WO2019103329A1 - 갈색거저리 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물 - Google Patents

갈색거저리 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물 Download PDF

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WO2019103329A1
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brown
extract
fermented
present
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박경욱
강경윤
김현진
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(재) 순천천연물의약소재개발연구센터
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for antioxidation containing a fermented brown duck extract, and more particularly to a fermented soybean oil comprising a total amount of polyphenols, flavonoids, tannins and essential components
  • a pharmaceutical composition and a food composition containing the fermented extract as an active ingredient are particularly preferred.
  • the human skin consists of the epidermis, dermis, and connective tissue including the stratum corneum, and the stratum corneum is composed of a dead cell layer formed through the differentiation process of keratinocyte, the basal cell of the epidermis And is responsible for protecting the human body from the effects of the external environment.
  • stratum corneum is composed of a dead cell layer formed through the differentiation process of keratinocyte, the basal cell of the epidermis And is responsible for protecting the human body from the effects of the external environment.
  • the cellular components such as lipid, protein, It changes carbohydrate and DNA oxidative damage and enzymatic activity, causing various diseases such as skin cancer, and promotes aging.
  • the biggest cause of external aging is photoaging due to ultraviolet rays, which causes acute and chronic skin injuries such as skin cancer through continuous exposure to UV.
  • the "Tenebrio molitor” is an insect of the beetle neck, about 15 mm in length, dark brown and glossy.
  • the larvae of brown ducks are called mealworms and feed largely as food insects or pets.
  • the reason why the wheat worms are used for pets is that they are relatively clean because they have a relatively short period of transformation and are very clean insects that feed on grain to be.
  • Adults are nocturnal, hiding in the hole during the daytime and active at night. It grows in pupa and adults in spring when it swallows larvae in the grain bag near the main island.
  • brown goats are reported to be highly effective as protein donors because they have the highest protein content and insufficient fat content among insects. They are known to exhibit increased anticancer activity when treated with hepatocellular carcinoma cells, in particular with anticancer substances.
  • Korean Patent Registration No. 10-1752253 discloses an insecticidal gum composition using a brown gurrier and a method for producing the same.
  • Korean Patent Registration No. 10-1746111 discloses a method for preparing a gum-based food containing brown gurd
  • Korean Patent No. 10-1651908 discloses a composition for preventing or treating diabetes comprising an effective amount of a brown larva or an extract thereof as a patent related to the use of brown gourd
  • 10-2016-0041110 discloses a composition for the prevention or treatment of rheumatoid arthritis, which comprises a suspension of brown goats as an active ingredient.
  • 10-2014-0134331 discloses a composition for preventing or treating rheumatoid arthritis, Of the active ingredient of the suspension of obesity prevention or Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2015-0050712 discloses an anticancer composition comprising an extract of brown gruel or a fraction thereof as an active ingredient, Korean Patent Registration No. 10-1424125 discloses a composition for treating cancer, A composition for the treatment of inflammatory diseases including larva was reported.
  • Korean Patent Registration No. 10-1404566 has reported a composition for preventing or treating dementia including brown goat extract.
  • the inventors of the present invention have continued to develop new natural substances having antioxidative effects and fewer side effects on human body. As a result, they found that the brown duck fermented extract showed excellent antioxidative effects without cytotoxicity, Completed.
  • a technical problem to be solved by the present invention is to provide a substance having an antioxidative effect and excellent human stability.
  • a brown larva is extracted with an organic solvent to remove the fat and fat components contained in the larva and then lyophilized, followed by fermentation with a yeast strain, , Flavonoids, tannins, and essential amino acids, which are characterized in that they are obtained by extracting the extracts of the present invention by using the extracts of the present invention.
  • the present invention provides an antioxidative composition comprising the above-described brown gourd fermented extract as an active ingredient.
  • the composition comprising the brown frozen fermentation extract may be a cosmetic composition, a pharmaceutical composition or a food composition.
  • the brown duck fermented extract of the present invention has an effect of increasing and changing the total polyphenols, flavonoids, tannins, and essential amino acid contents, producing brown duck larvae yeast protein, and increasing antioxidant activity. Therefore, the composition can be used as an antioxidant composition containing the fermented extract of brown gourd according to the present invention.
  • Figure 1 is a schematic representation of a process for the production of a brown gruel fermented extract.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of measurement of the electron donating ability of the brown goat fermentation extract.
  • FIG. 3 shows the results of ABTS cation radical scavenging ability of brown goat fermented extract Fig.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of FRAP analysis of a brown duck fermented extract of a brown duck fermented extract.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of measurement of Cu 2 + reducing power (CUPRAC) of a brown goat fermented extract of a brown goat fermentation extract.
  • CUPRAC Cu 2 + reducing power
  • FIG. 7 is a graph showing the measurement results of Fe 2 + chelation of a brown goat fermented extract of a brown goat fermentation extract.
