WO2022055250A1 - 수득률이 향상된 미생물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법 및 이의 방법으로 제조된 세포 외 소포체를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 - Google Patents

수득률이 향상된 미생물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법 및 이의 방법으로 제조된 세포 외 소포체를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 Download PDF

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WO2022055250A1
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lactobacillus
spp
lysate
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saccharomyces
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강용원
박오성
왕혜수
이광수
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주식회사 바이오솔루션
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    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
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    • A61K8/99—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from microorganisms other than algae or fungi, e.g. protozoa or bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D61/00—Processes of separation using semi-permeable membranes, e.g. dialysis, osmosis or ultrafiltration; Apparatus, accessories or auxiliary operations specially adapted therefor
    • B01D61/14—Ultrafiltration; Microfiltration
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a microorganism-derived extracellular vesicle with improved yield by cell disruption, and a composition for improving skin condition comprising the extracellular vesicle prepared by the method.
  • Probiotics is a compound word of Pro and Biotics. Pro means 'for' and 'Biotics' means life.
  • the World Health Organization (WHO) defines probiotics as live microorganisms that have beneficial effects on health. Most probiotics known to date are lactic acid bacteria, which are generally consumed as food, health functional food, or medicine.
  • WHO World Health Organization
  • Most probiotics known to date are lactic acid bacteria, which are generally consumed as food, health functional food, or medicine.
  • the cosmetic industry there have been attempts to improve the skin condition by using a culture solution obtained by culturing probiotic microorganisms.
  • the culture medium of the strain contains various proteins, cytokines, growth factors, etc. secreted by the strain, it also contains components such as waste products secreted as the strain grows, so there is a possibility of exposure to various risks when used on the skin. . Therefore, in order to use the strain culture, a separate process for removing wastes or various dangerous components is required, and accordingly, the cost is high.
  • Extracellular ER is a generic term for membrane-structured endoplasmic reticulum secreted by cells for information exchange between cells.
  • Exosomes are endoplasmic reticulum with a size of several tens to hundreds of nanometers made up of a phospholipid double membrane identical to the structure of the cell membrane, and contain cytokines, growth factors, miRNA, DNA, proteins, etc. It reflects the specific genetic material and bioactive factors according to the nature and condition of the derived cell.
  • Exosomes can be isolated from various types of body fluids, for example, saliva, urine, plasma, serum, and amniotic fluid, and can also be isolated from various types of cell culture supernatants.
  • body fluids for example, saliva, urine, plasma, serum, and amniotic fluid
  • cell culture supernatants for example, saliva, urine, plasma, serum, and amniotic fluid
  • cells such as exosomes and exosome-like endoplasmic reticulum derived from cell lysates of probiotic microorganisms such as lactic acid bacteria Research on the use of exoplasmic reticulum for improving skin condition or technology for separating exosomes, exosome-like vesicles, etc. at high concentrations from microbial lysate is insignificant.
  • One aspect is (a) obtaining a lysate of the microbial culture; (b) filtering the lysate; And (c) ultra-filtering the filtered lysate; to provide a method for producing a microorganism-derived extracellular vesicle (extracellular vesicle) comprising a.
  • Another aspect is to provide a cosmetic composition for improving skin condition comprising a microorganism-derived extracellular vesicle as an active ingredient.
  • Another aspect is to provide a composition for external application for skin for anti-inflammatory or wound improvement comprising a microorganism-derived extracellular vesicle as an active ingredient.
  • Another aspect is to provide a health functional food composition for anti-inflammatory or wound improvement comprising a microorganism-derived extracellular vesicle as an active ingredient.
  • Another aspect is to provide a use of a microorganism-derived extracellular vesicle for the preparation of a cosmetic composition for improving skin conditions.
  • Another aspect is to provide the use of a microorganism-derived extracellular vesicle (extracellular vesicle) for the preparation of a composition for external application to the skin for anti-inflammatory or wound improvement.
  • extracellular vesicle extracellular vesicle
  • Another aspect is to provide the use of a microorganism-derived extracellular vesicle (extracellular vesicle) for the manufacture of a nutraceutical composition for anti-inflammatory or wound improvement.
  • extracellular vesicle extracellular vesicle
  • Another aspect is to provide a method for improving, preventing, or treating a skin condition, comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a microorganism-derived extracellular vesicle.
  • One aspect is (a) obtaining a lysate of the microbial culture; (b) filtering the lysate; And (c) ultra-filtering the filtered lysate; provides a method for producing a microorganism-derived extracellular vesicle (extracellular vesicle) comprising a.
  • extracellular vesicle refers to vesicles secreted from cells and released into the extracellular space. and plasma membrane protein, nucleic acid, and cytoplasmic components, and may mean a smaller size than the original cell, but is not limited thereto.
  • the membrane or the composition of the active ingredient inside may include the reconstituted ER.
  • the extracellular endoplasmic reticulum binds to other cells and delivers membrane components, mRNAs, miRNAs, etc., and delivers these transporters to recipient cells, thereby acting as an extracellular transporter mediating cell-cell communication.
  • exosome-like vesicle refers to a nano-sized extracellular vesicle, including nano-sized exosomes, as well as endoplasmic reticulum having a nano-sized ER structure and composition similar to exosomes. It may be the broadest concept that includes.
  • the microorganism-derived extracellular vesicles may include microorganism-derived exosomes and/or exosome-like endoplasmic reticulum.
  • microorganism may be an isolated strain or a variety of commercially available strains that can be used without limitation.
  • the microorganism is Bifidobacterium spp. , Lactobacillus ( Latobacillus spp. ), Streptococcus spp ., Enterococcus spp., Enterococcus spp ., Leuconostoc spp . ) and Lactococcus ( Lactococcus spp . ), or any one lactic acid bacteria selected from the group consisting of, or Saccharomyces spp. Specifically, Lactobacillus ( Latobacillus spp .) or Saccharomyces ( Saccharomyces spp. ) It may be a genus strain.
  • the Lactobacillus sp. strain is Lactobacillus rhamnosus ( Lactobacillus rhamnosus ), Lactobacillus plantarum ( Lactobacillus plantarum ), Lactobacillus brevis ( Lactobacillus brevis ), Lactobacillus sake Sakei ( Lactobacillus sakei ) Pentosus ( Lactobacillus pentosus ), Lactobacillus casei ( Lactobacillus casei ), and Lactobacillus paracasei ( Lactobacillus paracasei ) may be any one selected from the group consisting of, for example, Lactobacillus rhamnosus ( Lactobacillus rhamnosus ) Lactobacillus plantarum ( Lactobacillus plantarum ) It may be.
  • Saccharomyces ( Saccharomyces spp. ) genus strain is Saccharomyces Cerevisiae , Saccharomyces Carlsbergensis ), and Saccharomyces pastoria Nus ( Saccharomyces pastorianus ) It may be any one selected from the group consisting of, for example, Saccharomyces cerevisiae ( Saccharomyces cerevisiae ) may be.
  • the lysate of the microbial culture in step (a) may be a lysate of the cell mixture culture.
  • the lysate of the microbial culture in step (a) may be a lysate of the cells recovered by centrifuging the microbial culture to remove the culture supernatant.
  • the lysate of the microbial culture in step (a) may be a lysate of the culture supernatant recovered by centrifuging the microbial culture to remove the cells.
  • culture solution refers to the entire medium containing the strain, its metabolites, and extra nutrients, obtained by culturing the strain for a certain period of time in a medium capable of supplying nutrients so that the strain can grow and survive in vitro.
  • the "microorganism mixed culture solution” may mean the culture solution itself containing the cells.
  • Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus rhamnosus
  • Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum
  • Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
  • MRS medium a medium over 10 ° C
  • It may be obtained by culturing at any temperature below 40 °C for a certain time, for example, 4 to 50 hours.
  • Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus rhamnosus
  • Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum
  • Saccharomyces cerevisiae Culture medium and culture conditions for culturing the strain are those of ordinary skill in the art It can be appropriately selected or modified and used.
  • culture supernatant refers to only the liquid in the upper layer excluding the part that has sunk to the bottom by leaving the culture medium still for a certain period of time, or centrifugation of the culture medium to mean only the liquid in the upper layer except for the sediment at the bottom.
  • lysate may refer to a product obtained by crushing with chemical or physical force, and the term “lysate” may be used interchangeably with the term “cell lysate”.
  • the yield of the exosome-like vesicles can be increased compared to the case of separation from the culture supernatant, and the functional activity is excellent in improving the skin condition Since it is possible to separate the exosome-like vesicles, the composition comprising the exosome-like vesicles isolated from the biological cell mixture culture medium, the cells, or the lysate of the culture supernatant can be used as a composition for improving skin conditions.
  • the crushing in step (a) may be to physically crush the cells by applying pressure.
  • the shredding may be to break the cell membrane or to break the extracellular vesicles present inside or outside the cell, and the cell membrane ruptures to capture the active ingredient inside, and then forms the ER, or the ER to break the membrane Or it may be to reform the endoplasmic reticulum with a different composition inside.
  • the lysate may include an extracellular vesicle artificially generated by a physical force such as cell membrane or ER disruption in addition to the extracellular ER naturally occurring in the metabolic process of the strain.
  • the physical crushing may be to use a high pressure homogenizer, for example, the physical crushing is to crush 1 to 10 times using a microfluidizer. may be, for example, 1 to 8 times, 1 to 6 times, 1 to 5 times, 1 to 4 times, but 1 to 3 times may be appropriate. If cell disruption is not performed, it may be difficult to obtain an extracellular vesicle with improved functional activity in improving skin condition, and when the number of disruptions is more than 3 times, the ER membrane is destroyed due to external turgor of the extracellular vesicle, and the yield is reduced. Problems can arise.
  • the step of removing chemical components is added to prevent chemical modification of membrane components or adverse effects caused by chemical components, and contamination may occur during reagent processing.
  • the step of removing chemical components is added to prevent chemical modification of membrane components or adverse effects caused by chemical components, and contamination may occur during reagent processing.
  • mass production is difficult due to a low yield, and heat may be generated to cause degeneration of the extracellular vesicles.
  • homogenization may not be uniform, and in the case of crushing using glass beads and vortexing, a problem of not homogenizing may occur.
  • the pressure may be 700 to 2000 bar, for example, 700 to 1900 bar, 700 to 1800 bar, 700 to 1700 bar, 700 to 1600 bar, 700 to 1500 bar, 700 to 1400 bar , 700 to 1300 bar, 700 to 1200 bar, 700 to 1100 bar, 700 to 1000 bar, 800 to 2000 bar, 800 to 1900 bar, 800 to 1800 bar, 800 to 1700 bar, 800 to 1600 bar, 800 to 1500 bar , 800 to 1400 bar, 800 to 1300 bar, 800 to 1200 bar, 800 to 1100 bar, 800 to 1000 bar, 900 to 2000 bar, 900 to 1900 bar, 900 to 1800 bar, 900 to 1700 bar, 900 to 1600 bar , 900 to 1500 bar, 900 to 1400 bar, 900 to 1300 bar, 900 to 1200 bar, 900 to 1100 bar, 900 to 1000 bar.
  • the pressure may be 700 to 2000 bar. When the pressure exceeds 2000 bar, the desired exosome may be destroyed, and when the pressure is less than 700 bar, cell disruption may not occur smoothly.
  • step (b) may be to centrifuge the lysate obtained in step (a) to remove debris and filter the recovered supernatant.
  • the centrifugation may be performed at 8,000 to 100,000 ⁇ g for 20 minutes to 2 hours.
  • the step (b) may be filtering with a 0.3 to 1.0 ⁇ m filter, for example, 0.3 to 0.9 ⁇ m, 0.3 to 0.8 ⁇ m, 0.3 to 0.7 ⁇ m, 0.3 to 0.6 ⁇ m, 0.3 to 0.5 ⁇ m, 0.4 to 1.0 ⁇ m, 0.4 to 0.9 ⁇ m, 0.4 to 0.8 ⁇ m, 0.4 to 0.7 ⁇ m, 0.4 to 0.6 ⁇ m, 0.4 to 0.5 ⁇ m.
  • a 0.3 to 1.0 ⁇ m filter for example, 0.3 to 0.9 ⁇ m, 0.3 to 0.8 ⁇ m, 0.3 to 0.7 ⁇ m, 0.3 to 0.6 ⁇ m, 0.3 to 0.5 ⁇ m, 0.4 to 1.0 ⁇ m, 0.4 to 0.9 ⁇ m, 0.4 to 0.8 ⁇ m, 0.4 to 0.7 ⁇ m, 0.4 to 0.6 ⁇ m, 0.4 to 0.5 ⁇ m.
  • the size of the filter is more than 1.0 ⁇ m, cell disruption debris other than exosomes may be introduced to cause a problem that exosomes cannot be obtained in high purity, and if the size of the filter is less than 0.3 ⁇ m, there may be a problem of lowering the yield can
  • step (c) may be to use a molecular weight cutoff (MWCO) filter of 20 kDa to 500 kDa.
  • MWCO molecular weight cutoff
  • step (c) may be to use a molecular weight cutoff (MWCO) filter of 20 kDa to 500 kDa.
