 환경, 인종, 성별 등의 영향을 받으나 일반적으로 갈색의 멜라닌의 함량에 의해 결정된다. 상기 멜라닌은 햇빛의 UV(자외선) 빛 에너지를 흡수하여 UV에 의한 손상으로 부터 더 깊숙이 있는 세포들을 보호하는 역할을 하는 표피에서 생성되는 검은 색소로서, 주로 멜라노사이트라는 세포에서 생성된다. 이러한 멜라닌은 체내에서 적정 수준으로 생성되어야 하는데, 예를 들어 자외선 등 각종 환경요인 및 피부노화 등에 의해 피부의 기저층에 존재하는 멜라닌이 과다생성되면 피부 색소 침착이 증가되어 기미(melasma), 주근깨(freckle), 검버섯(seborrheic keratosis) 등을 일으키는 부작용이 발생하고, 반대로 멜라닌이 비정상적으로 적게 생산되면 백반증과 같은 피부병변이 유발되고, 반대로 자외선 등에 의한 멜라닌의 과도한 합성은 피부에 손상을 줄 뿐만 아니라 기미, 주근깨를 형성하고 이와 같은 병변으로부터 나아가 피부암의 원인이 되기도 한다.

상술한 이유로, 외부자극 또는 내재적인 원인에 의한 멜라닌의 생성수준의 변화를 최소화 할 수 있는 방법을 다양한 각도에서 모색하고 있는데, 상기 멜라닌의 생성수준에 특별한 영향을 미치지 않도록 주로 천연물을 대상으로 하여 멜라닌의 생성수준의 변화를 최소화 할 수 있는 조성물을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.

