KR102406594B1 - 락토바실러스 사케이 amp 5104 균주 및 이의 용도 - Google Patents

락토바실러스 사케이 amp 5104 균주 및 이의 용도 Download PDF

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김진화
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Abstract

락토바실러스 사케이 AMP 5104 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 상기 균주는 피부 관련 상태 또는 염증 관련 상태의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

락토바실러스 사케이 AMP 5104 균주 및 이의 용도{Lactobacillus sakei AMP 5104 strain and uses thereof}
락토바실러스 사케이 AMP 5104 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
피부는 외부 환경에 직접적으로 노출되는 신체 부위로서, 외부의 자극으로부터 신체를 보호하는 역할을 한다. 사람의 피부 조직에는 수많은 미생물(microflora)이 서식하며, 피부 미생물은 유익한 미생물과 유해한 미생물이 균형을 이루며 피부 면역을 강화한다. 그러나, 외부 자극, 스트레스 및 호르몬 변화 등으로 유해한 미생물이 증식해 피부 미생물의 균형이 깨지게 되면 피부 장벽의 약화로 유해 미생물에 의한 1차 염증 반응이 발생하고 유해 미생물의 초 항원 등의 독성 대사물에 의해 가려움증, 염증 심화 반응 등과 같은 2차 염증 반응이 유발된다. 상기와 같은 원인에 의한 피부 트러블은 미관상 문제가 될 뿐만 아니라, 염증 반응 과정에서 생성되는 물질들이 부수적으로 피부의 색소 침착을 일으키고 피부 탄력 섬유의 붕괴를 촉진시켜 피부 노화를 유발한다.
한편, 한국전통식품인 김치 효능의 원인이 되는 프로바이오틱스(Probiotics) 균에 대한 연구가 활발하다. 특히 유산균은 유기산을 분비하기 때문에 항균력이 뛰어나며 항균력에 의해 미생물 균총의 균형을 잘 유지한다. 피부는 이러한 미생물 균총의 균형 및 피부 면역 세포 인자의 균형을 통해 피부 면역을 이루고 있다.
따라서, 피부 면역 균형에 역할을 하는 새로운 미생물 균주를 개발할 필요가 있다.
일 양상은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.)에 속하는 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 균주의 건조물, 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물 또는 용해물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 균주, 그의 건조물, 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물, 용해물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
일 양상은 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주를 제공한다.
상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주는 기탁번호 KCTC 14319BP로 기탁된 균주일 수 있다.
상기 락토바실러스 사케이(Lactobacillus sakei) 균주는 서열번호 1의 16s rRNA를 포함하는 균주일 수 있다.
상기 균주는 피부 미용 개선 효과, 예를 들면, 피부 노화 억제, 피부 항균, 피부 장벽 강화, 피부 염증 억제, 또는 피부 면역 균형 조절 효과를 갖는 것일 수 있다.
상기 균주는 β-defensins(HBD)-2, cathelicidin(LL-37), RNase7의 발현을 증가시키는 것일 수 있다. 또한, 상기 균주는 Heme oxygenase-1 (HO-1), IL-1β, IL-6, TNF-α의 발현을 증가시키는 것일 수 있다. 또한, 상기 균주는 TNF-α 및 IL-10 발현의 항상성(Immunological homeostasis)을 유지하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 균주는 항염, 항균, 항산화 작용 및 피부각질세포 보호를 통해 피부의 면역 균형을 유지하는 기능성을 가진다.
다른 양상은 상기 균주의 건조물, 파쇄물, 배양액, 또는 배양액의 추출물을 제공한다.