  • the present invention is characterized by extracting brown goat larvae with an organic solvent, removing the fat and fat components contained in brown goat larvae, freeze-drying, fermenting using yeast strains, and extracting with water or an organic solvent
  • the total polyphenol, flavonoid, tannin, and essential amino acid content of the brown duck fermented extract is characterized by extracting brown goat larvae with an organic solvent, removing the fat and fat components contained in brown goat larvae, freeze-drying, fermenting using yeast strains, and extracting with water or an organic solvent.
  • the present invention provides an antioxidative composition comprising the above-described brown gourd fermented extract as an active ingredient.
  • the composition comprising the brown frozen fermentation extract may be a cosmetic composition, a pharmaceutical composition or a food composition.
  • the "brown duck fermented extract” is obtained by extracting brown goat larvae with an organic solvent, removing the fat and fat components contained in brown goat larvae, freeze-drying, fermenting them with yeast strains, Can be obtained by extraction with an organic solvent.
  • the removal of the fat and fat components contained in the brown gully is carried out in an organic solvent such as water, methanol, ethanol, isopropanol, butanol, ethylene, acetone, hexane, ether, chloroform, ethyl acetate, Butyl alcohol, butyl acetate, dichloromethane, N, N-dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO), 1,3-butylene glycol, propylene glycol or a mixed solvent thereof, 30 hours, preferably 23 to 25 hours.
  • an organic solvent such as water, methanol, ethanol, isopropanol, butanol, ethylene, acetone, hexane, ether, chloroform, ethyl acetate, Butyl alcohol, butyl acetate, dichloromethane, N, N-dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO), 1,3-butylene glycol, prop
  • the fermentation is carried out by inoculating a yeast strain into a brown duck larva which has been subjected to fat and oil removal, and then inoculated at 20 to 30 DEG C, preferably at 23 to 27 DEG C for 60 to 80 hours, For 70 to 75 hours.
  • the fermentation temperature is lower than 20 ° C, the fermentation is not sufficiently carried out or it takes a long time to ferment, which is inefficient.
  • the fermentation temperature exceeds 30 ° C, the activity of the yeast strain may be lowered and the fermentation may not sufficiently take place.
  • the fermentation time is less than 60 hours, the fermented brown duck fermented extract can not sufficiently exhibit the antioxidative effect because the fermentation of the brown duck does not sufficiently take place. If the fermentation time exceeds 80 hours, And there is no difference in fermentation efficiency.
  • the yeast strains include, for example, strains of Saccharomyces cerevisiae , S. ellipsoideus , S. eubayanus , Saccharomyces spp . S. pastorianus , S. florentinus and the like, and Saccharomyces cerevisiae strain is preferably used.
  • the extraction of the brown frozen fermented product is carried out in water or in an organic solvent such as water, methanol, ethanol, isopropanol, butanol, ethylene, acetone, hexane, ether, chloroform, ethyl acetate, Extraction with hot water, cold extraction, ultrasonic extraction, reflux cooling extraction using dichloromethane, N, N-dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO), 1,3-butylene glycol, propylene glycol or a mixed solvent thereof .
  • the brown gruel fermented product can be heated, unheated or cold-extracted using water or 60 to 100% alcohol.
  • the brown gully fermentation extract may be obtained by a conventional purification process in addition to the extraction method using the above extraction solvent.
  • a conventional purification process for example, by separation using an ultrafiltration membrane having a constant molecular weight cut-off value, separation by various chromatographies (made for separation by size, charge, hydrophobicity or affinity), and the like, A brown goat fermented extract can also be obtained through fractionation.
  • the brown gruel fermentation extract of the present invention may be any extract, fraction, purified product, diluted solution, concentrate or dried product obtained in each step of extraction, fractionation or purification (separation, fractionation).
  • the above-mentioned " active ingredient” means a component that exhibits the desired activity alone or can exhibit activity together with a carrier which is itself inactive.
  • the composition of the present invention may contain from 0.005 to 50% by weight, more preferably from 0.01 to 30% by weight, and most preferably from 0.1 to 10% by weight, based on the total weight of the composition, of a brown dumpling fermentation extract. If the content of the fermented extract is less than 0.005% by weight, the antioxidant effect of the present invention can not be obtained. If the content of the fermented extract is more than 50% by weight, the effect may not be proportional to the content, There is a problem that the stability of the shape is not ensured.
  • composition containing the fermented extract of the present invention has an antioxidative effect and is almost free from cytotoxicity as a natural substance.
  • a cosmetic composition comprising as an active ingredient an extract of a fermented brown gruel.
  • the cosmetic composition according to the present invention may contain, in addition to the brown goat's fermented extract as an active ingredient, conventional additives such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavoring agents, Can be added.
  • conventional additives such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and flavoring agents, Can be added.
  • the cosmetic composition of the present invention can be prepared into any of the formulations conventionally produced in the art and can be used as a solution, a suspension, an emulsion, a paste, a gel, a cream, a lotion, a powder, a soap, , Oil, powder foundation, emulsion foundation, wax foundation and spray, but is not limited thereto. More specifically, it can be prepared as a nutritional cream, a convergent lotion, a soft lotion, a lotion, an essence, a nutritional gel or a massage cream.
