CN101077062B - 红头兰(Tuberolabium quisumbingii)的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及红头兰(Tuberolabium quisumbingii)的组织培养方法。利用无菌播种得到红头兰圆球茎状体和小苗进行组培培养，在MS培养基加上椰子水(CW)、激动素(KT)、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、α-萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、活性炭(AC)、蔗糖和琼脂组成的培养基培养形成完整植株，获得大量试管苗，进行红头兰种苗的工厂化大批量生产，并可为管唇兰属其它种、属内或与其它属间杂种的无菌播种和组织培养提供方法。
Description
技术领域：
本发明涉及一种植物的组织培养方法，特别是管唇兰属植物红头兰(Tuberolabium quisumbingii)的组织培养方法。
技术背景：
红头兰(Tuberolabium quisumbingii)是兰科(Orchidaceae)管唇兰属(Tuberolabium)植物。管唇兰属植物全球约有11种，主要分布于东南亚、澳大利亚和太平洋岛屿，向北到我国台湾和印度阿萨姆。管唇兰属植物因其花型独特、花色艳丽而具较高的观赏价值，红头兰是该属较具代表性的一个种，原产菲律宾，它的花序自叶间长出，花生于花序具鞘的节上，白色花瓣上散布有红色或紫色的斑点，香味浓烈怡人，花期长达90天，适于室内和庭院养植，有很高的观赏价值，属于观赏花中的好品种，一直为人们所喜爱。但是，红头兰和管唇兰属的其它植物的种子，因其胚发育不完全，并且无胚乳，在自然状态下极难萌发，繁育速度与数量非常有限，远远不能满足市场需求。
发明内容：
本发明的目的在于解决红头兰种子自然萌发困难的问题，提供一种组织培养的方法，使红头兰种苗实现大规模工厂化生产。
本发明采用的技术方案是：采用无菌播种和组织培养方法，选红头兰人工授粉的成熟果实为外植体，无菌播种获得大量的试管苗(类圆球茎状体或小苗)，经过组织培养(增值培养和分化成苗培养)形成完整植株，所用的培养基由MS培养基加上椰子水(CW)、激动素(KT)、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、α-萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、活性炭(AC)、蔗糖、蛋白胨和琼脂组成。瓶苗再经练苗和移栽，即得到大量性状一致的红头兰种苗。
本发明技术路线如下：
1、人工授粉：在红头兰开花时选取生长健壮的母株进行人工授粉，授粉100-120天后的成熟果实作为外植体；
2、无菌播种：红头兰授粉后100-120天时将果实取下，用75％乙醇浸泡20-40秒，然后置于0.1％的升汞(氯化汞HgCl)溶液中消毒10-15分钟，无菌水冲洗4-5次后，切开果实，用接种针将粉末状种子均匀地播种到培养基上进行培养，其培养基为：1/4MS+椰子水(CW)10-15％+激动素(KT)0.5-1.0mg.L-1+琼脂7.5g.L-1+蔗糖15.0g.L-1+活性炭(AC)1.0g.L-1+蛋白胨1.0g.L-1，约15-20天后胚开始萌发，种子萌发后形成圆球茎状体，圆球茎状体边增殖边分化为小苗；
3、组织培养：首先将种子萌发后的圆球茎状体或小苗转移到增殖继代培养基上进行增殖培养，增殖培养基为：1/3MS+6-苄基氨基嘌呤(6-BA)2.0-5.0mg.L-1+α-萘乙酸(NAA)0.2-0.5mg.L-1+蔗糖20.0g.L-1+活性炭(AC)2.0g.L-1+琼脂7.5g.L-1，形成芽和类圆球茎状体的混合组织，在45天左右时繁殖系数一般可达10-15，类圆球茎状体在相同的培养基上可继续进行继代增殖；然后将增殖后的芽或圆球茎状体转至分化成苗培养基上继续培养，分化成苗培养基为：1/2MS+α-萘乙酸(NAA)0.1-0.5mg.L-1+吲哚丁酸(IBA)0.1-0.5mg.L-1+蔗糖20.0g.L-1+活性炭(AC)2.0g.L-1+蛋白胨2.0g.L-1+琼脂7.5g.L-1，60天后即可形成带短根的完整瓶苗植株；
4、练苗：完整的瓶苗植株培养90-120天，当瓶苗长到约5cm高时，转移到自然光下炼苗7-10天；