상기 균주의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
본 명세서에서 용어"배양액"은 "배양 상층액", "조건 배양액" 또는 "조정 배지"와 호환적으로 사용될 수 있고, 락토바실러스 사케이 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다. 또한, 상기 배양액은 균주를 배양하여 얻은 균체 배양액에서 균체를 제거한 배양액을 의미할 수 있다. 한편, 상기　배양액　중 균체를 제거한 액체를 "상등액"이라고도 하며,　배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 취하거나, 여과를 통해 균체를 제거하거나,　배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제거하고 상부의 액체만을 취하여 획득할 수 있다. 상기 "균체"는 본 발명의　균주　자체를 의미하는 것으로 피부 샘플 등으로부터 분리하여 선별한　균주　자체 또는 상기　균주를 배양하여　배양액으로부터 분리한　균주를 포함한다. 상기 균체는　배양액을 원심분리하여 하층에 가라앉은 부분을 취하여 획득할 수 있고, 또는 중력에 의해　배양액의 하층으로 가라앉으므로 일정 시간동안 가만히 두었다가 상부의 액체를 제거함으로써 획득할 수 있다.
상기 배양액은 균주를 배양하여 수득된 배양액 자체, 그의 농축물, 또는 동결건조물 또는 배양액으로부터 균주를 제거하여 수득된 배양 상층액, 그의 농축물 또는 동결건조물을 포함할 수 있다.
상기 배양액은 락토바실러스 사케이 균주를 배지(예를 들면, 액상의 락토바실리(Lactobacilli) MRS 브로스(broth) 배지, 유산균 배지 제외)에서 10 ℃ 초과 또는 40 ℃ 미만 중 어느 온도에서 일정 시간, 예를 들면, 4 내지 72시간 동안 배양하여 수득된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 균주의 배양 상층액은 균주 배양액을 원심분리나 여과시켜 균주를 제거하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
다른 구체예에서, 농축물은 상기 균주 배양액 자체, 또는 상기 배양액을 원심분리나 필터를 이용하여 여과한 후 수득된 상층액을 농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
상기 락토바실러스 사케이 균주를 배양하기 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "파쇄물"은 균주 자체를 화학적 또는 물리적 힘에 의하여 균주의 세포벽을 파쇄하여 얻은 산물을 의미할 수 있으며, "용해물"과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "배양액 추출물"은 상기 배양액 또는 그의 농축액으로부터 추출한 것을 의미하며, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물을 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 균주, 상기 균주의 건조물, 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물 또는 용해물의 용도를 제공한다. 상세하게는, 락토바실러스 사케이 균주, 그의 건조물, 파쇄물, 배양액, 그의 배양액의 추출물 또는 용해물을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 균주의 용도는 피부 상태 개선, 피부 미용 개선, 피부 질환의 예방, 개선 또는 치료, 피부 염증성 질환의 예방, 개선, 또는 치료 등을 포함할 수 있다.
상기 피부 상태 개선 또는 피부 미용 개선은 피부 노화 억제 또는 개선, 또는 피부 장벽 강화일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "피부 노화"란 나이가 들어가면서 피부에 나타나게 되는 유형과 무형상의 변화를 통틀어 말하는 것으로, 예컨대 표피 두께가 얇아지는 현상, 진피의 세포 수나 혈관 수, DNA 손상복구 능력, 세포교체주기, 상처 회복, 피부장벽기능, 표피의 수분 유지, 땀분비, 피지분비, 비타민D 생산, 물리적 손상방어, 화학물질 제거능력, 면역반응, 감각 기능, 체온조절의 감소를 말한다.
상기 균주 또는 이의 배양액은 외인성 요인 또는 내인성 요인에 의해 유발되는 피부 노화 개선용일 수 있다. 상기 외인성 요인은 여러 가지 외부 요인, 예컨대 자외선(광)을 말하고 내인성 요인은 연대기적 요인이라고도 지칭되며 주로 시간의 흐름에 의해 발생하는 요인을 말한다. 즉, 상기 피부 노화는 구체적으로는 자외선, 공해, 담배연기, 화학물질 등에 의한 외부 자극에 의해 유도되는 조기 노화 증상뿐만 아니라, 나이가 들어감에 의해 피부세포의 증식이 감소함에 따라 발생하는 자연노화 현상을 포함하며 주름, 탄력 감소, 피부 쳐짐 및 건조 현상 등을 모두 포함하는 개념이다. 또한 주름은 내ㆍ외부 요인의 변화에 의한 자극이 피부조직을 구성하고 있는 성분을 변화시켜 주름을 유발하는 것을 포함한다.
