본 발명은 청미래덩굴의 생약추출물을 함유하는 천연추출 피부 미백용 조성물에 관한 것으로, 그 하나의 실시예로서 화장료로서의 미백효과 및 피부 개선효과가 있는 생약 조성물을 제공하는 것을 기술사상으로 하고 있다.
이하, 본 발명의 기술분야에 속한 통상의 지식을 가진 (이하 '당업자'라고 칭함)가 용이하게 실시 가능하도록, 실시예를 포함하여 상세하게 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 상술(詳述)한다.
본 발명자들은 피부색소 침착과 노화를 방지하는 물질을 발견하기 위하여, 여러 종의 식물을 대상으로 연구한 결과, 청미래덩굴 뿌리가 디오신(dioscine), 사포닌, 알칼로이드 성분이 함유되므로 미백작용이 우수함을 확인하고, 이를 토대로 본 발명을 완성하게 되었다.
청미래덩굴은 토복령(Smilax china L.)의 근경(뿌리)을 지칭하는 생약이다. 동아시아 지역에서 분포하며, 국내에서는 황해도 이남의 산기슭 양지에 생장하는 덩굴성 낙엽 관목으로, 물성이 딱딱하고 외부는 검은색이며 내부는 하얀색이다. 길이 3m, 뿌리는 굵고 꾸불꾸불 옆으로 뻗으며, 줄기에 갈고리 같은 가시가 있다. 잎은 호생하며 광택이 나고, 길이 3∼12 ㎝, 폭 2∼10 ㎝이고, 형태는 두껍고 둥글거나 넓은 타원형이고, 끝이 뾰족하고, 밑은 둥글거나 심장형이고, 가장자리는 밋밋하고, 5∼7개의 맥, 그물맥이 있다. 꽃은 암수 딴그루, 황록색, 잎겨드랑이에 산형화서로 달리고, 화축의 길이는 1.5∼3 ㎝, 꽃자루는 1 ㎝의 길이를 지닌다. 화피는 6장으로, 긴 타원형이며 뒤로 말리는 형태를 이룬다. 자방은 긴 타원형으로서, 3실이며, 뒤로 말리는 형태를 이룬다. 열매는 장과, 둥근 모양, 붉은 색이고, 종자는 5개이며 황갈색이다.
청미래덩굴의 뿌리는 편압되고 고르지 않은 원주형 내지 덩어리형으로 때때로 결절상으로 갈라졌고, 길이 5∼15 ㎝, 지름 2∼5 ㎝이며, 바깥면은 회색을 띤 황갈색이고 윗면에는 군데군데 줄기의 잔기가 돌출되어 있고, 냄새와 맛이 거의 없으며, 디오신(dioscine), 사포닌, 알칼로이드 성분이 함유되어 있다. 상기와 같은 성분이 함유된 청미래 덩굴의 근경을 중국에서는 발계, 한국에서는 토복령이라고 하며 물을 넣고 달인 액을 관절동통, 근육마비, 설사, 이질, 수종, 임병, 나력, 종독, 치창을 치료하는데 사용한다.
본 발명에서는 상기와 같은 청미래덩굴의 뿌리가 용매에 의해 추출됨으로써, 디오신(dioscine), 사포닌, 알칼로이드 성분이 함유된 청미래덩굴 뿌리 추출물이 형성되는 것이다.
이러한 청미래덩굴 뿌리 추출물은 청미래덩굴 뿌리와 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 및 디에틸에테르로 이루어진 군으로부터 단독으로 선택되는 용매 또는 2종 이상 혼합되는 혼합용매를 혼합하여, 상기 청미래덩굴 뿌리의 유효성분을 효과적으로 추출함으로써 청미래덩굴 뿌리 용매추출액을 형성할 수 있다.
상기와 같은 청미래덩굴 뿌리 용매추출액을 그대로 사용하여 청미래덩굴 추출물 함유 피부 미백용 화장료 조성물을 구성할 수 있으나, 피부 미백용 화장료 조성물을 정량적으로 용이하게 구성하려면 고체 상태인 청미래덩굴 추출물을 사용하는 것이 바람직하다. 이에 따라, 본 발명에서는 청미래덩굴 뿌리 용매추출액으로부터, 감압농축이나 감압증발과 같은 기 공지된 용매 휘발 방법에 의해 용매를 휘발시켜서 분리함으로써 고체 상태, 바람직하게는 분말 상태인 청미래덩굴 추출물을 구성한다.
즉, 청미래덩굴 뿌리의 유효성분이 용매에 의해 추출되고 고/액 분리된 상등액인 청미래덩굴 뿌리 용매추출액이 형성되고, 상기 청미래덩굴 뿌리 용매추출액으로부터 감압농축이나 감압증발과 같은 기 공지된 용매 휘발 방법에 의해 용매가 휘발되어 분말 상태인 청미래덩굴 추출물이 구성되는 것이다.