  • MWCO molecular weight cutoff
  • step (c) the cell lysate is concentrated through the membrane filter, and the material larger than the pore size is caught by the filter, and the small material that has passed through the membrane filter may be removed by diffusion.
  • the method is a 0.01 to 0.3 ⁇ m filter, for example, 0.01 to 0.25 ⁇ m, 0.01 to 0.2 ⁇ m, 0.1 to 0.3 ⁇ m, 0.1 to 0.25 of the ultra-filtered lysate after step (c). It may further include the step of sterilizing and filtering with a filter of ⁇ m, 0.1 to 0.2 ⁇ m, 0.2 to 0.3 ⁇ m, or 0.2 to 0.25 ⁇ m.
  • the size of the filter is more than 0.3 ⁇ m, there may be a problem that sterilization filtration is not performed, and when the size of the filter is less than 0.01 ⁇ m, there may be a problem that the efficiency is lowered.
  • the method may be to prepare an extracellular vesicle having a diameter of 20 nm to 400 nm.
  • One aspect provides a cosmetic composition for improving skin condition comprising a microorganism-derived extracellular vesicle as an active ingredient.
  • a cosmetic composition for improving skin condition comprising a microorganism-derived extracellular vesicle as an active ingredient.
  • the microorganisms and the extracellular vesicles are as described above.
  • the microorganism is Bifidobacterium spp. , Lactobacillus ( Latobacillus spp. ), Streptococcus spp ., Enterococcus spp., Enterococcus spp ., Leuconostoc spp . ), Lactococcus ( Lactococcus spp .), Saccharomyces (Saccharomyces spp.), Kluyveromyces (Kluyveromyces spp.) and Bacillus (Bacillus spp.) It may be any one selected from the group consisting of strains.
  • the Lactobacillus sp. strain is Lactobacillus rhamnosus ( Lactobacillus rhamnosus ), Lactobacillus plantarum ( Lactobacillus plantarum ), Lactobacillus brevis ( Lactobacillus brevis ), Lactobacillus sake Sakei ( Lactobacillus sakei ) Pentosus ( Lactobacillus pentosus ), Lactobacillus casei ( Lactobacillus casei ), and Lactobacillus paracasei ( Lactobacillus paracasei ) may be any one selected from the group consisting of.
  • Saccharomyces spp. genus strain is Saccharomyces Cerevisiae, Saccharomyces Carlsbergensis, and Saccharomyces pastoria Nus (Saccharomyces pastorianus) may be any one selected from the group consisting of.
  • the extracellular vesicles may be separated from the lysate of the microbial culture.
  • the lysate of the microbial culture may be a lysate of a mixed culture solution, cells, or culture supernatant.
  • the extracellular vesicles may be separated by ultrafiltration with a molecular weight cutoff (MWCO) filter of 20 kDa to 500 kDa.
  • MWCO molecular weight cutoff
  • the extracellular vesicles may be separated by ultrafiltration from a microbial cell mixture culture medium, cells, or a lysate of a culture supernatant.
  • the extracellular vesicles may be extracellular vesicles prepared by the above-described manufacturing method.
  • the skin condition improvement may be one or more selected from the group consisting of anti-inflammatory, skin whitening, skin moisturizing, skin barrier strengthening, skin regeneration, wound improvement, and anti-aging.
  • anti-inflammatory may be used interchangeably with “inhibiting or improving inflammation”, and may refer to any action in which an immune response is alleviated to suppress NO production.
  • skin lightening may refer to any action that inhibits or prevents skin deposition by inhibiting the synthesis of melanin.
  • moistureturizing the skin may refer to any action that retains moisture in the skin or prevents moisture loss.
  • skin barrier strengthening may refer to any action in which the function of the skin barrier that is located at the outermost part of the skin and prevents loss of moisture and nutrients is enhanced.
  • skin regeneration may refer to any action that replenishes a part of the skin when a part of the skin is lost or promotes the proliferation of skin cells.
  • wound amelioration may include use of reducing or alleviating the severity of a wound by promoting skin regeneration.
  • the wound improvement may be to reduce or alleviate the degree of a wound that has already occurred by promoting skin regeneration.
  • wound may be at least one selected from the group consisting of cuts, burns, abrasions, photodamage by ultraviolet (UV) rays, and scars.
  • the term “anti-aging” may refer to any action that prevents or inhibits skin aging.
  • Skin aging includes intrinsic aging over time and extrinsic aging caused by external environments.
  • the skin aging may include skin wrinkles, blemishes, blemishes, and the like.
  • the skin wrinkles may be fine wrinkles caused by the deterioration of the skin.
  • the skin wrinkles may be due to photoaging, age, facial expression, lack of moisture, or a combination thereof.
  • the photoaging may be skin aging caused by exposure to ultraviolet rays (including UVA, UVB, and UVC).
  • skin wrinkle improvement may refer to suppressing or inhibiting the formation of wrinkles on the skin, or alleviating the already generated wrinkles.
  • amelioration may refer to any action that at least reduces the severity of a parameter, eg, a symptom, associated with alleviation or treatment of a condition.
  • the composition may inhibit NO production.
  • the composition may inhibit melanin production.
  • the composition may enhance the expression of fibronectin (Fibronectin).
  • the composition may enhance the expression of filaggrin.
  • the composition may be to proliferate skin fibroblast cells.
  • the extracellular vesicles may have a diameter of 20 nm to 400 nm.
  • the composition comprises 0.000000001 wt% to 80 wt%, for example, 0.0001 wt% to 60 wt%, 0.0001 wt% to 40 wt%, 0.0001 wt% to 30 wt%, 0.0001 wt% to 20 wt% with respect to the total weight of the composition %, 0.0001% to 10%, 0.0001% to 5%, 0.001% to 80%, 0.001% to 60%, 0.001% to 40%, 0.001% to 30%, 0.001% to 20% by weight, 0.001% to 10% by weight, 0.001% to 5% by weight, 0.01% to 80% by weight, 0.01% to 60% by weight, 0.01% to 40% by weight, 0.01% by weight % to 30 wt%, 0.01 wt% to 20 wt%, 0.01 wt% to 10 wt%, 0.01 wt% to 5 wt%, 0.1 wt% to 80 wt%, 0.1 wt% to 60 wt%
  • the composition comprises 10 6 / ml to 10 12 / ml, for example, 10 6 /ml to 10 11 / ml, 10 6 /ml to 10 10 extracellular vesicles /ml, 10 6 /ml to 10 9 /ml, 10 6 /ml to 10 8 /ml, 10 6 /ml to 10 7 /ml, 10 7 /ml to 10 12 /ml , 10 7 /ml to 10 11 /ml, 10 7 /ml to 10 10 /ml, 10 7 /ml to 10 9 /ml, 10 7 /ml to 10 8 /ml, 10 8 /ml to 10 12 /ml, 10 8 /ml to 10 11 /ml, 10 8 /ml to 10 10 /ml, 10 8 /ml to 10 9 /ml, 10 9 /ml to 10 12 pcs./ml, 10 9 pcs./m
  • the term "included as an active ingredient” means that the extracellular vesicles of the present specification are added to an extent capable of exhibiting the above-mentioned effects, and various components are added as subcomponents for delivery and stabilization, etc. It may mean that it includes formulation).
  • the cosmetic composition may have a cosmetic formulation of, for example, a softening lotion, a nourishing lotion, a massage cream, a nourishing cream, a lotion, an essence, a pack, a gel, an ampoule, or a skin adhesion type.
  • Components included in the cosmetic composition may include components commonly used in cosmetic compositions in addition to the composition as an active ingredient, for example, conventional adjuvants and carriers such as stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and fragrances. may include
  • compositions for external application for skin for improving anti-inflammatory or wound wounds comprising a microorganism-derived extracellular vesicle as an active ingredient.
  • a microorganism-derived extracellular vesicle as an active ingredient.
  • microorganisms, extracellular vesicles, anti-inflammatory, wound improvement, and composition are the same as described above.
  • the external preparation for skin may be a cream, gel, ointment, skin emulsifier, skin suspension, transdermal patch, drug-containing bandage, lotion, or a combination thereof.
  • the external preparation for skin is a component usually used in external preparations for skin such as cosmetics or pharmaceuticals, for example, an aqueous component, an oily component, a powder component, alcohol, a moisturizer, a thickener, an ultraviolet absorber, a whitening agent, a preservative, an antioxidant, a surfactant, a fragrance , colorant, various skin nutrients, or a combination thereof may be appropriately formulated as needed.
  • the external preparation for skin includes metal-blocking agents such as disodium edetate, trisodium edetate, sodium citrate, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, and gluconic acid, caffeine, tannin, belapamil, licorice extract, glablidine, and kaline.
  • metal-blocking agents such as disodium edetate, trisodium edetate, sodium citrate, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, and gluconic acid, caffeine, tannin, belapamil, licorice extract, glablidine, and kaline.
  • Fruit hot water extracts, various herbal medicines, tocopherol acetate, glitylittic acid, tranexamic acid and derivatives or salts thereof, vitamin C, magnesium ascorbate phosphate, ascorbic acid glucoside, arbutin, kojic acid, glucose, fructose, Sugars, such as trehalose, etc. can be mix
  • Another aspect provides a health functional food composition for anti-inflammatory or wound improvement comprising a microorganism-derived extracellular vesicle as an active ingredient.
  • a health functional food composition for anti-inflammatory or wound improvement comprising a microorganism-derived extracellular vesicle as an active ingredient.
  • microorganisms, extracellular vesicles, anti-inflammatory, wound improvement as described above for the composition.
  • the health functional food composition may be used alone or in combination with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the purpose of use (prophylactic, health or therapeutic treatment).
  • the composition of the present specification may be added in an amount of 15 parts by weight or less based on the raw material.
  • the beverage composition may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as an additional component like a conventional beverage.
  • the natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • sweetener natural sweeteners such as taumartin and stevia extract, synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame, and the like can be used.
  • the health food composition can also be added to nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, coloring agents, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonated beverages carbonation agent used, or a combination thereof.
  • the health functional food composition may also contain natural fruit juice, fruit juice beverage, fruit flesh for the production of vegetable beverage, or a combination thereof.
  • Another aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases or improving wounds, comprising a microorganism-derived extracellular vesicle as an active ingredient.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory diseases or improving wounds, comprising a microorganism-derived extracellular vesicle as an active ingredient.
  • microorganisms, extracellular vesicles, wound improvement as described above for the composition.
  • prevention may mean comprehensively preventing a disease or lowering the likelihood or frequency of occurrence by administering the composition in a pharmaceutically effective amount. For example, it may be to reduce the probability of an inflammatory disease, such as a skin inflammatory disease, or to reduce the probability of recurrence in a patient who is likely to develop or a patient who has had it.
  • pharmaceutically effective amount refers to the type of disease, the patient's age, weight, health, sex, the patient's sensitivity to the drug, the route of administration, the administration method, the number of administration, the treatment period, the combination, or drugs used simultaneously in the medical field. It can be easily determined by a person skilled in the art according to factors well known in
  • treatment may mean comprehensively improving the disease by administering the composition in a pharmaceutically effective amount, and may be to provide relief or cure of the symptoms of the disease in a shorter time compared to natural healing, It may be to improve one symptom or most of the symptoms caused by The pharmaceutically effective amount is as described above.
  • the "inflammatory disease” may be an inflammatory skin disease, an allergic inflammatory disease, an inflammatory eye disease, an inflammatory osteoarticular disease, an inflammatory muscle disease or an inflammatory bowel disease, and the "inflammatory skin disease” is atopic dermatitis, psoriasis, contact dermatitis, It may be any one selected from the group consisting of dermatitis eczema, actinic dermatitis, seborrheic dermatitis, dermatitis herpetiformis, lichen planus, lichen planus, pyoderma gangrene, pemphigus, epidermolysis bullosa, allergy, and hypersensitivity.
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable diluent or carrier.
  • the diluent may be lactose, corn starch, soybean oil, microcrystalline cellulose, or mannitol, and the lubricant may be magnesium stearate, talc, or a combination thereof.
  • the carrier may be an excipient, a disintegrant, a binder, a lubricant, or a combination thereof.
  • the excipient may be microcrystalline cellulose, lactose, low-substituted hydroxycellulose, or a combination thereof.
  • the disintegrant may be carboxymethyl cellulose calcium, sodium starch glycolate, anhydrous calcium monohydrogen phosphate, or a combination thereof.
  • the binder may be polyvinylpyrrolidone, low-substituted hydroxypropylcellulose, hydroxypropylcellulose, or a combination thereof.
  • the lubricant may be magnesium stearate, silicon dioxide, talc, or a combination thereof.
  • Another aspect provides the use of a microorganism-derived extracellular vesicle for the manufacture of a cosmetic composition for improving a skin condition.
  • a microorganism-derived extracellular vesicle for the manufacture of a cosmetic composition for improving a skin condition.
  • Another aspect provides the use of a microorganism-derived extracellular vesicle (extracellular vesicle) for the preparation of a composition for external application to the skin for anti-inflammatory or wound improvement.
  • extracellular vesicle extracellular vesicle
  • anti-inflammatory, wound improvement, external composition for skin, microorganism, microorganism-derived extracellular vesicles are the same as described above.