상기 노화는 자외선, 활성산소 등에 의한 노화일 수 있다. 본 명세서에서 용어, "광노화(Photoaging)"는 외부 환경적인 요인에 의해 유발되는 현상으로, 가장 대표적인 인자로는 자외선이 있다. 자외선은 단백질 분해효소의 활성화와 기질단백질의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합 등의 생체 구성 성분들의 손상을 가져오고, 이러한 메커니즘의 반복은 외관상으로도 확연한 피부노화를 초래하게 된다. 상기 "활성산소"는 피부 세포 및 조직 손상을 주도하는 것으로 항산화효소와 비효소적 항산화제들로 구성된 피부 항산화 방어망을 파괴함으로써 산화제와 항산화제 사이의 균형을 산화상태 쪽으로 기울게 함으로써 지질 과산화, 단백질 산화, 세포간질 성분을 파괴시키는 단백질 분해효소의 활성화, 탄력 섬유인 콜라겐과 엘라스틴의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합, 히알루론산 사슬의 절단, 멜라닌 생성반응 촉진, DNA산화와 같은 생체 구성 성분들의 손상을 야기시킨다. 또한, 피부에 염증을 유발시키고, 피부면역기능을 억제시켜 세균 감염증 또는 발암율의 증가를 가져온다. 그 결과 탄력감소, 주름살 및 기미, 주근깨 등으로 특징 지워지는 피부 노화를 가속화한다.
상기 "피부 장벽 강화"는 피부 가장 바깥쪽에 위치하여 수분과 영양 손실을 막아주는 피부 장벽의 기능이 증진되는 모든 작용을 의미할 수 있다.
용어, "항염증"이란 "염증 억제 또는 개선"과 혼용될 수 있으며, 면역 반응이 완화되어 NO 생성이 억제되는 모든 작용을 의미할 수 있다.
상기 "피부 질환"은 피부 장벽 기능 손상에 의한 질환, 피부 노화, 피부 상처, 피부 흉터, 또는 피부 염증일 수 있다. 용어, "예방"은 질병의 발생을 억제하는 것을 포함한다. 용어, "치료"는 질병의 발전의 억제, 경감, 또는 제거를 포함한다.
상기 피부 장벽 기능 손상은 피부 장벽의 기능이 저하되거나 손상되어 피부에 나타나는 모든 변화를 의미할 수 있다. 예를 들어, 피부 주름 증가, 건조, 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 여드름 등을 포함할 수 있다.
상기 피부 염증성 질환은 피부 상처, 피부염, 아토피 피부염, 소양증, 습진성 피부질환, 건성 습진, 홍반, 두드러기, 건선, 약발진, 및 여드름으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
일 실시예에서는 상기 균주 및 락토바실러스 속 락토바실러스 펜토서스의 용해물 혼합액에서 피부 항균 활성, 디톡스 및 노화 개선 효과, 피부 면역 균형 효과가 현저한 것을 확인하였다. 따라서, 또 다른 구체예에 있어서, 상기 균주는 피부 개선 효과를 갖는 락토바실러스에 속하는 다른 균주, 즉 제2 락토바실러스 속 균주와 함께 사용되어 시너지 효과를 나타낸 것일 수 있다. 상기 제2 락토바실러스 속 균주는 예를 들어, 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus), 락토바실러스 퍼멘툼(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 산프란시스센시스(Lactobacillus sanfranciscensis), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 김치(Lactobacillus kimchi), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%의 균주, 이의 건조물, 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물 또는 용해물을 포함할 수 있다.
용어, "유효성분으로 포함"은 상기에서 언급한 효과를 나타낼 수 있는 정도로 본 명세서의 균주, 이의 건조물, 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물 또는 용해물이 첨가되는 것을 의미하고, 약물전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 포뮬레이션 (formulation)되는 것을 포함하는 의미이다.