청미래덩굴 뿌리 용매추출액을 구성하기 위한 청미래덩굴 뿌리와 용매의 추출용 혼합물은, 상기 청미래덩굴 뿌리가 건조중량 기준으로 100 중량부, 용매 100∼1,500 중량부가 혼합되어 이루어진다. 추출용 혼합물을 형성하도록 청미래덩굴 뿌리 건조중량 기준으로 100 중량부에 혼합되는 용매의 양이 100 중량부 미만이면 상기 청미래덩굴 뿌리의 유효성분이 충분하게 추출되지 않으며, 추출용 혼합물을 형성하도록 청미래덩굴 뿌리의 건조중량 기준으로 100 중량부에 혼합되는 용매의 양이 1,500 중량부를 초과하면 상기 용매의 과다 사용에 따른 청미래덩굴 뿌리 용매추출액의 용매 제거비용 증가 등의 이유로 인하여 화장료 조성물의 제조원가가 상승하게 된다.
구체적인 예를 들면, 청미래덩굴 뿌리, 또는 청미래덩굴 뿌리가 건조되고 분쇄되어 형성된 청미래덩굴 뿌리 건조분말과 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 및 디에틸에테르로 이루어진 군으로부터 단독으로 선택되는 용매 또는 2종 이상 혼합되는 혼합용매가 혼합되어 추출용 혼합물이 형성되고, 싱기 추출용 혼합물이 15∼40 ℃로 1∼15 일간 유지되어 청미래덩굴 뿌리가 용매추출된 추출 조성물이 형성되고, 상기 추출 조성물이 고/액 분리되어 액상 성분인 청미래덩굴 뿌리 용매추출액이 수득될 수 있다.
청미래덩굴 뿌리 용매추출액을 형성하기 위하여 청미래덩굴 뿌리 또는 청미래덩굴 뿌리 건조분말과 용매의 혼합물이 유지되는 온도가 15 ℃ 미만이면 상기 청미래덩굴 뿌리 또는 청미래덩굴 뿌리 건조분말의 유효성분이 제대로 추출되지 않으며, 청미래덩굴 뿌리 또는 청미래덩굴 뿌리 건조분말와이 용매의 혼합물이 유지되는 온도가 40 ℃를 초과하면 상기 유지 과정에서 청미래덩굴 뿌리 용매추출액이 변질되는 현상이 발생할 수 있다. 또한, 청미래덩굴 뿌리 용매추출액을 형성하기 위하여 청미래덩굴 뿌리 또는 청미래덩굴 뿌리 건조분말과 용매의 혼합물이 유지되는 시간이 1 일 미만이면 상기 청미래덩굴 뿌리 또는 청미래덩굴 뿌리 건조분말의 유효성분이 충분하게 추출되지 않으며, 청미래덩굴 뿌리 또는 청미래덩굴 뿌리 건조분말과 용매의 혼합물이 유지되는 시간이 15 일을 초과하면 상기 청미래덩굴 뿌리 또는 청미래덩굴 뿌리 건조분말의 유효성분이 더 이상 추출되지 않는다.
별도의 예를 들면, 청미래덩굴 뿌리, 또는 청미래덩굴 뿌리가 건조되고 분쇄되어 형성된 청미래덩굴 뿌리 건조분말과 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 및 디에틸에테르로 이루어진 군으로부터 단독으로 선택되는 용매 또는 2종 이상 혼합되는 혼합용매가 혼합되어 추출용 혼합물이 형성되고, 상기 추출용 혼합물이 50∼80 ℃로 1∼24 시간동안 용매추출되어 추출 조성물이 형성되고, 상기 추출 조성물이 고/액 분리되어 액상 성분인 청미래덩굴 뿌리 용매추출액이 수득될 수 있다.
청미래덩굴 뿌리 용매추출액을 형성하기 위하여 청미래덩굴 뿌리 또는 청미래덩굴 뿌리 건조분말을 용매추출하는 온도가 50 ℃ 미만이면 상기 청미래덩굴 뿌리 또는 청미래덩굴 뿌리 건조분말의 유효성분이 제대로 추출되지 않으며, 청미래덩굴 뿌리 또는 청미래덩굴 뿌리 건조분말을 용매추출하는 온도가 80 ℃를 초과하면 상기 청미래덩굴 뿌리 또는 청미래덩굴 뿌리 건조분말의 유효성분이 변성될 수 있다. 또한, 청미래덩굴 뿌리 용매추출액을 형성하기 위하여 청미래덩굴 뿌리 또는 청미래덩굴 뿌리 건조분말을 용매추출하는 시간이 1 시간 미만이면 상기 청미래덩굴 뿌리 또는 청미래덩굴 뿌리 건조분말의 유효성분이 충분하게 추출되지 않으며, 청미래덩굴 뿌리 또는 청미래덩굴 뿌리 건조분말을 용매추출하는 시간이 24 시간을 초과하면 상기 청미래덩굴 뿌리 또는 청미래덩굴 뿌리 건조분말의 유효성분이 더 이상 추출되지 않는다.
