WO2022065774A1 - 식물 유래 세포 외 소포체를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

식물 유래 세포 외 소포체를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a composition for improving skin condition comprising a plant-derived extracellular vesicle and a method for preparing the same.
  • Extracellular ER is a generic term for membrane-structured endoplasmic reticulum secreted by cells for information exchange between cells.
  • Exosomes are endoplasmic reticulum with a size of several tens to hundreds of nanometers made up of a phospholipid double membrane identical to the structure of the cell membrane, and contain cytokines, growth factors, miRNA, DNA, proteins, etc. It reflects the specific genetic material and bioactive factors according to the nature and condition of the derived cell.
  • Exosomes can be isolated from various types of body fluids, for example, saliva, urine, plasma, serum, and amniotic fluid, and can also be isolated from various types of cell culture supernatants. Studies on specific uses of exosomes isolated from human stem cell culture supernatant have been conducted (Korean Patent Application Laid-Open No. 10-2016-0086253), and the existence of exosomes in plant cells or between cell walls and cell membranes has been reported, Studies on the separation, purification and characterization of extracellular vesicles such as exosomes derived from lysates of plants, plant callus, or plant culture roots are insignificant.
  • One aspect is (a) obtaining a lysate of a plant or tissue culture thereof; (b) filtering the lysate; And (c) ultra-filtering the filtered lysate; to provide a method for producing a plant or tissue culture-derived extracellular vesicle (extracellular vesicle) comprising a.
  • Another aspect is to provide a cosmetic composition for improving skin condition comprising an extracellular vesicle derived from a plant or tissue culture thereof as an active ingredient.
  • Another aspect is to provide an anti-inflammatory or wound-improving composition for external application for skin comprising an extracellular vesicle derived from a plant or tissue culture thereof as an active ingredient.
  • Another aspect is to provide a health functional food composition for anti-inflammatory or wound improvement comprising an extracellular vesicle derived from a plant or tissue culture thereof as an active ingredient.
  • Another aspect is to provide the use of an extracellular vesicle derived from a plant or tissue culture thereof for the manufacture of a cosmetic composition for improving skin conditions.
  • Another aspect is to provide the use of an extracellular vesicle derived from a plant or tissue culture thereof for the preparation of a composition for external application for skin for anti-inflammatory or wound improvement.
  • Another aspect is to provide the use of an extracellular vesicle derived from a plant or tissue culture thereof for the manufacture of a dietary supplement composition for anti-inflammatory or wound healing.
  • Another aspect is to provide a method for improving, preventing, or treating a skin condition, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of an extracellular vesicle derived from a plant or tissue culture thereof. .
  • One aspect is (a) obtaining a lysate of a plant or tissue culture thereof; (b) filtering the lysate; And (c) ultra-filtering the filtered lysate; provides a method for producing a plant or tissue culture-derived extracellular vesicle (extracellular vesicle) comprising a.
  • extracellular vesicle refers to vesicles secreted from cells and released into the extracellular space. and plasma membrane protein, nucleic acid, and cytoplasmic components, and may mean a smaller size than the original cell, but is not limited thereto.
  • the ER or dis endoplasmic reticulum formed after capture bursts may include a membrane or the composition of the active ingredient inside the reconstituted ER.
  • the extracellular endoplasmic reticulum binds to other cells and delivers membrane components, mRNAs, miRNAs, etc., and delivers these transporters to recipient cells, thereby acting as an extracellular transporter mediating cell-cell communication.
  • exosome-like vesicle refers to a nano-sized extracellular vesicle, including nano-sized exosomes, as well as endoplasmic reticulum having a nano-sized ER structure and composition similar to exosomes. It may be the broadest concept that includes.
  • the extracellular vesicles may include exosomes and/or exosome-like endoplasmic reticulum.
  • plant may be a whole plant or a part of a plant, and specifically may include all plant tissues, plant cells, and plant seeds.
  • the plant may be any part selected from the group consisting of flowers, leaves, stems, branches, fruits, fruit skins, and roots of plants.
  • the plant is wild ginseng, centella asiatica, ginseng, lavender, jasmine, vitex, rose. Any selected from the group consisting of green barley, green tangerine noni, stone, adenium, myrrh, edelweiss, erengium, luxampire, green tea, apple, grape, aloe, chrysanthemum, tangerine, persimmon, orange, grapefruit, blueberry, and cucumber can be one
  • the "grape” is a creeping plant belonging to the order Rhamnales and the family Vitaceae, and may be native or cultivated all over the globe except for areas near the equator and at a latitude of 50° or higher. About 700 species of 11 genera are known in the grape family, European grapes (Vitis vinifera), American grapes (Vitis labrusca), river grapes (Vitis riparia), desert grapes (Vitis rupestris), winter grapes (Vitis berladieri), and meuro (Vitis). coignetiae), Wangmeoru (Vitis amurensis), etc. may be, but is not limited thereto.
  • tissue culture of a plant is a generic term that is induced by transferring and culturing a part of plant tissue in a tissue culture medium, and from the group consisting of flowers, leaves, stems, branches, fruits, fruit skins, and roots of plants It may be derived from any one selected site, for example, it may be a callus or cultured root.
  • callus refers to a non-organized flow cell mass of a plant, which means cells with typical performance, and may include somatic cell embryos and plant stem cells, and also transfers a part of plant tissue to a tissue culture medium. It may be induced by culturing. Induction of the callus may be performed through a conventional method known in the art. More specifically, the induction of the callus may be achieved by culturing a plant tissue or an explant thereof in a tissue culture medium.
  • tissue culture medium MS (Murashige and Skoog, 1962) medium, SH Medium (Duchefa, Haarlem, Netherlands), N6 (Chu et al., 1975), B5 (Gamborg et al., 1968), NN (Nitsch) andNitsch, 1967) medium and WHITE medium, etc.
  • MS Middlerashige and Skoog, 1962
  • SH Medium Duchefa, Haarlem, Netherlands
  • N6 Chou et al., 1975
  • B5 Gaamborg et al., 1968
  • NN Neitsch
  • WHITE medium WHITE medium
  • the plant growth regulator may use a material known in the art, for example, 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 2,4,5-T (2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid) ), Dicamba (2-methoxy-3,6-dichlorobenzoic acid), IAA (indole-3-acetic acid), IBA (indole-3-butyric acid), MCPA (2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid), NAA ( Auxins, such as 1-naphthylacetic acid), NOA (2-naphthyloxyacetic acid), and Picloram (4-amino-2,5,6-trichloropicolinic acid); BAP (6-benzylaminopurine), 2iP (N6-(2-isopentyl)adenine), Kinetin (6-furfurylaminopurine), Thidiazuron (1-phenyl-3-(1,2,3-thiadiazol-5-yl)urea), Cyto
  • cultivación may refer to an irregular root obtained by removing tissue from a main root, culturing it in a nutrient medium to which a plant growth regulator is added, and inducing a thin root. It may be obtained by transferring a part of plant tissue to a tissue culture medium and inducing only the roots.
  • the callus may be a callus mixed culture.
  • the callus may be a callus recovered by removing the culture supernatant from the callus mixed culture.
  • the callus may be a culture supernatant recovered after removing the callus from the callus mixed culture.
  • a standard sieve and a mesh network may be used to separate the callus or culture supernatant from the plant callus mixed culture, and the pore size may be appropriately 100 ⁇ m to 200 ⁇ m, but is not limited thereto, and a centrifuge, a filtration device, and a qualitative filter paper A conventional method used to separate callus and culture supernatant in the art may be used.
  • the cultured root may be a cultured root mixed culture solution.
  • the cultured root may be a cultured root recovered by removing the culture supernatant from the cultured root mixed culture solution.
  • the cultured root may be a culture supernatant recovered after removing the cultured root from the cultured root mixed culture solution.
  • a standard sieve and a mesh network may be used to separate the cultured roots or the culture supernatant from the plant cultured root mixture, and the pore size may be appropriately 100 ⁇ m to 200 ⁇ m, but is not limited thereto, and a centrifuge, a filtration device, and a qualitative filter paper A conventional method used to separate cultured roots and culture supernatant in the art may be used.
  • callus mixed culture solution or the term “cultured root mixed culture solution” refers to the callus or cultured root obtained by culturing the callus or cultured root for a period of time in a medium capable of supplying nutrients so that the plant callus or cultured root can grow and survive in vitro. It may refer to the whole medium including metabolites, and extra nutrients. For example, it may be obtained by culturing the callus or cultured root in a medium at any temperature of more than 10 °C or less than 40 °C for a certain period of time, for example, 1 to 40 days.
  • the culture medium and culture conditions for culturing the callus or cultured root can be appropriately selected or modified by those of ordinary skill in the art.
  • culture supernatant refers to only the liquid in the upper layer excluding the part that has sunk to the bottom by leaving the culture medium still for a certain period of time, or centrifugation of the culture medium to mean only the liquid in the upper layer except for the sediment at the bottom.
  • shredded material may refer to a product obtained by crushing with a chemical or physical force.
  • a lysate of a plant or tissue culture thereof such as a lysate of a plant callus mixed culture, a lysate of a mixed culture of plant culture, etc.
  • a composition comprising an exosome-like vesicle and/or an extracellular vesicle isolated from a lysate of a plant or tissue culture thereof may be used as a composition for improving skin conditions.
  • the step (a) may further include the step of pulverizing by adding isotonic solution or purified water before pulverization.
  • isotonic solution When an isotonic solution is added, it is possible to prevent osmotic pressure from occurring by balancing the concentration inside and outside the callus or cultured root and maintain a normal state.
  • the pulverization may be using a homogenizer. When the callus is pulverized with a homogenizer, it may be to loosen the lumps and at the same time damage the primary and secondary cell walls of plants with hardened cell walls, thereby facilitating the next process, namely, cell wall disruption and filtration.
  • the crushing in step (a) may be physically crushing by applying pressure.
  • the disruption may be to disrupt cells, or to disrupt the extracellular vesicles present inside the cell, in the cell wall, or outside the cell, and the cell bursts to collect the active ingredient inside and then form the endoplasmic reticulum, As the multivesicular body bursts, it may be to re-form the endoplasmic reticulum with a different composition of the membrane or the inside.
  • the lysate of the callus may include, in addition to the extracellular vesicles naturally generated during the culturing of the callus, the extracellular vesicles artificially generated by a physical force such as cell membrane or endoplasmic reticulum disruption.
  • the physical crushing may be to use a high pressure homogenizer, for example, the physical crushing is to crush 1 to 10 times using a microfluidizer. may be, for example, 1 to 8 times, 1 to 6 times, 1 to 5 times, 1 to 4 times, but 1 to 3 times may be appropriate.
  • the step of removing chemical components is added to prevent chemical modification of membrane components or adverse effects caused by chemical components, and contamination may occur during reagent processing.
  • the step of removing chemical components is added to prevent chemical modification of membrane components or adverse effects caused by chemical components, and contamination may occur during reagent processing.
  • physical disruption methods other than those using pressure for example, in the case of a sonicator using high frequency, endoplasmic reticulum may not be formed because not only cell membranes but also DNA are decomposed, and denaturation may occur due to heat generation due to ultrasound. or a problem in which the yield is lowered may occur.
  • the grinding method using a mortar and pestle there may be a problem that the homogenization is not uniform.
  • the pressure may be 700 to 2000 bar, for example, 700 to 1900 bar, 700 to 1800 bar, 700 to 1700 bar, 700 to 1600 bar, 700 to 1500 bar, 700 to 1400 bar , 700 to 1300 bar, 700 to 1200 bar, 700 to 1100 bar, 700 to 1000 bar, 800 to 2000 bar, 800 to 1900 bar, 800 to 1800 bar, 800 to 1700 bar, 800 to 1600 bar, 800 to 1500 bar , 800 to 1400 bar, 800 to 1300 bar, 800 to 1200 bar, 800 to 1100 bar, 800 to 1000 bar, 900 to 2000 bar, 900 to 1900 bar, 900 to 1800 bar, 900 to 1700 bar, 900 to 1600 bar , 900 to 1500 bar, 900 to 1400 bar, 900 to 1300 bar, 900 to 1200 bar, 900 to 1100 bar, 900 to 1000 bar.
  • the pressure may be 700 to 2000 bar. When the pressure is more than 2000 bar, the desired exosome may be destroyed, and if the pressure is less than 700 bar, callus or cell disruption may not occur smoothly
  • step (b) may be to centrifuge the lysate obtained in step (a) to remove debris and filter the recovered supernatant.
  • the centrifugation may be performed at 8,000 to 100,000 ⁇ g for 20 minutes to 2 hours.
  • the step (b) may be filtering with a 0.3 to 1.0 ⁇ m filter, for example, 0.3 to 0.9 ⁇ m, 0.3 to 0.8 ⁇ m, 0.3 to 0.7 ⁇ m, 0.3 to 0.6 ⁇ m, 0.3 to 0.5 ⁇ m, 0.4 to 1.0 ⁇ m, 0.4 to 0.9 ⁇ m, 0.4 to 0.8 ⁇ m, 0.4 to 0.7 ⁇ m, 0.4 to 0.6 ⁇ m, 0.4 to 0.5 ⁇ m.
  • a 0.3 to 1.0 ⁇ m filter for example, 0.3 to 0.9 ⁇ m, 0.3 to 0.8 ⁇ m, 0.3 to 0.7 ⁇ m, 0.3 to 0.6 ⁇ m, 0.3 to 0.5 ⁇ m, 0.4 to 1.0 ⁇ m, 0.4 to 0.9 ⁇ m, 0.4 to 0.8 ⁇ m, 0.4 to 0.7 ⁇ m, 0.4 to 0.6 ⁇ m, 0.4 to 0.5 ⁇ m.
  • the size of the filter is more than 1.0 ⁇ m, cell disruption debris other than exosomes may be introduced and there may be a problem that exosomes cannot be obtained in high purity, and when the size of the filter is less than 0.3 ⁇ m, exosomes of a target size There may be problems in that the inflow of the product is blocked and the yield is lowered.
  • the step (c) may be to use a MWCO (molecular weight cutoff) filter of 20 kDa to 500 kDa.
  • a MWCO molecular weight cutoff
  • MWCO molecular weight cutoff
  • step (c) the lysate is concentrated through the membrane filter, and the material larger than the pore size is caught by the filter, and the material passing through the small material may be removed by diffusion.
  • the ultrafiltered lysate is subjected to a 0.01 to 0.3 ⁇ m filter, for example, 0.01 to 0.25 ⁇ m, 0.01 to 0.2 ⁇ m, 0.1 to 0.3 ⁇ m, 0.1 to 0.25 ⁇ m. , 0.1 to 0.2 ⁇ m, 0.2 to 0.3 ⁇ m, 0.2 to 0.25 ⁇ m filter may further include the step of sterilization and filtration. If the size of the filter exceeds 0.3 ⁇ m, substances other than exosomes may be introduced, so that exosomes cannot be obtained with high purity, and when the size of the filter is less than 0.01 ⁇ m, there may be a problem in that the yield is lowered.
  • the method may be to prepare an extracellular vesicle having a diameter of 20 nm to 400 nm.
  • One aspect provides a cosmetic composition for improving skin condition comprising an extracellular vesicle derived from a plant or tissue culture thereof as an active ingredient.
  • a cosmetic composition for improving skin condition comprising an extracellular vesicle derived from a plant or tissue culture thereof as an active ingredient.
  • plants, tissue cultures, and extracellular vesicles are as described above.
  • the plant is wild ginseng, centella asiatica, ginseng, lavender, jasmine, vitex, rose. Any selected from the group consisting of green barley, green tangerine noni, stone, adenium, myrrh, edelweiss, erengium, luxampire, green tea, apple, grape, aloe, chrysanthemum, tangerine, persimmon, orange, grapefruit, blueberry, and cucumber can be one
  • the plant may be any part selected from the group consisting of flowers, leaves, stems, branches, fruits, fruit skins, and roots of plants, for example, it may be a fruit.
  • the tissue culture may be derived from any one site selected from the group consisting of flowers, leaves, stems, branches, fruits, fruit skins, and roots of plants.
  • the tissue culture may be a callus or cultured root.
  • the callus may be a callus mixed culture solution, a callus recovered by removing the culture supernatant from the callus mixed culture solution, or a culture supernatant recovered after removing the callus from the callus mixed culture solution.