예를 들어, 특허공개 제2004-0025293호에는 상지, 감초, 앵두, 매실, 백봉령, 목단피, 녹두, 율피 등의 종류액에 히아루론산, 비타민 E, 및 아로마 에센스 오일을 첨가한 조성물 및 이를 순면, 부직포, 스판레이스 또는 펄프에 흡수시켜 제조한 일회용 피부미백 및 보습 마스크 팩이 개시되어 있고, 특허등록 제2011-0088832호에는 레몬밤 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부미백 개선용 조성물이 개시되어 있으며, 특허등록 제863614호에는 시로미(Crowberry, Empetrum nigrum var. japonium K. Koch.)추출물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 조성물이 개시되어 있고, 특허등록 제863615호에는 프리프리오카 오일(priprioca oil)을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 조성물이 개시되어 있으며, 특허등록 제848800호에는 브라질리안 페퍼 오일(Brazilian pepper oil)을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 조성물이 개시되어 있고, 특허등록 제863616호에는 코파이바발삼 오일(copaiba balsam oil)을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 조성물이 개시되어 있다. 그러나, 이들 천연물로부터 유래된 조성물에는 피부미백효과를 나타내는 유효성분 이외에도 다른 다양한 성분이 포함되어 있어, 상기 유효성분의 피부미백 효과를 희석시키거나 심지어는 감소시킬 수도 있으므로, 이러한 천연물로부터 유래된 피부미백효과를 나타내는 유효성분을 규명하려는 노력이 계속되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과가 보고되지 않고 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 종래에 피부미백효과를 나타낸다고 알려진 천연물의 일종인 토복령의 추출물로부터 피부미백효과를 나타낼 수 있는 유효성분인 옥시레스베라트롤(Oxyresveratrol)을 규명하였고, 상기 토복령의 추출물에 함께 포함된 디오스신(Dioscin)은 그 자체로는 피부미백효과를 나타내지 않지만 상기 옥시레스베라트롤의 피부미백효과를 증폭시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 옥시레스베라트롤과 디오스신을 포함하는 피부미백용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 옥시레스베라트롤과 디오스신을 함유한 토복령 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 옥시레스베라트롤과 디오스신을 포함하는 타이로시나제 활성 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 피부미백용 화장품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태로서, 본 발명은 옥시레스베라트롤과 디오스신을 포함하는 피부미백용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "옥시레스베라트롤(Oxyresveratrol)"이란, 2,3',4,5'-tetrahydroxystilbene, 4-[(1E)-2-(3,5-dihydroxyphenyl)ethenyl]-1,3-Benzenediol, (E)-2,3',4,5'-Stilbenetetrol, trans-Stilbene-2,4,3',5'-tetrol 등으로 표기되는 화합물로서 C₁₄H₁₂O₄의 화학식을 갖고, 상온에서 노란색 고형분으로 존재하는 화합물을 의미한다. 상기 옥시레스베라트롤은 천연물 중에서 뽕나무의 근피인 상백피, 산뽕나무의 심재 등에 존재하고, 티로시나제(tyrosinase)의 도파 옥시다제(dopa oxidase) 활성의 억제제로서 사용된다. 본 발명의 목적상 상기 옥시레스베라트롤은 토복령의 추출물 또는 그의 분획물로부터 유래되고, 피부미백효과를 나타내는 직접적인 유효성분으로서 사용되며, 상기 효과는 디오스신에 의하여 배가될 수 있지만, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "디오스신(Dioscin)"이란 C₄₅H₇₂O₁₆의 화학식, 869.06의 분자량, 288℃의 녹는점 및 [α]D-115˚의 비광선도를 가지는 스테로이드사포닌 화합물의 일종으로서, 아글리콘의 디오스게닌에 소분자의 포도당과 2분자의 람노오스가 결합한 구조를 갖는 화합물을 의미하는데, 천연물 중에서 마과식물 왕마(Dioscorea tokoro MAKINO)의 뿌리에 존재하고, 에탄올에는 용해되지만, 아세톤에는 용해되지 않으며, 유독성, 최토성 및 용혈성을 갖는다. 본 발명의 목적상 상기 디오스신은 토복령의 추출물 또는 그의 분획물로부터 유래되고, 그 자체로는 피부미백 효과를 나타내지 않지만, 옥시레스베라트롤의 피부미백 효과를 배가시키는 효과를 나타내지만, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "피부미백"이란 멜라닌 등의 색소의 과다로 인하여 명도가 감소된 피부의 명도를 증가시키거나 또는 피부의 명도를 일정 수준으로 유지하는 방법, 상기 방법으로 형성된 명도가 증가된 피부 등을 포괄하여 의미하는데, 상기 피부미백을 수행하는 실질적인 수단으로는 높은 명도를 가지는 화장료 조성물을 사용한 피부 마스킹 방법, 멜라닌 색소가 과다한 피부를 제거하는 피부박피술, 피부의 멜라닌 합성을 억제하는 화학적 방법 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 피부미백은 옥시레스베라트롤과 디오스신의 조합에 의하여 피부에서 형성되는 멜라닌의 합성을 억제하는 수단에 의하여 수행되지만, 특별히 이에 제한되지는 않고, 이때, 사용되는 옥시레스베라트롤과 디오스신의 함량 역시 특별히 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 토복령의 추출물로부터 타이로시나제 억제활성을 나타내는 분획물을 추적하여, 상기 토복령의 추출물에 포함된 타이로시나제 억제활성을 나타내는 유효성분이 옥시레스베라트롤 및 디오스신임을 규명하였고(실시예 1), 상기 옥시레스베라트롤 및 디오스신을 개별적으로 또는 조합하여 타이로시나제의 억제활성을 측정한 결과, 단일 성분 중에서는 옥시레스베라트롤이 상대적으로 우수한 타이로시나제 억제활성을 나타내었고, 디오스신은 별다른 타이로시나제 억제활성을 나타내지 않았지만, 전체적으로 볼 때, 옥시레스베라트롤과 디오스신의 혼합물이 가장 우수한 타이로시나제 억제활성을 나타내었고, 상기 혼합물의 타이로시나제 억제활성 수준은 옥시레스베라트롤 및 디오스신 각각의 타이로시나제 억제활성 수준을 합산한 것보다도 더욱 높은 수준을 나타냄을 알 수 있었다(표 1 및 2). 따라서, 토복령 추출물 또는 그의 분획물로부터 유래된 옥시레스베라트롤은 타이로시나제 억제활성을 나타내고, 이러한 옥시레스베라트롤의 타이로시나제 억제활성은 디오스신에 의하여 증폭되므로, 상기 옥시레스베라트롤과 디오스신은 피부미백용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 다른 실시양태로서, 본 발명은 옥시레스베라트롤과 디오스신을 함유한 토복령 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "토복령(土茯笭, Smilax)"이란 백합과에 속하는 덩굴 낙엽관목의 일종인 청미래덩굴의 뿌리부분을 의미하는데, 소나무뿌리에서 기생하는 복령과 형태가 유사하다고 하여 토복령이라 불리며, 그 외에도 산귀래, 선유향 등으로 호칭될 수 있다. 한방에서는 항균작용, 소염작용, 해독작용 등을 나타내고, 독성이 없어 구황작물로도 사용될 수 있을 정도로 안전한 약제로서 사용되어 왔다. 본 발명의 목적상 상기 토복령은 피부미백효과를 나타내는 옥시레스베라트롤과 디오스신을 포함하는 천연물로서 사용되고, 이의 추출물 또는 그의 분획물을 피부미백용 조성물의 유효성분으로서 사용할 수 있다.