5、移栽：将瓶苗从瓶中取出，洗净根部的培养基，移栽至用水苔作为栽培基质的穴盘或营养钵中，适当遮荫，保持适当的通风和湿度，移栽的成活率一般在95％左右。上述所需培养条件均为：培养基的pH5.4-5.8，培养温度24±2℃，光照1500-2000lux，光照时间12h.d-1。
上述MS为常规基本培养基，其成分和配制方法在组织培养和植物生理学实验参考书或手册中均可查到，1/4MS、1/3MS、1/2MS是指大量元素减为1/4、1/3、1/2的MS培养基。
本发明所述的红头兰无菌播种和组织培养技术，种子萌发率高，生长迅速，圆球茎状体增殖边分化一般30-45天可增值10-15倍，移栽的成活率可达到95％左右，苗壮、抗性强、种苗品质好，本发明供试材料具有广泛的代表性，可作为管唇兰属其它种或属内、属间杂交种的无菌播种和组织培养方法，具有很好的应用前景。
具体实施方式：
1、选生长健壮的红头兰(Tuberolabium quisumbingii)母株进行人工授粉，授粉120天后，取果实作为外植体；
2、用75％的乙醇浸泡果实30秒后，将其置于0.1％的升汞容液中消毒15分钟，无菌水冲洗4-5次后，用无菌的刀片切开果实，用接种针将褐色粉末状种子均匀地撒在接种培养基上，所用培养基为1/4MS+CW10％+KT0.5mg.L-1+蔗糖15.0g.L-1+AC1.0g.L-1+蛋白胨1.0g.L-1+琼脂7.5g.L-1，培养基的pH为5.4，培养温度24±2℃，光照1500-2000lux，光照时间12h.d-1，约20天后胚开始萌发形成圆球茎状体，圆球茎状体边增殖边分化为小苗；
3、将无菌播种产生的圆球茎状体或者小苗在增殖继代培养基上培养，30天后形成芽和类圆球茎状体的混合组织，在相同的培养基上可进行继代增殖培养，所用培养基为1/3MS+6-BA5.0mg.L-1+NAA0.5mg.L-1+蔗糖20.0g.L-1+AC2.0g.L-1+琼脂7.5g.L-1；再将芽和圆球茎状体接种在分化成苗培养基上，培养基为1/2MS+NAA0.5mg.L-1+IBA0.5mg.L-1+蔗糖20.0g.L-1+AC2.0g.L-1+蛋白胨2.0g.L-1+琼脂7.5g.L-1，60天后可形成带短根的完整的瓶苗植株；
4、瓶苗培养90天左右，当苗高约5cm时，转移到自然光下练苗10天，然后将其从玻璃瓶中取出，洗净根部的培养基，用水苔作为栽培基质，保持适当的通风和湿度，移栽的成活率一般在95％以上。
以上各步培养条件为：培养基pH5.4-5.8，培养温度24±2℃，光照1500-2000lux，光照时间12h.d-1。
Claims (2)
1.一种红头兰(Tuberolabium quisumbingii)的组织培养方法，其特征在于：采用无菌播种和组织培养方法，选红头兰人工授粉的成熟果实为外植体，无菌播种获得大量的试管苗，经过组织培养形成完整植株；所述组织培养包括增殖培养和分化成苗培养；所用的培养基由MS培养基加上椰子水(CW)、激动素(KT)、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、α-萘乙酸(NAA)、吲哚丁酸(IBA)、活性炭(AC)、蔗糖、蛋白胨和琼脂组成；无菌播种所用的培养基为1/4MS+CW10-15％+KT0.5-1.0mg.L-1+琼脂7.5g.L-1+蔗糖15.0g.L-1+ACl.0g.L-1+蛋白胨1.0g.L-1；组织培养所用的增殖培养基为1/3MS+6-BA2.0-5.0mg.L-1+NAA 0.2-0.5mg.L-1+蔗糖20.0g.L-1+AC 2.0g.L-1+琼脂7.5g.L-1；组织培养中分化成苗培养基为1/2MS+NAA0.1-0.5mg.L-1+IBA 0.1-0.5mg.L-1+蔗糖20.0g.L-1+AC2.0g.L-1+蛋白胨2.0g.L-1+琼脂7.5g.L-1。
2.如权利要求1所述的红头兰(Tuberolabium quisumbingii)的组织培养方法，其特征在于：无菌播种的方法是红头兰授粉后100-120天时将果实取下，用75％乙醇浸泡20-40秒，然后置于0.1％的升汞(氯化汞HgCl)溶液中消毒10-15分钟，无菌水冲洗4-5次后，切开果实，用接种针将粉末状种子均匀地播种到培养基上进行培养。
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