상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 제형인 것일 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제 함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이, 스틱 등인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 상세하게는, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등과 같은 화장수, 훼이셜 로션, 바디로션, 두피에센스, 헤어로션 등과 같은 유액, 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등과 같은 크림, 에센스, 화장연고, 스프레이, 젤, 팩, 선 스크린, 메이크업 베이스, 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션, 파우더 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이 경우 상기 화장료 조성물은 유화제, 비누산, 용매, 착색제, 보존제, 항산화제, 소포제, 항균제, 항재침착제, 효소, 식물 또는 미네랄 오일, 지방, 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 보존제, 단백질, 실리콘, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물, 왁스 등을 포함하는 부형제를 함유할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 조성물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 피부외용제용 조성물일 수 있다.
상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종 생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류 등도 적절하게 배합할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 하이드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 식품조성물 또는 건강기능식품 조성물을 일 수 있다.
상기 식품조성물 또는 건강기능식품 조성물은 상기 균주 또는 이의 배양액 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 건강기능식품의 종류 중 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 건강식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 건강기능식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다.
또한, 다른 양상은 유효한 양의 상기한 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 처리 또는 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상태를 예방, 개선, 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체의 상태는 피부와 관련된 상태, 또는 염증과 관련된 상태일 수 있다.
용어, "투여하는", "도입하는", 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다.
투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 피부미용 개선, 예를 들어 피부 보습, 피부 장벽 강화, 피부 염증 억제, 피부 주름 개선 효과를 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 투여는 일 구체예에 따른 조성물을 개체당 일당 0.1 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg을 투여하는 것일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료 시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.
일 양상에 따른 신규 락토바실러스 사케이 균주에 의하면, 피부 관련 상태 또는 염증 관련 상태의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 피부면역균형을 유지하기 위한 요소를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 균주의 분리
제주도 전통 김치 10 g을 멸균수 100 ㎖에 넣어 37 ℃에서 1시간 동안 정치한 후, 식염수로 희석하였다. 이후, 희석액을 락토바실리(Lactobacilli) MRS 브로스(broth) 고체 배지(BD사, 288130)에 희석 단계별로 100 ㎕씩 분주하여 평면도말한 뒤 도말된 고체 배지를 37 ℃에서 2일 동안 배양하였다. 이후, 형성된 콜로니를 분취한 후, 공지된 27F, 338F, 518F, 785F, 518R, 805R, 907R, 및 1492R 프라이머를 사용하여 16s rRNA 유전자 서열 동정을 실시하였다. PCR 증폭은 95℃ 1분, 55℃1분, 75℃ 1분30초씩 30 사이클로 실시하였으며, 마지막으로 72℃에서 8분간 처리한 후 4℃에서 보관하였다. PCR 반응이 끝난 뒤 분리 배양된 종들의 DNA 서열은 ABI-3730XL(ABI, USA)를 이용하여 결정하였다. 분리 배양된 미생물 콜로니 중 결정된 16S rRNA부위의 염기서열을 미국 국립생물정보센터(NCBI, National Center for Biotechnology Information) 홈페이지에서 제공되는 BLAST 프로그램으로 등록된 다른 균주들과 비교 분석하였다. 상동성 97% 이하의 신규성 있는 종들만 선별하여 사용하였고, 그 중 상동성 94% 이하의 신규 미생물(이하 "AMP 5104"라 함)을 선별하였다. AMP 5104는 서열번호 1(complementary DNA)의 16s rRNA 서열을 갖는다. 이후, 상기 균주를 2020년 9월 23일자로 한국생명공학 연구원 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호 KCTC 14319BP를 부여받았다.
실시예 2. 락토바실러스 사케이 AMP 5104 용해물
상기 실시예 1에서 동정한 락토바실러스 사케이 AMP 5104 균주의 용해물 제조하였다. 구체적으로, 실시예 1의 균주를 Lactobacilli MRS Broth (BD사, 288130)에 접종하여 35~37℃에서 1~2일 동안 배양한 후, 호모게나이저(homogenizer)를 이용하여 균주의 세포벽을 파쇄하였다.