  • the formulation of the present invention is a paste, cream or gel
  • tosse When the formulation of the present invention is a powder or a spray, tosse, talc, silica, aluminum hydroxide, calcium silicate or polyamide powder may be used as a carrier component.
  • a spray in particular, chlorofluorohydrocarbons, propane / Propane or dimethyl ether.
  • a solvent, a solubilizing agent or an emulsifying agent is used as a carrier component, and examples thereof include water, ethanol, isopropanol, ethyl carbonate, ethyl acetate, benzyl alcohol, benzyl benzoate, , 3-butyl glycol oil, glycerol aliphatic ester, polyethylene glycol or sorbitan fatty acid esters.
  • the formulation of the present invention is a suspension
  • a carrier such as water, a liquid diluent such as ethanol or propylene glycol, a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, Castellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracert, etc.
  • a suspending agent such as ethoxylated isostearyl alcohol, polyoxyethylene sorbitol ester and polyoxyethylene sorbitan ester, Castellulose, aluminum metahydroxide, bentonite, agar or tracert, etc.
  • the carrier component may include aliphatic alcohol sulfate, aliphatic alcohol ether sulfate, sulfosuccinic acid monoester, isethionate, imidazolinium derivative, methyltaurate, sarcosinate, fatty acid amide Ether sulfates, alkylamidobetaines, aliphatic alcohols, fatty acid glycerides, fatty acid diethanolamides, vegetable oils, lanolin derivatives or ethoxylated glycerol fatty acid esters.
  • a pharmaceutical composition comprising as an active ingredient an extract of fermented brown gruel.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention includes a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the brown frozen fermentation extract.
  • the pharmaceutically acceptable carrier to be contained in the pharmaceutical composition of the present invention is one usually used at the time of formulation, and includes lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, But are not limited to, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrups, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. It is not.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further contain a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc., in addition to the above components.
  • a lubricant e.g., a lubricant, a wetting agent, a sweetening agent, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, etc.
  • Suitable pharmaceutically acceptable carriers and formulations are described in detail in Remington ' s Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995).
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and is preferably applied by parenteral administration, more preferably topical application by application.
  • a suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may vary depending on such factors as the formulation method, administration method, age, body weight, sex, pathological condition, food, administration time, route of administration, excretion rate, .
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is in the range of 0.001-100 mg / kg on an adult basis.
  • the composition is an external preparation, it is preferably applied in an amount of 1.0 to 3.0 ml on an adult basis once to five times a day, and continued for 1 month or more.
  • the dose is not intended to limit the scope of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in unit dosage form by formulating it using a pharmaceutically acceptable carrier and / or excipient according to a method which can be easily carried out by a person having ordinary skill in the art, Into the container.
  • the formulations may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in an oil or aqueous medium, or in the form of excipients, powders, powders, granules, tablets or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.
  • a food composition comprising an extract of fermented brown gruel as an active ingredient.
  • the food composition according to the present invention may further contain, as an active ingredient, a brown dough fermented extract as well as a component that is ordinarily added in the manufacture of food such as proteins, carbohydrates, fats, nutrients, seasonings and flavors .
  • Such carbohydrates are monosaccharides, such as glucose, fructose, and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose, oligosaccharides and the like; And polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin and the like, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.
  • Natural flavorings such as tau martin and stevia extract (e.g., rebaudioside A and glycyrrhizin) and synthetic flavorings (saccharine, aspartame, etc.) can be used as flavorings.
  • the food composition of the present invention when prepared as a drink, it additionally contains citric acid, liquid fructose, sugar, glucose, acetic acid, malic acid, juice, mulberry extract, jujube extract, licorice extract, etc., .
  • the brown gourd fermented extract of the present invention is a natural substance which is harmless to the human body and has little toxicity and side effects, so that it can be safely used even in long-term use and can be safely applied to cosmetic, pharmaceutical and food compositions as described above have.
  • the present invention provides a method for preventing oxidation by administering to a subject a composition comprising an effective amount of a fermented brown goat extract as an active ingredient.
  • &quot means a mammal such as a monkey, a cow, a horse, a pig, a sheep, a dog, a cat, a rat, a mouse or a chimpanzee including a human in order to prevent oxidation by administering the composition of the present invention do.
  • the dose may be administered locally by parenteral administration, preferably ointment, lotion, spray, gel or the like.
  • the dosage thereof may vary depending on factors such as the formulation method, administration method, age, body weight, sex, And can be easily changed and used by a person having ordinary skill in the art according to the factors of.
  • Oxidation of the individual can be prevented by administering the composition according to the invention to the individual.
  • Brown goat larvae which had been preserved and removed the fatty components, were concentrated using a rotary vacuum concentrator and lyophilized.
  • Saccharomyces S. cerevisiae strain (KCTC 17299) was purchased from the Korean Cell Line Bank for the third time.