  • Another aspect provides the use of a microorganism-derived extracellular vesicle for the manufacture of a nutraceutical composition for anti-inflammatory or wound healing.
  • anti-inflammatory, wound improvement, health functional food composition, microorganism, microorganism-derived extracellular vesicles are the same as described above.
  • Another aspect provides a method of improving, preventing, or treating a condition in a subject, comprising administering to the subject in need thereof an effective amount of a microorganism-derived extracellular vesicle.
  • microorganisms, microorganism-derived extracellular vesicles, improvement, prevention, treatment are the same as described above.
  • the subject's condition may be a skin condition or a condition related to inflammation, for example, an inflammatory disease, as described above for the skin condition or the inflammatory disease.
  • administering means the arrangement of the composition according to the
  • Administration may be administered by methods known in the art. Administration may be administered directly to a subject by any means, for example, intravenous, intramuscular, oral, transdermal, mucosal, intranasal, intratracheal or subcutaneous administration. can The administration may be systemically or locally.
  • the subject may be a mammal, such as a human, cow, horse, pig, dog, sheep, goat, or cat.
  • the subject may be an individual in need of skin condition improvement, for example, skin inflammation suppression, skin whitening, skin moisturizing, skin barrier strengthening, skin regeneration, wound improvement, and skin aging suppression effect, or improvement of inflammatory diseases , may be a subject in need of a prophylactic, or therapeutic effect.
  • the administration is 0.1 mg to 1,000 mg, for example, 0.1 mg to 500 mg, 0.1 mg to 100 mg, 0.1 mg to 50 mg, 0.1 mg to 25 mg, 1 mg to 1 mg of the composition according to one embodiment per day 1,000 mg, 1 mg to 500 mg, 1 mg to 100 mg, 1 mg to 50 mg, 1 mg to 25 mg, 5 mg to 1,000 mg, 5 mg to 500 mg, 5 mg to 100 mg, 5 mg to 50 mg, 5 mg to 25 mg, 10 mg to 1,000 mg, 10 mg to 500 mg, 10 mg to 100 mg, 10 mg to 50 mg, or 10 mg to 25 mg may be administered.
  • the dosage may be prescribed in various ways depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, morbidity, food, administration time, administration route, excretion rate and reaction sensitivity, and those skilled in the art
  • the dosage may be appropriately adjusted in consideration of these factors.
  • the number of administration may be once a day or twice or more within the range of clinically acceptable side effects, and may be administered to one or two or more sites for the administration site, and total daily or at intervals of 2 to 5 days
  • the number of days of administration may range from 1 to 30 days per treatment. If necessary, the same treatment can be repeated after a titration period.
  • the dose is the same as that of a human per kg, or the above dose is converted, for example, by the volume ratio (for example, average value) of the target animal and the organ (heart, etc.) of the human One dose can be administered.
  • the method for preparing a microorganism-derived extracellular vesicles according to an aspect can obtain a large amount of extracellular vesicles with excellent functional activity, and can be usefully used in the preparation of a composition for improving skin conditions.
  • FIG. 1 is a flowchart schematically illustrating a method for producing a microorganism-derived extracellular vesicles according to an embodiment.
  • Figure 2 is a flowchart exemplarily showing a method for producing an extracellular vesicle derived from a lactic acid bacteria mixed culture medium lysate according to an embodiment.
  • FIG. 3 is a flowchart exemplarily illustrating a method for producing an extracellular vesicle derived from a lactic acid bacteria cell lysate according to an embodiment.
  • Figure 4 is a flowchart exemplarily showing a method for producing an extracellular vesicle derived from a lactic acid bacteria culture supernatant lysate according to an embodiment.
  • 5a and 5b are photographs of observing the change in turbidity according to the repetition of the cell disruption and debris removal process of the complex sample and the lysate sample, respectively.
  • 6a to 6e are graphs measuring the number of particles according to the size of the extracellular vesicles separated by the method of Examples 1 to 4 and Comparative Example 1 by nano-sight, respectively.
  • 9A and 9B are results of comparative analysis of fibronectin and filaggrin gene expression ability after treating the extracellular vesicles isolated from Example 3 and Comparative Example 1 in HaCaT cells, respectively.
  • 10a and 10b are results of confirming the HDF proliferation ability of the extracellular vesicles isolated from the cell lysate of Examples 2 and 4, respectively.
  • 12A and 12B are results of comparative analysis of fibrillin and elastin gene expression ability after treating HS68 cells with extracellular vesicles isolated from the cell lysate of Example 2, respectively.
  • Example 13 is a result of comparative analysis of melanin production after treating the extracellular vesicles isolated from the cell lysate of Example 2 in B16F10 cells.
  • Example 14 is a result of evaluating the water retention of the extracellular vesicles derived from the lactic acid bacteria cell lysate isolated in Example 2.
  • the extracellular vesicles containing exosome-like vesicles from various microorganisms were separated according to the method of the following example (this is named 'HPEV' process) to prepare microbial-derived extracellular vesicles, and it was used for yield evaluation, functional activity evaluation, etc. .
  • Example 1 Separation of extracellular vesicles derived from lactic acid bacteria mixed culture medium lysate (S1)
  • Lactobacillus rhamnosus (Lactobacillus rhamnosus) Extracellular vesicles containing exosome-like ERs were isolated from the mixed culture medium. Lactobacillus rhamnosus ( Lactobacillus rhamnosus, KCCM 32405) was used after receiving the strain deposited at the Korea Center for Microorganisms (KCCM).
  • Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus rhamnosus
  • MRS medium a mixed culture solution
  • a complex sample a mixed culture solution
  • Cell disruption was performed on the obtained complex sample at a pressure of 1000 bar using a high-pressure homogenizer (Microfludizer, MN600P-300, Picomax, Seoul, Republc of Korea).
  • the obtained cell lysate was centrifuged at 10,000 ⁇ g at 4°C for 30 minutes to remove cell-related debris and a supernatant was obtained.
  • the cell disruption and debris removal process was repeated three times.
  • Figure 5a is a photograph observing the change in turbidity of the complex sample according to the repetition of the cell disruption and debris removal process. As a result, as shown in FIG. 5a, it was confirmed that most of the debris caused by cell disruption was removed. The obtained supernatant was filtered through a 0.45 ⁇ m sterile filter to further remove residual cell debris.
  • the eluted sample was subjected to ultrafiltration (ultrafiltration, Pellicon ® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany) with a MWCO (molecular weight cutoff) 100 kDa filter to separate extracellular vesicles over 100 kDa, It was washed twice with tertiary distilled water or isotonic solution (saccharide or PBS, etc.) to remove medium components. The obtained solution was sterilized and filtered through a 0.2 ⁇ m sterile filter, and after freeze-drying, it was stored at -20°C and used for the following test.
  • ultrafiltration ultrafiltration, Pellicon ® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany
  • MWCO molecular weight cutoff
  • Extracellular vesicles were isolated in the same manner as in Example 1, except that a lysate sample was used.
  • Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus rhamnosus
  • MRS medium for 24 hours
  • the obtained cell mixture was centrifuged at 4 ° C. at 10,000 ⁇ g for 30 minutes to remove the culture supernatant and recover the cells.
  • the recovered cells were suspended in 500 mL of tertiary distilled water or isotonic solution (eg, saccharide or PBS, etc.) to prepare a cell sample (hereinafter, referred to as a lysate sample).
  • FIG. 5b is a photograph observing the change in turbidity of the lysate sample according to the repetition of the cell disruption and debris removal process. As a result, as shown in FIG. 5b , it was confirmed that most of the debris caused by cell disruption was removed.
  • the obtained supernatant was filtered through a 0.45 ⁇ m sterile filter to further remove residual cell debris.
  • the eluted sample was subjected to ultrafiltration (ultrafiltration, Pellicon ® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany) with a MWCO (molecular weight cutoff) 100 kDa filter to separate extracellular vesicles over 100 kDa.
  • the obtained solution was sterilized and filtered through a 0.2 ⁇ m sterile filter, and after freeze-drying, it was stored at -20°C and used for the following test.
  • Extracellular vesicles were isolated in the same manner as in Example 1, except that a filtration sample was used.
  • the cell mixture obtained after culturing Lactobacillus rhamnosus in MRS medium at 37 °C for 24 hours was centrifuged twice for 30 minutes at 10,000 ⁇ g at 4 °C to remove the cells and culture supernatant. (hereinafter referred to as a filtration sample) was recovered.
  • the obtained filtration sample was disrupted at a pressure of 1000 bar using a high-pressure homogenizer (Microfludizer, MN600P-300, Picomax, Seoul, Republc of Korea) to induce reconstitution of the extracellular vesicles secreted into the culture medium 0.45 Filtration through a ⁇ m sterile filter.
  • a high-pressure homogenizer Microfludizer, MN600P-300, Picomax, Seoul, Republc of Korea
  • the eluted sample was subjected to ultrafiltration (ultrafiltration, Pellicon ® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany) with a MWCO (molecular weight cutoff) 100 kDa filter to separate extracellular vesicles over 100 kDa, It was washed twice with tertiary distilled water or isotonic solution (saccharide or PBS, etc.) to remove medium components. The obtained solution was sterilized and filtered through a 0.2 ⁇ m sterile filter, and after freeze-drying, it was stored at -20°C and used for the following test.
  • ultrafiltration ultrafiltration, Pellicon ® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany
  • MWCO molecular weight cutoff
  • Example 2 the extracellular vesicles were isolated in the same manner as in Example 2, except that Saccharomyces Cerevisiae was used instead of Lactobacillus rhamnosus .
  • ultra-filtration sample After culturing Lactobacillus rhamnosus at 37 ° C for 24 hours in MRS medium, centrifugation was repeated twice for 30 minutes at 4 ° C. at 10,000 ⁇ g to remove the cells and the obtained culture supernatant ( Hereinafter, referred to as ultra-filtration sample) was filtered through a 0.45 ⁇ m sterile filter.
  • the eluted sample was subjected to ultrafiltration (ultrafiltration, Pellicon ® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany) with a MWCO (molecular weight cutoff) 100 kDa filter to separate extracellular vesicles over 100 kDa, and to remove the medium components It was washed twice with tertiary distilled water or isotonic solution (saccharide or PBS, etc.). The obtained solution was filtered through a 0.2 ⁇ m sterile filter, lyophilized and stored at -20° C. for use in the following test.
  • ultrafiltration ultrafiltration, Pellicon ® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany
  • MWCO molecular weight cutoff
  • the size and concentration of the extracellular ER was measured by performing nanoparticle tracking analysis using nano-sight NS300 (Malvern Panalytical, Almelo, Nederland).
  • the extracellular vesicle samples isolated in Examples 1 to 4 and Comparative Example 1 were diluted with PBS or tertiary distilled water so that the number of particles was 1 to 4x10 8 , and the number of frames during measurement was 20 to 30. 1mL of the sample was prepared and loaded into the instrument chamber. After focusing on the particle and adjusting the camera level, measurement was started. The capture duration was set between 30 and 60 seconds, and measurements were repeated 3 times. After the measurement, the detection threshold was adjusted and the values measured three times were analyzed. In this case, it was considered appropriate if the pattern of the results repeated three times showed a similar pattern.
  • 6a to 6e are graphs measuring the number of particles according to the size of the extracellular vesicles separated by the method of Examples 1 to 4 and Comparative Example 1 by nano-sight, respectively.
  • Example 1 (Unit: particles/L) Example 1 (S1) Example 2 (S2) Example 3 (S3) Example 4 (S4) Comparative Example 1 (R1) Number of particles (particles/L) 5.17E+11 7.00E+11 3.26E+10 1.58E+11 8.20E+09
  • the cell pellet obtained by centrifugation after bacterial culture and the extracellular vesicle protein pattern isolated from Examples 1 to 3 and Comparative Example 1 were subjected to SDS-PAGE. was used for comparison.
  • the cell pellet obtained by centrifugation after culturing the bacteria was suspended in PBS.
  • the lyophilized product of the extracellular vesicles obtained in Examples 1 to 3 and Comparative Example 1 was dissolved in tertiary distilled water or PBS at a constant concentration. After that, it was mixed with the sample buffer and boiled at 95°C for 10 minutes. After that, electrophoresis was performed by loading on 10% SDS-PAGE gel. After electrophoresis, the gel was stained with Coomassie blue staining solution for 30 minutes. After staining, destaining solution was used to destain and the results were confirmed. 7 is a result of confirming the pattern of the extracellular vesicle protein isolated from Examples 1 to 3 and Comparative Example 1 using SDS-PAGE.
  • Raw264.7 macrophages were cultured in DMEM medium containing 10% FBS and aliquoted to each have a density of 80% in a 96-well plate. After culturing for 24 hours, 1ug/mL of LPS, an inflammatory substance, and samples of Examples 1 to 3 and Comparative Example 1 were treated with concentrations of 0.0025 and 0.01% (v/v) and further cultured for 24 hours.
  • the control group was treated with PBS, the negative control group was treated with only LPS 1ug/mL, and the positive control group was treated with LPS 1ug/mL and then treated with ascorbic acid.