그리고, 상기와 같은 청미래덩굴 뿌리 용매추출액을 4∼15 ℃에서 1∼7 일간 숙성시키는 것이, 상기 청미래덩굴 뿌리 용매추출액의 유효성분이 포함된 피부 미백용 화장료 조성물의 피부에 대한 친화력을 향상시키는 측면에서 바람직하다. 청미래덩굴 뿌리 용매추출액을 숙성시키는 온도가 4 ℃ 미만이면 상기 청미래덩굴 뿌리 용매추출액이 제대로 숙성되지 않으며, 청미래덩굴 뿌리 용매추출액을 숙성시키는 온도가 15 ℃를 초과하면 상기 청미래덩굴 뿌리 용매추출액이 숙성 과정에서 변성되는 문제가 발생할 수 있다. 또한 청미래덩굴 뿌리 용매추출액을 숙성시키는 기간이 1 일 미만이면 상기 청미래덩굴 뿌리 용매추출액이 충분히 숙성되지 않으며, 청미래덩굴 뿌리 용매추출액을 숙성시키는 기간이 7 일을 초과하면 상기 청미래덩굴 뿌리 용매추출액의 유효성분이 포함된 피부 미백용 화장료 조성물의 피부에 대한 친화력이 더 이상 향상되지 않는다.
이러한 청미래덩굴 뿌리 용매추출액에서 감압증발 등에 의해 용매가 증발되어 청미래덩굴 고상 추출물이 구성된다.
본 발명에서는 상기에서 기술된 청미래덩굴 추출물이 건조 고형분 기준으로 0.1∼10 중량%, 화장료용 부형제 잔량이 함유되어 피부 미백용 화장료 조성물이 구성된다.
피부 미백용 화장료 조성물에 함유되는 청미래덩굴 추출물의 함량이 0.1 중량% 미만이면 상기 피부 미백용 화장료 조성물의 피부 미백 효과가 저하되며, 피부 미백용 화장료 조성물에 함유되는 청미래덩굴 추출물의 함량이 10 중량%를 초과하면 상기 피부 미백용 화장료 조성물은 청미래덩굴 추출물의 함량 대비 피부 미백 효과가 저하된다.
또한 본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물은 상기한 청미래덩굴 추출물 외에도 필요에 따라 본 발명의 효과를 저하시키지 않는 범위 내에서 피부 외용제에 일반적으로 사용하는 각종 성분, 예를 들면 수용성 성분, 분말성분, 유분, 계면활성제, 보습제, 점도조절제, 방부제, 산화방지제, 향료, 색소 등을 배합하여 구성된다.
본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물의 제형은 임의로 선택할 수 있으되, 유효성분인 청미래덩굴 추출물과 함께, 물, 생리식염수, 글리세롤, 유분, 계면활성제, 보습제, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 및 향료 등과 같은 기 공지된 화장료용 부형제가 혼합되어 로션제(lotiones), 액제(液劑), 유제, 에멀션제, 현탁제(懸濁劑), 정제(錠劑) 및 캡슐제(capsules) 형태를 이루는 피부 미백용 화장료 조성물이 형성된다. 상기 피부 미백용 화장료 조성물을 사용하여 유연 화장수, 밀크로션, 영양크림, 맛사지 크림, 에센스, 클렌싱 폼, 클렌싱 워터, 팩 또는 바디오일 등의 기초 화장료 및 화운데이션, 립스틱, 마스카라 또는 메이크업 베이스 등의 색조 화장료를 제조할 수 있으며, 또한 세안제 및 목욕제를 제조할 수 있다.
이러한 피부 미백용 화장료 조성물의 청미래덩굴 추출물이 피부에 흡수 및 고정되는 것을 촉진하도록, 화장료용 부형제 중에서 글리세린 1∼7 중량%가 포함되어 청미래덩굴 추출물 함유 피부 미백용 화장료 조성물이 구성되는 것이 바람직하다. 피부 미백용 화장료 조성물에 포함되는 글리세린의 함량이 1 중량% 미만이면 상기 피부 미백용 화장료 조성물의 청미래덩굴 추출물이 피부에 제대로 흡수 및 고정되지 않으며, 피부 미백용 화장료 조성물에 포함되는 글리세린의 함량이 7 중량%를 초과하면 상기 피부 미백용 화장료 조성물에서 글리세린 이외의 다른 화장료용 부형제의 함량이 상대적으로 저하되므로 실용적인 피부 미백용 화장료 조성물의 제조가 곤란하게 된다.
또한, 피부 미백용 화장료 조성물에게 항산화 기능을 제공하도록, 화장료용 부형제 중에서 선플라워 오일(sunflower oil)이 포함되어 청미래덩굴 추출물 함유 피부 미백용 화장료 조성물이 구성되는 것이 바람직하다. 선플라워 오일은 해바라기씨에서 추출된 천연오일로서, 불포화지방산과 항산화제로 잘 알려진 디알파토코페롤이 다량으로 함유되어 있는데, 상기 디알파토코페롤은 활성산소(free radical)과 과산화물에 의해 야기된 손상으로부터 세포를 보호하는 역할을 한다.