  • the peptone in the composition of yeast peptone dextrose (YPD) medium 1000 mL was replaced with peptone, and the powdered brown dung larvae powder was used, and the subcultured Saccharomyces cerevisiae cerevisiae strain (KCTC 17299) was inoculated in an amount of 10 ⁇ l and fermented at 25 ⁇ C for 72 hours at a stirring speed of 100 rpm.
  • the fermented brown dung larva fermentation broth was subjected to reflux extraction by four methods such as hot water, cold water, 70% alcohol and 70% ethanol.
  • test group 1 1 L of brown goat larva fermentation broth was added with 1 L of water, followed by hot water extraction at 80 ° C. Separation of supernatant and precipitate was repeated twice for 2 hours.
  • test group 2 1 L of brown goat larva fermentation broth was added with 1 L of water
  • test group 3 was extracted with 1 L of brown goat larva fermentation broth instead of water at room temperature
  • test group 4 1 L of brown goat larva fermentation broth was replaced with 70%
  • Test group 5 was extracted by the same method as hot water extraction with 1 L of brown goat larva fermentation broth using water instead of water.
  • the obtained extracts, the fermentation broth, and the culture broth were filtered using a Wattman No. 2 paper filter, and then concentrated using a rotary vacuum concentrator.
  • the concentrated samples were filtered using a sterile membrane filter (0.45 ⁇ m) and stored at -80 ° C.
  • Figure 1 is a schematic representation of a process for the production of a brown gruel fermented extract.
  • the total tannin content was determined by adding 2 mL of vanillin dissolved in H 2 SO 4 solution to 1 mL of the diluted sample. The absorbance was measured at 500 nm after being left for 15 minutes. The total standard tannin content of the extract was expressed as ⁇ g TE (Tannin equivalent) / g after the standard calibration curve was prepared using tannin as a reference material.
  • the total amount of polyphenol was determined by adding 75 ⁇ l of distilled water and 25 ⁇ l of Folin-Ciocalteu phenol reagent reagent to 25 ⁇ l of the sample diluted in distilled water, reacting for 6 minutes, adding 100 ⁇ l of saturated solution Na 2 CO 3 , After the absorbance was measured at 765 nm, the content of polyphenol was calculated by comparing the absorbance of the standard curve with a standard curve of gallic acid.
  • the total flavonoid content was 1.25 mL and 75 ⁇ l of 5% NaNO 2 solution was added and left for 5 minutes. 150 ⁇ l of a 10% AlCl 3 .6H 2 O solution was added and the mixture was allowed to stand for 6 minutes. 500 ⁇ l of 1 M NaOH and 275 ⁇ l of distilled water were added to the reaction solution, and the absorbance at 510 nm was measured. After the standard calibration curve was prepared using catechin as the reference material, the total flavonoid content of the extract was expressed in ⁇ g CE (catechin equivalent) / g.
  • KCTC 17299 a fermentation broth fermented by inoculating Saccharomyces cerevisiae strain (KCTC 17299) subcultured in a yeast peptone dextrose (YPD) medium was used, and as a comparative group 2 Brown goat larva fermentation broth was used without further extraction.
  • YPD yeast peptone dextrose
  • GAE is the milligrams gallic equivalent per gram
  • QE is the milligram quercetin equivalent per gram
  • CE is the milligram tannin equivalent per gram.
  • the electron donating ability was measured by the Blois method. 60 ⁇ l of 0.45 mM 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazide (DPPH) was added to 120 ⁇ l of each sample solution, left for 15 minutes, and absorbance was measured at 517 nm. The electron donating ability was expressed by the absorbance reduction rate of the sample solution addition group and the no addition group.
  • DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazide
  • FIG. 2 is a graph showing the results of measurement of the electron donating ability of the brown goat fermentation extract.
  • FIG. Where 1 is the comparison group 1, 2 is the comparison group 2, 3 is the test group 1, 4 is the test group 2, 5 is the test group 3, 6 is the test group 4, , And 8 represents vitamin C (ascorbic acid) as a positive control.
  • the electron donating ability tended to increase with increasing concentration of test group, and the highest activity was observed in the brown goat fermented hot water extract (Test group 1) and 70% alcohol extract (test group 5) And also showed very good electron donating ability when compared to the positive control group.
  • the concentration of 1000 ⁇ g / mL the same activity as the 10 ⁇ g / mL concentration of the positive control vitamin C was shown by the brown goat fermented hot water extract (test group 1) and 70% alcohol extract (test group 5).
  • other brown goat fermented extracts showed higher activity than the fermentation broth.
  • Antioxidant activity using ABTS radical was measured by ABTS + cation decolorization assay. After mixing ABTS + with 7 mM 2,2-azino-bis (3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid) and 2.45 mM potassium persulfate, the mixture was allowed to stand at room temperature for 24 hours to form ABTS + 100 ⁇ l of the sample was added and left for 7 minutes, and the absorbance was measured at 734 nm.
  • FIG. 3 shows the results of ABTS cation radical scavenging ability of brown goat fermented extract Fig.