실시예 3. 락토바실러스 사케이 AMP 5104 배양액
상기 실시예 1에서 동정한 락토바실러스 사케이 AMP 5104 균주의 배양액에서 균주를 제거한 배양액을 제조하였다. 구체적으로, 실시예 1의 균주를 Lactobacilli MRS Broth (BD사, 288130)에 접종하여 35~37℃에서 1~2일 동안 배양한 후, 상기 배양액에서 원심분리기를 이용하여 균주를 제거하였다.
실시예 4. 락토바실러스 사케이 AMP 5104 및 락토바실러스 펜토서스 HB-8023의 혼합 용해물
락토바실러스 펜토서스 HB-8023 균주(KCTC 13322BP)를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 균주 용해물을 제조하였다. 이후, 상기 실시예 2에서 제조한 락토바실러스 사케이 AMP 5104 용해물과 1:1의 비율로 혼합하였다.
[비교예]
비교예 1. 락토바실러스 사케이 L35 용해물
상기 실시예 1과 동일한 제주도 전통 김치에서 분리된 락토바실러스 사케이 L35 균주를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 균주 용해물을 제조하였다.
비교예 2. 락토바실러스 사케이 L42 용해물
상기 실시예 1과 동일한 제주도 전통 김치에서 분리된 락토바실러스 사케이 L42 균주를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 균주 용해물을 제조하였다.
[실험예]
세포 독성 및 세포 증식
일 양상에 따른 락토바실러스 사케이 균주의 세포 활성을 확인하기 위하여 CCK-8 (wst-8) assay를 수행하였다. 구체적으로, 인간 각질형성세포 세포주(Human HaCaT)를 48 웰 플레이트에 5X104/웰로 분주한 후, 상기 실시예 2 및 비교예 1~2를 농도별(0.3%, 0.6%, 2.5%, 5% 및 10%)로 처리하였다. 이후, Cell Counting Kit-8(Munich, Germany)를 사용하여 세포독성을 평가하고, spectrophotometer를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
세포활성 용해물 함량에 따른 세포활성 (%)
control 0.3 % 0.6 % 2.5 % 5 % 10 %
실시예2 100 106 126 125 125 123
비교예1 100 106 111 120 119 124
비교예2 100 100 103 109 111 112
그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, 실시예 2는 비교예 1~2와 비교하여 모든 농도에서 세포 활성이 뛰어난 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 양상에 따른 락토바실러스 사케이 AMP 5104 균주는 세포 활성능력이 가장 우수하고, 세포 독성이 없는바 화장품, 약품, 식품 등으로 이용가능하다.
피부 항균 활성 및 피부 장벽 개선
일 양상에 따른 락토바실러스 사케이 균주의 피부 항균 활성 및 피부 장벽 개선 효과를 확인하였다. 구체적으로, 인간 각질형성세포 세포주(Human HaCaT)를 6웰 플레이트에 7.5x105로 분주한 후, 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고 FBS 첨가되지 않은 DMEM: F12(3:1) 배지로 갈아준 후, 상기 실시예 2~4 및 비교예 1~2를 처리한 뒤 24시간 동안 추가 배양하였다. 그 후 각 시료의 세포에서 RNeasy Mini Kit(Hilden, 독일)를 이용하여 RNA를 분리한 뒤 nanodrop으로 260㎚에서 RNA를 정량한 후, 각각 2㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(LunaScript® RT SuperMix Kit, 미국). 합성된 cDNA를 주형으로 타겟 유전자인 cathelicidin (LL-37), RNase7 및 β-defensins(HBD)-2에 대하여 사이버그린 (Luna Universal qPCR Master Mix, New England BioLabs, 미국)을 프라이머 및 cDNA와 함께 첨가하여 실시간(real-time) PCR 기계 (BMS사 MIC 2 기기, Queensland)에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 유전자의 발현량은 RPL13A 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
control 실시예 2 실시예 3 실시예 4 비교예 1 비교예 2
LL37 1 9.2 6.6 13.2 8.6 5.6
RNase7 1 4.9 3.9 5.9 3.9 4.5
HBD-2 1 9.4 6.7 16.9 6.8 6.1
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 비교예 1~2와 비교하여 실시예 2~4에서 항균 펩타이드의 발현이 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다. 특히, 락토바실러스 펜토서스 HB-8023 균주와의 혼합 용해물에서 항균 펩타이드 발현양이 현저하게 높았다.