  • fibronectin fibronectin
  • HaCat keratinocytes
  • Example 3 and Comparative Example 1 were treated at a concentration of 0.00001% (v/v). After incubation for 48 hours after treatment, the supernatant was removed and mRNA was extracted according to the experimental method of the kit (TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit, Takara, Shiga, Japan), and then synthesized into cDNA using reverse transcriptase, and the synthesized cDNA was SYBR After mixing with green master mix (LightCycler® 480 SYBR Green I Master, Roche, Basel, Switzerland), realtime-PCR was performed to confirm gene expression in real time.
  • 9A and 9B are results of comparative analysis of fibronectin and filaggrin gene expression ability after treating the extracellular vesicles isolated from Example 3 and Comparative Example 1 in HaCaT cells, respectively.
  • the extracellular vesicles treated group isolated in Example 3 significantly increased the expression of fibronectin and filaggrin, and in particular, compared to the extracellular vesicles treated group isolated in Comparative Example 1. It was confirmed that the expression of fibronectin and filaggrin was remarkably improved. This means that even in the case of extracellular vesicles derived from the same culture medium, the efficacy is determined to be increased by this process, and the extracellular vesicles with significantly improved skin barrier strengthening activity are isolated according to the manufacturing method of the present invention for performing crushing.
  • the lactic acid bacteria and yeast-derived extracellular vesicles isolated from the cell lysates of Examples 2 and 4 were treated with human skin fibroblasts (HDF) to determine their effect on cell proliferation.
  • HDF human skin fibroblasts
  • human skin fibroblast HDFs were cultured in a CO2 incubator, and the samples of Examples 2 and 4 were treated at concentrations of 0.00001 to 0.001% (v/v) and then cultured in serum-free conditions for 24 hours. did As a control group, an untreated group was used, and a culture medium containing serum was used as a positive control group. After completion of the culture, the supernatant was removed, treated with 1 mg/mL of MTT reagent, and further cultured for 4 hours. After removing the supernatant and treating with DMSO, absorbance was measured at a wavelength of 570 nm to calculate cell proliferation and cytotoxicity compared to the control group. 10a and 10b are the results of confirming the HDF proliferation ability of the extracellular vesicles isolated from the cell lysate of Examples 2 and 4, respectively.
  • the extracellular vesicles isolated from the cell lysate of Examples 2 and 4 had an effect on skin fibroblast proliferation, and the cell proliferation rate did not significantly decrease even when the concentration of the test substance increased. Bar, it was confirmed that it is safe because there is no cytotoxicity. This means that the safe extracellular vesicles were isolated without cytotoxicity while having excellent wound healing and skin regeneration ability according to the manufacturing method of the present invention for performing crushing.
  • the samples of Examples 2 and 4 were treated at a concentration of 0.00001% (v/v). After incubation for 48 hours after treatment, the supernatant was removed and mRNA was extracted according to the experimental method of the kit (TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit, Takara, Shiga, Japan), and then synthesized into cDNA using reverse transcriptase, and the synthesized cDNA was SYBR After mixing with green master mix (LightCycler® 480 SYBR Green I Master, Roche, Basel, Switzerland), realtime-PCR was performed to confirm gene expression in real time.
  • 11 is a result of comparative analysis of collagen type I ⁇ 1 gene expression ability after treating the extracellular vesicles isolated from the cell lysate of Examples 2 and 4 in HDF cells.
  • Example 2 human dermal fibroblasts (HS68) were treated with the extracellular vesicles of Example 2 and then fibrillin, elastin (Elastin) gene expression ability was evaluated.
  • HS68 human dermal fibroblasts
  • Example 2 After culturing so that the density of HS68 cells is about 80%, the sample of Example 2 was treated for each concentration of 0.000000001 and 0.00000001% (v/v). The positive control group was treated with EGCG. After incubation for 24 hours after treatment, the supernatant is removed, mRNA is extracted using trizol, and cDNA is synthesized using reverse transcriptase. The synthesized cDNA is mixed with a primer, dNTP, and taq polimerase, and then PCR is performed to check gene expression in real time. Confirmed. 12A and 12B are results of comparative analysis of fibrillin and elastin gene expression ability after treating HS68 cells with extracellular vesicles isolated from the cell lysate of Example 2, respectively.
  • Example 2 As a result, as shown in FIGS. 12A and 12B , it was confirmed that the extracellular vesicles isolated in Example 2 significantly increased fibrillin and elastin expression in a concentration-dependent manner. This means that the extracellular vesicles having excellent anti-aging activity, such as skin wrinkles and elasticity improvement, were isolated according to the manufacturing method of the present invention for performing crushing.
  • B16F10 cells were treated with the extracellular vesicles of Example 2 and then melanin production was evaluated.
  • Example 2 As a result, as shown in FIG. 13 , it was confirmed that the extracellular vesicles isolated in Example 2 significantly reduced melanin expression in a concentration-dependent manner. This means that the extracellular vesicles having excellent skin whitening activity were isolated according to the preparation method of the present invention for performing lysis.
  • the moisture content of the site to which the test substance is to be applied was measured in advance using a moisture meter (JANUS-III, Pie, Seoul, Korea). After applying the same amount of tertiary distilled water as a control and the sample of Example 2 to the filter paper, attach it to the subject's arm, wait 30 minutes for the sample to permeate, and then remove the filter paper for 0 minutes, 5 minutes, 15 minutes, Moisture power was measured every 30 minutes with a moisture meter. The amount of moisture change was evaluated by the following formula (1).
  • Example 14 is a result of evaluating the water retention of the extracellular vesicles derived from the lactic acid bacteria cell lysate isolated in Example 2.

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Abstract

본 발명은 세포 파쇄에 의해 수득률이 향상된 미생물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법 및 이의 방법으로 제조된 유산균 유래 세포 외 소포체를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것으로, 일 양상에 따른 미생물 유래 세포 외 소포체 제조 방법은 항염증, 피부 미백 등의 기능적 활성이 우수한 세포 외 소포체를 대량으로 수득할 수 있어, 피부 상태 개선용 조성물의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

수득률이 향상된 미생물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법 및 이의 방법으로 제조된 세포 외 소포체를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물
본 발명은 세포 파쇄에 의해 수득률이 향상된 미생물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법 및 이의 방법으로 제조된 세포 외 소포체를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물에 관한 것이다.
프로바이오틱스(Probiotics)는 Pro와 Biotics의 합성어로서, Pro는 '~를 위한'을 의미하고, 'Biotics'는 생명을 뜻한다. 세계보건기구(WHO)는 프로바 이오틱스를 건강에 좋은 효과를 주는 살아있는 균으로 정의하고 있다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 유산균으로, 일반적으로 식품, 건강기능식품, 또는 의약품으로 섭취되고 있다. 화장품 산업에서도 프로바이오틱스 미생물을 배양하여 얻은 배양액을 이용하여 피부 상태를 개선하고자 하는 시도가 있어 왔다. 그러나, 균주 배양액에는 균주가 분비하는 다양한 단백질, 사이토카인, 성장인자 등이 함유되어 있는 반면, 균주가 성장하면서 분비한 노폐물 등의 성분도 포함되어 있기 때문에 피부에 사용할 경우 각종 위험에 노출될 가능성이 있다. 따라서, 균주 배양액을 이용하기 위해서는 노폐물이나 각종 위험 성분을 제거하기 위한 별도의 공정이 필요하고 이에 따라 비용이 많이 들게 된다.
세포 외 소포체는 세포간 정보교환을 위해 세포에서 분비하는 막 구조의 소포체의 총칭으로, 엑소좀(exosome), 엑토좀(ectosome), 마이크로소포체(microvesicle), 마이크로입자 (microparticle), 세포자멸체(apoptotic body) 등을 포함한다. 엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 인지질 이중막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 cytokine, growth factor, miRNA, DNA, 단백질 등이 포함되어 있으며, 분비하는 기원 세포(공여 세포)의 상태를 반영하므로 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다.
엑소좀은 다양한 종류의 체액, 예를 들어 침, 소변, 혈장, 혈청, 양수로부터 분리할 수 있고 여러 종류의 세포 배양 상층액에서도 분리가 가능하다. 인간 줄기세포 배양 상층액으로부터 엑소좀을 분리하는 방법이 개발된 바 있으나 (한국공개특허 10-2016-0086253), 유산균과 같은 프로바이오틱스 미생물의 세포 파쇄물로부터 유래된 엑소좀, 엑소좀 유사 소포체 등의 세포 외 소포체의 피부 상태 개선 용도나 미생물의 파쇄물로부터 엑소좀, 엑소좀 유사 소포체 등의 세포 외 소포체를 고농도로 분리하는 기술에 대한 연구는 미미한 실정이다.
일 양상은 (a) 미생물 배양액의 파쇄물을 수득하는 단계; (b) 상기 파쇄물을 여과하는 단계; 및 (c) 상기 여과된 파쇄물을 한외여과하는 단계;를 포함하는 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 양상은 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 상처 개선용 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 상처 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 피부 상태를 개선하기 위한 화장료 조성물의 제조를 위한, 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)의 용도를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 항염증 또는 상처 개선을 위한 피부외용제 조성물의 제조를 위한, 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)의 용도를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 항염증 또는 상처 개선을 위한 건강기능식품 조성물의 제조를 위한, 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)의 용도를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 상태를 개선, 예방, 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 (a) 미생물 배양액의 파쇄물을 수득하는 단계; (b) 상기 파쇄물을 여과하는 단계; 및 (c) 상기 여과된 파쇄물을 한외여과하는 단계;를 포함하는 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 제조하는 방법을 제공한다.
용어 “세포 외 소포체(extracellular vesicle)”는 세포에서 분비되어 세포 외 공간으로 방출된 소포체(vesicles)를 의미하는 것으로서, 막 구조 소포체로 내부와 외부가 구분되며, 세포의 세포막 지질(plasma membrane lipid)과 세포막 단백질(plasma membrane protein), 핵산(nucleic acid), 및 세포질 성분 등을 가지고 있고, 원래 세포보다 크기가 작은 것을 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 세포가 터지면서 내부의 유효 성분을 포집한 뒤 형성된 소포체나 다소포체가 터지면서 막이나 내부의 유효 성분 조성이 재구성된 소포체 등을 포함하는 것일 수 있다. 상기 세포 외 소포체는 다른 세포에 결합하여 막 구성요소, mRNAs, miRNAs 등을 전달해 주고, 이들 전달 물질을 수용 세포에 전달해 줌으로써 세포-세포 간 소통을 매개하는 세포 외 전달체로 작용하는 것일 수 있다.
용어 “엑소좀 유사 소포체(exosome like vesicle)”는 나노 크기의 세포 외 소포체를 의미하는 것으로서, 나노 크기의 엑소좀을 포함할 뿐만 아니라 나노 크기의 소포체 구조 및 그 조성물이 엑소좀과 유사한 소포체를 모두 포함하는 최광의 개념일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 미생물 유래 세포 외 소포체는 미생물 유래 엑소좀 및/또는 엑소좀 유사 소포체를 포함하는 것일 수 있다.
상기 “미생물”은 분리 균주 또는 시판 중인 다양한 균주를 제한 없이 사용 가능한 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 미생물은 비피도박테리움(Bifidobacterium spp.), 락토바실러스(Latobacillus spp.), 스트렙토코커스(Streptocuccus spp.), 엔테로코커스(Enterococcus spp.), 류코노스톡(Leuconostoc spp.) 및 락토코커스(Lactococcus spp.)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 유산균이거나, 사카로마이세스(Saccharomyces spp.) 클루이베로마이세스(Kluyveromyces spp.), 또는 바실러스(Bacillus) 속 균주일 수 있으며, 구체적으로 락토바실러스(Latobacillus spp.) 또는 사카로마이세스(Saccharomyces spp.) 속 균주일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 및 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 예를 들어, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 또는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 사카로마이세스(Saccharomyces spp.) 속 균주는 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces Cerevisiae), 사카로마이세스 칼스버겐시스 (Saccharomyces Carlsbergensis), 및 사카로마이세스 파스토리아누스 (Saccharomyces pastorianus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으며, 예를 들어, 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae)일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 미생물 배양액의 파쇄물은 균체 혼합 배양액의 파쇄물일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 미생물 배양액의 파쇄물은 미생물 배양액을 원심분리하여 배양 상등액을 제거하고 회수한 균체의 파쇄물일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 미생물 배양액의 파쇄물은 미생물 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고 회수한 배양 상등액의 파쇄물일 수 있다.
용어 “배양액”은 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다.
상기 “균체 혼합 배양액”은 균체가 포함된 배양액 그 자체를 의미할 수 있다. 예를 들어, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 또는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae) 균주를 배지 (예를 들면, MRS 배지)에서 10 ℃초과 또는 40 ℃미만 중 어느 온도에서 일정 시간, 예를 들면, 4 내지 50시간 동안 배양하여 수득된 것일 수 있다. 상기 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 또는 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 배양하기 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다.
용어 “배양 상등액”은 배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 의미하거나,　배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제외한 상부의 액체만을 의미할 수 있다.