  • 1 is the comparison group 1
  • 2 is the comparison group 2
  • 3 is the test group 1
  • 4 is the test group 2
  • 5 is the test group 3
  • 6 is the test group 4
  • And 8 represents vitamin C (ascorbic acid) as a positive control.
  • the cation radical scavenging ability tended to increase with increasing concentration in all samples, and showed excellent electron donating ability even when compared with the positive control group.
  • the efficacy of the fermentation broth and fermented extract was higher than that of the strain.
  • Fe3 + ⁇ Fe2 + reduction power was measured by modifying Oyaizu's method. 1 mL of each sample was added with 1 mL each of 200 mM phosphate buffer solution (pH 6.6) and 1% potassium ferricyanide, and the mixture was reacted for 20 minutes in a water bath at 50 ° C. Then, 1 mL of 10% TCA solution Followed by centrifugation at 13,500 xg for 15 minutes. The supernatant was then mixed with 1 mL of distilled water and ferric chloride, respectively, and absorbance was measured at 700 nm.
  • the Fe 3 + reducing power tended to increase with increasing concentration
  • 70% ethanol extract (bulk) (test group 5) Showed a slightly higher reducing power.
  • hot water and alcohol extracts showed about twice the reducing power than the fermented water.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of FRAP analysis of a brown duck fermented extract of a brown duck fermented extract.
  • 1 is the comparison group 1
  • 2 is the comparison group 2
  • 3 is the test group 1
  • 4 is the test group 2
  • 5 is the test group 3
  • 6 is the test group 4
  • And 8 represents vitamin C (ascorbic acid) as a positive control.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of measurement of Cu 2 + reducing power (CUPRAC) of a brown goat fermented extract of a brown goat fermentation extract.
  • CUPRAC Cu 2 + reducing power
  • the reducing power of Cu 2 + reductase was increased as the concentration increased.
  • the fermented product and the fermented product were highly active at a concentration of 1000 ⁇ g / mL. 70% of the extracts from the fermented extract showed a slightly higher reducing power. Also, it showed higher reducing power than 100 ⁇ g / mL when compared with the positive control group, vitamin C.
  • Fe 2 + chelation measurement Dinis et al. (1994) was modified and measured.
  • To 0.4 mL of the sample was added FeCl 2 solution (0.1 mL, 0.6 mM) and bipyridyl solution (0.1 mL, 5 mM) in that order, reacted for 10 min, and absorbance was measured at 562 nm.
  • FIG. 7 is a graph showing the measurement results of Fe 2 + chelation of a brown goat fermented extract of a brown goat fermentation extract.
  • FIG. Where 1 is the comparison group 1, 2 is the comparison group 2, 3 is the test group 1, 4 is the test group 2, 5 is the test group 3, 6 is the test group 4, And 8 represents EDTA as a positive control.
  • Amino acid analysis was analyzed by HPLC (Agilent Technologies 1200 Series FLD) after digestion and derivatization according to the method of Daniel and Steven. Put 0.5 g of sample in a test tube, add 10 mL of 6 N HCl, and dissolve the test tube to make an ampoule. After sealing, autoclave is hydrolyzed at 110 ° C for 24 hours. Break the ampoule and filter it with filter paper. Concentrate under reduced pressure and use 5 mL of 20 mM HCl. After filtration with a 0.45- ⁇ m membrane filter, a certain amount of the filtrate was collected and analyzed by HPLC using AccQ-Tag reagent. The content was calculated by an external standard method using an integrator. The analysis conditions are shown in Table 2 below, and the results are shown in Table 3.
  • Free amino acid analysis was performed by Ohara and Ariyosh 's method. In other words, 25 mg of sulfa salicylic acid was added to 10 mL of the filtrate obtained by treating 5 g of the sample in the same manner as the pretreatment per glass, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 4 hours and centrifuged (50,000 rpm, 30 min) The supernatant was filtered through a 0.45 ⁇ m membrane filter, and a certain amount of the filtrate obtained was subjected to derivatization using AccQ-Tag reagent and analyzed by HPLC. The content was calculated by an external standard method based on an integrator. The analysis conditions were the same as the constituent amino acids. The results are shown in Table 4 below.
  • the brown duck fermented extract of the present invention has an effect of increasing and changing the total polyphenols, flavonoids, tannins, and essential amino acid contents, producing brown duck larvae yeast protein, and increasing antioxidant activity. Therefore, the composition can be used as an antioxidant composition containing the fermented extract of brown gourd according to the present invention.

Abstract

본 발명은 갈색거저리 발효 추출물 및 이를 함유하는 항산화용 조성물에 관한 것으로, 갈색거저리 유충을 유기용매로 추출하여 갈색거저리 유충에 함유된 유지 및 지방 성분을 제거한 다음 동결건조하고, 효모 균주를 이용하여 발효시키고 물 또는 유기용매를 이용하여 추출하여 수득된 것을 특징으로 하는 본 발명의 갈색거저리 발효 추출물은 총 폴리페놀, 플라보노이드, 탄닌 및 필수구성 아미노산 함량이 증가 및 변화되고, 갈색거저리 유충 이용 효모단백질이 생성되며, 항산화 활성이 증대되는 효과가 있다. 따라서, 본 발명에 따른 갈색거저리 발효 추출물을 포함하는 항산화용 조성물로서 이용될 수 있다.