이에 따라, 본 발명에서는 이러한 선플라워 오일(sunflower oil) 1∼12 중량%가 화장료용 부형제로서 포함되어 청미래덩굴 추출물 함유 피부 미백용 화장료 조성물이 구성된다. 피부 미백용 화장료 조성물에 포함되는 선플라워 오일(sunflower oil)의 함량이 1 중량% 미만이면 상기 피부 미백용 화장료 조성물에게 항산화 기능이 충분히 제공되지 않으며, 피부 미백용 화장료 조성물에 포함되는 선플라워 오일(sunflower oil)의 함량이 12 중량%를 초과하면 상기 피부 미백용 화장료 조성물에서 선플라워 오일 이외의 다른 화장료용 부형제의 함량이 상대적으로 저하되므로 실용적인 피부 미백용 화장료 조성물의 제조가 곤란하게 된다.
그런데, 본 발명의 피부 미백용 화장료 조성물은 청미래덩굴 추출물과 각종 화장료용 부형제가 포함되어 있으므로 성상이 변화되기 쉽고, 이러한 경향은 유연화장수 등과 같이 수분 함량이 높아서 농도가 낮은 화장료 조성물보다 영양로션, 영양크림, 에센스 등과 같이 수분 함량이 낮아서 농도가 높은 화장료 조성물에서 심하게 발생하는 경향을 나타내고 있다. 따라서, 피부 미백용 화장료 조성물의 성상을 안정화시키도록, 화장료용 부형제 중에서 안정화제인 디세틸포스페이트 0.1∼1 중량%가 포함되어 청미래덩굴 추출물 함유 피부 미백용 화장료 조성물이 구성되는 것이 바람직하다. 피부 미백용 화장료 조성물에 포함되는 디세틸포스페이트의 함량이 0.1 중량% 미만이면 상기 피부 미백용 화장료 조성물의 성상이 제대로 안정화되지 않으며, 피부 미백용 화장료 조성물에 포함되는 디세틸포스페이트의 함량이 1 중량%를 초과하면 상기 피부 미백용 화장료 조성물의 성상을 안정화시키는 효과가 더 이상 증가되지 않는다.
또한 본 발명은 청미래덩굴 추출물에 기호성 식품 성분을 첨가하여 통상적으로 알려진 방법에 의하여 각종 건강기능식품을 제조할 수 있고, 또한 일반적인 제형으로 제형화될 수 있으며, 제형에 따라 당업자가 적의 적절하게 선택하여 배합할 수 있다.
도면과 구체적인 실시예를 참조하여 본 발명의 청미래덩굴 추출물 함유 피부 미백용 화장료 조성물에 대하여 상세하게 설명한다. 단, 다음의 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하기 위한 것일 뿐이고, 본 발명을 제한하는 것은 아니며, 본 발명은 오직 특허청구범위에 의해서만 제한된다.
1. 청미래덩굴 뿌리를 정제수로 세척하고 건조시킨 뒤 분쇄하여 청미래덩굴 뿌리 분말을 형성하였다.
2. 상기 청미래덩굴 뿌리 분말 1 ㎏, 용매인 에탄올 수용액(에탄올 70 중량%, 물 30 중량%) 5ℓ를 80 ℃에서 12 시간동안 반응시켜서 청미래덩굴 반응물을 형성하였다.
3. 상기 청미래덩굴 반응물을 와트만 여과지로 여과하여 침전물을 제거하고 상등액인 청미래덩굴 뿌리 용매추출액을 회수하였다.
4. 상기 청미래덩굴 뿌리 용매추출액을 회전 감압증발기에서 65 ℃로 감압증발시켜서 용매를 제거하고 청미래덩굴 고상 추출물을 수득하였다.
5. 상기 청미래덩굴 고상 추출물에 증류수 1ℓ를 혼합 교반하여 청미래덩굴 수용성 분획물인 상등액과 비수용성 침전물로 구분한 후에, 여과하여 청미래덩굴 수용성 분획물을 수득하였다.
상기 비수용성 침전물에 에틸아세테이트 1ℓ를 가하고 여과하여 액상 성분인 청미래덩굴 에틸아세테이트 분획물을 수득하는 공정을 추가하는 것 이외에는 상기 실시예 1과 동일하다.
상기 비수용성 침전물에 부탄올 1ℓ를 가하고 여과하여 액상 성분인 청미래덩굴 부탄올 분획물을 수득하는 공정을 추가하는 것 이외에는 상기 실시예 1과 동일하다.
상기 비수용성 침전물에 에탄올 1ℓ를 가하고 여과하여 액상 성분인 청미래덩굴 에탄올 분획물을 수득하는 공정을 추가하는 것 이외에는 상기 실시예 1과 동일하다.
상기 비수용성 침전물에 n-헥산 1ℓ를 가하고 여과하여 액상 성분인 청미래덩굴 헥산 분획물을 수득하는 공정을 추가하는 것 이외에는 상기 실시예 1과 동일하다.
상기 비수용성 침전물에 클로로포름 1ℓ를 가하고 여과하여 액상 성분인 청미래덩굴 클로로포름 분획물을 수득하는 공정을 추가하는 것 이외에는 상기 실시예 1과 동일하다.
<실험예 1>
실시예 1∼7의 분획물을 각각 증류수에 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 15 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖의 농도로 희석하여 시료용액을 형성하였다.
각 시료용액 100 ㎕에 5×10-4 M의 DPPH시약(1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)을 혼합하여 1분간 교반하고, 30 ℃, 암실의 인큐베이터에서 30분간 반응시킨 후에 분광광도계를 이용하여 517 ㎚에서 흡광도를 계측하였다. 이 때, 대조용 공시료액으로 증류수를 사용하였다.