즉, 일 양상에 따른 락토바실러스 사케이 균주는 각질형성세포에서 LL37, RNase7 및 HBD-2와 같은 항균 펩타이드의 발현을 증가시키는 바, 피부 항균 활성을 나타내어 아토피 피부염 등과 같은 염증성 피부 질환을 예방, 치료 또는 개선할 수 있으며, 상기 염증성 피부 질환에 의해 유발된 피부의 장벽 기능을 개선할 수 있다.
피부 디톡스 및 노화
일 양상에 따른 락토바실러스 사케이 균주의 피부 디톡스 및 노화 개선 효과를 확인하였다. 구체적으로, Heme oxygenase-1 (HO-1) 프라이머를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 항산화효소의 발현량을 분석하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
control 실시예 2 실시예 3 실시예 4 비교예 1 비교예 2
HO-1 1 4.7 4.3 5.57 3.8 4.1
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 2~4의 경우, 비교예 1~2에 비해 HO-1의 발현이 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 양상에 따른 락토바실러스 사케이 균주는 자외선, 활성 산소 등으로 쌓인 독소를 제거함으로써 피부 노화 개선 효과가 있다.
피부 염증
일 양상에 따른 락토바실러스 사케이 균주의 피부 염증 및 면역증강 효과를 확인하였다. 구체적으로, TNF-α, IL-6 및 IL-1β 프라이머를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 사이토카인의 발현량을 분석하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
control 실시예 2 실시예 3 실시예 4 비교예 1 비교예 2
TNF-α 1 1.49 1.45 1.72 1.17 1.45
IL-6 1 1.23 1.20 1.01 1.25 1.15
IL-1β 1 3.39 3.10 2.46 2.36 2.87
LDH 감소량 (%) 0 70 65 73 65 62
그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 2~4의 경우, 비교예 1~2에 비해 염증성 사이토카인의 발현이 유의하게 증가하였으며, LDH의 발현이 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 양상에 따른 락토바실러스 사케이 균주는 피부 세포 손상 없이 피부를 보호할 수 있을 뿐만 아니라 피부 염증 질환을 예방, 치료 및 개선할 수 있다.
피부 면역 균형
일 양상에 따른 락토바실러스 사케이 균주의 피부 면역 균형 효과를 확인하였다. 구체적으로, TNF-α 및 IL-10 프라이머를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 사이토카인의 발현량을 분석하였고 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
control 실시예 2 실시예 3 실시예 4 비교예 1 비교예 2
TNF-α 1 1.49 1.45 1.72 1.17 1.45
IL-10 1 1.47 1.42 1.73 2.32 1.33
RATIO(TNF-α/IL-10) 1 1.01 1.02 1.00 0.74 1.09
그 결과, 표 5에 나타낸 바와 같이, 실시예 2~4의 경우, 비교예 1~2에 비해 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory)인 TNF-α 및 항염증성 사이토카인(anti-inflammatory)인 IL-10의 발현이 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 항염증성 사이토카인에 대한 전염증성 사이토카인의 발현 비율(TNF-α/IL-10)이 1에 근접한 수치를 나타내어 비교예 1~2에 비하여 면역 균형(Immunological homeostasis) 유지능이 우수한 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 양상에 따른 락토바실러스 사케이 균주는 면역 균형 상태를 유지할 수 있어 아토피, 두드러기, 가려움증, 피부염 등과 같은 알레르기성 피부 질환의 예방, 치료 및 개선에 효과적이다.