용어 “파쇄물”은 화학적 또는 물리적 힘으로 파쇄하여 얻은 산물을 의미할 수 있으며, 용어 “균체 파쇄물”은 용어 “세포 파쇄물”과 상호 호환적으로 사용될 수 있다. 세포 외 소포체를 미생물 균체 혼합 배양액, 균체, 또는 배양 상등액의 파쇄물로부터 분리할 경우, 배양 상등액으로부터 분리하는 경우에 비해 엑소좀 유사 소포체의 수율을 증가시킬 수 있으며, 피부 상태 개선에 있어서 기능적 활성이 우수한 엑소좀 유사 소포체를 분리할 수 있는 바, 생물 균체 혼합 배양액, 균체, 또는 배양 상등액의 파쇄물로부터 분리된 엑소좀 유사 소포체를 포함하는 조성물은 피부 상태 개선용 조성물로 사용될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 파쇄는 압력을 가하여 세포를 물리적으로 파쇄하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 파쇄는 세포막을 파쇄하거나, 세포 내부 또는 외부에 존재하는 세포 외 소포체를 파쇄하는 것일 수 있으며, 세포막이 터지면서 내부의 유효 성분을 포집한 뒤 소포체를 형성하거나, 소포체가 터지면서 막이나 내부의 조성을 달리하는 소포체를 재형성하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 파쇄물에는 균주의 대사 과정에서 자연적으로 발생한 세포 외 소포체 이외에 세포막 또는 소포체 파쇄와 같은 물리적인 힘에 의해 인위적으로 발생한 세포 외 소포체를 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 물리적 파쇄는 고압균질기(High pressure homogenizer)를 사용하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 상기 물리적 파쇄는 마이크로플루다이저 (Microfluidizer)를 사용하여 1 내지 10회 파쇄하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 1 내지 8회, 1 내지 6회, 1 내지 5회, 1 내지 4회일 수 있으나, 1 내지 3회가 적절할 수 있다. 세포 파쇄를 수행하지 않을 경우 피부 상태 개선에 있어서 기능적 활성이 향상된 세포 외 소포체를 획득하기 어려울 수 있고, 파쇄 회수가 3회 초과일 경우 세포 외 소포체가 외부 팽압으로 인해 소포체막이 파괴되어 수율이 저하되는 문제가 생길 수 있다.
화학적 파쇄 방법의 경우 대량으로 세포 파쇄를 하기에 적합하지 않고, 막 성분이 화학적으로 변형되거나 화학 성분으로 인한 부작용을 방지하기 위해 화학 성분을 제거하는 단계가 추가되며, 시약 처리 과정에서 오염이 발생할 수 있다. 물리적 파쇄 방법 중 압력을 이용한 방법이 아닌 경우, 예를 들어, 고주파를 이용하는 초음파 분쇄기(sonicator)의 경우 수율이 낮아 대량 생산이 어려우며, 열이 발생하여 세포 외 소포체의 변성을 유발할 수 있다. 막자 사발을 이용한 분쇄법의 경우 균질화가 고르게 되지 않을 수 있으며, 유리구슬과 볼텍싱(vortexing)을 이용하여 파쇄하는 경우 균질화가 되지 않는 문제가 발생할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 압력은 700 내지 2000 bar일 수 있으며, 예를 들어, 700 내지 1900 bar, 700 내지 1800 bar, 700 내지 1700 bar, 700 내지 1600 bar, 700 내지 1500 bar, 700 내지 1400 bar, 700 내지 1300 bar, 700 내지 1200 bar, 700 내지 1100 bar, 700 내지 1000 bar, 800 내지 2000 bar, 800 내지 1900 bar, 800 내지 1800 bar, 800 내지 1700 bar, 800 내지 1600 bar, 800 내지 1500 bar, 800 내지 1400 bar, 800 내지 1300 bar, 800 내지 1200 bar, 800 내지 1100 bar, 800 내지 1000 bar, 900 내지 2000 bar, 900 내지 1900 bar, 900 내지 1800 bar, 900 내지 1700 bar, 900 내지 1600 bar, 900 내지 1500 bar, 900 내지 1400 bar, 900 내지 1300 bar, 900 내지 1200 bar, 900 내지 1100 bar, 900 내지 1000 bar일 수 있다. 구체적으로, 상기 압력은 700 내지 2000 bar일 수 있다. 상기 압력이 2000 bar 초과일 경우 원하는 엑소좀이 파괴될 수 있고, 상기 압력이 700 bar 미만일 경우 세포 파쇄가 원활히 일어나지 않을 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 수득된 파쇄물을 원심분리하여 잔해를 제거하고 회수한 상등액을 여과하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 원심분리는 8,000 내지 100,000 ×g에서 20분 내지 2 시간 동안 수행하는 것일 수 있다. 예를 들어, 8,000 내지 80,000 ×g, 8,000 내지 60,000 ×g, 8,000 내지 40,000 ×g, 8,000 내지 30,000 ×g, 8,000 내지 20,000 ×g, 8,000 내지 10,000 ×g, 9,000 내지 100,000 ×g, 9,000 내지 80,000 ×g, 9,000 내지 60,000 ×g, 9,000 내지 40,000 ×g, 9,000 내지 30,000 ×g, 9,000 내지 20,000 ×g, 9,000 내지 10,000 ×g, 10,000 내지 100,000 ×g, 10,000 내지 80,000 ×g, 10,000 내지 60,000 ×g, 10,000 내지 40,000 ×g, 10,000 내지 30,000 ×g, 10,000 내지 20,000 ×g에서 20분 내지 2 시간, 20분 내지 1시간 30분, 20 분 내지 1시간, 20분 내지 40분, 20분 내지 30분, 30분 내지 2 시간, 30분 내지 1시간 30분, 30 분 내지 1시간, 30분 내지 40분 동안 수행하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다. 상기 중력가속도가 100,000 ×g 초과일 경우 목표하는 크기의 엑소좀과 잔해물이 함께 제거되어 수율이 낮아지는 문제가 생길 수 있다. 상기 중력가속도가 8,000 ×g 미만일 경우 세포 파쇄 잔해물이 상층액에 남아있는 문제가 생길 수 있으며, 고순도의 엑소좀을 정제하기에 효율이 낮아지는 문제가 생길 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (b) 단계는 0.3 내지 1.0 ㎛ 필터로 여과하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 0.3 내지 0.9 ㎛, 0.3 내지 0.8 ㎛, 0.3 내지 0.7 ㎛, 0.3 내지 0.6 ㎛, 0.3 내지 0.5 ㎛, 0.4 내지 1.0 ㎛, 0.4 내지 0.9 ㎛, 0.4 내지 0.8 ㎛, 0.4내지 0.7 ㎛, 0.4 내지 0.6 ㎛, 0.4 내지 0.5 ㎛일 수 있다. 상기 필터의 크기가 1.0 ㎛ 초과일 경우 엑소좀 이외의 세포 파쇄 잔해 물질들이 유입되어 엑소좀을 고순도로 얻을 수 없는 문제가 생길 수 있고, 상기 필터의 크기가 0.3 ㎛ 미만일 경우 수율이 떨어지는 문제가 생길 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 (c) 단계는 20 kDa 내지 500kDa의 MWCO(molecular weight cutoff) 필터를 사용하는 것일 수 있다. 예를 들어, 20 kDa, 100 kDa, 200 kDa, 300 kDa, 400 kDa, 500 kDa의 MWCO(molecular weight cutoff) 필터를 사용하여 100kDa 이상, 200kDa 이상, 300kDa 이상, 400kDa 이상, 500kDa 이상의 시료를 수득하여 농축하는 것일 수 있다. 상기 MWCO 필터의 크기가 500kDa 초과일 경우 엑소좀 이외의 물질들이 유입되어 엑소좀을 고순도로 얻을 수 없는 문제가 생길 수 있고, 상기 MWCO 필터의 크기가 20 kDa 미만일 경우 목표하는 크기의 엑소좀의 유입이 차단되는 문제가 생길 수 있다. 상기 (c) 단계에서 세포 파쇄물은 membrane 필터를 통해 pore 사이즈보다 큰 물질은 필터에 걸려 농축되고, 작아서 통과한 물질은 확산 작용에 의해 제거되는 것일 수 있다. 구체적으로, 100 kDa의 MWCO(molecular weight cutoff) 필터를 사용할 경우, 세포 소기관들은 제거되고 100 kDa 이상의 엑소좀 및/또는 엑소좀 유사 소포체를 포함하는 세포 외 소포체는 필터에 걸리면서 고농축 되는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 방법은 상기 (c) 단계 이후에 상기 한외여과된 파쇄물을 0.01 내지 0.3 ㎛ 필터, 예를 들어, 0.01 내지 0.25 ㎛, 0.01 내지 0.2 ㎛, 0.1 내지 0.3 ㎛, 0.1 내지 0.25 ㎛, 0.1 내지 0.2 ㎛, 0.2 내지 0.3 ㎛, 0.2 내지 0.25 ㎛의 필터로 제균 여과하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 필터의 크기가 0.3 ㎛ 초과일 경우 제균 여과가 되지 않는 문제가 생길 수 있고, 상기 필터의 크기가 0.01 ㎛ 미만일 경우 효율이 떨어지는 문제가 생길 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 방법은 20 nm 내지 400 nm의 직경을 갖는 세포 외 소포체를 제조하는 것일 수 있다. 예를 들어, 20 nm 내지 350 nm, 20 nm 내지 300 nm, 20 nm 내지 250 nm, 20 nm 내지 200 nm, 50 nm 내지 400 nm, 50 nm 내지 350 nm, 50 nm 내지 300 nm, 50 nm 내지 250 nm, 50 nm 내지 200 nm, 100 nm 내지 400 nm, 100 nm 내지 350 nm, 100 nm 내지 300 nm, 100 nm 내지 250 nm, 100 nm 내지 200 nm, 100 nm 내지 150 nm, 150 nm 내지 400 nm, 150 nm 내지 350 nm, 150 nm 내지 300 nm, 150 nm 내지 250 nm, 150 nm 내지 200 nm, 200 nm 내지 400 nm, 200 nm 내지 350 nm, 200 nm 내지 300 nm, 200 nm 내지 250 nm, 250 nm 내지 400 nm, 250 nm 내지 350 nm, 250 nm 내지 300 nm, 300 nm 내지 400 nm, 또는 300 nm 내지 350 nm일 수 있으며, 구체적으로, 20 nm 내지 200 nm일 수 있다.
일 양상은 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물을 제공한다. 상기 화장료 조성물에 있어서, 미생물, 세포 외 소포체에 대해서는 상술한 바와 같다.
일 구체예에 있어서, 상기 미생물은 비피도박테리움(Bifidobacterium spp.), 락토바실러스(Latobacillus spp.), 스트렙토코커스(Streptocuccus spp.), 엔테로코커스(Enterococcus spp.), 류코노스톡(Leuconostoc spp.), 락토코커스(Lactococcus spp.), 사카로마이세스(Saccharomyces spp.), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces spp.) 및 바실러스(Bacillus spp.) 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 및 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 사카로마이세스(Saccharomyces spp.) 속 균주는 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces Cerevisiae), 사카로마이세스 칼스버겐시스 (Saccharomyces Carlsbergensis), 및 사카로마이세스 파스토리아누스 (Saccharomyces pastorianus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 미생물 배양액의 파쇄물로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 미생물 배양액의 파쇄물은 균체 혼합 배양액, 균체, 또는 배양 상등액의 파쇄물일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 20 kDa 내지 500kDa의 MWCO(molecular weight cutoff) 필터로 한외여과(ultrafiltration)하여 분리된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 세포 외 소포체는 미생물 균체 혼합 배양액, 균체, 또는 배양 상등액의 파쇄물로부터 한외여과법에 의해 분리되는 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 세포 외 소포체는 전술한 제조 방법에 의해 제조된 세포외 소포체일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 피부 상태 개선은 항염증, 피부 미백, 피부 보습, 피부 장벽 강화, 피부 재생, 상처 개선, 및 항노화로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 용어 "항염증"은 "염증 억제 또는 개선"과 혼용될 수 있으며, 면역 반응이 완화되어 NO 생성이 억제되는 모든 작용을 의미할 수 있다. 용어 "피부 미백"이란 멜라닌의 합성을 저해하여 피부 침착을 억제하거나 방지하는 모든 작용을 의미할 수 있다. 용어 “피부 보습”은 피부 수분을 유지하거나 수분 손실을 방지하는 모든 작용을 의미할 수 있다. 용어, "피부 장벽 강화"란 피부 가장 바깥쪽에 위치하여 수분과 영양 손실을 막아주는 피부 장벽의 기능이 증진되는 모든 작용을 의미할 수 있다. 용어, "피부 재생"이란 피부의 일부분이 소실되었을 경우 그 부분을 보충하거나 피부 세포의 증식을 증진시키는 모든 작용을 의미할 수 있다. 용어 “상처 개선”은 피부의 재생을 촉진시켜 상처의 정도를 낮추어주거나 완화시키는 용도를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 상처 개선은 피부 재생을 촉진 시켜 이미 발생한 상처의 정도를 낮추거나 완화시키는 것일 수 있다. 용어 "상처"는 창상, 화상, 찰과상, 자외선(UV)에 의한 광손상 및 흉터로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 용어 “항노화”는 피부 노화를 방지하거나 억제하는 모든 작용을 의미할 수 있다. 피부 노화는 시간의 흐름에 따른 내인성 노화 및 외부 환경에 의한 외인성 노화를 포함한다. 상기 피부 노화는 피부 주름, 잡티, 기미 등을 포함할 수 있다. 상기 피부 주름은 피부가 쇠하여 생긴 잔주름일 수 있다. 상기 피부 주름은 광노화, 연령, 얼굴 표정, 수분 부족, 또는 이들의 조합에 의한 것일 수 있다. 상기 광노화는 자외선(UVA, UVB, 및 UVC 포함) 노출에 의한 피부 노화일 수 있다. 용어 “피부 주름 개선”은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화시키는 것일 수 있다.