실험 대조군으로는 항산화제인 농도 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖, 15 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖의 엘-아스코르빈산(L-Ascorbic acid) 수용액을 사용하였으며, 항산화능은 대조용 공시료액인 증류수와 비교한 프리 라디칼 소거율로 나타내었다. 상기 계측된 각 시료용액의 흡광도를 다음의 프리 라디칼 소거율(수치가 높을수록 전자 공여능 및 프리 라디칼 소거능이 우수하여 항산화 기능이 탁월함) 계산식에 대입하여 프리 라디칼 소거율(항산화능)을 산출하고, 상기 산출된 프리 라디칼 소거율을 다음 표 1과 도 1에 나타낸다.
* 프리 라디칼 소거율(%) = (공시료액 흡광도 - 시료용액 흡광도/공시료액 흡광도×100)
구 분 |
프리 라디칼 소거율(항산화능, %) |
20 ㎍/㎖ |
15 ㎍/㎖ |
10 ㎍/㎖ |
5 ㎍/㎖ |
실험대조군 |
100 |
100 |
98.69 |
57.5 |
실시예 1 |
39.57 |
26.92 |
14.28 |
1.63 |
실시예 2 |
100 |
100 |
100 |
50 |
실시예 3 |
100 |
100 |
67.56 |
34.55 |
실시예 4 |
46.58 |
30.66 |
14.75 |
0 |
실시예 5 |
46.16 |
37.98 |
29.81 |
21.63 |
실시예 6 |
100 |
100 |
65.76 |
33.65 |
상기 표 1 및 도 1에서 전체적으로 청미래덩굴 분획물은 낮은 농도에서도 프리 라디칼 소거율(항산화능)이 우수한 것으로 나타났으며, 특히 실시예 2의 청미래덩굴 에틸아세테이트 분획물은 항산화제인 엘-아스코르빈산(L-Ascorbic acid)과 동일한 정도의 항산화능을 지니고 있는 것으로 나타났다. 이에 따라, 본 발명의 청미래덩굴 추출물 함유 피부 미백용 화장료 조성물은 피부에서 도파(DOPA)의 산화 활성을 저해함으로써 색소침착의 원인인 멜라닌 생성을 억제할 수 있는 것으로 판단된다.
또한, 표 1에 의거하여 프리 라디칼 소거율 50 %(IC50)일 때의 각 시료의 농도를 산출하고, 상기 산출된 프리 라디칼 소거율 50 %(IC50)일 때의 각 시료의 농도를 다음 표 2에 나타낸다.
구 분 |
프리 라디칼 소거율 50 %(IC50)의 시료 농도(㎍/㎖) |
실험대조군 |
4.08 |
실시예 1 |
24.12 |
실시예 2 |
3.16 |
실시예 3 |
7.33 |
실시예 4 |
21.07 |
실시예 5 |
21.99 |
실시예 6 |
42.61 |
상기 표 2에서 전체적으로 청미래덩굴 분획물은 낮은 농도에서도 프리 라디칼 소거율 50%의 효과를 지닌 것으로 나타났으며, 특히 실시예 2의 청미래덩굴 에틸아세테이트 분획물은 항산화제인 엘-아스코르빈산(L-Ascorbic acid) 보다도 낮은 농도에서 프리 라디칼 소거율 50%의 효과를 지닌 것으로 나타났다.
<실험예 2>
실시예 1∼7의 분획물을 각각 증류수에 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖의 농도로 희석하여 시료용액을 형성하였다.
시험관에 시료용액 200 ㎕, 머쉬룸 타이로시나아제 100 ㎕를 혼합하고, 여기에 5 mM의 타이로신액 800 ㎕를 혼합하여 37 ℃, 암실의 인큐베이터에서 30분간 반응시킨 후에 분광광도계를 이용하여 475 ㎚에서 흡광도를 계측하였다. 이 때, 대조용 공시료액으로 0.1 M 인산염 완충용액을 사용하였다.
실험 대조군으로는 타이로시나아제 활성 저해제인 농도 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖의 알부틴 수용액을 사용하였으며, 대조용 공시료액인 0.1 M 인산염 완충용액과 비교한 타이로시나아제 활성 저해율로 나타내었다. 상기 계측된 각 시료용액의 흡광도를 타이로시나아제 활성 저해율 계산식에 대입하여 타이로시나아제 활성 저해율을 산출하고, 상기 산출된 타이로시나아제 활성 저해율을 다음 표 3과 도 2에 나타낸다.
* 타이로시나아제 활성 저해율(%) = 100-(B1-B2)/(A1-A2)×100
A1 : 시료용액의 흡광도
B1 : 대조용 공시료액의 흡광도
A2, B2 : 타이로시나아제 대신 완충액으로 대체하여 측정한 흡광도.