  • the cultured root may be a cultured root mixed culture solution, a cultured root recovered by removing the culture supernatant from the cultured root mixed culture solution, or a culture supernatant recovered after removing the cultured root from the cultured root mixed culture solution.
  • the extracellular vesicles may be derived from a lysate of a plant or a tissue culture thereof. Specifically, the extracellular vesicles may be extracellular vesicles prepared by the above-described manufacturing method.
  • the skin condition improvement may be one or more selected from the group consisting of anti-inflammatory, skin whitening, skin moisturizing, anti-aging, skin regeneration, and wound improvement.
  • anti-inflammatory may be used interchangeably with “inhibiting or improving inflammation”, and may refer to any action in which an immune response is alleviated to suppress NO production.
  • skin lightening may refer to any action that inhibits or prevents skin deposition by inhibiting the synthesis of melanin.
  • moistureturizing the skin may refer to any action that retains moisture in the skin or prevents moisture loss.
  • anti-aging may refer to any action that prevents or inhibits skin aging. Skin aging includes intrinsic aging over time and extrinsic aging caused by external environments.
  • the skin aging may include skin wrinkles, blemishes, blemishes, and the like.
  • the skin wrinkles may be fine wrinkles caused by the deterioration of the skin.
  • the skin wrinkles may be due to photoaging, age, facial expression, lack of moisture, or a combination thereof.
  • the photoaging may be skin aging caused by exposure to ultraviolet rays (including UVA, UVB, and UVC).
  • skin wrinkle improvement may refer to suppressing or inhibiting the formation of wrinkles on the skin, or alleviating the already generated wrinkles.
  • skin regeneration may refer to any action that replenishes a part of the skin when a part of the skin is lost or promotes the proliferation of skin cells.
  • wound amelioration may include use of reducing or alleviating the severity of a wound by promoting skin regeneration.
  • the wound improvement may be to reduce or alleviate the degree of a wound that has already occurred by promoting skin regeneration.
  • wound may be at least one selected from the group consisting of cuts, burns, abrasions, photodamage by ultraviolet (UV) rays, and scars.
  • improvement may refer to any action that at least reduces the severity of a parameter, eg, a symptom, associated with alleviation or treatment of a condition.
  • the composition may inhibit NO production.
  • the composition may inhibit the cytotoxicity of immune cells.
  • the composition may inhibit the expression of tyrosinase.
  • the composition may enhance the expression of Fibronectin.
  • the extracellular vesicles may have a diameter of 20 to 400 nm.
  • the composition comprises 0.000000001 wt% to 80 wt%, for example, 0.000000001 wt% to 60 wt%, 0.000000001 wt% to 40 wt%, 0.000000001 wt% to 30 wt%, 0.000000001 wt% to 20 wt% with respect to the total weight of the composition %, 0.000000001 wt% to 10 wt%, 0.000000001 wt% to 5 wt%, 0.000000001 wt% to 0.001 wt%, 0.000000001 wt% to 0.0001 wt%, 0.000000001 wt% to 0.00001 wt%, 0.0001 wt% to 80 wt%, 0.0001% to 60% by weight, 0.0001% to 40% by weight, 0.0001% to 30% by weight, 0.0001% to 20% by weight, 0.0001% to 10% by weight, 0.0001% to 5% by weight, 0.001% by weight % to 80%, 0.001% to 60%,
  • the composition comprises 10 5 / ml to 10 12 /ml, for example, 10 5 / ml to 10 11 / ml, 10 5 / ml to 10 10 extracellular vesicles /ml, 10 5 /ml to 10 9 /ml, 10 5 /ml to 10 8 /ml, 10 5 /ml to 10 7 /ml, 10 5 /ml to 10 6 /ml , 10 6 /ml to 10 12 /ml, 10 6 /ml to 10 11 /ml, 10 6 /ml to 10 10 /ml, 10 6 /ml to 10 9 /ml, 10 6 /ml to 10 8 /ml, 10 6 /ml to 10 7 /ml, 10 7 /ml to 10 12 /ml, 10 7 /ml to 10 11 /ml, 10 7 /ml to 10 10 pieces/ml, 10 7 pieces/ml to 10 9
  • the term "included as an active ingredient” means that the extracellular vesicles of the present specification are added to an extent capable of exhibiting the above-mentioned effects, and various components are added as subcomponents for delivery and stabilization, etc. It may mean that it includes formulation).
  • the cosmetic composition is a lotion (skin lotion), skin softener, skin toner, astringent, lotion, milk lotion, moisture lotion, nourishing lotion, massage cream, nourishing cream, moisture cream, eye cream, hand cream, foundation, essence, nourishing essence , eye essence, pack, soap, cleansing foam, cleansing lotion, cleansing cream, body lotion, body cream, body cleanser, suspension, gel, powder, paste, mask pack or sheet, or a formulation containing an aerosol composition.
  • the composition of such a formulation can be prepared according to a method conventional in the art.
  • Components included in the cosmetic composition may include components commonly used in cosmetic compositions in addition to the composition as an active ingredient, for example, conventional adjuvants and carriers such as stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and fragrances. may include
  • compositions for external application for skin comprising an extracellular vesicle derived from a plant or tissue culture thereof as an active ingredient.
  • the plant, tissue culture, extracellular vesicles, anti-inflammatory, wound improvement, and composition are the same as described above.
  • the external preparation for skin may be a cream, gel, ointment, skin emulsifier, skin suspension, transdermal patch, drug-containing bandage, lotion, or a combination thereof.
  • the external preparation for skin is a component usually used in external preparations for skin such as cosmetics or pharmaceuticals, for example, an aqueous component, an oily component, a powder component, alcohol, a moisturizer, a thickener, an ultraviolet absorber, a whitening agent, a preservative, an antioxidant, a surfactant, a fragrance , colorant, various skin nutrients, or a combination thereof may be appropriately formulated as needed.
  • the external preparation for skin includes metal-blocking agents such as disodium edetate, trisodium edetate, sodium citrate, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, and gluconic acid, caffeine, tannin, belapamil, licorice extract, glablidine, and kaline.
  • metal-blocking agents such as disodium edetate, trisodium edetate, sodium citrate, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, and gluconic acid, caffeine, tannin, belapamil, licorice extract, glablidine, and kaline.
  • Fruit hot water extracts, various herbal medicines, tocopherol acetate, glitylittic acid, tranexamic acid and derivatives or salts thereof, vitamin C, magnesium ascorbate phosphate, ascorbic acid glucoside, arbutin, kojic acid, glucose, fructose, Sugars, such as trehalose, etc. can be mix
  • Another aspect provides a health functional food composition for anti-inflammatory or wound improvement comprising an extracellular vesicle derived from a plant or tissue culture thereof as an active ingredient.
  • plants, tissue culture, extracellular vesicles, anti-inflammatory, wound improvement, as described above for the composition are also provided.
  • the health functional food composition may be used alone or in combination with other foods or food ingredients derived from the plant or tissue culture thereof, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the purpose of use (prophylactic, health or therapeutic treatment).
  • the composition of the present specification may be added in an amount of 15 parts by weight or less based on the raw material.
  • the beverage composition may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as an additional component like a conventional beverage.
  • the natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • sweetener natural sweeteners such as taumartin and stevia extract, synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame, and the like can be used.
  • the health food composition can also be added to nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, coloring agents, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonated beverages carbonation agent used, or a combination thereof.
  • the health functional food composition may also contain natural fruit juice, fruit juice beverage, fruit flesh for the production of vegetable beverage, or a combination thereof.
  • Another aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating an inflammatory disease comprising an extracellular vesicle derived from a plant or tissue culture thereof or for improving a wound.
  • plants, tissue culture, extracellular vesicles, wound improvement, as described above for the composition are also provided.
  • prevention may mean comprehensively preventing a disease or lowering the likelihood or frequency of occurrence by administering the composition in a pharmaceutically effective amount. For example, it may be to reduce the probability of occurrence or recurrence in a patient who is likely to develop a disease or a patient who has had the disease.
  • pharmaceutically effective amount refers to the type of disease, the patient's age, weight, health, sex, the patient's sensitivity to the drug, the route of administration, the administration method, the number of administration, the treatment period, the combination, or drugs used simultaneously in the medical field. It can be easily determined by a person skilled in the art according to factors well known in
  • treatment may mean comprehensively improving the disease by administering the composition in a pharmaceutically effective amount, and may be to provide relief or cure of the symptoms of the disease in a shorter time compared to natural healing, It may be to improve one symptom or most of the symptoms caused by The pharmaceutically effective amount is as described above.
  • the "inflammatory disease” may be an inflammatory skin disease, an allergic inflammatory disease, an inflammatory eye disease, an inflammatory osteoarticular disease, an inflammatory muscle disease or an inflammatory bowel disease, and the "inflammatory skin disease” is atopic dermatitis, It may be any one selected from the group consisting of psoriasis, contact dermatitis, dermatitis eczema, actinic dermatitis, seborrheic dermatitis, dermatitis herpeticum, lichen planus, lichen planus, pyoderma gangrene, pemphigus, epidermolysis bullosa, allergy, and hypersensitivity. there is.
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable diluent or carrier.
  • the diluent may be lactose, corn starch, soybean oil, microcrystalline cellulose, or mannitol, and the lubricant may be magnesium stearate, talc, or a combination thereof.
  • the carrier may be an excipient, a disintegrant, a binder, a lubricant, or a combination thereof.
  • the excipient may be microcrystalline cellulose, lactose, low-substituted hydroxycellulose, or a combination thereof.
  • the disintegrant may be carboxymethyl cellulose calcium, sodium starch glycolate, anhydrous calcium monohydrogen phosphate, or a combination thereof.
  • the binder may be polyvinylpyrrolidone, low-substituted hydroxypropylcellulose, hydroxypropylcellulose, or a combination thereof.
  • the lubricant may be magnesium stearate, silicon dioxide, talc, or a combination thereof.
  • Another aspect provides the use of an extracellular vesicle derived from a plant or a tissue culture thereof for the manufacture of a cosmetic composition for improving skin conditions.
  • skin condition, improvement, cosmetic composition, plant or tissue culture thereof, extracellular vesicles derived from plant or tissue culture thereof are as described above.
  • Another aspect provides the use of an extracellular vesicle derived from a plant or a tissue culture thereof for the preparation of a composition for external application for skin for anti-inflammatory or wound improvement.
  • anti-inflammatory, wound improvement, external composition for skin, plant or tissue culture thereof, extracellular vesicles derived from plant or tissue culture thereof are as described above.
  • Another aspect provides the use of an extracellular vesicle derived from a plant or a tissue culture thereof for the manufacture of a nutraceutical composition for anti-inflammatory or wound healing.
  • anti-inflammatory, wound improvement, health functional food composition, plant or tissue culture thereof, extracellular vesicles derived from a plant or tissue culture thereof are as described above.
  • Another aspect provides a method for improving, preventing, or treating a condition of a subject, comprising administering to the subject in need thereof an effective amount of an extracellular vesicle derived from a plant or tissue culture thereof.
  • plants or tissue cultures thereof, extracellular vesicles derived from plants or tissue cultures thereof, improvement, prevention, and treatment are the same as described above.
  • the subject's condition may be a skin condition or a condition related to inflammation, for example, an inflammatory disease, as described above for the skin condition or the inflammatory disease.
  • administering means the arrangement of the composition according to
  • Administration may be administered by methods known in the art. Administration may be administered directly to a subject by any means, for example, intravenous, intramuscular, oral, transdermal, mucosal, intranasal, intratracheal or subcutaneous administration. can The administration may be systemically or locally.
  • the subject may be a mammal, such as a human, cow, horse, pig, dog, sheep, goat, or cat.
  • the subject may be an individual in need of skin condition improvement, for example, skin inflammation suppression, skin whitening, skin moisturizing, skin barrier strengthening, skin regeneration, wound improvement, and skin aging suppression effect, or improvement of inflammatory diseases , may be a subject in need of a prophylactic, or therapeutic effect.
  • the administration is 0.1 mg to 1,000 mg, for example, 0.1 mg to 500 mg, 0.1 mg to 100 mg, 0.1 mg to 50 mg, 0.1 mg to 25 mg, 1 mg to 1 mg of the composition according to one embodiment per day 1,000 mg, 1 mg to 500 mg, 1 mg to 100 mg, 1 mg to 50 mg, 1 mg to 25 mg, 5 mg to 1,000 mg, 5 mg to 500 mg, 5 mg to 100 mg, 5 mg to 50 mg, 5 mg to 25 mg, 10 mg to 1,000 mg, 10 mg to 500 mg, 10 mg to 100 mg, 10 mg to 50 mg, or 10 mg to 25 mg may be administered.
  • the dosage may be prescribed in various ways depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, morbidity, food, administration time, administration route, excretion rate and reaction sensitivity, and those skilled in the art
  • the dosage may be appropriately adjusted in consideration of these factors.
  • the number of administration may be once a day or twice or more within the range of clinically acceptable side effects, and may be administered to one or two or more sites for the administration site, and total daily or at intervals of 2 to 5 days
  • the number of days of administration may range from 1 to 30 days per treatment. If necessary, the same treatment can be repeated after a titration period.
  • the dose is the same as that of a human per kg, or the above dose is converted, for example, by the volume ratio (for example, average value) of the target animal and the organ (heart, etc.) of the human One dose can be administered.
  • the method for producing extracellular vesicles derived from a plant or tissue culture according to an aspect can obtain a large amount of extracellular vesicles with excellent functional activity, so that a cosmetic composition for improving skin condition, a health functional food composition, a composition for external application for the skin, pharmaceutical composition It can be usefully used in the preparation of the composition.
  • FIG. 1 is a flowchart schematically illustrating a method for producing an extracellular vesicle derived from a plant or tissue culture thereof according to an embodiment.
  • Figure 2 is a flowchart exemplarily showing a method for producing an extracellular vesicle derived from a plant callus mixed culture lysate according to an embodiment.
  • FIG. 3 is a flowchart exemplarily illustrating a method for producing an extracellular vesicle derived from a plant callus lysate according to an embodiment.
  • FIG. 4 is a flowchart exemplarily illustrating a method for producing an extracellular vesicle derived from a plant callus culture supernatant lysate according to an embodiment.
  • FIG. 5 is a flowchart exemplarily illustrating a method for preparing an extracellular vesicle derived from a plant fruit lysate according to an embodiment.
  • FIG. 6 is a photograph of observing the change in turbidity of a complex sample according to the repetition of the cell wall disruption and debris removal process.
  • 7A to 7D are photographs of microscopic observation of changes in cell morphology of complex samples according to an increase in the number of cell wall disruptions.
  • 8A to 8E are graphs in which the number of particles according to the size of the extracellular vesicles isolated by the method of Examples 1-1 to 1-4 and Comparative Example 1-1 was measured by nano-sight, respectively.
  • Figures 9a to 9c are graphs comparing the size distribution of extracellular vesicles according to the increase in the number of cell wall disruptions of the lysate sample in Example 1-2, and cells when disrupted once, twice, and three times with a high-pressure homogenizer, respectively; It is a graph measuring the number of particles according to the size of the exoplasmic reticulum with nano-sight.
  • Example 10 shows extracellular vesicles isolated from the grape callus mixed culture solution of Examples 1-1 to 1-4, grape callus, grape callus culture supernatant, and lysate of grape fruit, and isolated from the grape fruit juice of Comparative Example 1-1; This is the result of comparative analysis of the anti-inflammatory effect after treating the extracellular vesicles with Raw264.7 macrophages.
  • Example 11 shows the mixed culture solution of grape callus of Examples 1-1 to 1-4, the grape callus, the culture supernatant of the grape callus, and the extracellular vesicles isolated from the lysate of the grape fruit and the juice of the grape fruit of Comparative Example 1-1. It is a photograph observing the wound healing effect of the isolated extracellular vesicles.
  • Extracellular vesicles containing exosome-like vesicles from various plants or callus or cultured roots induced by tissue culture thereof are separated according to the method of the following example (this is called 'HPEV' process), and the plant or tissue culture-derived extracellular An endoplasmic reticulum was prepared and used for yield evaluation, functional activity evaluation, and the like.