본 발명의 용어 "토복령 추출물"이란 상기 토복령을 추출하여 수득한 추출물을 의미하는데, 본 발명의 목적상, 토복령 추출물은 토복령 또는 그의 분쇄물을 물, 탄소수 1 내지 6의 알콜(메탄올, 에탄올, 부탄올 등) 또는 이들의 혼합 용매 등으로 추출하여 수득한 결과물이 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않고, 상기 결과물은 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물 등을 모두 포함한다.

본 발명의 용어 "분획물"이란 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다. 본 발명에서는 바람직하게는 토복령의 추출물을 n-헥산, 에탄올 등의 용매를 이용한 용매분획방법으로 분획한 결과물일 수 있으며, 극성 용매 분획물과 비극성 용매 분획물을 모두 포함하며, 구체적으로는 헥산 분획물, 에탄올 분획물 및 물 분획물 등이 모두 사용될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 옥시레스베라트롤과 디오스신을 포함하는 타이로시나제 활성 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "타이로시나제"란, 약 0.2%의 구리를 함유하는 페놀옥시다아제의 일종으로서, 티로신을 산소가 존재하는 곳에서 히드록시화하여 dihydroxyphenylalanine(DOPA)을 형성하고, 추가로 산화되어 도파퀴논을 형성하는 효소를 의미한다. 상기 타이로시나제에 의한 도파퀴논의 형성은 멜라닌 합성의 첫 번째 단계이고, 상기 효소가 결손되면 백자증이 유발된다. 본 발명의 목적상 상기 타이로시나제는 토복령 추출물 또는 그의 분획물로부터 유래된 옥시레스베라트롤과 디오스신에 의하여 직접적으로 활성이 억제되는 대상물로서 사용되나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 또 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 피부미백용 기능성 화장품을 제공한다.