Description

갈색거저리 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 조성물
본 발명은 갈색거저리 발효 추출물을 함유하는 항산화용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 갈색거저리의 유지 및 지방성 성분을 탈지시킨 다음 효모를 이용하여 발효시켜 제조된 총 폴리페놀, 플라보노이드, 탄닌 및 필수구성 아미노산 함량이 증대된 갈색거저리 발효 추출물 및 이를 유효성분으로 함유하는 항산화용 화장료, 약학적 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
사람의 피부는 각질층을 포함하는 표피와 진피, 그리고 결합조직으로 구성되어 있는데, 그 중 각질층은 표피(epidermis)의 기저세포인 케라티노사이트(keratinocyte)의 분화과정을 통해 형성되는 죽은 세포층으로 구성되어 있고 인체를 외부환경의 영향으로부터 보호해주는 역할을 담당하고 있다. 이러한 피부에서의 노화의 원인에 대해서는 크게 두 가지로 연구되고 있는데, 하나는 "내적 노화"로서 연령의 증가에 따른 피부의 구성단위인 세포의 기능변화에 기인한 것이고, 다른 하나는 "외적 노화"로서 외부 환경 즉 자외선, 공해, 스트레스 등에 의한 것으로 나눌 수 있다.
피부의 세포는 생체 내에서 필요한 에너지 공급을 위해 인간의 생체 내에서 필요한 에너지 공급을 위해 끊임없이 일어나는 생화학 반응에서 발생하는 활성산소종에 의해 산화적 스트레스가 가해지게 되면, 세포 구성 성분들인 지질, 단백질, 탄수화물과 DNA 산화적 손상 및 효소활성을 변화시켜 피부암 등의 각종 질병을 일으키는 원인이 되며, 노화를 촉진시킨다. 아울러 외적 노화의 원인 중에서 가장 큰 부분을 차지하고 있는 것은 자외선에 의한 광노화로서 UV에 지속적인 노출을 통해 피부암 등의 급성 및 만성적인 피부의 상해가 유발된다.
생체 외부로부터 유입되거나, 생체 내에서 발생하는 활성 산소는 생체의 노화를 촉진시키거나, 암을 발생시키는 등 많은 문제의 원인이 된다. 따라서 활성 산소에 의한 산화를 억제하는 항산화 물질에 대한 개발 및 연구가 많이 이루어지고 있다. 항산화 물질은 동, 식물계에 널리 분포되어 있으며 과일과 채소에 많은 페놀성화합물, 플라보노이드, 토코페롤, 비타민 C, 셀레늄 등이 알려져 있다. 다만, 천연에 존재하는 항산화 물질은 피부 적용 시 실질적으로 충분한 효과를 기대할 수 없는 실정이다. 따라서, 항산화력이 뛰어나고 가격이 저렴한 합성 항산화제가 많이 사용되고 있으나, 인체 부작용 등 안전성에 대한 우려로 그 사용이 제한된다.
따라서, 화장품 분야 및 식품 분야에서는 항산화 효과를 가지는 기능성 제품에 대한 연구 및 개발이 활발하게 진행되고 있으며, 특히 피부에 독성이나 자극을 주지 않기 위하여 천연 물질을 이용한 연구가 계속되고 있다.
한편, "갈색거저리(Tenebrio molitor)"는 딱정벌레목 거저리과의 곤충으로, 몸길이는 약 15mm정도이며, 어두운 갈색이며 광택이 난다. 갈색거저리의 유충은 밀웜(mealworm)이라 하여 먹이곤충이나 애완용으로 많이 사육하는데, 밀웜이 애완용으로 이용되는 이유는 변태기간이 비교적 짧아 곤충을 쉽게 체험할 수 있고 곡식을 먹이로 하는 매우 청결한 곤충이기 때문이다. 유충은 번데기가 되기까지 먹이와 온도에 따라 9-20번 탈피한다. 번데기가 되고 2∼3주가 지나면 성충으로 우화하며 처음으로 우화할 때에는 연한 갈색이나 점차 검게 변한다. 성충은 야행성으로 낮에는 구멍 속에 숨어 지내다가 밤에 활동한다. 주로 인가 근처의 곡식부대 속에서 유충으로 월동하다가 봄에 번데기와 성충으로 변태한다.
이러한 갈색거저리는 곤충 중에서 단백질 함량이 제일 높고 지방함량이 낮아 단백질 보급원으로 매우 효과적이라는 보고가 있으며, 특히 항암물질들과 함께 간암세포주에 처리되었을 때 증대되는 항암활성을 나타낸다고 알려져 있다.