용어 "개선"이란 상태의 완화 도는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 NO 생성을 억제하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 멜라닌 생성을 억제하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 피브로넥틴 (Fibronectin)의 발현을 증진시키는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 필라그린 (filaggrin)의 발현을 증진시키는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 피부 섬유아세포 (fibroblast cell)를 증식시키는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 20 nm 내지 400 nm의 직경을 갖는 것일 수 있다. 예를 들어, 20 nm 내지 350 nm, 20 nm 내지 300 nm, 20 nm 내지 250 nm, 20 nm 내지 200 nm, 50 nm 내지 400 nm, 50 nm 내지 350 nm, 50 nm 내지 300 nm, 50 nm 내지 250 nm, 50 nm 내지 200 nm, 100 nm 내지 400 nm, 100 nm 내지 350 nm, 100 nm 내지 300 nm, 100 nm 내지 250 nm, 100 nm 내지 200 nm, 100 nm 내지 150 nm, 150 nm 내지 400 nm, 150 nm 내지 350 nm, 150 nm 내지 300 nm, 150 nm 내지 250 nm, 150 nm 내지 200 nm, 200 nm 내지 400 nm, 200 nm 내지 350 nm, 200 nm 내지 300 nm, 200 nm 내지 250 nm, 250 nm 내지 400 nm, 250 nm 내지 350 nm, 250 nm 내지 300 nm, 300 nm 내지 400 nm, 또는 300 nm 내지 350 nm일 수 있으며, 구체적으로, 20 nm 내지 200 nm일 수 있다.
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.000000001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.0001 중량% 내지 60 중량%, 0.0001 중량% 내지 40 중량%, 0.0001 중량% 내지 30 중량%, 0.0001 중량% 내지 20 중량%, 0.0001 중량% 내지 10 중량%, 0.0001 중량% 내지 5 중량%, 0.001 중량% 내지 80 중량%, 0.001 중량% 내지 60 중량%, 0.001 중량% 내지 40 중량%, 0.001 중량% 내지 30 중량%, 0.001 중량% 내지 20 중량%, 0.001 중량% 내지 10 중량%, 0.001 중량% 내지 5 중량%, 0.01 중량% 내지 80 중량%, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 80 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 0.1 중량% 내지 5 중량%의 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 세포 외 소포체가 106 개/ml 내지 1012 개/ml, 예를 들어, 106 개/ml 내지 1011 개/ml, 106 개/ml 내지 1010 개/ml, 106 개/ml 내지 109 개/ml, 106 개/ml 내지 108 개/ml, 106 개/ml 내지 107 개/ml, 107 개/ml 내지 1012 개/ml, 107 개/ml 내지 1011 개/ml, 107 개/ml 내지 1010 개/ml, 107 개/ml 내지 109 개/ml, 107 개/ml 내지 108 개/ml, 108 개/ml 내지 1012 개/ml, 108 개/ml 내지 1011 개/ml, 108 개/ml 내지 1010 개/ml, 108 개/ml 내지 109 개/ml, 109 개/ml 내지 1012 개/ml, 109 개/ml 내지 1011 개/ml, 109 개/ml 내지 1010 개/ml, 1010 개/ml 내지 1012 개/ml, 1010 개/ml 내지 1011 개/ml, 1011 개/ml 내지 1012 개/ml의 농도로 포함된 것일 수 있다. 세포 외 소포체가 조성물 내에 106 개/ml 미만으로 포함될 경우 유의한 피부 상태 개선 효과가 나타나지 않을 수 있고, 1012 개/ml 초과로 포함될 경우 제형 안정성이 저하될 수 있다.
용어 "유효성분으로 포함"은 상기에서 언급한 효과를 나타낼 수 있는 정도로 본 명세서의 세포 외 소포체가 첨가되는 것을 의미하고, 전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 포뮬레이션 (formulation)되는 것을 포함하는 의미일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 로션, 에센스, 팩, 젤, 앰플 또는 피부 점착 타입의 화장료 제형을 갖는 것일 수 있다.
상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 조성물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.
다른 양상은 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 상처 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다. 상기 피부 외용제 조성물에 있어서, 미생물, 세포외 소포체, 항염증, 상처 개선, 조성물에 대해서는 상술한 바와 같다.
상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.
또 다른 양상은 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 상처 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 상기 건강기능식품 조성물에 있어서, 미생물, 세포외 소포체, 항염증, 상처 개선, 조성물에 대해서는 상술한 바와 같다.
상기 건강기능식품 조성물은 상기 미생물 유래 세포외 소포체 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 건강기능식품의 종류 중 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 건강식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다.
또 다른 양상은 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 또는 상처 개선용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 미생물, 세포 외 소포체, 상처 개선, 조성물에 대해서는 상술한 바와 같다.
용어 "예방"은 상기 조성물을 약학적 유효량으로 투여하여 질환을 사전에 방지하거나 발생 가능성 또는 발생 빈도를 낮추는 것을 포괄적으로 의미할 수 있다. 예를 들어, 피부 염증 질환 등의 염증 질환이 발생할 가능성이 있는 환자 또는 발병한 적이 있는 환자에게서 발병 확률을 낮추거나, 재발 확률을 낮추는 것일 수 있다. 상기 "약학적 유효량"은 질환의 종류, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 경로, 투여 방법, 투여 횟수, 치료 기간, 배합, 또는 동시 사용되는 약물 등 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
용어 "치료"는 상기 조성물을 약학적 유효량으로 투여하여 질환을 개선시키는 것을 포괄적으로 의미할 수 있고, 자연 치유에 비하여 단축된 시간에 질환의 증상이 완화 또는 치유되는 것을 제공하는 것일 수 있으며, 질환으로 인한 한가지 증상 또는 대부분의 증상을 개선시키는 것일 수 있다. 상기 약학적 유효량에 대해서는 상술한 바와 같다.
상기 "염증성 질환"은 염증성 피부질환, 알레르기성 염증질환, 염증성 안구질환, 염증성 골관절질환, 염증성 근육질환 또는 염증성 장질환일 수 있으며, 상기 "염증성 피부 질환"은 아토피 피부염, 건선, 접촉성 피부염, 습진성 피부염, 광선피부염, 지루피부염, 포진성피부염, 편평태선, 경화태선, 괴저성 농피증, 천포창, 수포성 표피박리증, 알러지, 및 과민증으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
또 다른 양상은 피부 상태를 개선하기 위한 화장료 조성물의 제조를 위한, 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)의 용도를 제공한다. 상기 용도에 있어서, 피부 상태, 개선, 화장료 조성물, 미생물, 미생물 유래 세포 외 소포체에 대해서는 전술한 바와 같다.
또 다른 양상은 항염증 또는 상처 개선을 위한 피부외용제 조성물의 제조를 위한, 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)의 용도를 제공한다. 상기 용도에 있어서, 항염증, 상처 개선, 피부외용제 조성물, 미생물, 미생물 유래 세포 외 소포체에 대해서는 전술한 바와 같다.
또 다른 양상은 항염증 또는 상처 개선을 위한 건강기능식품 조성물의 제조를 위한, 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)의 용도를 제공한다. 상기 용도에 있어서, 항염증, 상처 개선, 건강기능식품 조성물, 미생물, 미생물 유래 세포 외 소포체에 대해서는 전술한 바와 같다.
다른 양상은 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상태를 개선, 예방, 또는 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법에 있어서, 미생물, 미생물 유래 세포외 소포체, 개선, 예방, 치료에 대해서는 전술한 바와 같다. 상기 개체의 상태는 피부 상태, 또는 염증과 관련된 상태, 예를 들어, 염증성 질환일 수 있으며, 상기 피부 상태 또는 상기 염증성 질환에 대해서는 전술한 바와 같다.
용어 "투여하는", "도입하는", 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다.
투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 피부 상태 개선, 예를 들어, 피부 염증 억제, 피부 미백, 피부 보습, 피부 장벽 강화, 피부 재생, 상처 개선, 및 피부 노화 억제 효과를 필요로 하는 개체일 수 있으며, 또는 염증성 질환의 개선, 예방, 또는 치료 효과를 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 투여는 일 구체예에 따른 조성물을 개체당 일당 0.1 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg을 투여하는 것일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료 시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.
일 양상에 따른 미생물 유래 세포 외 소포체 제조 방법은 기능적 활성이 우수한 세포 외 소포체를 대량으로 수득할 수 있어, 피부 상태 개선용 조성물의 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 미생물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법을 개략적으로 나타낸 순서도이다.
도 2는 일 실시예에 따른 유산균 균체 혼합 배양액 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법을 예시적으로 나타낸 순서도이다.
도 3은 일 실시예에 따른 유산균 균체 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법을 예시적으로 나타낸 순서도이다.
도 4는 일 실시예에 따른 유산균 배양 상등액 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법을 예시적으로 나타낸 순서도이다.
도 5a 및 도 5b는 각각 complex 샘플 및 lysate sample의 세포 파쇄 및 잔해 제거 과정의 반복에 따른 탁도 변화를 관찰한 사진이다.
도 6a 내지 도 6e는 각각 실시예 1 내지 4 및 비교예 1의 방법으로 분리된 세포 외 소포체의 크기에 따른 입자 수를 nano-sight로 측정한 그래프이다.
도 7은 실시예 1 내지 3 및 비교예 1로부터 분리된 세포 외 소포체 단백질의 패턴을 SDS-PAGE를 이용하여 확인한 결과이다.
도 8은 실시예 1 내지 3의 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체와 비교예 1로부터 분리된 세포 외 소포체를 Raw264.7 대식세포에 처리한 후 항염 효과를 비교 분석한 결과이다.
도 9a 및 도 9b는 각각 실시예 3 및 비교예 1 로부터 분리된 세포 외 소포체를 HaCaT cell에 처리한 후 피브로넥틴과 필라그린 유전자 발현능을 비교 분석한 결과이다.
도 10a 및 10b는 각각 실시예 2와 4의 균체 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체의 HDF 증식능을 확인한 결과이다.
도 11은 실시예 2와 4의 균체 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체를 HDF cell에 처리한 후 collagen type Ⅰ α 1 유전자 발현능을 비교 분석한 결과이다.
도 12a 및 도 12b는 각각 실시예 2의 균체 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체를 HS68 cell에 처리한 후 피브릴린과 엘라스틴 유전자 발현능을 비교 분석한 결과이다.
도 13은 실시예 2의 균체 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체를 B16F10 cell에 처리한 후 멜라닌 생성량을 비교 분석한 결과 이다.
도 14는 실시예 2에서 분리된 유산균 균체 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 수분유지력을 평가한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
다양한 미생물로부터 엑소좀 유사 소포체를 포함하는 세포 외 소포체를 하기 실시예의 방법(이를 'HPEV'공정이라 명명)에 따라 분리하여 미생물 유래 세포 외 소포체를 제조하고, 이를 수율 평가, 기능적 활성 평가 등에 사용하였다.
실시예 1. 유산균 균체 혼합 배양액 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 분리 (S1)
락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 균체 혼합 배양액으로부터 엑소좀 유사 소포체를 포함하는 세포 외 소포체를 분리하였다. 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus, KCCM 32405)는 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁되어 있는 균주를 분양 받아 이용하였다.
구체적으로, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)를 MRS 배지에서 37 ℃, 24 시간 배양 후 얻어진 균체 혼합 배양액 (이하, complex sample로 명명)을 수득하였다. 상기 수득된 complex sample을 고압균질기(Microfludizer, MN600P-300, Picomax, Seoul, Republc of Korea)를 이용하여 1000 bar의 압력으로 세포 파쇄를 수행하였다. 수득된 세포 파쇄물을 4 ℃에서 10,000 ×g으로 30분 동안 원심분리를 수행하여 세포 관련 잔해를 제거하고 상등액을 수득하였다. 상기 세포 파쇄 및 잔해 제거 과정을 3회 반복하였다. 도 5a는 세포 파쇄 및 잔해 제거 과정의 반복에 따른 complex 샘플의 탁도 변화를 관찰한 사진이다. 그 결과, 도 5a에 나타난 바와 같이, 세포 파쇄에 의한 잔해가 대부분 제거되었음을 확인하였다. 수득된 상등액은 0.45 ㎛ 멸균 필터로 여과하여 잔존 세포 잔해를 추가적으로 제거하였다. 용출된 시료를 MWCO(molecular weight cutoff) 100 kDa의 필터로 한외여과(ultrafiltration, Pellicon® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany)하여 100 kDa 이상의 세포 외 소포체를 분리하고, 배지성분을 제거하기 위하여 3차 증류수 혹은 등장액 (saccharide 또는 PBS 등)으로 2회 워싱하였다. 수득된 용액은 0.2 ㎛ 멸균 필터로 제균 여과하고, 동결건조 후 -20 ℃에서 저장하여 하기 시험에 이용하였다.