본 발명의 용어 "기능성 화장품(cosmedical, cosmeceutical)"이란 화장품에 의약품의 전문적인 치료기능이 도입되어, 일반 화장품과 달리 생리활성적인 효능, 효과가 강조된 전문적인 기능성을 갖는 제품으로서, 피부의 미백에 도움을 주는 제품, 피부 주름개선에 도움을 주는 제품, 피부를 곱게 태우거나 자외선으로부터 피부를 보호하는데 도움을 주는 제품 중에서 보건복지부령이 정하는 화장품을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 기능성 화장품은 다양한 기능성 화장품 중에서 피부의 미백에 도움을 주는 제품을 의미하고, 바람직하게는 토복령의 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 기능성 화장품이 될 수 있으며, 보다 바람직하게는 토복령 추출물 또는 그의 분획물로부터 유래된 옥시레스베라트롤과 디오스신을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 기능성 화장품이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않고, 상기 피부미백용 기능성 화장품에 포함되는 토복령 추출물, 그의 분획물, 옥시레스베라트롤 또는 디오스신의 함량역시 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 피부미백용 기능성 화장품은 옥시레스베라트롤과 디오스신을 유효성분으로 포함하고, 통상적으로 사용되는 화장료를 추가로 함유할 수 있는데, 예를 들면 수용성 스킨제제화를 위하여 글리세롤, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 솔비톨, 폴리에틸렌글리콜, 카르복시비닐 폴리머, 잔탄검, 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 하이드록시메틸셀룰로오스, 로커스트빈검, 알란토인, 카라기난 등을 첨가할 수 있으며; 점도와 경도조절제로 밀납, 파라핀 왁스, 스테아릴알콜, 카르나우바 왁스, 칸데릴라 왁스 및 칼슘스테아레이트, 알루미늄스테아레이트, 아연스테아레이트, 위치하젤(witchhazel) 등을 사용할 수 있고; 자외선 흡수제로 부틸메톡시디벤조일메탄, 옥틸메톡시신나메이트 등을 사용할 수 있으며; 안료로는 이산화티탄, 미립자 이산화디탄, 카올린, 나이론 파우다, 탈크, 세리사이트, 마이카, 폴리메틸메타크릴레이트 등의 체질 안료와 황색산화철, 흑색산화철, 적색산화철, 울트라마린, 산화크롬, 수산화크롬 등의 착색안료를 사용할 수 있고; 보습제로 1,3-부틸렌글리콜, 농글리세린, 에틸렌글리콜 등과 키틴, 키토산, 히아론산, 하이알루로닌산, 젖산, 글리콜산 등의 천연보습 물질들을 이용할 수 있으며; 방부제로 파라옥시안식향산 에스테르류, 이미다졸리디닐우레아 등을 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 상기한 성분들을 제품특성에 따라 1종 또는 2종이상 혼용 배합할 수도 있다.

본 발명의 기능성 화장품은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

한편, 본 발명의 옥시레스베라트롤 및 디오스신은 종래에 한약재로 사용되어온 토복령으로부터 유래된 것으로서, 상기 토복령은 독성 및 부작용이 거의 없이 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있으므로, 상기 토복령으로부터 유래된 옥시레스베라트롤 및 디오스신 뿐만 아니라, 상기 옥시레스베라트롤 및 디오스신을 포함하는 조성물 역시 안전하게 적용할 수 있다.

본 발명의 피부미백용 조성물은 피부미백효과를 나타내는 옥시레스베라트롤 및 상기 옥시레스베라트롤의 피부미백효과를 증폭시킬 수 있는 디오스신을 포함하여, 보다 향상된 피부미백효과를 나타낼 수 있으므로, 피부미백용 기능성 화장품의 개발 및 제조에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 피부미백용 조성물의 유효성분인 디오스신의 화학적 구조를 나태는 구조식이다.
도 2는 본 발명의 피부미백용 조성물의 유효성분인 옥시레스베라트롤의 화학적 구조를 나태는 구조식이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 토복령 추출물 유래의 미백활성성분의 규명