이러한 갈색거저리와 관련된 식품특허로서 대한민국 특허등록 제10-1752253호에는 갈색거저리를 이용한 곤충어묵 조성물 및 이의 제조방법이 개시되어 있으며, 대한민국 특허등록 제10-1746111호에는 갈색거저리를 이용한 연하식품 및 이의 제조방법을 기술하고 있으며, 갈색거저리의 용도와 관련된 특허로서는 대한민국 특허등록 제10-1651908호에서 갈색거저리 유충 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 예방 또는 치료용 조성물을 기술하고 있으며, 대한민국 특허공개 제 10-2016-0041110호에서는 갈색거저리의 현탁액을 유효성분으로 포함하는 류마티스 관절염 예방 또는 치료용 조성물을 개시하고 있으며, 대한민국 특허공개 제10-2014-0134331호에서는 갈색거저리 유충의 추출물 또는 갈색거저리 유충의 현탁액을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 또는 치료용 조성물을 개시하고, 대한민국 특허공개 제10-2015-0050712호에서는 갈색거저리 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 기술하고 있으며, 대한민국 특허등록 제10-1424125호는 갈색거저리 유충을 포함하는 염증성 질환 치료용 조성물을 보고하였으며, 대한민국 특허등록 제10-1404566호는 갈색거저리 추출물을 포함하는 치매 예방 또는 치료용 조성물을 보고한 바 있다.
그러나, 아직까지 갈색거저리를 이용한 항산화 효과에 관해서는 보고된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 항산화 효과를 가지면서 인체 부작용이 적은 새로운 천연물질을 개발하기 위해 계속 연구를 진행한 결과, 갈색거저리 발효 추출물이 세포 독성이 없으면서도 우수한 항산화 효과를 나타낸다는 사실을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 항산화 효과를 가지면서 인체 안정성이 우수한 물질을 제공하기 위한 것이다.
상기한 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 갈색거저리 유충을 유기용매로 추출하여 갈색거저리 유충에 함유된 유지 및 지방 성분을 제거한 다음 동결건조하고, 효모 균주를 이용하여 발효시키고 물 또는 유기용매를 이용하여 추출하여 수득된 것을 특징으로 하는 총 폴리페놀, 플라보노이드, 탄닌 및 필수구성 아미노산 함량이 증대된 갈색거저리 발효 추출물을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 상기 갈색거저리 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화용 조성물을 제공한다.
바람직하게, 본 발명에서 갈색거저리 발효 추출물을 포함하는 조성물은 화장료 조성물, 약학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 갈색거저리 발효 추출물은 총 폴리페놀, 플라보노이드, 탄닌 및 필수구성 아미노산 함량이 증가 및 변화되고, 갈색거저리 유충 이용 효모단백질이 생성되며, 항산화 활성이 증대되는 효과가 있다. 따라서, 본 발명에 따른 갈색거저리 발효 추출물을 포함하는 항산화용 조성물로서 이용될 수 있다.
도 1은 갈색거저리 발효 추출물의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 2는 갈색거저리 발효 추출물의 전자공여능 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 갈색거저리 발효 추출물의 ABTS 양이온 라디칼 소거능 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 갈색거저리 발효 추출물의 Fe3 + 환원력 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 갈색거저리 발효 추출물의 갈색거저리 발효 추출물의 FRAP 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 갈색거저리 발효 추출물의 갈색거저리 발효 추출물의 Cu2 + 환원력(CUPRAC) 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 갈색거저리 발효 추출물의 갈색거저리 발효 추출물의 Fe2 + 킬레이트화 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명에서는 갈색거저리 유충을 유기용매로 추출하여 갈색거저리 유충에 함유된 유지 및 지방 성분을 제거한 다음 동결건조하고, 효모 균주를 이용하여 발효시키고 물 또는 유기용매를 이용하여 추출하여 수득된 것을 특징으로 하는 총 폴리페놀, 플라보노이드, 탄닌 및 필수구성 아미노산 함량이 증대된 갈색거저리 발효 추출물을 제공한다.
또한, 본 발명에서는 상기 갈색거저리 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화용 조성물을 제공한다.
바람직하게, 본 발명에서 갈색거저리 발효 추출물을 포함하는 조성물은 화장료 조성물, 약학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다.