  • Example 1-1 Isolation of extracellular vesicles derived from grape callus mixed culture lysate (complex sample)
  • the sterilized grape skins were cut to a height of 5 mm or less and a width of 2 to 5 mm, followed by dentition in a stem cell induction medium and cultured.
  • 3% Sucrose, B5 Medium (Duchefa, Haarlem, Netherlands) was added as a growth regulator, NAA (1-naphthylacetic acid), an auxin, at a concentration of 0.4 ppm, and Cytokinin, BAP (6-benzylaminopurine) was added at a concentration of 0.1 ppm.
  • the prepared medium was adjusted to pH 5.8.
  • Cultivation was carried out in a dark room controlled at 27 ⁇ 1°C. After 15 days of culture, amorphous callus by dedifferentiation began to be induced. After 20 days of culture, the separated callus was placed in a flask containing a liquid medium and incubated in a dark room controlled at 27 ⁇ 1° C. on a rotating shaker at 70 rpm.
  • Example 1-1 (1) An isotonic solution was added to the mixed culture solution of grape callus cultured in the liquid medium of Example 1-1 (1) (hereinafter referred to as a complex sample) and pulverized using a homogenizer (Homogenizer, T50D, IKA, Aachen, Germany). .
  • the obtained pulverized product was subjected to cell wall disruption at a pressure of 1000 bar using a high-pressure homogenizer (Microfludizer, MN600P-300, Picomax, Seoul, Republc of Korea).
  • the eluted sample was subjected to ultrafiltration (ultrafiltration, Pellicon ® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany) with a MWCO (molecular weight cutoff) 100 kDa filter to separate extracellular vesicles over 100 kDa.
  • ultrafiltration ultrafiltration, Pellicon ® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany
  • MWCO molecular weight cutoff
  • sterilization was filtered through a 0.2 ⁇ m sterilization filter, and after freeze-drying, it was stored at -20°C and used for the following test.
  • Example 1-2 Isolation of extracellular vesicles derived from grape callus lysate (lysate sample)
  • the mixed culture solution of grape callus cultured in the liquid medium of Example 1-1 (1) was separated from the callus using a standard sieve of 100 to 200 ⁇ m and a nylon mesh network, and after sieving, grape callus (hereinafter, as lysate sample) name) was recovered.
  • Isotonic solution was added to the recovered grape callus and pulverized using a homogenizer (Homogenizer, T50D, IKA, Aachen, Germany).
  • the obtained pulverized product was subjected to cell wall disruption at a pressure of 1000 bar using a high-pressure homogenizer (Microfludizer, MN600P-300, Picomax, Seoul, Republc of Korea).
  • the obtained callus lysate was centrifuged at 10,000 ⁇ g at 4° C. for 30 minutes to remove cell-related debris and a supernatant was obtained. The cell wall disruption and debris removal process was repeated three times. The obtained supernatant was filtered through a 0.45 ⁇ m sterile filter to further remove residual cell debris.
  • the eluted sample was subjected to ultrafiltration (ultrafiltration, Pellicon ® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany) with a MWCO (molecular weight cutoff) 100 kDa filter to separate extracellular vesicles over 100 kDa.
  • Figures 9a to 9c are graphs comparing the size distribution of extracellular vesicles according to the increase in the number of cell wall disruptions of the lysate sample in Example 1-2, and cells when disrupted once, twice, and three times with a high-pressure homogenizer, respectively; It is a graph measuring the number of particles according to the size of the exoplasmic reticulum with nano-sight. As a result, as shown in FIGS. 9a to 9c, it was confirmed that the size of the particles was homogenized as the number of cell wall disruptions increased.
  • the mixed culture solution of grape callus cultured in the liquid medium of Example 1-1 (1) was separated from the callus using a standard sieve of 100 to 200 ⁇ m and a nylon mesh network, and the culture supernatant after sieving (hereinafter, culture medium sample) named) was recovered.
  • the obtained culture supernatant was disrupted at a pressure of 1000 bar using a high-pressure homogenizer (Microfludizer, MN600P-300, Picomax, Seoul, Republc of Korea) to induce reconstitution of the extracellular vesicles secreted into the culture solution and then sterilize to 0.45 ⁇ m Filtration with a filter.
  • a high-pressure homogenizer Microfludizer, MN600P-300, Picomax, Seoul, Republc of Korea
  • the eluted sample was subjected to ultrafiltration (ultrafiltration, Pellicon® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany) with a MWCO (molecular weight cutoff) 100 kDa filter to separate extracellular vesicles over 100 kDa.
  • the obtained solution was sterilized and filtered through a 0.2 ⁇ m sterilization filter, and after freeze-drying, it was stored at -20°C and used for the following test.
  • Isotonic solution was added to the grape fruit that had undergone sterilization, and the pressure was increased to 1000 bar using a homogenizer (Homogenizer, T50D, IKA, Aachen, Germany) and a high-pressure homogenizer (Microfludizer, MN600P-300, Picomax, Seoul, Republc of Korea). Cell wall disruption was performed. The obtained lysate was centrifuged at 10,000 ⁇ g at 4° C. for 30 minutes to remove cell-related debris and a supernatant was obtained. The obtained supernatant was filtered through a 0.45 ⁇ m sterile filter to further remove residual cell debris.
  • the eluted sample was subjected to ultrafiltration (ultrafiltration, Pellicon ® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany) with a MWCO (molecular weight cutoff) 100 kDa filter to separate extracellular vesicles over 100 kDa.
  • ultrafiltration ultrafiltration, Pellicon ® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany
  • MWCO molecular weight cutoff
  • sterilization was filtered through a 0.2 ⁇ m sterilization filter, and after freeze-drying, it was stored at -20°C and used for the following test.
  • Isotonic solution was added to the washed grape fruits, and the cell wall was disrupted using a homogenizer (Homogenizer, T50D, IKA, Aachen, Germany) to obtain a juice. Centrifugation was performed at 10,000 ⁇ g at 4° C. for 30 minutes to remove cell-related debris and a supernatant was obtained. The obtained supernatant was filtered through a 0.45 ⁇ m sterile filter to further remove residual cell debris. The eluted sample was subjected to ultrafiltration (ultrafiltration, Pellicon ® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany) with a MWCO (molecular weight cutoff) 100 kDa filter to separate extracellular vesicles over 100 kDa.
  • a homogenizer Homogenizer, T50D, IKA, Aachen, Germany
  • Juice.UF sample (hereinafter referred to as Juice.UF sample)
  • Juice.UF sample In order to additionally remove impurities, sterilization and filtration were performed with a 0.2 ⁇ m sterilization filter, and after freeze-drying, it was stored at -20°C and used for the following test.
  • Example 2-1 Isolation of extracellular vesicles derived from apple callus mixed culture lysate (complex sample)
  • Extracellular vesicles were isolated in the same manner as in Example 1-1, except that in Example 1-1, callus was induced from apples instead of grapes.
  • Apple callus was induced in the following way. Specifically, the sterilized apple fruit was cut to a height of 5 mm or less and a width of 2 to 5 mm, followed by dentition in a stem cell induction medium and cultured. 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid), an auxin as a growth regulator, was added to a medium containing 3% Sucrose, MS Medium (Duchefa, Haarlem, Netherlands) at a concentration of 0.5 ppm, and cytokines Cytokinin, BAP (6-benzylaminopurine) was added at a concentration of 1 ppm. The prepared medium was adjusted to pH 5.8. Cultivation was carried out in a dark room controlled at 27 ⁇ 1°C.
  • amorphous callus by dedifferentiation began to be induced. After 20 days of culture, the separated callus was placed in a flask containing a liquid medium and incubated in a dark room controlled at 27 ⁇ 1° C. on a rotating shaker at 70 rpm.
  • Example 3-1 Isolation of extracellular vesicles derived from lysate of jasmine callus mixed culture (complex sample)
  • Extracellular vesicles were isolated in the same manner as in Example 1-1, except that in Example 1-1, callus was induced from jasmine instead of grapes.
  • Jasmine callus was induced in the following way. Specifically, jasmine leaves that had undergone a sterilization process were cut to a height of 5 mm or less and a width of 2 to 5 mm, followed by dentition in a stem cell induction medium and cultured. 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid), an auxin as a growth regulator, was added to a medium containing 3% Sucrose, MS Medium (Duchefa, Haarlem, Netherlands) at a concentration of 2 ppm, and cytokinesis Cytokinin, BAP (6-benzylaminopurine) was added at a concentration of 2 ppm. The prepared medium was adjusted to pH 5.8.
  • Cultivation was carried out in a dark room controlled at 27 ⁇ 1°C. After 15 days of culture, amorphous callus by dedifferentiation began to be induced. After 20 days of culture, the separated callus was placed in a flask containing a liquid medium and incubated in a dark room controlled at 27 ⁇ 1° C. on a rotating shaker at 70 rpm.
  • Example 4-1 Isolation of extracellular vesicles derived from lavender callus mixed culture medium (complex sample)
  • Extracellular vesicles were isolated in the same manner as in Example 1-1, except that in Example 1-1, callus was induced from lavender instead of grapes.
  • Lavender callus was induced in the following way. Specifically, lavender leaves that had undergone a sterilization process were cut to a height of 5 mm or less and a width of 2 to 5 mm, followed by dentition in a stem cell induction medium and cultured. 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid), an auxin as a growth regulator, was added to a medium containing 3% Sucrose, MS Medium (Duchefa, Haarlem, Netherlands) at a concentration of 1 ppm, and cytokines Cytokinin, BAP (6-benzylaminopurine) was added at a concentration of 0.5 ppm. The prepared medium was adjusted to pH 5.8.
  • Cultivation was carried out in a dark room controlled at 27 ⁇ 1°C. After 15 days of culture, amorphous callus by dedifferentiation began to be induced. After 20 days of culture, the separated callus was placed in a flask containing a liquid medium and incubated in a dark room controlled at 27 ⁇ 1° C. on a rotating shaker at 70 rpm.
  • Example 5-1 Isolation of extracellular vesicles derived from the mixed culture medium of wild ginseng root (complex sample)
  • Extracellular vesicles were isolated in the same manner as in Example 1-1, except that cultured roots were induced from wild ginseng instead of grape callus in Example 1-1.
  • Wild ginseng cultured roots were induced in the following way. Specifically, wild ginseng main roots that had undergone a sterilization process were cut to 2-5 mm in length and then cultured in a cultured root induction liquid medium. 3% Sucrose, SH Medium (Duchefa, Haarlem, Netherlands) was added to a medium containing IBA (Indole-3-Butyric Acid) as a growth regulator at a concentration of 5 ppm. The prepared medium was adjusted to pH 5.8. Cultivation was carried out in a dark room controlled at 27 ⁇ 1°C. After 15 days of culture, cultured wild ginseng roots began to be induced. After 20 days of culture, the separated wild ginseng cultured roots were placed in a flask containing a liquid medium and cultured in a dark room controlled at 27 ⁇ 1° C. on a 70 rpm rotary shaker.
  • IBA Indole-3-Butyric Acid
  • Example 6-1 Isolation of extracellular vesicles derived from lysate of rose callus mixed culture (complex sample)
  • Extracellular vesicles were isolated in the same manner as in Example 1-1, except that in Example 1-1, a callus was induced from a rose instead of grapes.
  • Rose callus was induced in the following way. Specifically, the sterilized rose petals were incised to a height of 5 mm or less and a width of 2 to 5 mm, followed by dentition in a stem cell induction medium and cultured. 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid), an auxin as a growth regulator, was added to a medium containing 3% Sucrose and MS Medium (Duchefa, Haarlem, Netherlands) at a concentration of 1 ppm. The prepared medium was adjusted to pH 5.8. Cultivation was carried out in a dark room controlled at 27 ⁇ 1°C. After 15 days of culture, amorphous callus by dedifferentiation began to be induced. After 20 days of culture, the separated callus was placed in a flask containing a liquid medium and incubated in a dark room controlled at 27 ⁇ 1° C. on a rotating shaker at 70 rpm.
  • 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) an
  • nano-sight was performed to measure the size and concentration of the extracellular ER.
  • the extracellular vesicle samples isolated in Examples 1-1 to 1-4 and Comparative Example 1-1 were diluted with PBS or tertiary distilled water so that the number of particles was 1x10 8 to 4x10 8 , and the number of frames during measurement was 20 It was set to ⁇ 30. 1 ml of the diluted sample was loaded into the instrument chamber. After focusing on the particle, adjusting the camera level, measurement was started. The capture duration was set to 30 to 60 seconds and repeated measurements were performed 3 times. After the measurement, the detection threshold was adjusted, and analysis was performed based on the value measured three times. In this case, it was considered appropriate if the pattern of the results repeated three times showed a similar pattern.
  • FIGS. 8a to 8E are graphs measuring the number of particles according to the size of the extracellular vesicles separated by the method of Examples 1-1 to 1-4 and Comparative Example 1-1 by nano-sight, respectively. As a result, as shown in FIGS. 8a to 8e, it was confirmed that most of the endoplasmic reticulum separated by the method of Examples 1-1 to 1-4 and Comparative Example 1-1 had a diameter of 80 to 200 nm.
  • Example 1-1 a lot of extracellular vesicles having a diameter of 80 to 100 nm were measured, in the case of Example 1-2, a lot of ERs having a diameter of 100 to 120 nm were measured, and in Example 1-3, 100 A lot of ERs were measured to 130 nm, and in the case of Examples 1-4, it was found that many ERs having a diameter of 150 to 200 nm were measured. In addition, in the case of Comparative Example 1-1, it was found that many vesicles having a diameter of 130 to 200 nm were measured.
  • Example 1-1 Example 1-2 Examples 1-3 Examples 1-4 Comparative Example 1-1 Number of particles (unit: particles/ml) 8.80e+9 (8.8 billion) 5.38e+9 (5.4 billion) 1.27e+09 (1.3 billion) 4.14e+08 (400 million) 3.77e+07 (0.4 billion)
  • Examples 1-1 to 1-4 and Comparative Example 1-1 In order to confirm the anti-inflammatory effect of the extracellular vesicles isolated in Examples 1-1 to 1-4 and Comparative Example 1-1, Examples 1-1 to 1-4 and Comparative Example 1- to Raw264.7 macrophages After treating the extracellular vesicles isolated in 1, the amount of NO production was evaluated.
  • Raw264.7 macrophages were cultured in DMEM medium containing 10% FBS and aliquoted to each have a density of 80% in a 96-well plate. After incubation for 24 hours, samples of LPS, an inflammatory substance, 1ug/mL, Examples 1-1 to 1-4, and Comparative Example 1-1 were treated at concentrations of 25ug/mL and 100ug/mL and further cultured for 24 hours.
  • the control group was treated with PBS, the negative control group was treated with only LPS 1ug/mL, and the positive control group was treated with LPS 1ug/mL and then treated with ascorbic acid.
  • the extracellular vesicles isolated in Examples 1-1 to 1-4 reduced NO production in a concentration-dependent manner, and more NO production than the extracellular vesicles isolated in Comparative Example 1-1. It was confirmed that the inhibitory effect was significantly improved. This means that the extracellular vesicles with remarkably improved anti-inflammatory activity were isolated according to the preparation method of the present invention for performing crushing of a callus mixed culture medium, callus, callus culture supernatant, or fruit.
  • human dermal fibroblast cells were seeded in a 6 well plate at 200,000 cells/well, respectively. After 24 hours, scratches were applied using a sterile 1ml pipette tip. After scratching, the extracellular vesicles isolated in Examples 1-1 to 1-4 and Comparative Example 1-1 were treated, PBS treatment was used as a control, and a medium containing FBS was used as a positive control, 0, 24 , and pictures were taken after treatment for 32 hours.
  • Example 11 is an extracellular vesicle isolated from the mixed culture solution of grape callus of Examples 1-1 to 1-4, the grape callus, the culture supernatant of the grape callus, and the lysate of the grape fruit, and the juice of the grape fruit of Comparative Example 1-1. It is a photograph observing the wound healing effect of the isolated extracellular vesicles.