먼저, 음건하고, 세절한 토복령 2Kg을 10L의 메탄올에 하룻밤 동안 침지하면서 추출하는 과정을 3회 반복하여 액상성분을 수득하고, 상기 수득한 액상성분을 농축 및 동결건조시켜서 166g의 토복령 메탄올 추출물을 수득하였다. 상기 수득한 토복령 메탄올 추출물을 160g을 헥산(n-hexane)과 증류수를 1:1(v/v)로 포함하는 혼합용매에 용해시키고, 분별추출하여 헥산층과 증류수층을 각각 수득하였다. 이어, 상기 수득한 헥산층을 농축 및 동결건조시켜서 토복령 헥산추출물 1g을 수득하였다. 또한, 상기 수득한 증류수층에 동일부피의 에탄올을 가하여 혼합한 다음, 분별추출하여 에탄올층과 증류수층을 각각 수득하였고, 상기 수득한 에탄올층과 증류수층을 각각 농축 및 동결건조시켜서 토복령 에탄올 추출물 15g과 토복령 증류수 추출물 142g을 각각 수득하였다.

다음으로, 상기 수득한 토복령의 헥산 추출물, 에탄올 추출물 및 증류수 추출물의 타이로시나제 억제활성을 측정하고 비교하였다. 구체적으로, 상기 각 추출물을 50% DMSO에 용해시켜서 각각의 시료액을 수득하고, 상기 시료액 20㎕과 0.1M 인산염완충액(pH 6.5) 220㎕을 혼합한 다음, 머시룸 유래의 타이로시나제(1500U/mL) 20㎕를 가하였다. 이어, 상기 혼합물에 1.5mM 타이로신 수용액 40㎕를 가하여 37℃에서 10분 동안 반응시키고, 반응이 종료된 반응액을 대상으로 하여 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 대조군으로는 시료액 대신에 0.1M 인산염완충액(pH 6.5)을 포함하는 반응액을 사용하였고, 검정은 96웰 팔콘3097의 바닥이 평평한 마이크로타이터 플레이트(Beckton Dickinson, NJ)에서 수행하였다. 상기 측정된 값을 하기의 식에 대입하여 타이로시나아제 억제활성 수준을 산출하였다.

(대조군 흡광도 - 시료액의 흡광도) / 대조군 흡광도 X 100

그 결과, 에탄올 추출물이 가장 우수한 타이로시나제 억제활성을 나타냄을 확인하였다.

상기 가장 우수한 타이로시나제 억제활성을 나타낸 토복령의 에탄올 추출물을 시료로 사용하고, CH₂Cl₂:MeOH = 50:1의 비율로 시작해서 단계적으로 극성을 향상시킨 농도구배 용매를 사용한 silica gel column chromatography를 실시하여 4개의 활성분획(fraction 1(0.1g), fraction 2(1.1g), fraction 3(0.2g) 및 fraction 4(0.3 g))을 수득하고, 이들의 타이로나아제 억제활성을 측정 및 비교하여, 가장 우수한 타이로나아제 억제활성을 나타내는 fraction 2를 선발하였다. 상기 선발된 fraction 2를 시료로 사용하여 다시 silica gel column chromatography를 실시하여, 타이로나아제 억제활성을 나타내는 두개의 화합물을 분리하였다.

상기 분리된 두개의 화합물을 대상으로 하여 NMR 분석을 수행하였으며, 그 결과는 다음과 같다:

화합물 1: White powder; ¹H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz)δ5.31 (1H, brd, J = 4.5 Hz, H-6) 0.84 (3H, s, H-18), 1.06 (3H, s, H-19), 1.15 (3H, d, J = 6.8 Hz, H-21), 0.70(3H, d, J=5.0Hz, H-27), 4.96 (1H, d, J = 8.6 Hz, H-1'Glu), 5.86, (1H, brs, H-1"Rha), 1.64 (3H, d, J = 6.2 Hz, H-6"Rha), 6.41 (1H, brs, H-1'"Rha) , 1.77 (3H, d, J = 6.1 Hz, H-6'"Rha) 13C-NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ 37.5 (C-1), 30.2 (C-2), 78.0 (C-3), 39.0 (C-4), 140.8 (C-5), 121.8 (C-6), 32.2 (C-7), 31.7 (C-8), 50.3 (C-9), 37.2 (C-10), 21.1 (C-11), 39.9 (C-12), 40.5 (C-13), 56.6 (C-14), 32.3 (C-15), 81.1 (C-16), 62.8 (C-17), 16.4 (C-18), 19.4 (C-19), 42.0 (C-20), 15.1 (C-21), 109.3 (C-22), 31.8 (C-23), 29.3 (C-24), 30.6 (C-25), 66.9 (C-26), 17.3 (C-27), 100.3 (C-1'), 78.6 (C-2'), 77.0 (C-3'), 78.1 (C-4'), 77.8 (C-5'), 61.3 (C-6'), 102.0 (C-1"), 72.6 (C-2"), 72.6 (C-3"), 74.1 (C-4"), 70.4 (C-5"), 18.5 (C-6"), 102.9(C-1'"), 72.8 (C-2'"), 72.9 (C-3'"), 73.9 (C-4'"), 69.5 (C-5'"), 18.7 (C-6'").