자외선에 의한 항산화 효과
일 양상에 따른 락토바실러스 사케이 균주의 자외선에 의해 유도된 세포 내 항산화 활성을 확인하였다. 구체적으로, 인간 각질형성세포 세포주(Human HaCaT)를 96웰 플레이트에 1.0 x 106 개/mL의 농도로 분주하고, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이후, 상기 실시예 2~4 및 비교예 1~2을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 추가로 배양한 후, 세포를 UVB에 노출(30 mJ/㎝2)시키고 37℃에서 24시간 동안 추가로 배양하였다. 이후, DCF-DA 용액(25 μM)을 각 웰에 첨가하고, 세포를 어두운 곳에 10분 동안 방치한 후, 세포 내 활성산소종(ROS)에 의해 발생하는 2',7'-디클로로플루오레세인(DCF) 생성물의 형광을 PerkinElmer LS-5B 분광형광계(PerkinElmer, Waltham, MA, USA)를 이용하여 검출하였다. 대조군으로는 녹차추출물을 이용하였다.
대조군 실시예 2 실시예 3 실시예 4 비교예 1 비교예 2
세포 내 항산화 활성(%) 53.17 49.45 47.72 51.32 32.25 28.51
그 결과, 표 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 2~4의 경우, 비교예 1~2와 비교하여 세포 내 항산화 활성 수준이 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 실시예 2~4는 우수한 항산화 활성을 가지는 것으로 알려진 녹차추출물과 유사한 수준의 항산화 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 양상에 따른 락토바실러스 사케이 균주는 자외선에 의해 증가된 피부 내 ROS 수준을 약화시킴으로써 우수한 항산화 활성을 가지는 바, 피부 노화의 예방, 개선에 효과적이다.
자유라디칼 소거능에 의한 항산화 효과
일 양상에 따른 락토바실러스 사케이 균주의 자유라디칼 소거능에 의한 항산화 활성을 확인하였다. 구체적으로, 실시예 2~4 및 비교예 1~2를 96웰 플레이트의 각 웰에 일정한 용량으로 넣어준 뒤, 100 μM 메탄올 용액으로 제조된 DPPH(2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical)를 첨가하여 용액의 총 부피가 200 ㎕가 되도록 하였다. 이후, 37℃에서 30분 동안 방치한 후, 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 560 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 녹차추출물을 이용하였다.
대조군 실시예 2 실시예 3 실시예 4 비교예 1 비교예 2
자유라디칼 소거활성(%) 86.91 84.72 84.65 85.24 83.33 81.17
그 결과, 표 7에 나타낸 바와 같이, 실시예 2~4의 경우, 비교예 1~2와 비교하여 자유라디칼 소거 활성이 우수한 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 실시예 2~4는 우수한 항산화 활성을 가지는 것으로 알려진 녹차추출물과 유사한 수준의 자유라디칼 소거 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 양상에 따른 락토바실러스 사케이 균주는 자유라디칼을 제거하는 항산화 활성이 우수한 바, 피부 노화의 예방 또는 개선에 이용될 수 있다.