구 분 |
타이로시나아제 활성 저해율(%) |
500 ㎍/㎖ |
100 ㎍/㎖ |
50 ㎍/㎖ |
10 ㎍/㎖ |
실험대조군 |
50.59 |
21.70 |
2.29 |
0 |
실시예 1 |
23.13 |
7.69 |
0 |
0 |
실시예 2 |
63.10 |
59.5 |
40.86 |
17.51 |
실시예 3 |
42.21 |
38.07 |
1.90 |
0 |
실시예 4 |
59.33 |
26.06 |
2.73 |
0 |
실시예 5 |
3.35 |
0 |
0 |
0 |
실시예 6 |
0 |
0 |
0 |
0 |
상기 표 3 및 도 2에서 전체적으로 청미래덩굴 분획물은 일정한 정도의 타이로시나아제 활성 저해 효과를 구비하고 있으며, 특히 실시예 2의 청미래덩굴 에틸아세테이트 분획물은 타이로시나아제 활성 저해제인 알부틴 이상의 타이로시나아제 활성 저해 효과를 지니고 있는 것으로 나타났다. 이에 따라, 본 발명의 청미래덩굴 추출물 함유 피부 미백용 화장료 조성물은 피부에서 타이로시나아제 활성을 저해함으로써 색소침착의 원인인 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 판단되다.
<실험예 3>
실시예 1∼7의 분획물을 각각 증류수에 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 1,000 ㎍/㎖의 농도로 희석하여 시료용액을 형성하였다.
시험관에 시료용액 200 ㎕, 0.1 M 인산염 완충용액(pH6.8) 100 ㎕, 머쉬룸 타이로시나아제 100 ㎕를 혼합하여 6분간 반응시키고, 여기에 5 mM의 L-DOPA액 200 ㎕를 혼합하여 37 ℃, 암실의 인큐베이터에서 1분간 반응시킨 후에 분광광도계를 이용하여 475 ㎚에서 흡광도를 계측하였다. 이 때, 대조용 공시료액으로 0.1 M 인산염 완충용액을 사용하였다.
실험 대조군으로는 항산화제인 농도 10 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 500 ㎍/㎖, 1,000 ㎍/㎖의 엘-아스코르빈산(L-Ascorbic acid) 수용액을 사용하였으며, 항산화능은 대조용 공시료액인 0.1 M 인산염 완충용액과 비교한 L-DOPA 산화 활성 저해율로 나타내었다. 상기 계측된 각 시료용액의 흡광도를 L-DOPA 산화 활성 저해율 계산식에 대입하여 L-DOPA 산화 활성 저해율을 산출하고, 상기 산출된 L-DOPA 산화 활성 저해율을 다음 표 4와 도 3에 나타낸다.
* L-DOPA 산화 활성 저해율(%) = 100-(B1-B2)/(A1-A2)×100
A1 : 시료용액의 흡광도
B1 : 대조용 공시료액의 흡광도
A2, B2 : 타이로시나아제 대신 완충액으로 대체하여 측정한 흡광도.
구 분 |
L-DOPA 산화 활성 저해율(%) |
1,000 ㎍/㎖ |
500 ㎍/㎖ |
100 ㎍/㎖ |
50 ㎍/㎖ |
10 ㎍/㎖ |
실험대조군 |
98.75 |
99.28 |
97.44 |
91.34 |
25.74 |
실시예 1 |
66.49 |
63.57 |
32.38 |
29.68 |
19.24 |
실시예 2 |
89.79 |
85.07 |
64.26 |
57.81 |
57.21 |
실시예 3 |
68.77 |
65.95 |
40.84 |
40.08 |
0 |
실시예 4 |
80.31 |
68.26 |
47.55 |
56.29 |
28.57 |
실시예 5 |
68.09 |
58.87 |
30.940 |
30.80 |
1.17 |
실시예 6 |
53.00 |
42.35 |
15.85 |
30.56 |
0 |
상기 표 4 및 도 3에서 전체적으로 청미래덩굴 분획물은 L-DOPA 산화 활성 저해율(항산화능)이 우수한 것으로 나타났으며, 특히 실시예 2의 청미래덩굴 에틸아세테이트 분획물은 항산화제인 엘-아스코르빈산(L-Ascorbic acid)과 비교될 정도의 항산화능을 지니고 있는 것으로 나타났다. 이에 따라, 본 발명의 청미래덩굴 추출물 함유 피부 미백용 화장료 조성물은 피부에서 도파(DOPA)의 산화 활성을 저해함으로써 색소침착의 원인인 멜라닌 생성을 억제할 수 있는 것으로 판단된다.
<실험예 4>
실시예 1에서 제조된 각각의 청미래덩굴 추출물로 세포의 독성을 실험하였다.
MTT 분석법을 사용하여 청미래덩굴 추출물의 세포 독성을 실험하였다.
DMEM 배지에 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 페니실린-스트렙토 마이신(penicillin-streptomycin)을 첨가한 배지에서 B16F10 멜라노마 세포(B16F10 melanoma cell)를 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하여 실험대조군으로 사용하였다.