  • Example 1-1 when cell migration was analyzed 24 and 32 hours after wounding, in Examples 1-2 to 1-4, and Comparative Example 1-1, cell migration at a level similar to that of the control group
  • Example 1-1 when Example 1-1 and Comparative Example 1-1 were compared, there was a clear difference, indicating that the extracellular vesicles derived from the lysate of the mixed culture solution of grape callus stimulated the wound healing mechanism in fibroblasts to promote wound healing. Confirmed. This means that the extracellular vesicles with significantly improved wound regeneration activity were isolated according to the preparation method of the present invention for performing disruption of the callus mixed culture.
  • Examples 1-1 and 2-1 on Raw264.7 macrophages , 3-1, 4-1, and LDH assay was performed after treating the isolated extracellular vesicles in 5-1.
  • Raw264.7 macrophages were seeded at 20,000 cells/well in a 96 well plate. After incubation for 24 hours, 1ug/mL of LPS, an inflammatory substance, and samples of Examples 1-1, 2-1, 3-1, 4-1, and 5-1 were treated at concentrations of 0.1ug/mL and 10ug/mL and further cultured for 48 hours. A control group was treated with PBS, and a negative control group treated with only LPS 1ug/mL was used. 100ul of assay buffer was dispensed into each well and reacted for 30 minutes at room temperature by blocking light. The reaction was terminated by treating each well with 50ul of Stop solution. After that, absorbance was measured at 490 nm.
  • mice melanoma cells were seeded at 50,000 cells/well in a 12 well plate, respectively.
  • 0.5 ⁇ M of ⁇ -MSH a substance that promotes the production of melanin
  • samples of Examples 1-1, 2-1, 3-1, and 4-1 were treated at a concentration of 10 ⁇ g/ml for 48 hours Further incubation.
  • the control group was treated with PBS, the negative control group was treated with only ⁇ -MSH 0.5 ⁇ M, and the positive control group was treated with ⁇ -MSH 0.5 ⁇ M and then treated with Kojic acid.
  • RNA was isolated and quantified using RNA Kit.
  • cDNA was synthesized from the quantified RNA using a cDNA synthesis kit. qRT-PCR was performed by mixing the synthesized cDNA with Tyrosinase Primer and SYBR Green. 13 is an extracellular vesicle isolated from each lysate of the grape callus mixed culture solution, apple callus mixed culture solution, jasmine callus mixed culture solution, and lavender callus mixed culture solution of Examples 1-1, 2-1, 3-1, and 4-1. It is the result of comparative analysis of the whitening effect of
  • the mixed culture solution of grape callus mixed culture solution, apple callus mixed culture solution, jasmine callus mixed culture solution, and lavender callus of Examples 1-1, 2-1, 3-1, and 4-1 It was confirmed that the extracellular vesicles isolated from the vesicles significantly reduced the expression level of Tyrosinase, and in particular, it was confirmed that the expression level of tyrosinase was most excellently reduced in the group treated with the extracellular vesicles isolated from the jasmine callus mixed culture of Example 3-1. did.
  • the production method of the present invention for performing crushing of the callus mixed culture is capable of separating the extracellular vesicles with significantly improved skin whitening activity for various plant species. means you can
  • HaCaT cells which are dermal keratinocytes, were seeded in a 12 well plate at 50,000 cells/well, respectively. After culturing for 24 hours, the samples of Examples 1-1, 2-1, 3-1, 5-1, and 6-1 were treated at a concentration of 10 ⁇ g/mL and further cultured for 48 hours. As a control, a PBS treated one was used. RNA was isolated and quantified using RNA Kit. cDNA was synthesized from the quantified RNA using a cDNA synthesis kit. qRT-PCR was performed by mixing the synthesized cDNA with Fibronectin Primer and SYBR Green.
  • the grape callus mixed culture solution, apple callus mixed culture solution, jasmine callus mixed culture solution, wild ginseng cultured root of Examples 1-1, 2-1, 3-1, 5-1, and 6-1 It was confirmed that the extracellular vesicles isolated from the mixed culture medium and the rose callus mixed culture significantly increased the Fibronectin expression level, and in particular, it was confirmed that the Fibronectin expression level was most excellently increased in the wild ginseng cultured root.
  • the production method of the present invention for performing crushing of a callus mixed culture medium or cultured root mixed culture medium has significantly improved skin regeneration activity for various plant species This means that extracellular vesicles can be isolated.

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Abstract

본 발명은 식물 또는 이의 조직배양물 유래 세포 외 소포체를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 일 양상에 따른 식물 또는 이의 조직배양물 유래 세포 외 소포체 제조 방법은 기능적 활성이 우수한 세포 외 소포체를 대량으로 수득할 수 있어, 피부 상태 개선용 조성물의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

식물 유래 세포 외 소포체를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 및 이의 제조방법
본 발명은 식물 유래 세포 외 소포체를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
식물 유래 유용 물질의 대부분은 항바이러스, 항박테리아, 항암, 항산화 능력 등의 생리 활성이 있어, 신규 효능 물질로서 발전 가능한 이상적인 자원으로 주목받고 있으며, 식물을 유래로 하기 때문에 효능이 있으면서도 인체에 친화적이라는 장점 또한 가지고 있다.
세포 외 소포체는 세포간 정보교환을 위해 세포에서 분비하는 막 구조의 소포체의 총칭으로, 엑소좀(exosome), 엑토좀(ectosome), 마이크로소포체(microvesicle), 마이크로입자 (microparticle), 세포자멸체(apoptotic body) 등을 포함한다. 엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 인지질 이중막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 cytokine, growth factor, miRNA, DNA, 단백질 등이 포함되어 있으며, 분비하는 기원 세포(공여 세포)의 상태를 반영하므로 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다.
엑소좀은 다양한 종류의 체액, 예를 들어 침, 소변, 혈장, 혈청, 양수로부터 분리할 수 있고 여러 종류의 세포 배양 상층액에서도 분리가 가능하다. 인간 줄기세포 배양 상층액으로부터 분리된 엑소좀의 특정 용도 등에 대한 연구가 진행된 바 있으며 (한국공개특허 10-2016-0086253), 식물 세포 내 또는 세포벽과 세포막 사이에도 엑소좀의 존재가 보고되고 있으나, 식물, 식물 캘러스, 또는 식물 배양근의 파쇄물로부터 유래된 엑소좀 등의 세포 외 소포체의 분리 정제 및 특성 분석에 대한 연구는 미미한 실정이다.
일 양상은 (a) 식물 또는 이의 조직배양물의 파쇄물을 수득하는 단계; (b) 상기 파쇄물을 여과하는 단계; 및 (c) 상기 여과된 파쇄물을 한외여과하는 단계;를 포함하는 식물 또는 이의 조직배양물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 상처 개선용 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 상처 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 피부 상태를 개선하기 위한 화장료 조성물의 제조를 위한, 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체(extracellular vesicle)의 용도를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 항염증 또는 상처 개선을 위한 피부외용제 조성물의 제조를 위한, 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체(extracellular vesicle)의 용도를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 항염증 또는 상처 개선을 위한 건강기능식품 조성물의 제조를 위한, 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체(extracellular vesicle)의 용도를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체(extracellular vesicle)의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 상태를 개선, 예방, 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 (a) 식물 또는 이의 조직배양물의 파쇄물을 수득하는 단계; (b) 상기 파쇄물을 여과하는 단계; 및 (c) 상기 여과된 파쇄물을 한외여과하는 단계;를 포함하는 식물 또는 이의 조직배양물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 제조하는 방법을 제공한다.
용어 “세포 외 소포체(extracellular vesicle)”는 세포에서 분비되어 세포 외 공간으로 방출된 소포체(vesicles)를 의미하는 것으로서, 막 구조 소포체로 내부와 외부가 구분되며, 세포의 세포막 지질(plasma membrane lipid)과 세포막 단백질(plasma membrane protein), 핵산(nucleic acid), 및 세포질 성분 등을 가지고 있고, 원래 세포보다 크기가 작은 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 세포가 터지면서 내부의 유효 성분을 포집한 뒤 형성된 소포체나 디소포체가 터지면서 막이나 내부의 유효 성분 조성이 재구성된 소포체 등을 포함하는 것일 수 있다. 상기 세포 외 소포체는 다른 세포에 결합하여 막 구성요소, mRNAs, miRNAs 등을 전달해 주고, 이들 전달 물질을 수용 세포에 전달해 줌으로써 세포-세포 간 소통을 매개하는 세포 외 전달체로 작용하는 것일 수 있다.
용어 “엑소좀 유사 소포체(exosome like vesicle)”는 나노 크기의 세포 외 소포체를 의미하는 것으로서, 나노 크기의 엑소좀을 포함할 뿐만 아니라 나노 크기의 소포체 구조 및 그 조성물이 엑소좀과 유사한 소포체를 모두 포함하는 최광의 개념일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 엑소좀 및/또는 엑소좀 유사 소포체를 포함하는 것일 수 있다.
용어 "식물"은 전체 식물(whole plant) 또는 식물의 일부분일 수 있으며, 구체적으로, 식물 조직, 식물 세포, 및 식물 종자를 모두 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 식물은 식물의 꽃, 잎, 줄기, 가지, 열매, 열매 껍질, 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 부위일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 식물은 산삼, 병풀, 인삼, 라벤더, 자스민, 바이텍스, 장미. 청보리, 청귤 노니, 돌외, 아데니움, 몰약, 에델바이스, 에렌지움, 룩샘파이어, 녹차, 사과, 포도, 알로에, 국화, 감귤, 감, 오렌지, 자몽, 블루베리, 및 오이로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
상기 "포도"는 갈매나무목(Rhamnales), 포도과(Vitaceae)에 속하는 덩굴성 식물로 적도부근 및 위도 50°이상 지역을 제외한 지구상 전역에서 자생 혹은 재배되는 것일 수 있다. 포도과에는 11속 700 여종이 알려져 있으며, 유럽종 포도(Vitis vinifera), 미국종 포도(Vitis labrusca), 강변 포도(Vitis riparia), 사막 포도(Vitis rupestris), 겨울 포도(Vitis berladieri), 머루(Vitis coignetiae), 왕머루(Vitis amurensis) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 “식물의 조직배양물”은 식물 조직의 일부를 조직배양용 배지에 옮겨 배양함으로써 유도되는 것을 총칭하는 것으로, 식물의 꽃, 잎, 줄기, 가지, 열매, 열매 껍질, 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 부위로부터 유도된 것일 수 있으며, 예를 들어, 캘러스 (callus) 또는 배양근일 수 있다.
용어 “캘러스 (callus)”는 식물의 조직화되지 않은 유세포 덩어리로, 전형성능을 갖는 세포를 의미하는 것으로 체세포배, 식물 줄기세포를 포함할 수 있으며, 또한 식물 조직의 일부를 조직배양용 배지에 옮겨 배양함으로써 유도되는 것일 수 있다. 상기 캘러스의 유도는 당업계에 공지된 통상의 방법을 통해 수행될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 캘러스의 유도는 식물체의 조직 또는 이의 절편체를 조직배양용 배지에서 배양하여 이루어지는 것일 수 있다. 상기 조직배양용 배지로는 MS (Murashige and Skoog, 1962) 배지, SH Medium (Duchefa, Haarlem, Netherlands), N6 (Chu et al., 1975), B5 (Gamborg et al., 1968), NN (Nitsch andNitsch, 1967) 배지, WHITE 배지 등 다양한 식물의 기본 배지를 사용할 수 있다. 또한, 상기 조직배양용 배지는 식물 생장조절제가 첨가된 것을 사용할 수 있다. 상기 식물 생장조절제는 당업계에 공지된 물질을 이용할 수 있으며, 예를 들어, 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 2,4,5-T (2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid), Dicamba (2-methoxy-3,6-dichlorobenzoic acid), IAA (indole-3-acetic acid),IBA (indole-3-butyric acid), MCPA (2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid), NAA (1-naphthylacetic acid), NOA (2-naphthyloxyacetic acid), Picloram (4-amino-2,5,6-trichloropicolinic acid) 등의 옥신(Auxin)류; BAP (6-benzylaminopurine), 2iP (N6-(2-isopentyl)adenine), Kinetin (6-furfurylaminopurine), Thidiazuron (1-phenyl-3-(1,2,3-thiadiazol-5-yl)urea), Zeatin (4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine) 등의 사이토키닌(Cytokinin)류 및 이의 유도체를 포함할 수 있다. 이외에도 조직배양용 배지에는 세포의 분화 및 증식에 작용하는 알카로이드류, 테르페노이드류, 카로테노이드류, 페놀류 화합물 및 천연 추출물 등을 추가로 첨가할 수 있다.
용어 “배양근”은 주근에서 조직을 떼어내어 식물 생장조절제가 첨가된 영양배지에서 배양하고 가는 뿌리를 유도되어 얻은 부정근을 의미할 수 있다. 식물 조직의 일부를 조직배양용 배지에 옮겨 뿌리만 유도하여 얻은 것일 수도 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 캘러스는 캘러스 혼합 배양액일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 캘러스는 캘러스 혼합 배양액으로부터 배양 상등액을 제거하고 회수한 캘러스일 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 상기 캘러스는 캘러스 혼합 배양액으로부터 캘러스를 제거하고 회수한 배양 상등액일 수 있다.
상기 식물 캘러스 혼합 배양액으로부터 캘러스 또는 배양 상등액을 분리하기 위해 표준체 및 메쉬망이 사용될 수 있으며, 기공 크기는 100 ㎛ 내지 200 ㎛이 적절할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 원심분리기, 여과 장치, 정성 여과지 등 당해 기술분야에서 캘러스와 배양상등액을 분리하기 위해 사용되는 통상적인 방법이 사용될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 배양근은 배양근 혼합 배양액일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 배양근은 배양근 혼합 배양액으로부터 배양 상등액을 제거하고 회수한 배양근일 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 상기 배양근은 배양근 혼합 배양액으로부터 배양근을 제거하고 회수한 배양 상등액일 수 있다.
상기 식물 배양근 혼합 배양액으로부터 배양근 또는 배양 상등액을 분리하기 위해 표준체 및 메쉬망이 사용될 수 있으며, 기공 크기는 100 ㎛ 내지 200 ㎛이 적절할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 원심분리기, 여과 장치, 정성 여과지 등 당해 기술분야에서 배양근과 배양상등액을 분리하기 위해 사용되는 통상적인 방법이 사용될 수 있다.
용어 “캘러스 혼합 배양액” 또는 용어 “배양근 혼합 배양액”은 식물 캘러스 또는 배양근이 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 캘러스 또는 배양근을 일정기간 배양하여 얻는 상기 캘러스 또는 배양근, 이의 대사물, 및 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다. 예를 들어, 캘러스 또는 배양근을 배지에서 10 ℃ 초과 또는 40 ℃ 미만 중 어느 온도에서 일정 시간, 예를 들면, 1 내지 40여 일 동안 배양하여 수득된 것일 수 있다. 상기 캘러스 또는 배양근을 배양하기 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다.
용어 “배양 상등액”은 배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 의미하거나,　배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제외한 상부의 액체만을 의미할 수 있다.