한국생명공학연구원 KCTC14319BP 20200912
<110> IT'S HANBUL CO., LTD. <120> Lactobacillus sakei AMP 5104 strain and uses thereof <130> PN141524 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1534 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lactobacillus sakei AMP 5104 <400> 1 tggctcagga cgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgaacgc actctcgttt 60 agattgaagg agcttgctcc tgattgataa acatttgagt gagtggcgga cgggtgagta 120 acacgtgggt aacctgccct aaagtggggg ataacatttg gaaacagatg ctaataccgc 180 ataaaaccta acaccgcatg gtgtagggtt gaaagatggt ttcggctatc actttaggat 240 ggacccgcgg tgcattagtt agttggtgag gtaaaggctc accaagaccg tgatgcatag 300 ccgacctgag agggtaatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 360 ggcagcagta gggaatcttc cacaatggac gaaagtctga tggagcaacg ccgcgtgagt 420 gaagaaggtt ttcggatcgt aaaactctgt tgttggagaa gaatgtatct gatagtaact 480 gatcaggtag tgacggtatc caaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg 540 gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt 600 ttcttaagtc tgatgtgaaa gccttcggct caaccgaaga agtgcatcgg aaactgggaa 660 acttgagtgc agaagaggac agtggaactc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat 720 ggaagaacac cagtggcgaa ggcggctgtc tggtctgtaa ctgacgctga ggctcgaaag 780 catgggtagc aaacaggatt agataccctg gtagtccatg ccgtaaacga tgagtgctag 840 gtgttggagg gtttccgccc ttcagtgccg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg 900 agtacgaccg caaggttgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc 960 atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctttgaccac 1020 tctagagata gagctttccc ttcggggaca aagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1080 ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat tactagttgc 1140 cagcatttag ttgggcactc tagtgagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggac 1200 gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggatggtac 1260 aacgagttgc gagaccgcga ggtttagcta atctcttaaa accattctca gttcggattg 1320 taggctgcaa ctcgcctaca tgaagccgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc 1380 ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgagag tttgtaacac 1440 ccaaagccgg tgaggtaacc ccttcggggg agccagcccg tctaaagtgg ggacagatga 1500 attaagggtg aagtcgtaag aggggggacc ccgt 1534

Claims (15)

  1. 기탁번호 KCTC 14319BP로 기탁된, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus Sakei) AMP 5104 균주.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 16s rRNA를 갖는 것인 락토바실러스 사케이 AMP 5104 균주.
  3. 기탁번호 KCTC 14319BP로 기탁된, 락토바실러스 사케이(Lactobacillus Sakei) AMP 5104 균주의 건조물, 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물 또는 용해물.
  4. 청구항 1의 균주, 그의 건조물, 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물, 용해물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 화장료 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 제2 락토바실러스 속 균주, 그의 건조물, 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물, 용해물, 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함하는 것인 화장료 조성물.
  6. 청구항 4 또는 5에 있어서, 피부 상태 개선용 화장료 조성물로서, 상기 피부 상태는 자외선 또는 활성 산소에 의한 피부 노화, 또는 피부 장벽인 것인 조성물.
  7. 청구항 4 또는 5에 있어서, 피부 항균, 피부 염증 또는 피부 면역 개선용 화장료 조성물.
  8. 청구항 1의 균주, 그의 건조물, 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물, 용해물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 피부 상태 개선용 피부 외용제 조성물로서, 상기 피부 상태는 자외선 또는 활성 산소에 의한 피부 노화, 또는 피부 장벽인 것인 조성물.
  9. 청구항 1의 균주, 그의 건조물, 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물, 용해물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 피부 항균, 피부 염증 또는 피부 면역 개선용 피부 외용제 조성물.
  10. 청구항 1의 균주, 그의 건조물, 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물, 용해물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 피부 항균, 피부 면역 또는 피부 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 피부 염증 질환은 피부 상처, 피부염, 아토피 피부염, 소양증, 습진성 피부질환, 건성 습진, 홍반, 두드러기, 건선, 약발진, 및 여드름으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 약학적 조성물.
  12. 청구항 1의 균주, 그의 건조물, 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물, 용해물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 피부 상태 개선용 건강기능식품 조성물로서, 상기 피부 상태는 자외선 또는 활성 산소에 의한 피부 노화, 또는 피부 장벽인 것인 조성물.
  13. 청구항 1의 균주, 그의 건조물, 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물, 용해물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 피부 항균, 피부 면역 또는 피부 염증 질환의 개선용 건강기능식품 조성물.
  14. 청구항 1의 균주, 그의 건조물, 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물, 용해물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 피부 상태 개선용 식품 조성물로서, 상기 피부 상태는 자외선 또는 활성 산소에 의한 피부 노화, 또는 피부 장벽인 것인 조성물.
  15. 청구항 1의 균주, 그의 건조물, 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물, 용해물, 또는 이들이 혼합물을 포함하는 피부 항균, 피부 면역 또는 피부 염증 질환 개선용 식품 조성물.
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