화합물 2: Yellow powder; ¹H-NMR (CD3OD, 400 MHz) δ 6.45 (2H, d, J= 2.2 Hz,H-2, 6), 6.14 (1H, d, J= 2.2 Hz, H-4), 6.81 (1H, d, J= 16.4 Hz, H-a), 7.27(1H, d, J= 16.4 Hz, H-b), 6.32 (1H, d, J= 2.6 Hz, H-3'), 6.32 (1H, dd,J= 2.6, 9.2 Hz, H-5'), 7.32 (1H, d, J= 9.2 Hz, H-6'). 13C-NMR (CD3OD,100 MHz) δ142.2 (C-1), 105.7 (C-2, 6), 159.6 (C3, 5), 103.6(C-4), 124.8 (C-a), 126.5 (C-b), 117.9 (C-1'), 159.2 (C-2'),102.3 (C-3'), 157.3 (C-4'), 108.4 (C-5'), 128.4 (C-6').

상기 NMR 분석결과로부터 상기 화합물 1은 Dioscin임을 확인할 수 있었고(도 1), 상기 화합물 2는 Oxyresveratrol임을 확인할 수 있었다(도 2).

실시예 2: 옥시레스베라트롤과 디오스신의 타이로시나제 억제활성

상기 실시예 1에서 확인된 토복령 추출물의 유효성분인 옥시레스베라트롤과 디오스신을 개별적으로 또는 혼합하여 타이로시나제에 대한 억제활성을 측정하였다. 구체적으로, 시료액으로서 옥시레스베라트롤, 디오스신 또는 옥시베라트롤과 디오스신의 혼합물(1:1, w/w)을 50% DMSO에 다양한 농도(50, 10, 5 또는 2㎍/㎖)로 용해시킨 용액을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법을 수행하여 타이로시나제 억제활성을 측정하였다(표 1). 이때, 대조군으로는 타이로시나제 억제활성을 나타낸다고 알려진 코진산(Kojic acid)을 처리한 실험군을 사용하였다.

옥시레스베라트롤과 디오스신의 타이로시나제 억제활성(단위: %)

시료	시료액의 농도(㎍/㎖)
시료	50	10	5	2
Cojic acid Oxyresveratrol Dioscin Oxyresveratrol+Dioscin	5.4 97.4 7.6 97.8	10.7 64.2 3.2 91.6	9.2 26.9 1.3 47.1	4.5 14.6 2.1 25.7

상기 표 1에서 보듯이, 단일 성분 중에서는 옥시레스베라트롤이 상대적으로 우수한 타이로시나제 억제활성을 나타내었고, 디오스신은 별다른 타이로시나제 억제활성을 나타내지 않았지만, 전체적으로 볼 때, 옥시레스베라트롤과 디오스신의 혼합물이 가장 우수한 타이로시나제 억제활성을 나타내었고, 상기 혼합물의 타이로시나제 억제활성 수준은 옥시레스베라트롤 및 디오스신 각각의 타이로시나제 억제활성 수준을 합산한 것보다도 더욱 높은 수준을 나타냄을 알 수 있었다.