용어 “파쇄물”은 화학적 또는 물리적 힘으로 파쇄하여 얻은 산물을 의미할 수 있다. 세포 외 소포체를 식물 또는 이의 조직배양물의 파쇄물, 예컨대, 식물 캘러스 혼합 배양액의 파쇄물, 식물 배양근 혼합 배양액의 파쇄물 등으로부터 분리할 경우 피부 상태 개선에 있어서 기능적 활성이 우수한 엑소좀 유사 소포체를 대량으로 수득할 수 있는 바, 식물 또는 이의 조직배양물의 파쇄물로부터 분리된 엑소좀 유사 소포체 및/또는 세포 외 소포체를 포함하는 조성물은 피부 상태 개선용 조성물로 사용될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (a) 단계는 파쇄 전에 등장액 또는 정제수를 첨가하여 분쇄하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 등장액을 첨가할 경우 캘러스 또는 배양근의 내·외부의 농도 균형을 맞추어 삼투압 현상이 일어나지 않도록 하고 정상상태를 유지할 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 분쇄는 균질기(homogenizer)를 사용하는 것일 수 있다. 캘러스를 균질기로 분쇄할 경우 덩어리를 풀어주면서 동시에 세포벽이 굳어 있는 식물의 1차, 2차 세포벽에 손상을 주어 다음 공정 즉, 세포벽 파쇄 및 여과 단계를 용이하게 하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 파쇄는 압력을 가하여 물리적으로 파쇄하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 파쇄는 세포를 파쇄하거나, 세포 내부, 세포벽 내, 또는 세포 외부에 존재하는 세포 외 소포체를 파쇄하는 것일 수 있으며, 세포가 터지면서 내부의 유효 성분을 포집한 뒤 소포체를 형성하거나, 다소포체가 터지면서 막이나 내부의 조성을 달리하는 소포체를 재형성하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 캘러스의 파쇄물에는 캘러스의 배양 과정에서 자연적으로 발생한 세포 외 소포체 이외에 세포막 또는 소포체 파쇄와 같은 물리적인 힘에 의해 인위적으로 발생한 세포 외 소포체를 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 물리적 파쇄는 고압균질기(High pressure homogenizer)를 사용하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 상기 물리적 파쇄는 마이크로플루다이저 (Microfluidizer)를 사용하여 1 내지 10회 파쇄하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 1 내지 8회, 1 내지 6회, 1 내지 5회, 1 내지 4회일 수 있으나, 1 내지 3회가 적절할 수 있다. 세포 파쇄를 수행하지 않을 경우 피부 상태 개선에 있어서 기능적 활성이 향상된 세포 외 소포체를 획득하기 어려울 수 있고, 파쇄 회수가 3회 초과일 경우 외부 팽압으로 인한 소포체의 지질층이 파괴되어 수율이 감소되는 문제가 생길 수 있다.
화학적 파쇄 방법의 경우, 대량으로 세포 파쇄를 하기에 적합하지 않고, 막 성분이 화학적으로 변형되거나 화학 성분으로 인한 부작용을 방지하기 위해 화학 성분을 제거하는 단계가 추가되며, 시약 처리 과정에서 오염이 발생할 수 있다. 물리적 파쇄 방법 중 압력을 이용한 방법이 아닌 경우, 예를 들어, 고주파를 이용하는 초음파 분쇄기(sonicator)의 경우 세포막 뿐 만 아니라 DNA까지 분해하므로 소포체가 형성되지 않을 수 있으며, 초음파로 인한 열 발생으로 변성이 일어나거나, 수율이 낮아지는 문제가 발생할 수 있다. 막자 사발을 이용한 분쇄법의 경우 균질화가 고르게 되지 않는 문제가 발생할 수 있다. 프렌치 프레스(French Press)를 이용하여 파쇄하는 경우 대량으로 세포 파쇄를 하기에 적합하지 않을 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 압력은 700 내지 2000 bar일 수 있으며, 예를 들어, 700 내지 1900 bar, 700 내지 1800 bar, 700 내지 1700 bar, 700 내지 1600 bar, 700 내지 1500 bar, 700 내지 1400 bar, 700 내지 1300 bar, 700 내지 1200 bar, 700 내지 1100 bar, 700 내지 1000 bar, 800 내지 2000 bar, 800 내지 1900 bar, 800 내지 1800 bar, 800 내지 1700 bar, 800 내지 1600 bar, 800 내지 1500 bar, 800 내지 1400 bar, 800 내지 1300 bar, 800 내지 1200 bar, 800 내지 1100 bar, 800 내지 1000 bar, 900 내지 2000 bar, 900 내지 1900 bar, 900 내지 1800 bar, 900 내지 1700 bar, 900 내지 1600 bar, 900 내지 1500 bar, 900 내지 1400 bar, 900 내지 1300 bar, 900 내지 1200 bar, 900 내지 1100 bar, 900 내지 1000 bar일 수 있다. 구체적으로, 상기 압력은 700 내지 2000 bar일 수 있다. 상기 압력이 2000 bar 초과일 경우 원하는 엑소좀이 파괴될 수 있고, 상기 압력이 700 bar 미만일 경우 캘러스 또는 세포 파쇄가 원활히 일어나지 않을 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 수득된 파쇄물을 원심분리하여 잔해를 제거하고 회수한 상등액을 여과하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 원심분리는 8,000 내지 100,000 ×g에서 20분 내지 2 시간 동안 수행하는 것일 수 있다. 예를 들어, 8,000 내지 80,000 ×g, 8,000 내지 60,000 ×g, 8,000 내지 40,000 ×g, 8,000 내지 30,000 ×g, 8,000 내지 20,000 ×g, 8,000 내지 10,000 ×g, 9,000 내지 100,000 ×g, 9,000 내지 80,000 ×g, 9,000 내지 60,000 ×g, 9,000 내지 40,000 ×g, 9,000 내지 30,000 ×g, 9,000 내지 20,000 ×g, 9,000 내지 10,000 ×g, 10,000 내지 100,000 ×g, 10,000 내지 80,000 ×g, 10,000 내지 60,000 ×g, 10,000 내지 40,000 ×g, 10,000 내지 30,000 ×g, 10,000 내지 20,000 ×g에서 20분 내지 2 시간, 20분 내지 1시간 30분, 20 분 내지 1시간, 20분 내지 40분, 20분 내지 30분, 30분 내지 2 시간, 30분 내지 1시간 30분, 30 분 내지 1시간, 30분 내지 40분 동안 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다. 상기 중력가속도가 100,000 ×g 초과일 경우 목표하는 크기의 엑소좀과 잔해물이 함께 제거되어 수율이 낮아지는 문제가 생길 수 있고, 상기 중력가속도가 8,000 ×g 미만일 경우 세포 파쇄 잔해물이 상층액에 남아있는 문제가 생길 수 있으며, 고순도의 엑소좀을 정제하기에 효율이 낮아지는 문제가 생길 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (b) 단계는 0.3 내지 1.0 ㎛ 필터로 여과하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 0.3 내지 0.9 ㎛, 0.3 내지 0.8 ㎛, 0.3 내지 0.7 ㎛, 0.3 내지 0.6 ㎛, 0.3 내지 0.5 ㎛, 0.4 내지 1.0 ㎛, 0.4 내지 0.9 ㎛, 0.4 내지 0.8 ㎛, 0.4 내지 0.7 ㎛, 0.4 내지 0.6 ㎛, 0.4 내지 0.5 ㎛일 수 있다. 상기 필터의 크기가 1.0 ㎛ 초과일 경우 엑소좀 이외의 세포 파쇄 잔해 물질들이 유입되어 엑소좀을 고순도로 얻을 수 없는 문제가 생길 수 있고, 상기 필터의 크기가 0.3 ㎛ 미만일 경우 목표하는 크기의 엑소좀의 유입이 차단되는 것과 수율이 낮아지는 문제가 생길 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (c) 단계는 20 kDa 내지 500 kDa의 MWCO(molecular weight cutoff) 필터를 사용하는 것일 수 있다. 예를 들어, 20 kDa, 100 kDa, 200 kDa, 300 kDa, 400 kDa, 500 kDa의 MWCO(molecular weight cutoff) 필터를 사용하여 100 kDa 이상, 200 kDa 이상, 300 kDa 이상, 400 kDa 이상, 500 kDa 이상의 시료를 수득하여 농축하는 것일 수 있다. 상기 MWCO 필터의 크기가 500 kDa 초과일 경우 엑소좀 이외의 물질들이 유입되어 엑소좀을 고순도로 얻을 수 없는 문제가 생길 수 있고, 상기 MWCO 필터의 크기가 20 kDa 미만일 경우 목표하는 크기의 엑소좀의 유입이 차단되는 문제가 생길 수 있다. 상기 (c) 단계에서 파쇄물은 membrane 필터를 통해 pore 사이즈보다 큰 물질은 필터에 걸려 농축되고, 작아서 통과한 물질은 확산 작용에 의해 제거되는 것일 수 있다. 구체적으로, 100 kDa의 MWCO(molecular weight cutoff) 필터를 사용할 경우, 세포 소기관들은 제거되고 100 kDa 이상의 엑소좀 및/또는 엑소좀 유사 소포체를 포함하는 세포 외 소포체는 필터에 걸리면서 고농축 되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 방법은 (c) 단계 이후에 상기 한외여과된 파쇄물을 0.01 내지 0.3 ㎛ 필터, 예를 들어, 0.01 내지 0.25 ㎛, 0.01 내지 0.2 ㎛, 0.1 내지 0.3 ㎛, 0.1 내지 0.25 ㎛, 0.1 내지 0.2 ㎛, 0.2 내지 0.3 ㎛, 0.2 내지 0.25 ㎛의 필터로 제균 여과하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 필터의 크기가 0.3 ㎛ 초과일 엑소좀 이외의 물질들이 유입되어 엑소좀을 고순도로 얻을 수 없는 문제가 생길 수 있고, 상기 필터의 크기가 0.01 ㎛ 미만일 경우 수율이 낮아지는 문제가 생길 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 방법은 20 nm 내지 400 nm의 직경을 갖는 세포 외 소포체를 제조하는 것일 수 있다. 예를 들어, 20 nm 내지 350 nm, 20 nm 내지 300 nm, 20 nm 내지 250 nm, 20 nm 내지 200 nm, 50 nm 내지 400 nm, 50 nm 내지 350 nm, 50 nm 내지 300 nm, 50 nm 내지 250 nm, 50 nm 내지 200 nm, 80 nm 내지 400 nm, 80 nm 내지 350 nm, 80 nm 내지 300 nm, 80 nm 내지 250 nm, 80 nm 내지 200 nm, 80 nm 내지 150 nm, 80 nm 내지 130 nm, 80 nm 내지 120 nm, 80 nm 내지 100 nm, 100 nm 내지 400 nm, 100 nm 내지 350 nm, 100 nm 내지 300 nm, 100 nm 내지 250 nm, 100 nm 내지 200 nm, 100 nm 내지 150 nm, 100 nm 내지 130 nm, 100 nm 내지 120 nm, 150 nm 내지 400 nm, 150 nm 내지 350 nm, 150 nm 내지 300 nm, 150 nm 내지 250 nm, 150 nm 내지 200 nm, 200 nm 내지 400 nm, 200 nm 내지 350 nm, 200 nm 내지 300 nm, 200 nm 내지 250 nm, 250 nm 내지 400 nm, 250 nm 내지 350 nm, 250 nm 내지 300 nm, 300 nm 내지 400 nm, 또는 300 nm 내지 350 nm일 수 있으며, 구체적으로, 80 nm 내지 200 nm일 수 있다.
일 양상은 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 상기 화장료 조성물에 있어서, 식물, 조직배양물, 세포 외 소포체에 대해서는 상술한 바와 같다.
일 구체예에 있어서, 상기 식물은 산삼, 병풀, 인삼, 라벤더, 자스민, 바이텍스, 장미. 청보리, 청귤 노니, 돌외, 아데니움, 몰약, 에델바이스, 에렌지움, 룩샘파이어, 녹차, 사과, 포도, 알로에, 국화, 감귤, 감, 오렌지, 자몽, 블루베리, 및 오이로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 식물은 식물의 꽃, 잎, 줄기, 가지, 열매, 열매 껍질, 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 부위일 수 있으며, 예를 들어, 열매일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조직배양물은 식물의 꽃, 잎, 줄기, 가지, 열매, 열매 껍질, 및 뿌리로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 부위로부터 유도된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조직배양물은 캘러스 또는 배양근일 수 있다. 상기 캘러스는 캘러스 혼합 배양액, 캘러스 혼합 배양액으로부터 배양상등액을 제거하고 회수한 캘러스, 또는 캘러스 혼합 배양액으로부터 캘러스를 제거하고 회수한 배양 상등액일 수 있다. 상기 배양근은 배양근 혼합 배양액, 배양근 혼합 배양액으로부터 배양 상등액을 제거하고 회수한 배양근, 또는 배양근 혼합 배양액으로부터 배양근을 제거하고 회수한 배양상등액일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 세포외 소포체는 식물 또는 이의 조직배양물의 파쇄물로부터 유래된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 세포외 소포체는 전술한 제조 방법에 의해 제조된 세포외 소포체일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 피부 상태 개선은 항염증, 피부 미백, 피부 보습, 항노화, 피부 재생, 및 상처 개선으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 용어 "항염증"은 "염증 억제 또는 개선"과 혼용될 수 있으며, 면역 반응이 완화되어 NO 생성이 억제되는 모든 작용을 의미할 수 있다. 용어 "피부 미백"이란 멜라닌의 합성을 저해하여 피부 침착을 억제하거나 방지하는 모든 작용을 의미할 수 있다. 용어 “피부 보습”은 피부 수분을 유지하거나 수분 손실을 방지하는 모든 작용을 의미할 수 있다. 용어 “항노화”는 피부 노화를 방지하거나 억제하는 모든 작용을 의미할 수 있다. 피부 노화는 시간의 흐름에 따른 내인성 노화 및 외부 환경에 의한 외인성 노화를 포함한다. 상기 피부 노화는 피부 주름, 잡티, 기미 등을 포함할 수 있다. 상기 피부 주름은 피부가 쇠하여 생긴 잔주름일 수 있다. 상기 피부 주름은 광노화, 연령, 얼굴 표정, 수분 부족, 또는 이들의 조합에 의한 것일 수 있다. 상기 광노화는 자외선(UVA, UVB, 및 UVC 포함) 노출에 의한 피부 노화일 수 있다. 용어 “피부 주름 개선”은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것일 수 있다. 용어 "피부 재생"은 피부의 일부분이 소실되었을 경우 그 부분을 보충하거나 피부 세포의 증식을 증진시키는 모든 작용을 의미할 수 있다. 용어 “상처 개선”은 피부의 재생을 촉진시켜 상처의 정도를 낮추어주거나 완화시키는 용도를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 상처 개선은 피부 재생을 촉진 시켜 이미 발생한 상처의 정도를 낮추거나 완화시키는 것일 수 있다. 용어 "상처"는 창상, 화상, 찰과상, 자외선(UV)에 의한 광손상 및 흉터로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
용어 "개선"이란 상태의 완화 또는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 NO 생성을 억제하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 면역세포의 세포독성을 억제하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 Tyrosinase의 발현을 억제하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 Fibronectin의 발현을 증진시키는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 20 내지 400nm의 직경을 갖는 것일 수 있다. 예를 들어, 20 nm 내지 350 nm, 20 nm 내지 300 nm, 20 nm 내지 250 nm, 20 nm 내지 200 nm, 50 nm 내지 400 nm, 50 nm 내지 350 nm, 50 nm 내지 300 nm, 50 nm 내지 250 nm, 50 nm 내지 200 nm, 80 nm 내지 400 nm, 80 nm 내지 350 nm, 80 nm 내지 300 nm, 80 nm 내지 250 nm, 80 nm 내지 200 nm, 80 nm 내지 150 nm, 80 nm 내지 130 nm, 80 nm 내지 120 nm, 80 nm 내지 100 nm, 100 nm 내지 400 nm, 100 nm 내지 350 nm, 100 nm 내지 300 nm, 100 nm 내지 250 nm, 100 nm 내지 200 nm, 100 nm 내지 150 nm, 100 nm 내지 130 nm, 100 nm 내지 120 nm, 150 nm 내지 400 nm, 150 nm 내지 350 nm, 150 nm 내지 300 nm, 150 nm 내지 250 nm, 150 nm 내지 200 nm, 200 nm 내지 400 nm, 200 nm 내지 350 nm, 200 nm 내지 300 nm, 200 nm 내지 250 nm, 250 nm 내지 400 nm, 250 nm 내지 350 nm, 250 nm 내지 300 nm, 300 nm 내지 400 nm, 또는 300 nm 내지 350 nm일 수 있으며, 구체적으로, 80 nm 내지 200 nm일 수 있다.