실시예 2. 유산균 균체 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 분리 (S2)
Lysate sample을 사용한 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 세포 외 소포체를 분리하였다.
구체적으로, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)를 MRS 배지에서 37 ℃, 24 시간 배양 후 얻어진 균체 혼합 배양액을 4 ℃에서 10,000×g으로 30분 동안 원심분리하여 배양 상등액 제거하고 균체를 회수하였다. 회수된 균체를 3차 증류수 혹은 등장액(예를 들면, saccharide 또는 PBS 등) 500 mL에 현탁하여 균체 샘플(이하, lysate sample로 명명)을 준비하였다. 상기 수득된 lysate 샘플을 고압균질기(Microfludizer, MN600P-300, Picomax, Seoul, Republc of Korea)를 이용하여 1000 bar의 압력으로 세포 파쇄를 수행하였다. 수득된 세포 파쇄물을 4 ℃에서 10,000×g으로 30분 동안 원심분리를 수행하여 세포 관련 잔해를 제거하고 상등액을 수득하였다. 상기 세포 파쇄 및 잔해 제거 과정을 3회 반복하였다. 도 5b는 세포 파쇄 및 잔해 제거 과정의 반복에 따른 lysate 샘플의 탁도 변화를 관찰한 사진이다. 그 결과, 도 5b에 나타난 바와 같이, 세포 파쇄에 의한 잔해가 대부분 제거되었음을 확인하였다. 수득된 상등액은 0.45 ㎛ 멸균 필터로 여과하여 잔존 세포 잔해를 추가적으로 제거하였다. 용출된 시료를 MWCO(molecular weight cutoff) 100kDa의 필터로 한외여과(ultrafiltration, Pellicon® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany)하여 100 kDa 이상의 세포 외 소포체를 분리하였다. 수득된 용액은 0.2 ㎛ 멸균 필터로 제균 여과하고, 동결건조 후 -20 ℃에서 저장하여 하기 시험에 이용하였다.
실시예 3. 유산균 배양 상등액 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 분리 (S3)
Filtration sample을 사용한 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 세포 외 소포체를 분리하였다.
구체적으로, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)를 MRS 배지에서 37 ℃, 24시간 배양 후 얻어진 균체 혼합 배양액을 4 ℃에서 10,000 ×g으로 30분 동안 원심분리를 2회 반복하여 균체를 제거하고 배양 상등액(이하, filtration sample로 명명)을 회수하였다. 상기 수득된 filtration sample을 고압균질기(Microfludizer, MN600P-300, Picomax, Seoul, Republc of Korea)를 이용하여 1000 bar의 압력으로 파쇄를 수행하여 배양액으로 분비된 세포 외 소포체의 재구성을 유도한 후 0.45 ㎛ 멸균 필터로 여과하였다. 용출된 시료를 MWCO(molecular weight cutoff) 100kDa의 필터로 한외여과(ultrafiltration, Pellicon® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany)하여 100 kDa 이상의 세포 외 소포체를 분리하고, 배지성분을 제거하기 위하여 3차 증류수 혹은 등장액 (saccharide 또는 PBS 등)으로 2회 워싱하였다. 수득된 용액은 0.2 ㎛ 멸균 필터로 제균 여과하고, 동결건조 후 -20 ℃에서 저장하여 하기 시험에 이용하였다.
실시예 4. 효모 균체 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 분리 (S4)
상기 실시예 2에서 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 대신에 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces Cerevisiae)를 사용한 점을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 세포 외 소포체를 분리하였다.
비교예 1. 유산균 배양 상등액 유래 세포 외 소포체의 분리(R1)
락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)를 MRS 배지에서 37 ℃, 24시간 배양 후 얻어진 균체 혼합 배양액을 4 ℃에서 10,000 ×g으로 30분 동안 원심분리를 2회 반복하여 균체를 제거하고 수득된 배양 상등액(이하, ultra-filtration sample로 명명)을 0.45 ㎛ 멸균 필터로 여과하였다. 용출된 시료를 MWCO(molecular weight cutoff) 100 kDa의 필터로 한외여과(ultrafiltration, Pellicon® 2 and 3 Mini Holder, Merck, Darmstadt, Germany)하여 100kDa 이상의 세포 외 소포체를 분리하였고, 배지성분을 제거하기 위하여 3차 증류수 혹은 등장액 (saccharide 또는 PBS 등)으로 2회 워싱하였다. 수득된 용액은 0.2 ㎛ 멸균 필터로 제균 여과하고, 동결건조 후 -20 ℃에서 저장하여 하기 시험에 이용하였다.
실험예 1. 세포 외 소포체의 크기 및 농도 측정
분리 방법에 따른 세포 외 소포체의 특성과 수율을 비교 분석하기 위하여, nano-sight NS300(Malvern Panalytical, Almelo, Nederland)를 이용해 나노 입자 추적 분석을 수행하여 세포 외 소포체의 크기와 농도를 측정하였다.
구체적으로, 실시예 1 내지 4 및 비교예 1에서 분리된 세포 외 소포체 샘플을 PBS 혹은 3차 증류수로 입자 수가 1~4x108이 되도록 희석하였고, 측정 중 frame 수는 20~30이 되도록 하였다. 샘플을 1mL 준비하고, 기기 챔버에 loading 하였다. Particle에 초점을 맞추고, camera level을 조절한 후 측정을 시작하였다. Capture duration을 30~60초 사이로 하고 3번 반복 측정을 시행하였다. 측정이 끝나면 detection threshold를 조절하고, 3번 측정한 값을 분석하였다. 이때 3번 반복한 결과의 패턴이 비슷한 양상을 보이는 것이 적당한 것으로 간주하였다. 도 6a 내지 도 6e는 각각 실시예 1 내지 4 및 비교예 1의 방법으로 분리된 세포 외 소포체의 크기에 따른 입자 수를 nano-sight로 측정한 그래프이다.
하기 [표 1]은 상기 실시예 1 내지 4와 비교예 1의 방법으로 분리된 세포 외 소포체의 배양액 기준 L당 총 입자수를 비교한 결과이다.
(단위: particles/L) 실시예 1
(S1)		 실시예 2
(S2)		 실시예 3
(S3)		 실시예 4
(S4)		 비교예 1
(R1)
입자 수 (particles/L) 5.17E+11 7.00E+11 3.26E+10 1.58E+11 8.20E+09
그 결과, 도 6a 내지 도 6e에 나타난 바와 같이, 실시예 1 내지 4 및 비교예 1의 대부분의 소포체 직경이 20 내지 200 nm인 것을 확인하였다. 또한, 표 1을 보면 세포 파쇄를 수행하지 않는 비교예 1에 비해 세포 파쇄를 수행하는 실시예 1~3에서 입자 수가 약 4~85배 증가되었는 바, 세포 파쇄에 의해 수득률이 향상되었음을 확인하였다.
실험예 2. 유산균 유래 세포 외 소포체의 단백질 패턴 비교
유산균 및 유산균 유래 세포외 소포체에 포함된 단백질의 발현 양상을 비교하기 위해, 균 배양 후 원심분리하여 얻은 cell pellet과 실시예 1 내지 3, 비교예 1로부터 분리된 세포 외 소포체 단백질 패턴을 SDS-PAGE를 이용하여 비교하였다.
구체적으로, 균 배양 후 원심분리하여 얻은 cell pellet을 PBS에 현탁시켰다. 그리고 실시예 1 내지 3 및 비교예 1에서 얻은 세포 외 소포체의 동결건조물을 일정한 농도로 3차증류수 혹은 PBS에 녹였다. 그 후 sample buffer와 섞은 후 95℃에서 10분간 끓여주었다. 이 후 10% SDS-PAGE gel에 loading하여 전기영동을 실시하였다. 전기영동을 끝난 gel을 Coomassie blue staining solution을 이용해 30분간 염색시켰다. 염색 후 destaining solution을 이용해 탈염색하고 결과를 확인하였다. 도 7은 실시예 1 내지 3 및 비교예 1로부터 분리된 세포 외 소포체 단백질의 패턴을 SDS-PAGE를 이용하여 확인한 결과이다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 cell pellet과 실시예 1 내지 3, 비교예 1의 유산균 유래 세포외 소포체는 단백질 구성에서 서로 다른 양상을 보임을 확인하였다.
실험예 3. 유산균 유래 세포 외 소포체의 항염 효과
상기 실시예 1 내지 3에서 분리된 세포 외 소포체의 항염 효과를 확인하기 위하여, Raw264.7 대식세포에 실시예 1 내지 3 및 비교예 1에서 분리된 세포 외 소포체를 처리한 뒤 NO 생성양을 평가하였다.
구체적으로, Raw264.7 대식세포를 10% FBS를 포함하는 DMEM 배지에 배양하고 96 웰 플레이트에 각각 80%의 밀도를 갖도록 분주하였다. 24시간 배양 후 염증유발물질인 LPS 1ug/mL과 실시예 1 내지 3, 비교예 1의 샘플들을 0.0025 및 0.01 %(v/v)의 농도별로 처리하여 24시간 추가 배양하였다. 대조군은 PBS를 처리하였고, 음성 대조군은 LPS 1ug/mL만 처리하였으며, 양성 대조군은 LPS 1ug/mL 처리 후 ascorbic acid를 처리한 것을 사용하였다. 배양 상층액과 NO와 발색반응을 일으키는 Griess reagent를 1:1 비율로 섞고 10분간 차광한 상태로 shake incubation하였다. 그 이후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. NO의 standard curve를 측정하여 NO 생성양을 확인하고, LPS만 처리한 음성 대조군 대비 억제율을 계산하였다. 도 8은 실시예 1 내지 3의 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체와 비교예 1로부터 분리된 세포 외 소포체를 Raw264.7 대식세포에 처리한 후 항염 효과를 비교 분석한 결과이다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 세포 파쇄를 수행하는 실시예 1 내지 3에서 분리된 세포 외 소포체는 NO 생성을 농도 의존적으로 유의하게 감소시켰으며, 비교예 1에서 분리된 세포 외 소포체보다 NO 생성 억제 효과가 현저하게 향상됨을 확인하였다. 이는 파쇄를 수행하는 본 발명의 제조 방법에 따라 항염 활성이 현저하게 향상된 세포 외 소포체가 분리되었음을 의미한다.
실험예 4. 유산균 유래 세포외 소포체의 피부 장벽 강화 효과 확인
상기 실시예 3에서 분리된 유산균 유래 세포 외 소포체의 피부 장벽 기능 개선 효과를 확인하기 위하여, 피부각질세포(HaCat)에 실시예 3과 비교예 1에서 분리된 세포 외 소포체를 처리한 뒤 피브로넥틴 (fibronectin; FN1)과 필라그린 (filaggrin; FLG)의 유전자 발현능을 평가하였다.
구체적으로, HaCaT 세포의 밀집도가 약 80%가 되도록 배양한 후 실시예 3과 비교예 1의 샘플들을 0.00001 %(v/v)의 농도로 처리하였다. 처리 후 48시간을 배양한 후 상등액을 제거한 후 kit (TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit, Takara, Shiga, Japan)의 실험 방법에 따라 mRNA를 추출한 후 reverse transcriptase를 이용해 cDNA로 합성하고, 합성된 cDNA를 SYBR green master mix (LightCycler® 480 SYBR Green I Master, Roche, Basel, Switzerland)와 섞은 후 realtime-PCR을 수행하며 실시간으로 유전자 발현을 확인하였다. 도 9a 및 도 9b는 각각 실시예 3 및 비교예 1 로부터 분리된 세포 외 소포체를 HaCaT cell에 처리한 후 피브로넥틴과 필라그린 유전자 발현능을 비교 분석한 결과이다.
그 결과, 도 9a와 9b에 나타난 바와 같이, 실시예 3에서 분리된 세포 외 소포체 처리군은 fibronectin과 filaggrin의 발현을 유의하게 증가시켰으며, 특히 비교예 1에서 분리된 세포 외 소포체 처리군에서보다 fibronectin과 filaggrin의 발현이 현저하게 향상됨을 확인하였다. 이는 같은 배양액으로부터 유래한 세포 외 소포체라도 본 공정에 의해 효능이 증가된 것으로 판단되며, 파쇄를 수행하는 본 발명의 제조 방법에 따라 피부 장벽 강화 활성이 현저하게 향상된 세포 외 소포체가 분리되었음을 의미한다.
실험예 5. 유산균 및 효모 유래 세포 외 소포체의 세포 독성 검사 및 피부 재생 효과 확인
상기 실시예 2와 4의 균체 파쇄물로부터 분리된 유산균 및 효모 유래의 세포외 소포체를 인체피부섬유아세포(HDF)에 처리하여 세포 증식에 미치는 영향을 확인하였다.