아울러, 시료액의 과량으로(50㎍/㎖) 처리한 경우에는 상기 혼합물과 옥시레스베라트롤의 타이로시나제 억제활성 수준이 차이가 없었으나, 이는 상기 방법으로 측정할 수 있는 타이로시나제 억제활성 수준의 상한값인 것으로 분석되었다.

실시예 3: DOPA 를 이용한 타이로시나제 억제활성의 측정

시료액으로서 옥시레스베라트롤, 디오스신 또는 옥시베라트롤과 디오스신의 혼합물(1:1, w/w)을 50% DMSO에 다양한 농도(10, 4, 2 또는 1㎍/㎖)로 용해시킨 용액을 사용하고, 상기 시료액 40㎕, 0.1M 인산염 완충액(pH6.8) 60㎕ 및 5mM L-DOPA 기질 100㎍을 혼합하여 200㎕의 혼합용액을 수득하고, 상기 혼합용액에 200 units의 티로시나제를 가하여 37℃에서 10 분간 반응시킨 후, 신속하게 얼음에서 5분간 방치하여 반응을 중단시켰다. 반응이 종료된 반응액을 대상으로 하여 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 대조군으로는 시료액 대신에 0.1M 인산염완충액(pH 6.5)을 포함하는 반응액을 사용하였고, 상기 측정된 흡광도 값을 실시예 1에서 사용한 수식에 대입하여 타이로시나아제 억제활성 수준을 산출하였다(표 2).

시료	시료액의 농도(㎍/㎖)
시료	10	4	2	1
Oxyresveratrol Dioscin Oxyresveratrol+Dioscin	46.4 2.7 69.6	28.3 2.5 45.9	17.5 3.4 29.2	3.6 2.1 11.0

상기 표 2에서 보듯이, 상기 표 1의 결과와 동일한 결과를 얻을 수 있었다. 구체적으로, 단일 성분 중에서는 옥시레스베라트롤이 상대적으로 우수한 타이로시나제 억제활성을 나타내었고, 디오스신은 별다른 타이로시나제 억제활성을 나타내지 않았지만, 전체적으로 볼 때, 옥시레스베라트롤과 디오스신의 혼합물이 가장 우수한 타이로시나제 억제활성을 나타내었고, 상기 혼합물의 타이로시나제 억제활성 수준은 옥시레스베라트롤 및 디오스신 각각의 타이로시나제 억제활성 수준을 합산한 것보다도 더욱 높은 수준을 나타냄을 알 수 있었다.

따라서, 토복령 추출물 또는 그의 분획물로부터 유래된 옥시레스베라트롤은 타이로시나제 억제활성을 나타내고, 이러한 옥시레스베라트롤의 타이로시나제 억제활성은 디오스신에 의하여 증폭되므로, 상기 옥시레스베라트롤과 디오스신은 피부미백용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

Claims

옥시레스베라트롤과 디오스신을 포함하는 피부미백용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 옥시레스베라트롤과 디오스신은 토복령 추출물 또는 그의 분획물로부터 유래되는 것인 조성물.
옥시레스베라트롤과 디오스신을 함유한 토복령 추출물 또는 그의 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부미백용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 토복령 추출물은 토복령 또는 그의 분쇄물을 물, 탄소수 1 내지 6의 알콜 또는 이들의 혼합 용매로 추출하여 수득하는 것인 조성물.
제3항에 있어서,
상기 분획물은 상기 토복령 추출물을 헥산, 에탄올 또는 물로 분획하여 수득한 것인 조성물.
옥시레스베라트롤과 디오스신을 포함하는 타이로시나제 활성 억제용 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 피부미백용 기능성 화장품.
제7항에 있어서,
화장료를 추가로 포함하는 것인 피부미백용 기능성 화장품.
제7항에 있어서,
용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성되는 군으로부터 선택되는 제형으로 제조되는 것인 피부미백용 기능성 화장품.