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.000000001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.000000001 중량% 내지 60 중량%, 0.000000001 중량% 내지 40 중량%, 0.000000001 중량% 내지 30 중량%, 0.000000001 중량% 내지 20 중량%, 0.000000001 중량% 내지 10 중량%, 0.000000001 중량% 내지 5 중량%, 0.000000001 중량% 내지 0.001 중량%, 0.000000001 중량% 내지 0.0001 중량%, 0.000000001 중량% 내지 0.00001 중량%, 0.0001 중량% 내지 80 중량%, 0.0001 중량% 내지 60 중량%, 0.0001 중량% 내지 40 중량%, 0.0001 중량% 내지 30 중량%, 0.0001 중량% 내지 20 중량%, 0.0001 중량% 내지 10 중량%, 0.0001 중량% 내지 5 중량%, 0.001 중량% 내지 80 중량%, 0.001 중량% 내지 60 중량%, 0.001 중량% 내지 40 중량%, 0.001 중량% 내지 30 중량%, 0.001 중량% 내지 20 중량%, 0.001 중량% 내지 10 중량%, 0.001 중량% 내지 5 중량%, 0.01 중량% 내지 80 중량%, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 80 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 0.1 중량% 내지 5 중량%의 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 세포 외 소포체가 105 개/ml 내지 1012 개/ml, 예를 들어, 105 개/ml 내지 1011 개/ml, 105 개/ml 내지 1010 개/ml, 105 개/ml 내지 109 개/ml, 105 개/ml 내지 108 개/ml, 105 개/ml 내지 107 개/ml, 105 개/ml 내지 106 개/ml, 106 개/ml 내지 1012 개/ml, 106 개/ml 내지 1011 개/ml, 106 개/ml 내지 1010 개/ml, 106 개/ml 내지 109 개/ml, 106 개/ml 내지 108 개/ml, 106 개/ml 내지 107 개/ml, 107 개/ml 내지 1012 개/ml, 107 개/ml 내지 1011 개/ml, 107 개/ml 내지 1010 개/ml, 107 개/ml 내지 109 개/ml, 107 개/ml 내지 108 개/ml, 108 개/ml 내지 1012 개/ml, 108 개/ml 내지 1011 개/ml, 108 개/ml 내지 1010 개/ml, 108 개/ml 내지 109 개/ml, 109 개/ml 내지 1012 개/ml, 109 개/ml 내지 1011 개/ml, 109 개/ml 내지 1010 개/ml, 1010 개/ml 내지 1012 개/ml, 1010 개/ml 내지 1011 개/ml, 1011 개/ml 내지 1012 개/ml의 농도로 포함된 것일 수 있다. 세포 외 소포체가 조성물 내에 105 개/ml 미만으로 포함될 경우 유의한 피부 상태 개선 효과가 나타나지 않을 수 있고, 1012 개/ml 초과로 포함될 경우 제형 안정성이 저하될 수 있다.
용어 "유효성분으로 포함"은 상기에서 언급한 효과를 나타낼 수 있는 정도로 본 명세서의 세포 외 소포체가 첨가되는 것을 의미하고, 전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 포뮬레이션 (formulation)되는 것을 포함하는 의미일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 화장수(스킨로션), 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양 로션, 마사지크림, 영양 크림, 모이스쳐 크림, 아이크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양 에센스, 아이 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디 크림, 바디클렌저, 현탁액, 겔, 분말, 페이스트, 마스크팩 또는 시트 또는 에어로졸 조성물을 포함하는 제형으로 제조될 수 있다. 이러한 제형의 조성물은 당해 분야에서 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.
상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 조성물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.
다른 양상은 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 상처 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다. 상기 피부 외용제 조성물에 있어서, 식물, 조직배양물, 세포 외 소포체, 항염증, 상처 개선, 조성물에 대해서는 상술한 바와 같다.
상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.
또 다른 양상은 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 상처 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 상기 건강기능식품 조성물에 있어서, 식물, 조직배양물, 세포 외 소포체, 항염증, 상처 개선, 조성물에 대해서는 상술한 바와 같다.
상기 건강기능식품 조성물은 상기 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포외 소포체 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 건강기능식품의 종류 중 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 건강식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다.
또 다른 양상은 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 또는 상처 개선용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 식물, 조직배양물, 세포 외 소포체, 상처 개선, 조성물에 대해서는 상술한 바와 같다.
용어 "예방"은 상기 조성물을 약학적 유효량으로 투여하여 질환을 사전에 방지하거나 발생 가능성 또는 발생 빈도를 낮추는 것을 포괄적으로 의미할 수 있다. 예를 들어, 질환이 발생할 가능성이 있는 환자 또는 발병한 적이 있는 환자에게서 발병 확률을 낮추거나, 재발 확률을 낮추는 것일 수 있다. 상기 "약학적 유효량"은 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여 횟수, 치료 기간, 배합, 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
용어 "치료"는 상기 조성물을 약학적 유효량으로 투여하여 질환을 개선시키는 것을 포괄적으로 의미할 수 있고, 자연 치유에 비하여 단축된 시간에 질환의 증상이 완화 또는 치유되는 것을 제공하는 것일 수 있으며, 질환으로 인한 한가지 증상 또는 대부분의 증상을 개선시키는 것일 수 있다. 상기 약학적 유효량에 대해서는 상술한 바와 같다.
일 구체예에 있어서, 상기 "염증성 질환"은 염증성 피부질환, 알레르기성 염증질환, 염증성 안구질환, 염증성 골관절질환, 염증성 근육질환 또는 염증성 장질환일 수 있으며, 상기 "염증성 피부 질환"은 아토피 피부염, 건선, 접촉성 피부염, 습진성 피부염, 광선피부염, 지루피부염, 포진성피부염, 편평태선, 경화태선, 괴저성 농피증, 천포창, 수포성 표피박리증, 알러지, 및 과민증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
또 다른 양상은 피부 상태를 개선하기 위한 화장료 조성물의 제조를 위한, 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체(extracellular vesicle)의 용도를 제공한다. 상기 용도에 있어서, 피부 상태, 개선, 화장료 조성물, 식물 또는 이의 조직배양물, 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체에 대해서는 전술한 바와 같다.
또 다른 양상은 항염증 또는 상처 개선을 위한 피부외용제 조성물의 제조를 위한, 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체(extracellular vesicle)의 용도를 제공한다. 상기 용도에 있어서, 항염증, 상처 개선, 피부외용제 조성물, 식물 또는 이의 조직배양물, 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체에 대해서는 전술한 바와 같다.
또 다른 양상은 항염증 또는 상처 개선을 위한 건강기능식품 조성물의 제조를 위한, 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체(extracellular vesicle)의 용도를 제공한다. 상기 용도에 있어서, 항염증, 상처 개선, 건강기능식품 조성물, 식물 또는 이의 조직배양물, 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체에 대해서는 전술한 바와 같다.
다른 양상은 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체(extracellular vesicle)의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상태를 개선, 예방, 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법에 있어서, 식물 또는 이의 조직배양물, 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체, 개선, 예방, 치료에 대해서는 전술한 바와 같다. 상기 개체의 상태는 피부 상태, 또는 염증과 관련된 상태, 예를 들어, 염증성 질환일 수 있으며, 상기 피부 상태 또는 상기 염증성 질환에 대해서는 전술한 바와 같다.
용어 "투여하는", "도입하는", 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다.
투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 피부 상태 개선, 예를 들어, 피부 염증 억제, 피부 미백, 피부 보습, 피부 장벽 강화, 피부 재생, 상처 개선, 및 피부 노화 억제 효과를 필요로 하는 개체일 수 있으며, 또는 염증성 질환의 개선, 예방, 또는 치료 효과를 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 투여는 일 구체예에 따른 조성물을 개체당 일당 0.1 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg을 투여하는 것일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료 시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.
일 양상에 따른 식물 또는 이의 조직배양물 유래 세포 외 소포체 제조 방법은 기능적 활성이 우수한 세포 외 소포체를 대량으로 수득할 수 있어, 피부 상태 개선용 화장료 조성물, 건강기능식품 조성물, 피부 외용제 조성물, 약학적 조성물의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 식물 또는 이의 조직배양물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법을 개략적으로 나타낸 순서도이다.
도 2는 일 실시예에 따른 식물 캘러스 혼합 배양액 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법을 예시적으로 나타낸 순서도이다.
도 3은 일 실시예에 따른 식물 캘러스 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법을 예시적으로 나타낸 순서도이다.
도 4는 일 실시예에 따른 식물 캘러스 배양 상등액 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법을 예시적으로 나타낸 순서도이다.
도 5는 일 실시예에 따른 식물 열매 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법을 예시적으로 나타낸 순서도이다.
도 6은 세포벽 파쇄 및 잔해 제거 과정의 반복에 따른 complex sample의 탁도 변화를 관찰한 사진이다.
도 7a 내지 도 7d는 세포벽 파쇄 회수 증가에 따른 complex sample의 세포 형태 변화를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 8a 내지 도 8e는 각각 실시예 1-1 내지 1-4, 비교예 1-1의 방법으로 분리된 세포 외 소포체의 크기에 따른 입자 수를 nano-sight로 측정한 그래프이다.
도 9a 내지 도 9c는 실시예 1-2에서 lysate sample의 세포벽 파쇄 회수 증가에 따른 세포 외 소포체의 크기별 분포를 비교한 그래프로, 각각 고압균질기로 1회, 2회, 3회 파쇄한 경우의 세포 외 소포체의 크기에 따른 입자수를 nano-sight로 측정한 그래프이다.
도 10은 실시예 1-1 내지 1-4의 포도 캘러스 혼합 배양액, 포도 캘러스, 포도 캘러스 배양 상등액, 및 포도 열매의 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체와 비교예 1-1의 포도 열매 착즙액으로부터 분리된 세포 외 소포체를 Raw264.7 대식세포에 처리한 후 항염 효과를 비교 분석한 결과이다.
도 11은 실시예 1-1 내지 1-4의 포도 캘러스 혼합 배양액, 포도 캘러스, 포도 캘러스 배양 상등액, 및 포도 열매의 파쇄물로부터 분리된 세포외 소포체와 비교예 1-1의 포도 열매의 착즙액로부터 분리된 세포 외 소포체의 상처치유 효과를 관찰한 사진이다.
도 12는 실시예 1-1, 2-1, 3-1, 4-1, 및 5-1의 포도 캘러스 혼합 배양액, 사과 캘러스 혼합 배양액, 자스민 캘러스 혼합 배양액, 라벤더 캘러스 혼합 배양액, 산삼 배양근 혼합 배양액의 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체의 면역 세포 독성 억제효과를 비교 분석한 결과이다.
도 13은 실시예 1-1, 2-1, 3-1, 및 4-1의 포도 캘러스 혼합 배양액, 사과 캘러스 혼합 배양액, 자스민 캘러스 혼합 배양액, 라벤더 캘러스 혼합 배양액의 각 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체의 미백 효과를 비교 분석한 결과이다.
도 14는 실시예 1-1, 2-1, 3-1, 5-1, 및 6-1의 포도 캘러스 혼합 배양액, 사과 캘러스 혼합 배양액, 자스민 캘러스 혼합 배양액, 산삼배양근 혼합 배양액, 및 장미 캘러스 혼합 배양액의 각 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체의 피부 재생 효과를 비교 분석한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
다양한 식물 또는 이를 조직배양하여 유도된 캘러스 또는 배양근으로부터 엑소좀 유사 소포체를 포함하는 세포 외 소포체를 하기 실시예의 방법(이를 'HPEV'공정이라 명명)에 따라 분리하여 식물 또는 이의 조직배양물 유래 세포 외 소포체를 제조하고, 이를 수율 평가, 기능적 활성 평가 등에 사용하였다.
실시예 1-1. 포도 캘러스 혼합 배양액 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 분리 (complex sample)
(1) 포도 캘러스의 유도
대표적인 상업용 포도 품종인 켐벨(Vitis vinifera L. cv Campbell Early)을 사용하여 포도 조직으로부터 캘러스를 유도하였다.
구체적으로, 살균과정을 거친 포도 껍질을 높이 5 mm 이하, 폭 2~5 mm로 칼집을 낸 뒤 줄기세포 유도배지에 치상하여 배양하였다. 3% Sucrose, B5 Medium (Duchefa, Haarlem, Netherlands)가 함유된 배지에 생장 조절제로서 옥신류(Auxin)인 NAA (1-naphthylacetic acid)를 0.4 ppm 농도로 첨가하였고, 사이토키닌류(Cytokinin)인 BAP(6-benzylaminopurine)를 0.1 ppm 농도로 첨가하였다. 제조된 배지는 pH 5.8에 맞게 조정하였다. 배양은 27±1℃로 조절된 암실에서 실시되었다. 배양 15일 이후에 탈분화에 의한 무정형의 캘러스가 유도되기 시작하였다. 배양 20일 이후에 분리된 캘러스를 액상배지가 함유된 플라스크에 넣어 27±1℃로 조절된 암실에서 70rpm의 회전 교반기(shaker)에서 배양하였다.
(2) 세포 외 소포체의 분리 (complex sample)
상기 실시예 1-1 (1)의 액상배지에서 배양된 포도 캘러스 혼합 배양액(이하, complex sample로 명명)에 등장액을 첨가하고 균질기 (Homogenizer, T50D, IKA, Aachen,Germany)를 사용하여 분쇄하였다. 수득된 분쇄물을 고압균질기 (Microfludizer, MN600P-300, Picomax, Seoul, Republc of Korea)를 이용하여 1000bar의 압력으로 세포벽 파쇄를 수행하였다. 상기 세포벽 파쇄 및 잔해 제거 과정을 3회 반복하였다. 도 6은 세포벽 파쇄 및 잔해 제거 과정의 반복에 따른 complex sample의 탁도 변화를 관찰한 사진이다. 그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 3회 반복 이후에 파쇄물의 탁도가 매우 맑아진 것으로 나타났는 바, 식물의 세포벽이 파쇄되고 남은 소기관(lipid, DNA, protein 등)만 수용액 내에 존재함을 확인하였다. 도 7a 내지 도 7d는 세포벽 파쇄 회수 증가에 따른 complex sample의 세포 형태 변화를 현미경으로 관찰한 사진이다. 그 결과, 도 7a 내지 도 7d에 나타난 바와 같이, 3회 반복 이후 세포벽이 파쇄되어 사이즈가 점차 감소됨을 확인하였다. 수득된 혼합 배양액 파쇄물을 4 ℃에서 10,000×g로 30분 동안 원심분리를 수행하여 세포 관련 잔해를 제거하고 상등액을 수득하였다. 수득된 상등액은 0.45 ㎛ 멸균 필터로 여과하여 잔존 세포 잔해를 추가적으로 제거하였다. 용출된 시료를 MWCO(molecular weight cutoff) 100kDa의 필터로 한외여과(ultrafiltration, Pellicon® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany)하여 100kDa 이상의 세포 외 소포체를 분리하였다. 추가적으로 불순물을 제거하기 위해 0.2 ㎛ 제균 필터로 제균 여과하고, 동결건조 후 -20℃에서 저장하여 하기 시험에 이용하였다.
실시예 1-2. 포도 캘러스 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 분리 (lysate sample)
상기 실시예 1-1 (1)의 액상 배지에서 배양된 포도 캘러스 혼합 배양액을 100 내지 200 ㎛의 표준체 및 나일론 메쉬망을 이용하여 캘러스와 배양액을 분리하였으며, 체별 후 포도 캘러스(이하, lysate sample로 명명)를 회수하였다. 회수한 포도 캘러스에 등장액을 첨가하고 균질기 (Homogenizer, T50D, IKA, Aachen, Germany)를 사용하여 분쇄하였다. 수득된 분쇄물을 고압균질기 (Microfludizer, MN600P-300, Picomax, Seoul, Republc of Korea)를 이용하여 1000bar의 압력으로 세포벽 파쇄를 수행하였다. 수득된 캘러스 파쇄물을 4 ℃에서 10,000×g로 30분 동안 원심분리를 수행하여 세포 관련 잔해를 제거하고 상등액을 수득하였다. 상기 세포벽 파쇄 및 잔해 제거 과정을 3회 반복하였다. 수득된 상등액은 0.45 ㎛ 멸균 필터로 여과하여 잔존 세포 잔해를 추가적으로 제거하였다. 용출된 시료를 MWCO(molecular weight cutoff) 100kDa의 필터로 한외여과(ultrafiltration, Pellicon® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany)하여 100kDa 이상의 세포 외 소포체를 분리하였다. 추가적으로 불순물을 제거하기 위해 0.2 ㎛ 제균 필터로 제균 여과하고, 동결건조 후 -20 ℃에서 저장하여 하기 시험에 이용하였다. 도 9a 내지 도 9c는 실시예 1-2에서 lysate sample의 세포벽 파쇄 회수 증가에 따른 세포 외 소포체의 크기별 분포를 비교한 그래프로, 각각 고압균질기로 1회, 2회, 3회 파쇄한 경우의 세포 외 소포체의 크기에 따른 입자수를 nano-sight로 측정한 그래프이다. 그 결과, 도 9a 내지 도 9c에 나타난 바와 같이, 세포벽 파쇄 횟수가 증가함에 따라 입자의 크기가 균질화되었음을 확인하였다.