구체적으로, 인체피부섬유아세포 HDF을 CO2 배양기에서 배양하고, 상기 실시예 2와 실시예 4의 샘플들을 0.00001~0.001% (v/v)의 농도별로 처리한 후 24시간 동안 serum-free 조건에서 배양하였다. 대조군은 무처리군을 사용하였고, 양성 대조군으로는 serum을 포함하는 배지에서 배양한 것을 사용하였다. 배양 종료 후, 상등액을 제거하고 1 mg/mL의 MTT 시약을 처리하고 4시간동안 추가 배양하였다. 상등액을 제거하고 DMSO를 처리해 준 후 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 세포 증식 및 세포 독성을 대조군과 비교하여 산정하였다. 도 10a 및 10b는 각각 실시예 2와 4의 균체 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체의 HDF 증식능을 확인한 결과이다.
그 결과, 도 10a와 10b에 나타난 바와 같이, 실시예 2와 4의 균체 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체는 피부섬유아세포 증식 효과가 있으며, 시험물질의 농도가 증가함에도 세포 증식율이 유의하게 감소하지 않았는 바, 세포 독성이 없어 안전함을 확인하였다. 이는 파쇄를 수행하는 본 발명의 제조 방법에 따라 우수한 상처 치유 및 피부 재생능을 가지면서, 세포 독성이 없어 안전한 세포외 소포체가 분리되었음을 의미한다.
실험예 6. 유산균 및 효모 유래 세포 외 소포체의 항노화 효과 확인
(1) 콜라겐 유전자 발현능 평가
상기 실시예 2와 실시예 4의 균체 파쇄물로부터 분리된 유산균 및 효모 유래 세포 외 소포체의 항노화 효과를 확인하기 위하여, 인체피부섬유아세포(HDF)에 실시예 2와 실시예 4의 세포 외 소포체를 처리한 뒤 collagen type Ⅰ α 1의 유전자 발현능을 평가하였다.
구체적으로, HDF 세포의 밀집도가 약 80%가 되도록 배양한 후 실시예 2와 실시예 4의 샘플들을 0.00001 %(v/v)의 농도로 처리하였다. 처리 후 48시간을 배양한 후 상등액을 제거한 후 kit (TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit, Takara, Shiga, Japan) 의 실험 방법에 따라 mRNA를 추출한 후 reverse transcriptase를 이용해 cDNA로 합성하고, 합성된 cDNA를 SYBR green master mix (LightCycler® 480 SYBR Green I Master, Roche, Basel, Switzerland)와 섞은 후 realtime-PCR을 수행하며 실시간으로 유전자 발현을 확인하였다. 도 11은 실시예 2와 4의 균체 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체를 HDF cell에 처리한 후 collagen type Ⅰ α 1 유전자 발현능을 비교 분석한 결과이다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 실시예 2와 4의 균체 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체는 collagen type Ⅰ α 1 발현을 유의하게 증가시킴을 확인하였다. 이는 파쇄를 수행하는 본 발명의 제조 방법에 따라 피부 주름 개선 등의 우수한 항노화 활성을 갖는 세포 외 소포체가 분리되었음을 의미한다.
(2) 피브릴린, 엘라스틴 유전자 발현능 평가
상기 실시예 2에서 분리된 유산균 균체 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 항노화 효과를 확인하기 위하여, 인간 진피 섬유아세포(HS68)에 실시예 2의 세포 외 소포체를 처리한 뒤 피브릴린(Fibrilin), 엘라스틴(Elastin) 유전자 발현능을 평가하였다.
구체적으로, HS68 세포의 밀집도가 약 80%가 되도록 배양한 후 실시예 2의 샘플을 0.000000001 및 0.00000001 %(v/v)의 농도별로 처리하였다. 양성 대조군은 EGCG를 처리한 것을 사용하였다. 처리 후 24시간을 배양한 후 상등액을 제거한 후 trizol을 이용해 mRNA를 추출한 후 reverse transcriptase를 이용해 cDNA로 합성하고, 합성된 cDNA를 프라이머와 dNTP, taq polimerase와 섞은 후 PCR을 수행하며 실시간으로 유전자 발현을 확인하였다. 도 12a 및 도 12b는 각각 실시예 2의 균체 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체를 HS68 cell에 처리한 후 피브릴린과 엘라스틴 유전자 발현능을 비교 분석한 결과이다.
그 결과, 도 12a및 도 12b에 나타난 바와 같이, 실시예 2에서 분리된 세포 외 소포체는 피브릴린과 엘라스틴 발현을 농도 의존적으로 유의하게 증가시킴을 확인하였다. 이는 파쇄를 수행하는 본 발명의 제조 방법에 따라 피부 주름 및 탄력 개선 등의 우수한 항노화 활성을 갖는 세포외 소포체가 분리되었음을 의미한다.
실험예 7. 유산균 유래 세포 외 소포체의 미백 효과 확인
상기 실시예 2에서 분리된 유산균 균체 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 미백 효과를 확인하기 위하여, B16F10 cell에 실시예 2의 세포 외 소포체를 처리한 뒤 멜라닌 생성량을 평가하였다.
구체적으로, B16F10 세포의 밀집도가 약 80%가 되도록 배양한 후 멜라닌 색소의 생성을 촉진하는 물질인 α-MSH 0.5 μM과 실시예 2의 샘플을 0.00005~0.005 %(v/v)의 농도별로 처리하였다. 대조군은 무처리군을 사용하였고, 음성 대조군은 α-MSH 0.5 μM만 처리하였으며, 양성 대조군은 kojic acid를 처리한 것을 사용하였다. 처리 후 48시간을 배양한 후 상등액을 제거한 후 PBS를 이용해 세포를 워싱한 후 trypsin을 이용해 회수한 후 세포를 계수하여 일정한 세포수로 맞추었다. 13000 rpm에서 5분간 원심분리 하여 상층액을 제거하였다. 1N 농도의 NaOH와 10% DMSO 100 uL를 넣고 80 ℃에서 2시간을 두어 세포를 lysis하였다. 이후 405 nm에서 흡광도를 제거하였다. 도 13은 실시예 2의 균체 파쇄물로부터 분리된 세포 외 소포체를 B16F10 cell에 처리한 후 멜라닌 생성량을 비교 분석한 결과이다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 실시예 2에서 분리된 세포 외 소포체는 멜라닌 발현을 농도 의존적으로 유의하게 감소시킴을 확인하였다. 이는 파쇄를 수행하는 본 발명의 제조 방법에 따라 우수한 피부 미백 활성을 갖는 세포 외 소포체가 분리되었음을 의미한다.
실험예 8. 유산균 유래 세포 외 소포체의 보습 효과 확인
상기 실시예 2에서 분리된 유산균 균체 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 수분유지력을 확인하기 위해 단기 임상을 진행하였다.
구체적으로, 시험물질을 적용할 부위의 보습을 수분 측정기(JANUS-Ⅲ, Pie, Seoul, Korea)를 이용해 미리 측정하였다. 대조군인 3차 증류수와 실시예 2의 샘플을 필터페이퍼에 동량으로 적용한 후 피험자 팔에 붙인 후 시료가 스며들 때까지 30분을 기다린 다음, 필터페이퍼를 제거한 후 0분, 5분, 15분, 30분마다 보습력을 수분측정기로 측정하였다. 보습 변화량은 하기 식 1에 의해 평가하였다.
[식 1]
Figure PCTKR2021012219-appb-I000001
도 14는 실시예 2에서 분리된 유산균 균체 파쇄물 유래 세포 외 소포체의 수분유지력을 평가한 결과이다.
그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이, 대조군인 3차 증류수에서보다 실시예 2에서 분리된 세포 외 소포체 처리군에서 수분 유지력이 우수함을 확인하였다. 이는 파쇄를 수행하는 본 발명의 제조 방법에 따라 우수한 피부 보습력을 갖는 세포 외 소포체가 분리되었음을 의미한다.

Claims (34)

  1. (a) 미생물 배양액의 파쇄물을 수득하는 단계;
    (b) 상기 파쇄물을 여과하는 단계; 및
    (c) 상기 여과된 파쇄물을 한외여과하는 단계;를 포함하는 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 제조하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 (a) 단계에서 미생물 배양액의 파쇄물은 균체 혼합 배양액의 파쇄물인 것인 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 (a) 단계에서 미생물 배양액의 파쇄물은 미생물 배양액을 원심분리하여 배양 상등액을 제거하고 회수한 균체의 파쇄물인 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 (a) 단계에서 미생물 배양액의 파쇄물은 미생물 배양액을 원심분리하여 균체를 제거하고 회수한 배양 상등액의 파쇄물인 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 수득된 파쇄물을 원심분리하여 잔해를 제거하고 회수한 상등액을 여과하는 것인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 상기 (c) 단계 이후에 상기 한외여과된 파쇄물을 0.01 내지 0.3 ㎛ 필터로 제균 여과하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 (a) 단계에서 상기 파쇄는 700 내지 2000 bar의 압력을 가하여 세포를 물리적으로 파쇄한 것인 방법.
  8. 청구항 3 내지 청구항 5 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 원심분리는 8,000 내지 100,000 ×g에서 20분 내지 2 시간 동안 수행하는 것인 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 (b) 단계는 0.3 내지 1.0 ㎛ 필터로 여과하는 것인 방법.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 (c) 단계는 20 kDa 내지 500kDa의 MWCO(molecular weight cutoff) 필터를 사용하는 것인 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 20 내지 400 nm의 직경을 갖는 것인 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 미생물은 비피도박테리움(Bifidobacterium spp.), 락토바실러스(Latobacillus spp.), 스트렙토코커스(Streptocuccus spp.), 엔테로코커스(Enterococcus spp.), 류코노스톡(Leuconostoc spp.) 락토코커스(Lactococcus spp.), 사카로마이세스(Saccharomyces spp.), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces spp.) 및 바실러스(Bacillus spp.) 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 및 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인 방법.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 사카로마이세스(Saccharomyces spp.) 속 균주는 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces Cerevisiae), 사카로마이세스 칼스버겐시스 (Saccharomyces Carlsbergensis), 및 사카로마이세스 파스토리아누스 (Saccharomyces pastorianus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인 방법.
  15. 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 피부 상태 개선은 항염증, 피부 미백, 피부 보습, 피부 장벽 강화, 피부 재생, 및 상처 개선으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것인 화장료 조성물.
  17. 청구항 15에 있어서, 상기 미생물은 비피도박테리움(Bifidobacterium spp.), 락토바실러스(Latobacillus spp.), 스트렙토코커스(Streptocuccus spp.), 엔테로코커스(Enterococcus spp.), 류코노스톡(Leuconostoc spp.), 락토코커스(Lactococcus spp.), 사카로마이세스(Saccharomyces spp.), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces spp.) 및 바실러스(Bacillus spp.) 속 균주로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인 화장료 조성물.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei), 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 및 락토바실러스 파라카제이 (Lactobacillus paracasei)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인 화장료 조성물.
  19. 청구항 17에 있어서, 상기 사카로마이세스(Saccharomyces spp.) 속 균주는 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces Cerevisiae), 사카로마이세스 칼스버겐시스 (Saccharomyces Carlsbergensis), 및 사카로마이세스 파스토리아누스 (Saccharomyces pastorianus)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것인 화장료 조성물.
  20. 청구항 15에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 미생물 배양액의 파쇄물로부터 분리된 것인 화장료 조성물.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 미생물 배양액의 파쇄물은 균체 혼합 배양액, 균체, 또는 배양 상등액의 파쇄물인 것인 화장료 조성물.
  22. 청구항 15에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 청구항 1 내지 14 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 것인 화장료 조성물.
  23. 청구항 15에 있어서, 상기 세포 외 소포체는 20 내지 400 nm의 직경을 갖는 것인 화장료 조성물.
  24. 청구항 15에 있어서, 상기 조성물은 NO 생성을 억제하는 것인 화장료 조성물.
  25. 청구항 15에 있어서, 상기 조성물은 멜라닌 생성을 억제하는 것인 화장료 조성물.
  26. 청구항 15에 있어서, 상기 조성물은 피브로넥틴 (Fibronectin)의 발현을 증진시키는 것인 화장료 조성물.
  27. 청구항 15에 있어서, 상기 조성물은 필라그린 (filaggrin)의 발현을 증진시키는 것인 화장료 조성물.
  28. 청구항 15에 있어서, 상기 조성물은 피부 섬유아세포 (fibroblast cell)를 증식시키는 것인 화장료 조성물.
  29. 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 상처 개선용 피부 외용제 조성물.
  30. 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)를 유효성분으로 포함하는 항염증 또는 상처 개선용 건강기능식품 조성물.
  31. 피부 상태를 개선하기 위한 화장료 조성물의 제조를 위한, 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)의 용도.
  32. 항염증 또는 상처 개선을 위한 피부외용제 조성물의 제조를 위한, 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)의 용도.
  33. 항염증 또는 상처 개선을 위한 건강기능식품 조성물의 제조를 위한, 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)의 용도.
  34. 미생물 유래 세포 외 소포체(extracellular vesicle)의 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 상태를 개선, 예방, 또는 치료하는 방법.
PCT/KR2021/012219 2020-09-08 2021-09-08 수득률이 향상된 미생물 유래 세포 외 소포체의 제조 방법 및 이의 방법으로 제조된 세포 외 소포체를 포함하는 피부 상태 개선용 조성물 WO2022055250A1 (ko)

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