대수증식기의 섬유모세포를 웰 당 8000 개로 96웰 플레이트에 접종하여 200 ㎕ DMEM 배지에서 24 시간동안 배양하였다. 상기 배지에 청미래덩굴 추출물의 최종 농도가 각각 0 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖가 되도록 하여 20 시간동안 반응시켰다. 상기 반응액을 MTT 용액 0.5 ㎎/㎖이 포함된 배지에서 4 시간 배양한 후에, 200 ㎕의 디메틸설폭사이드(DMSO)를 웰에 넣고 용해시켜서, ELISA 판독기로 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 실험대조군을 100 % 기준으로 하여 각 반응액의 세포 생존률을 산출하고, 그 결과를 다음 표 5와 도 4에 나타낸다.
구 분 |
세포 생존률(%) |
400 ㎍/㎖ |
200 ㎍/㎖ |
100 ㎍/㎖ |
50 ㎍/㎖ |
0 ㎍/㎖ |
실험대조군 |
100 |
100 |
100 |
100 |
100 |
실시예 1 |
98.23 |
102.72 |
99.82 |
102.72 |
103.89 |
실시예 2 |
98.12 |
99.56 |
99.82 |
101.23 |
102.23 |
실시예 3 |
96.22 |
98.23 |
97.45 |
100.22 |
101.69 |
실시예 4 |
99.11 |
99.73 |
99.55 |
101.44 |
100.23 |
실시예 5 |
98.89 |
98.44 |
98.83 |
101.62 |
99.82 |
실시예 6 |
99.11 |
99.21 |
99.43 |
102.43 |
101.44 |
상기 표 5에서는 모든 시료에서 세포 생존율이 100% 에 근접하여 청미래덩굴 추출물은 세포독성을 지니고 있지 않은 것으로 생각되며, 이에 따라 청미래덩굴 추출물 함유 피부 미백용 화장료 조성물은 피부에 대한 부작용 및 독성이 없고 안전하게 사용될 수 있는 것으로 판단된다.
<실험예 5>
DMEM 배지에 10 % 우태아 혈청(fetalbovine serum)을 첨가한 배지에서 B16F10 멜라노마 세포(B16F10 melanoma cell)를 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 배지 전체에 세포가 배양되면 PBS로 세척하고 0.05% trypsin-EDTA 용액을 첨가하여 세포를 떼어내고 배지를 가한 후 1000 rpm 에서 5 분간 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 얻어진 cell pellet에 배지를 첨가하여 충분히 현탁시킨 후 세포수를 측정하였다. 105 cells/ml의 농도로 세포를 배지에 희석하여 세포배양기에 배양하였다. 세포가 완전히 부착된 것을 확인한 뒤 청미래덩굴 추출물 또는 알부틴을 첨가한 배지로 교환하여 3일간 배양하였다. 상기 방법으로 세포 침전물을 얻은 후, 세포수를 측정하고 청미래 덩굴 추출물을 첨가하지 않은 실험대조군과 세포수의 증감을 비교하여 시료의 세포에서의 독성 정도를 측정하고, 같은 수의 세포(106 cells)가 되도록 cell pellet을 얻어 색깔을 육안으로 관찰하였다.
Cell pellet에 1N NaOH 1 ㎖을 가하고, 80 ℃에서 1시간동안 가열하여 세포를 완전히 녹인 후에 ELISA 판독기로 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 청미래덩굴 추출물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 각 시료의 멜라닌 생성률을 산출하고, 그 결과를 다음 표 6와 도 5에 나타낸다.
구 분 |
처리량(㎍/㎖) |
멜라닌 생성률(%) |
실험대조군 |
100 |
100 |
알부틴 |
100 |
33 |
실시예 1 |
100 |
20 |
실시예 2 |
100 |
6.2 |
실시예 3 |
100 |
15 |
실시예 4 |
100 |
10 |
실시예 5 |
100 |
26 |
실시예 6 |
100 |
28 |
상기 표 6에서는 모든 시료가 타이로시나아제 활성 저해제인 알부틴보다 멜라닌 생성률이 낮은 것으로 나타났으며, 이에 따라 청미래덩굴 추출물 함유 피부 미백용 화장료 조성물은 색소침착의 원인인 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백 효과가 탁월한 것으로 판단된다.
결론적으로, 본 발명의 청미래덩굴 추출물을 유효성분으로 하는 청미래덩굴 추출물 함유 피부 미백용 화장료 조성물은 피부에서 타이로시나아제 활성 및 도파(DOPA)의 산화 활성을 저해함으로써 색소침착의 원인인 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백 효과가 탁월하며, 피부에 대한 부작용 및 독성이 없고 안전하게 사용될 수 있으므로 색소침착의 예방 및 치료용으로 사용되기에 적합하다는 것을 확인할 수 있다.
상기와 같은 청미래덩굴 추출물이 함유되는 피부 미백용 화장료 조성물은 상기 청미래덩굴 뿌리의 디오신(dioscine), 사포닌, 알칼로이드 성분이 피부에서 타이로시나아제(Tyrosinase) 활성 및 도파(DOPA)의 산화 활성을 저해함으로써 색소침착의 원인인 멜라닌 생성을 억제하고 항산화 작용이 우수하여 피부 미백 효과가 탁월하며, 피부에 대한 부작용 및 독성이 없고 안전하게 사용될 수 있다.
본 발명의 청미래덩굴 추출물 함유 피부 미백용 화장료 조성물 중에서 유연화장품의 일 실시예에 의한 조성을 다음의 표 7에 나타낸다.