실시예 1-3. 포도 캘러스 배양 상등액 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 분리 (Culture medium sample)
상기 실시예 1-1 (1)의 액상 배지에서 배양된 포도 캘러스 혼합 배양액을 100 내지 200 ㎛의 표준체 및 나일론 메쉬망을 이용하여 캘러스와 배양액을 분리하였으며, 체별 후 배양 상등액(이하, Culture medium sample로 명명)을 회수하였다. 수득된 배양 상등액을 고압균질기 (Microfludizer, MN600P-300, Picomax, Seoul, Republc of Korea)를 이용하여 1000bar의 압력으로 파쇄를 수행하여 배양액으로 분비된 세포 외 소포체의 재구성을 유도한 후 0.45 ㎛ 멸균 필터로 여과하였다. 용출된 시료를 MWCO(molecular weight cutoff) 100kDa의 필터로 한외여과(ultrafiltration, Pellicon® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany)하여 100kDa 이상의 세포 외 소포체를 분리하였다. 수득된 용액은 0.2 ㎛ 제균 필터로 제균 여과하고, 동결건조 후 -20 ℃에서 저장하여 하기 시험에 이용하였다.
실시예 1-4. 포도 열매 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 분리
살균과정을 거친 포도 열매에 등장액을 첨가하고 균질기 (Homogenizer, T50D, IKA, Aachen, Germany)및 고압균질기 (Microfludizer, MN600P-300, Picomax, Seoul, Republc of Korea)를 이용하여 1000bar의 압력으로 세포벽 파쇄를 수행하였다. 수득된 파쇄물을 4 ℃에서 10,000×g로 30분 동안 원심분리를 수행하여 세포 관련 잔해를 제거하고 상등액을 수득하였다. 수득된 상등액은 0.45 ㎛ 멸균 필터로 여과하여 잔존 세포 잔해를 추가적으로 제거하였다. 용출된 시료를 MWCO(molecular weight cutoff) 100kDa의 필터로 한외여과(ultrafiltration, Pellicon® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany)하여 100kDa 이상의 세포 외 소포체를 분리하였다. 추가적으로 불순물을 제거하기 위해 0.2 ㎛ 제균 필터로 제균 여과하고, 동결건조 후 -20℃에서 저장하여 하기 시험에 이용하였다.
비교예 1-1. 포도 열매 착즙액 유래 세포 외 소포체의 분리
세척과정을 거친 포도 열매에 등장액을 첨가하고 균질기 (Homogenizer, T50D, IKA, Aachen, Germany)를 사용하여 세포벽을 파쇄하고 착즙액을 수득하였다. 4 ℃에서 10,000×g로 30분 동안 원심분리를 수행하여 세포 관련 잔해를 제거하고 상등액을 수득하였다. 수득된 상등액은 0.45 ㎛ 멸균 필터로 여과하여 잔존 세포 잔해를 추가적으로 제거하였다. 용출된 시료를 MWCO(molecular weight cutoff) 100kDa의 필터로 한외여과(ultrafiltration, Pellicon® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany)하여 100kDa 이상의 세포 외 소포체를 분리하였다. (이하, Juice.UF sample로 명명) 추가적으로 불순물을 제거하기 위해 0.2 ㎛ 제균 필터로 제균 여과하고, 동결건조 후 -20℃에서 저장하여 하기 시험에 이용하였다.
실시예 2-1. 사과 캘러스 혼합 배양액 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 분리 (complex sample)
실시예 1-1에서 포도 대신에 사과로부터 캘러스를 유도하여 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 세포외 소포체를 분리하였다.
사과 캘러스는 다음과 같은 방법으로 유도하였다. 구체적으로, 살균과정을 거친 사과 열매를 높이 5 mm 이하, 폭 2~5 mm로 칼집을 낸 뒤 줄기세포 유도배지에 치상하여 배양하였다. 3% Sucrose, MS Medium (Duchefa, Haarlem, Netherlands)가 함유된 배지에 생장 조절제로서 옥신류(Auxin)인 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)를 0.5 ppm 농도로 첨가하였고, 사이토키닌류(Cytokinin)인 BAP(6-benzylaminopurine)를 1 ppm 농도로 첨가하였다. 제조된 배지는 pH 5.8에 맞게 조정하였다. 배양은 27±1℃로 조절된 암실에서 실시되었다. 배양 15일 이후에 탈분화에 의한 무정형의 캘러스가 유도되기 시작하였다. 배양 20일 이후에 분리된 캘러스를 액상배지가 함유된 플라스크에 넣어 27±1℃로 조절된 암실에서 70rpm의 회전 교반기(shaker)에서 배양하였다.
실시예 3-1. 자스민 캘러스 혼합 배양액 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 분리 (complex sample)
실시예 1-1에서 포도 대신에 자스민으로부터 캘러스를 유도하여 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 세포외 소포체를 분리하였다.
자스민 캘러스는 다음과 같은 방법으로 유도하였다. 구체적으로, 살균과정을 거친 자스민 잎을 높이 5 mm 이하, 폭 2~5 mm로 칼집을 낸 뒤 줄기세포 유도배지에 치상하여 배양하였다. 3% Sucrose, MS Medium (Duchefa, Haarlem, Netherlands)가 함유된 배지에 생장 조절제로서 옥신류(Auxin)인 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)를 2 ppm 농도로 첨가하였고, 사이토키닌류(Cytokinin)인 BAP(6-benzylaminopurine)를 2 ppm 농도로 첨가하였다. 제조된 배지는 pH 5.8에 맞게 조정하였다. 배양은 27±1℃로 조절된 암실에서 실시되었다. 배양 15일 이후에 탈분화에 의한 무정형의 캘러스가 유도되기 시작하였다. 배양 20일 이후에 분리된 캘러스를 액상배지가 함유된 플라스크에 넣어 27±1℃로 조절된 암실에서 70rpm의 회전 교반기(shaker)에서 배양하였다.
실시예 4-1. 라벤더 캘러스 혼합 배양액 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 분리 (complex sample)
실시예 1-1에서 포도 대신에 라벤더로부터 캘러스를 유도하여 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 세포외 소포체를 분리하였다.
라벤더 캘러스는 다음과 같은 방법으로 유도하였다. 구체적으로, 살균과정을 거친 라벤더 잎을 높이 5 mm 이하, 폭 2~5 mm로 칼집을 낸 뒤 줄기세포 유도배지에 치상하여 배양하였다. 3% Sucrose, MS Medium (Duchefa, Haarlem, Netherlands)가 함유된 배지에 생장 조절제로서 옥신류(Auxin)인 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)를 1 ppm 농도로 첨가하였고, 사이토키닌류(Cytokinin)인 BAP(6-benzylaminopurine)를 0.5 ppm 농도로 첨가하였다. 제조된 배지는 pH 5.8에 맞게 조정하였다. 배양은 27±1℃로 조절된 암실에서 실시되었다. 배양 15일 이후에 탈분화에 의한 무정형의 캘러스가 유도되기 시작하였다. 배양 20일 이후에 분리된 캘러스를 액상배지가 함유된 플라스크에 넣어 27±1℃로 조절된 암실에서 70rpm의 회전 교반기(shaker)에서 배양하였다.
실시예 5-1. 산삼 배양근 혼합 배양액 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 분리 (complex sample)
실시예 1-1에서 포도 캘러스 대신에 산삼으로부터 배양근을 유도하여 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 세포외 소포체를 분리하였다.
산삼 배양근은 다음과 같은 방법으로 유도하였다. 구체적으로, 살균과정을 거친 산삼 주근을 길이를 2~5 mm으로 자른 뒤 배양근 유도 액상 배지에 배양하였다. 3% Sucrose, SH Medium (Duchefa, Haarlem, Netherlands)가 함유된 배지에 생장 조절제로서 옥신류(Auxin)인 IBA (Indole-3-Butyric Acid)를 5 ppm 농도로 첨가하였다. 제조된 배지는 pH 5.8에 맞게 조정하였다. 배양은 27±1℃로 조절된 암실에서 실시되었다. 배양 15일 이후에 산삼 배양근이 유도되기 시작하였다. 배양 20일 이후에 분리된 산삼 배양근을 액상배지가 함유된 플라스크에 넣어 27±1℃로 조절된 암실에서 70rpm의 회전 교반기(shaker)에서 배양하였다.
실시예 6-1. 장미 캘러스 혼합 배양액 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 분리 (complex sample)
실시예 1-1에서 포도 대신에 장미로부터 캘러스를 유도하여 사용한 것을 제외하고는 실시예 1-1과 동일한 방법으로 세포외 소포체를 분리하였다.
장미 캘러스는 다음과 같은 방법으로 유도하였다. 구체적으로, 살균과정을 거친 장미 꽃잎을 높이 5 mm 이하, 폭 2~5 mm로 칼집을 낸 뒤 줄기세포 유도배지에 치상하여 배양하였다. 3% Sucrose, MS Medium (Duchefa, Haarlem, Netherlands)가 함유된 배지에 생장 조절제로서 옥신류(Auxin)인 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)를 1 ppm 농도로 첨가하였다. 제조된 배지는 pH 5.8에 맞게 조정하였다. 배양은 27±1℃로 조절된 암실에서 실시되었다. 배양 15일 이후에 탈분화에 의한 무정형의 캘러스가 유도되기 시작하였다. 배양 20일 이후에 분리된 캘러스를 액상배지가 함유된 플라스크에 넣어 27±1℃로 조절된 암실에서 70rpm의 회전 교반기(shaker)에서 배양하였다.
실험예 1. 세포 외 소포체의 크기 및 농도 측정
분리 방법에 따른 세포 외 소포체의 특성과 수율을 비교 분석하기 위하여, nano-sight를 수행하여 세포 외 소포체의 크기와 농도를 측정하였다.
구체적으로, 실시예 1-1 내지 1-4 및 비교예 1-1에서 분리된 세포 외 소포체 샘플을 PBS 혹은 3차 증류수로 입자 수가 1x108~4x108이 되도록 희석하였고, 측정 중 frame 수는 20~30으로 설정하였다. 희석한 샘플 1ml를 기기 챔버에 loading 하였다. Particle에 초점을 맞추고, camera level을 조절한 후 측정을 시작하였다. Capture duration을 30~60초로 하고 3번 반복 측정을 시행하였다. 측정이 끝나면 detection threshold를 조절하고, 3번 측정한 값을 토대로 분석을 진행하였다. 이때, 3번 반복한 결과의 패턴이 비슷한 양상을 보이는 것을 적당한 것으로 간주하였다.
도 8a 내지 도 8e는 각각 실시예 1-1 내지 1-4 및 비교예 1-1의 방법으로 분리된 세포 외 소포체의 크기에 따른 입자 수를 nano-sight로 측정한 그래프이다. 그 결과, 도 8a 내지 도 8e에 나타난 바와 같이, 실시예 1-1 내지 1-4 및 비교예 1-1의 방법으로 분리된 대부분의 소포체의 직경이 80 내지 200 nm인 것을 확인하였다. 특히, 실시예 1-1의 경우 직경이 80 내지 100 nm인 세포 외 소포체들이 많이 측정되었고, 실시예 1-2의 경우 100 내지 120 nm인 소포체들이 많이 측정되었으며, 실시예 1-3의 경우 100 내지 130 nm 인 소포체들이 많이 측정되었고, 실시예 1-4의 경우 직경이 150 내지 200 nm인 소포체들이 많이 측정되는 것으로 나타났다. 또한, 비교예 1-1의 경우 직경이 130 내지 200 nm인 소포체들이 많이 측정되는 것으로 나타났다. 이는 포도 캘러스 혼합 배양액, 포도 캘러스, 포도 캘러스 배양 상등액의 파쇄물로부터 세포 외 소포체를 분리함에 따라 포도 열매로부터 분리하는 경우보다 직경이 작은 세포 외 소포체를 더 많이 수득할 수 있음을 의미한다.
하기 [표 1]은 상기 실시예 1-1 내지 1-4 및 비교예 1-1의 방법으로 분리된 세포 외 소포체의 ml당 입자수를 비교한 결과이다.
실시예 1-1 실시예 1-2 실시예 1-3 실시예 1-4 비교예 1-1
입자 수(단위: particles/ml) 8.80e+9
(88억개)		 5.38e+9
(54억개)		 1.27e+09
(13억개)		 4.14e+08
(4억개)		 3.77e+07
(0.4억개)
그 결과, 상기 [표 1]에 나타난 바와 같이, 캘러스 혼합 배양액, 캘러스, 캘러스 배양 상등액, 또는 열매 파쇄물로부터 분리하는 실시예 1-1 내지 1-4의 경우 1ml 당 약 4억 내지 88억 개의 세포 외 소포체가 분리되어 비교예 1-1의 분리 방법과는 10배 내지 220배 이상 차이가 나는 것을 확인하였다. 이는 캘러스 혼합 배양액, 캘러스, 캘러스 배양 상등액, 열매의 파쇄물로부터 분리할 경우 착즙액으로부터 분리하는 경우보다 세포 외 소포체의 수율이 현저하게 증가됨을 의미한다. 또한, 고압균질기의 공정을 진행하였을 때와 진행하지 않았을 때는 약 10배 이상 차이가 나는 것을 확인하였다.
하기 [표 2]는 고압균질기를 이용한 파쇄 회수가 수율에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-2의 분리방법에서 고압균질기를 이용하여 세포벽 파쇄 회수를 증가시킴에 따른 세포 외 소포체의 ml당 입자수를 비교한 결과이다.
MF 1차 파쇄 2차 파쇄 3차 파쇄
입자 수(단위: particles/ml) 1.57e+08 6.06e+08 9.12e+08
그 결과, 상기 [표 2]에 나타난 바와 같이, 1차 파쇄에 비해 3차 파쇄에서 세포 외 소포체의 입자 수가 약 5.8배 정도 증가함을 확인하였다. 이는 여러 차례로 고압 균질기를 사용함으로써 세포벽 파쇄로 인해 세포 외 소포체의 수율이 증가할 수 있음을 의미한다.
실험예 2. 분리 방법에 따른 포도 유래 세포 외 소포체의 항염 효과 비교
상기 실시예 1-1 내지 1-4 및 비교예 1-1에서 분리된 세포 외 소포체의 항염 효과를 확인하기 위하여, Raw264.7 대식세포에 실시예 1-1 내지 1-4 및 비교예 1-1에서 분리된 세포 외 소포체를 처리한 뒤 NO 생성양을 평가하였다.
구체적으로, Raw264.7 대식세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에 배양하고 96 웰 플레이트에 각각 80%의 밀도를 갖도록 분주하였다. 24시간 배양 후 염증유발물질인 LPS 1ug/mL과 실시예 1-1 내지 1-4, 비교예 1-1의 샘플들을 25ug/mL 및 100ug/mL의 농도별로 처리하여 24시간 추가 배양하였다. 대조군은 PBS를 처리하였고, 음성 대조군은 LPS 1ug/mL만 처리하였으며, 양성 대조군은 LPS 1ug/mL 처리 후 ascorbic acid를 처리한 것을 사용하였다. 배양 상층액과 NO와 발색반응을 일으키는 Griess reagent를 1:1 비율로 섞고 10분간 차광한 상태로 shake incubation하였다. 그 이후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. NO의 standard curve를 측정하여 NO 생성양을 확인하고, LPS만 처리한 negative control 대비 억제율을 계산하였다. 도 10은 실시예 1-1 내지 1-4의 포도 캘러스 혼합 배양액, 포도 캘러스, 포도 캘러스 배양 상등액, 및 포도 열매의 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체와 비교예 1-1의 포도 열매 착즙액으로부터 분리된 세포 외 소포체를 Raw264.7 대식세포에 처리한 후 항염 효과를 비교 분석한 결과이다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 실시예 1-1 내지 1-4에서 분리된 세포 외 소포체는 NO 생성을 농도 의존적으로 감소시켰으며, 비교예 1-1에서 분리된 세포 외 소포체보다 NO 생성 억제 효과가 현저하게 향상됨을 확인하였다. 이는 캘러스 혼합 배양액, 캘러스, 캘러스 배양 상등액, 또는 열매의 파쇄를 수행하는 본 발명의 제조 방법에 따라 항염 활성이 현저하게 향상된 세포 외 소포체가 분리되었음을 의미한다.