번호 |
성 분 |
함량(중량%) |
1 |
청미래덩굴 추출물 |
3 |
2 |
부틸렌글리콜 |
6 |
3 |
에탄올 |
4 |
4 |
글리세린 |
2 |
5 |
PEG-60하이드로제네이티드캐스터오일 |
0.5 |
6 |
카보머 |
0.15 |
7 |
트리에탄올아민 |
0.15 |
8 |
디소듐이디티에이 |
0.05 |
9 |
방부제 |
미량 |
10 |
향료 |
미량 |
11 |
부형제 |
잔량 |
본 발명의 청미래덩굴 추출물 함유 피부 미백용 화장료 조성물 중에서 영양로션의 일 실시예에 의한 조성을 다음의 표 8에 나타낸다.
번호 |
성 분 |
함량(중량%) |
1 |
청미래덩굴 추출물 |
3 |
2 |
부틸렌글리콜 |
8 |
3 |
글리세린 |
5 |
4 |
PEG-60소르비탄스테아레이트 |
1 |
5 |
글리세릴스테아레이트 |
0.5 |
6 |
PEG-100스테아레이트 |
0.5 |
7 |
소르비탄스테아레이트 |
0.5 |
8 |
카보머 |
0.1 |
9 |
선플라워오일 |
3 |
10 |
트리에탄올아민 |
0.1 |
11 |
알란토인 |
0.05 |
12 |
디소듐이디티에이 |
0.05 |
13 |
방부제 |
미량 |
14 |
향료 |
미량 |
15 |
정제수 |
잔량 |
본 발명의 청미래덩굴 추출물 함유 피부 미백용 화장료 조성물 중에서 영양크림의 일 실시예에 의한 조성을 다음의 표 9에 나타낸다.
번호 |
성 분 |
함량(중량%) |
1 |
청미래덩굴 추출물 |
3 |
2 |
부틸렌글리콜 |
5 |
3 |
PEG-100스테아레이트 |
3 |
4 |
글리세릴스테아레이트 |
2 |
5 |
소르비탄스테아레이트 |
1 |
6 |
PEG-60소르비탄스테아레이트 |
1 |
7 |
스테아린산 |
1 |
8 |
글리세린 |
1 |
9 |
선플라워오일 |
5 |
10 |
카보머 |
0.1 |
11 |
트리에탄올아민 |
0.1 |
12 |
방부제 |
미량 |
13 |
향료 |
미량 |
14 |
정제수 |
잔량 |
본 발명의 청미래덩굴 추출물 함유 피부 미백용 화장료 조성물 중에서 에센스의 일 실시예에 의한 조성을 다음의 표 10에 나타낸다.
번호 |
성 분 |
함량(중량%) |
1 |
청미래덩굴 추출물 |
3 |
2 |
부틸렌글리콜 |
5 |
3 |
글리세린 |
5 |
4 |
PEG-100스테아레이트 |
1 |
5 |
PEG-60소르비탄스테아레이트 |
1 |
6 |
스테아릴알콜 |
1 |
7 |
글리세릴스테아레이트 |
0.5 |
8 |
소르비탄스테아레이트 |
0.5 |
9 |
비즈왁스 |
0.5 |
10 |
쉐어버터 |
0.5 |
11 |
선플라워오일 |
5 |
12 |
카보머 |
0.15 |
13 |
트리에탄올아민 |
0.15 |
14 |
디소듐이디티에이 |
0.05 |
15 |
방부제 |
미량 |
16 |
향료 |
미량 |
17 |
정제수 |
잔량 |
본 발명의 청미래덩굴 추출물 함유 피부 미백용 화장료 조성물 중에서 에센스의 다른 실시예에 의한 조성을 다음의 표 11에 나타낸다.
번호 |
성 분 |
함량(중량%) |
1 |
청미래덩굴 추출물 |
1 |
2 |
부틸렌글리콜 |
10 |
3 |
글리세린 |
5 |
4 |
PEG-60소르비탄스테아레이트 |
1 |
5 |
스테아린산 |
1 |
6 |
PEG-100스테아레이트 |
0.5 |
7 |
글리세릴스테아레이트 |
0.5 |
8 |
소르비탄스테아레이트 |
0.5 |
9 |
스테아릴알콜 |
0.5 |
10 |
카보머 |
0.15 |
11 |
트리에탄올아민 |
0.15 |
12 |
디소듐이디티에이 |
0.05 |
13 |
방부제 |
미량 |
14 |
향료 |
미량 |
15 |
정제수 |
잔량 |
상기 표 7 내지 11의 조성에 의하여 구성된 피부 미백용 화장료 조성물은 청미래덩굴(Smilax china L.) 추출물이 유효성분으로 함유되어 피부에서 타이로시나아제 활성 및 도파(DOPA)의 산화 활성을 저해함으로써 색소침착의 원인인 멜라닌 생성을 억제하여 피부 미백 효과가 탁월하며, 피부에 대한 부작용 및 독성이 없고 안전하게 사용될 수 있으므로 색소침착의 예방 및 치료용으로 사용되기에 매우 적합하다.
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.