실험예 3. 분리 방법에 따른 포도 유래 세포 외 소포체의 상처 재생 효과 비교
상처 치유 중에 세포 이동은 가장 중요한 역할로 알려져 있는 바, 세포 이동에 상기 실시예 1-1 내지 1-4 및 비교예 1-1에서 분리된 세포 외 소포체가 미치는 영향을 확인하기 위해 스크래치 상처 분석(Scratch wound assay)을 실시하였다.
구체적으로, 인간 섬유아세포(HDF, Human dermal fibroblast cell)를 6 well plate에 각각 200,000 cells/well로 seeding을 하였다. 24시간 후에 멸균된 1ml 피펫 팁을 사용하여 스크래치를 가하였다. 스크래치 후에 실시예 1-1 내지 1-4 및 비교예 1-1에서 분리된 세포 외 소포체를 처리하였으며, PBS 처리를 대조군으로 사용하였고, FBS가 함유된 배지를 양성 대조군으로 사용하여, 0, 24, 및 32 시간 동안 처리 후 촬영을 하였다. 도 11은 실시예 1-1 내지 1-4의 포도 캘러스 혼합 배양액, 포도 캘러스, 포도 캘러스 배양 상등액, 및 포도 열매의 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체와 비교예 1-1의 포도 열매의 착즙액으로부터 분리된 세포 외 소포체의 상처치유 효과를 관찰한 사진이다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 상처 후 24, 32 시간 경과 후 세포 이동을 분석하였을 때, 실시예 1-2 내지 1-4, 및 비교예 1-1의 경우 대조군과 비슷한 수준의 세포 이동을 보여주었지만, 실시예 1-1의 세포 외 소포체를 처리한 군에서는 대조군보다 세포 이동이 활발히 이루어진 것으로 나타났다. 특히, 실시예 1-1과 비교예 1-1을 비교하였을 때, 확연한 차이가 있는 것으로 나타나, 포도 캘러스 혼합 배양액 파쇄물 유래 세포 외 소포체가 섬유아세포에서 상처 치유 기전을 자극하여 상처 치유를 촉진함을 확인하였다. 이는 캘러스 혼합 배양액의 파쇄를 수행하는 본 발명의 제조 방법에 따라 상처 재생 활성이 현저하게 향상된 세포 외 소포체가 분리되었음을 의미한다.
실험예 4. 다양한 식물 조직배양물 유래 세포 외 소포체의 면역세포독성 억제효과
다양한 식물의 꽃, 잎, 뿌리 등 다양한 부위에서 유도된 캘러스 또는 배양근으로부터 분리된 세포 외 소포체의 면역세포독성에 미치는 영향을 확인하기 위해, Raw264.7 대식세포에 실시예 1-1, 2-1, 3-1, 4-1, 및 5-1에서 분리된 세포 외 소포체를 처리한 뒤 LDH assay를 실시하였다.
구체적으로, Raw264.7 대식세포를 96 well plate에 20,000 cells/well만큼 seeding하였다. 24시간 배양 후 염증유발물질인 LPS 1ug/mL과 실시예 1-1, 2-1, 3-1, 4-1, 및 5-1의 샘플들을 0.1ug/mL 및 10ug/mL의 농도별로 처리하여 48시간 추가 배양하였다. 대조군은 PBS를 처리하였고, 음성 대조군은 LPS 1ug/mL만 처리한 것을 사용하였다. 각 well에 Assay buffer를 100ul씩 분주하고 상온에서 빛을 차단하여 30분간 반응시켰다. 각 well에 Stop solution을 50ul씩 처리하여 반응을 종료하였다. 그 이후 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 도 12는 실시예 1-1, 2-1, 3-1, 4-1, 및 5-1의 포도 캘러스 혼합 배양액, 사과 캘러스 혼합 배양액, 자스민 캘러스 혼합 배양액, 라벤더 캘러스 혼합 배양액, 산삼 배양근 혼합 배양액의 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체의 면역 세포 독성 억제효과를 비교 분석한 결과이다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 처리 농도가 같음에도 불구하고 품종 간 효과의 차이는 있었으나 실시예 1-1 내지 5-1로부터 분리된 세포 외 소포체 처리군은 모두 염증유발을 감소시켰다. 특히, 실시예 4-1의 라벤더 캘러스 혼합 배양액으로부터 분리된 세포 외 소포체 처리군에서 현저하게 감소되었음을 확인하였다. 이는 캘러스 또는 배양근 유도에 사용되는 식물의 종류나 부위 따라 정도의 차이는 있으나, 캘러스 혼합 배양액 또는 배양근 혼합 배양액의 파쇄를 수행하는 본 발명의 제조 방법은 다양한 식물 종에 대해 LPS에 의한 면역 세포의 독성을 현저하게 감소시키는 세포 외 소포체를 분리할 수 있음을 의미한다.
실험예 5. 다양한 식물 조직배양물 유래 세포 외 소포체의 미백 효과
다양한 식물의 꽃, 잎, 뿌리 등 다양한 부위에서 유도된 캘러스로부터 분리된 세포 외 소포체의 피부 미백 효과를 확인하기 위하여, 마우스 흑색종 세포인 B16F10 세포에 실시예 1-1, 2-1, 3-1, 및 4-1에서 분리된 세포 외 소포체를 처리한 뒤 Tyrosinase 발현량을 평가하였다.
구체적으로, 마우스 흑색종 세포인 B16F10 세포를 12 well plate에 각각 50,000 cells/well로 seeding하였다. 24시간 배양 후 멜라닌 색소의 생성을 촉진하는 물질인 α-MSH 0.5μM과 실시예 1-1, 2-1, 3-1, 및 4-1의 샘플들을 10μg/ml 의 농도로 처리하여 48시간 추가 배양하였다. 대조군은 PBS를 처리하였고, 음성 대조군으로는 α-MSH 0.5μM만 처리하였으며, 양성 대조군은 α-MSH 0.5μM 처리후 Kojic acid를 처리한 것을 사용하였다. RNA Kit를 이용하여 RNA를 분리하고 정량하였다. 정량한 RNA를 cDNA synthesis kit를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA와 Tyrosinase Primer 및 SYBR Green을 혼합하여 qRT-PCR를 실시하였다. 도 13은 실시예 1-1, 2-1, 3-1, 및 4-1의 포도 캘러스 혼합 배양액, 사과 캘러스 혼합 배양액, 자스민 캘러스 혼합 배양액, 라벤더 캘러스 혼합 배양액의 각 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체의 미백 효과를 비교 분석한 결과이다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 실시예 1-1, 2-1, 3-1, 및 4-1의 포도 캘러스 혼합 배양액, 사과 캘러스 혼합 배양액, 자스민 캘러스 혼합 배양액, 및 라벤더 캘러스의 혼합 배양액으로부터 분리된 세포 외 소포체는 Tyrosinase 발현량을 유의하게 감소시킴을 확인하였으며, 특히 실시예 3-1의 자스민 캘러스 혼합 배양액으로부터 분리된 세포외 소포체 처리군에서 가장 우수하게 Tyrosinase 발현량을 감소시키는 것을 확인하였다. 이는 캘러스 유도에 사용되는 식물의 종류나 부위 따라 정도의 차이는 있으나, 캘러스 혼합 배양액의 파쇄를 수행하는 본 발명의 제조 방법은 다양한 식물 종에 대해 피부 미백 활성이 현저하게 향상된 세포외 소포체를 분리할 수 있음을 의미한다.
실험예 6. 다양한 식물 조직배양물 유래 세포 외 소포체의 피부 재생 효과
다양한 식물의 꽃, 잎, 뿌리 등 다양한 부위에서 유도된 캘러스 또는 배양근으로부터 분리된 세포 외 소포체의 피부 재생 효과를 확인하기 위하여, 피부 각질 세포인 HaCaT 세포에 실시예 1-1, 2-1, 3-1, 5-1, 및 6-1에서 분리된 세포 외 소포체를 처리한 뒤 Fibronectin 발현량을 평가하였다.
구체적으로, 피부 각질 세포인 HaCaT 세포를 12 well plate에 각각 50,000 cells/well로 seeding하였다. 24시간 배양 후 실시예 1-1, 2-1, 3-1, 5-1, 및 6-1의 샘플들을 10μg/mL의 농도로 처리하여 48시간 추가 배양하였다. 대조군으로는 PBS를 처리한 것을 사용하였다. RNA Kit를 이용하여 RNA를 분리하고 정량하였다. 정량한 RNA를 cDNA synthesis kit를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA와 Fibronectin Primer 및 SYBR Green을 혼합하여 qRT-PCR를 실시하였다. 도 14는 실시예 1-1, 2-1, 3-1, 5-1, 및 6-1의 포도 캘러스 혼합 배양액, 사과 캘러스 혼합 배양액, 자스민 캘러스 혼합 배양액, 산삼배양근 혼합 배양액, 및 장미 캘러스 혼합 배양액의 각 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체의 피부 재생 효과를 비교 분석한 결과이다.
그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 실시예 1-1, 2-1, 3-1, 5-1, 및 6-1의 포도 캘러스 혼합 배양액, 사과 캘러스 혼합 배양액, 자스민 캘러스 혼합 배양액, 산삼배양근 혼합 배양액, 장미 캘러스 혼합 배양액으로부터 분리된 세포 외 소포체는 Fibronectin 발현량을 유의하게 증가시킴을 확인하였으며, 특히 산삼배양근에서 Fibronectin 발현량을 가장 우수하게 증가시키는 것을 확인하였다. 이는 캘러스 또는 배양근 유도에 사용되는 식물의 종류나 부위 따라 정도의 차이는 있으나, 캘러스 혼합 배양액 또는 배양근 혼합 배양액의 파쇄를 수행하는 본 발명의 제조 방법은 다양한 식물 종에 대해 피부 재생 활성이 현저하게 향상된 세포외 소포체를 분리할 수 있음을 의미한다.

Claims (36)

  1. (a) 식물 또는 이의 조직배양물의 파쇄물을 수득하는 단계;
    (b) 상기 파쇄물을 여과하는 단계; 및
    (c) 상기 여과된 파쇄물을 한외여과하는 단계;를 포함하는 식물 또는 이의 조직배양물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 제조하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 식물은 식물의 꽃, 잎, 줄기, 가지, 열매, 열매 껍질, 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 부위인 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 조직배양물은 식물의 꽃, 잎, 줄기, 가지, 열매, 열매 껍질, 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 부위로부터 유도된 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 조직배양물은 캘러스 또는 배양근인 것인 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 캘러스는 캘러스 혼합 배양액, 캘러스 혼합 배양액으로부터 배양상등액을 제거하고 회수한 캘러스, 또는 캘러스 혼합 배양액으로부터 캘러스를 제거하고 회수한 배양상등액인 것인 방법.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 배양근은 배양근 혼합 배양액, 배양근 혼합 배양액으로부터 배양 상등액을 제거하고 회수한 배양근, 또는 배양근 혼합 배양액으로부터 배양근을 제거하고 회수한 배양상등액인 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 수득된 파쇄물을 원심분리하여 잔해를 제거하고 회수한 상등액을 여과하는 것인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 상기 (c) 단계 이후에 상기 한외여과된 파쇄물을 0.01 내지 0.3 ㎛ 필터로 제균 여과하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 파쇄는 700 내지 2000 bar의 압력을 가하여 물리적으로 파쇄하는 것인 방법.
  10. 청구항 7에 있어서, 상기 원심분리는 8,000 내지 10,000 ×g에서 20분 내지 2 시간 동안 수행하는 것인 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 (a) 단계는 파쇄 전에 등장액 또는 정제수를 첨가하여 분쇄하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 (b) 단계는 0.3 내지 0.5 ㎛ 필터로 여과하는 것인 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 (c) 단계는 20kDa 내지 500kDa의 MWCO(molecular weight cutoff) 필터를 사용하는 것인 방법.
  14. 청구항 1에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 20 내지 400nm의 직경을 갖는 것인 방법.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 식물은 산삼, 병풀, 인삼, 라벤더, 자스민, 바이텍스, 장미. 청보리, 청귤 노니, 돌외, 아데니움, 몰약, 에델바이스, 에렌지움, 룩샘파이어, 녹차, 사과, 포도, 알로에, 국화, 감귤, 감, 오렌지, 자몽, 블루베리, 및 오이로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인 방법.
  16. 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 피부 상태 개선은 항염증, 피부 미백, 피부 재생 및 상처 개선으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 화장료 조성물.
  18. 청구항 16에 있어서, 상기 식물은 산삼, 병풀, 인삼, 라벤더, 자스민, 바이텍스, 장미. 청보리, 청귤 노니, 돌외, 아데니움, 몰약, 에델바이스, 에렌지움, 룩샘파이어, 녹차, 사과, 포도, 알로에, 국화, 감귤, 감, 오렌지, 자몽, 블루베리, 및 오이로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인 화장료 조성물.
  19. 청구항 16에 있어서, 상기 식물은 식물의 꽃, 잎, 줄기, 가지, 열매, 열매 껍질, 및 뿌리로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 부위인 것인 화장료 조성물.
  20. 청구항 16에 있어서, 상기 조직배양물은 식물의 꽃, 잎, 줄기, 가지, 열매, 열매 껍질, 및 뿌리로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 부위로부터 유도된 것인 화장료 조성물.
  21. 청구항 16에 있어서, 상기 조직배양물은 캘러스 또는 배양근인 것인 화장료 조성물.
  22. 청구항 16에 있어서, 상기 세포외 소포체는 상기 식물 또는 이의 조직배양물의 파쇄물로부터 유래된 것인 화장료 조성물.
  23. 청구항 21에 있어서, 상기 캘러스는 캘러스 혼합 배양액, 캘러스 혼합 배양액으로부터 배양상등액을 제거하고 회수한 캘러스, 또는 캘러스 혼합 배양액으로부터 캘러스를 제거하고 회수한 배양 상등액인 것인 화장료 조성물.
  24. 청구항 21에 있어서, 상기 배양근은 배양근 혼합 배양액, 배양근 혼합 배양액으로부터 배양 상등액을 제거하고 회수한 배양근, 또는 배양근 혼합 배양액으로부터 배양근을 제거하고 회수한 배양상등액인 것인 화장료 조성물.
  25. 청구항 16에 있어서, 상기 세포외 소포체는 청구항 1 내지 15 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 것인 화장료 조성물.
  26. 청구항 16에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 20 내지 400nm의 직경을 갖는 것인 조성물.
  27. 청구항 16에 있어서, 상기 조성물은 NO 생성을 억제하는 것인 화장료 조성물.
  28. 청구항 16에 있어서, 상기 조성물은 면역세포의 세포독성을 억제하는 것인 화장료 조성물.
  29. 청구항 16에 있어서, 상기 조성물은 Tyrosinase의 발현을 억제하는 것인 화장료 조성물.
  30. 청구항 16에 있어서, 상기 조성물은 Fibronectin의 발현을 증진시키는 것인 화장료 조성물.
  31. 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 상처 개선용 피부 외용제 조성물.
  32. 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 상처 개선용 건강기능식품 조성물.
  33. 피부 상태를 개선하기 위한 화장료 조성물의 제조를 위한, 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체(extracellular vesicle)의 용도.
  34. 항염증 또는 상처 개선을 위한 피부외용제 조성물의 제조를 위한, 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체(extracellular vesicle)의 용도.
  35. 항염증 또는 상처 개선을 위한 건강기능식품 조성물의 제조를 위한, 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체(extracellular vesicle)의 용도.
  36. 식물 또는 이의 조직배양물로부터 유래된 세포 외 소포체(extracellular vesicle)의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 상태를 개선, 예방, 또는 치료하는 방법.
PCT/KR2021/012432 2020-09-22 2021-09-13 식물 유래 세포 외 소포체를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 및 이의 제조방법 WO2022065774A1 (ko)

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