본 발명에 있어서, "갈색거저리 발효 추출물"은 갈색거저리 유충을 유기용매를 이용하여 추출하여 갈색거저리 유충에 함유된 유지 및 지방 성분을 제거한 다음 동결건조하고, 효모 균주를 이용하여 발효시킨 다음 물 또는 유기 용매를 이용하여 추출함으로써 수득될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시양태에 따르면, 상기 갈색거저리에 함유된 유지 및 지방 성분 제거는 유기용매 예를 들어, 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매를, 바람직하게는 헥산을 이용하여 20 내지 30 시간, 바람직하게는 23 내지 25시간 추출하여 수행될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시양태에 따르면, 상기 발효는 유지 및 지방 성분이 제거된 갈색거저리 유충에 효모 균주를 접종한 다음 20 내지 30℃, 바람직하게는 23 내지 27℃에서 60 내지 80 시간, 바람직하게는 70 내지 75 시간 동안 배양하는 것이다. 발효 온도가 20℃ 미만인 경우에는 발효가 충분히 일어나지 않거나 발효에 오랜 시간이 소요되므로 비효율적이고, 발효 온도가 30℃ 초과하는 경우 효모 균주의 활성이 저하될 수 있어 발효가 충분히 일어나지 않을 수 있다. 또한 발효 시간이 60시간 미만인 경우에는, 갈색거저리의 발효가 충분히 일어나지 않아 제조된 갈색거저리 발효 추출물이 항산화 효과를 충분히 발휘할 수 없으며, 발효 시간이 80시간을 초과하는 경우에는, 그 이하의 시간 동안 발효하는 것과 발효 효율에 차이가 없어 비경제적이다.
상기 효모 균주는 예를 들어 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주, 사카로마이세스 엘립소이데우스(S. ellipsoideus), 사카로마이세스 오베야누스(S. eubayanus), 사카로마이세스 파스토리아누스(S. pastorianus), 사카로마이세스 플로렌티누스(S. florentinus) 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주를 사용한다.
본 발명의 구체적인 실시양태에 따르면, 상기 갈색거저리 발효물의 추출은 물 또는 유기용매, 예를 들어 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 열수, 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등의 방법으로 수행할 수 있으며, 구체적으로 본 발명에서는 갈색거저리 발효물을 물 또는 60 내지 100% 주정을 이용하여 가열, 비가열 또는 냉침 추출할 수 있다.
또한, 상기 갈색거저리 발효 추출물은 상기 추출용매에 의하여 추출하는 방법 외에 통상적인 정제과정을 거쳐서도 수득할 수 있다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제방법을 통해 얻어진 분획을 통하여서도 갈색거저리 발효 추출물을 수득할 수 있다.
본 발명의 갈색거저리 발효 추출물은 추출, 분획, 또는 정제(분리, 분획)의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획, 정제물, 그들의 희석액, 농축액, 또는 건조물일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 발명의 조성물에는 갈색거저리 발효 추출물이 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 0.005 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30 중량%, 가장 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%로 포함할 수 있다. 이 때 갈색거저리 발효 추출물의 함량이 0.005 중량% 미만일 경우 본 발명의 목적효과인 항산화 효과를 수득할 수 없으며, 50 중량%를 초과할 경우 함량의 증가에 따라 효과가 비례적이지 않아 비효율적일 수 있으며 제형상의 안정성이 확보되지 않는 문제점이 있다.
본 발명의 갈색거저리 발효 추출물을 함유하는 조성물은 항산화 효과를 나타내며, 천연 물질로서 세포독성이 거의 없다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 갈색거저리 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 화장료 조성물에는 유효성분으로서의 갈색거저리 발효 추출물 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 첨가되는 성분, 예컨대 항산화제, 안정화제, 가용화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 추가로 첨가할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트 검, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 가용화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 검등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 갈색거저리 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 갈색거저리 발효 추출물 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여, 보다 바람직하게는 도포에 의한 국부 투여(topical application) 방식으로 적용된다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg 범위 내이다. 또한 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1.0 내지 3.0 ml의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속 하는 것이 좋다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 당분야의 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑시르제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 하나의 구현예에 따르면, 갈색거저리 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물에는 유효성분으로서 갈색거저리 발효 추출물뿐만 아니라 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 본 발명의 갈색거저리 발효 추출물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
한편, 본 발명의 갈색거저리 발효 추출물은 천연물질로서 인체에 무해하며, 독성 및 부작용이 거의 없으므로 장기간 사용시에도 안심하고 사용할 수 있으며, 특히 상기한 바와 같은 화장료, 약학적 및 식품 조성물에 안전하게 적용할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 갈색거저리 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 산화를 방지하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서,“개체”는 본 발명의 상기 조성물을 투여하여 산화를 방지하고자 하는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 돼지, 양, 개, 고양이, 랫드, 마우스, 침팬지 등의 포유동물을 의미한다.
상기 투여는 비경구 투여, 바람직하게는 연고제, 로션제, 스프레이제, 젤 등의 도포에 의한 국부 투여이며, 이의 투여량 등은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태 등의 요인에 따라 당업계의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 변경하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 조성물을 개체에 투여함으로써 개체의 산화를 방지할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 갈색거저리 발효 추출물 제조
(1) 갈색거저리에 함유된 지방성분 제거
갈색거저리 유충을 헥산을 이용하여 24℃에서 24시간 동안 3회 반복 추출하고 와트만 여과지(Wattman No.2 paper filter)로 여과하여 유지 및 지방성 성분을 분리하였다. 유지 및 지방성 성분이 제거된 갈색거저리 유충을 회전진공농축기를 이용하여 농축 후 동결건조하였다.
(2) 발효
상기 유지 및 지방성 성분이 제거된 갈색거저리 유충을 분말화하였다.
사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주 (KCTC 17299)를 한국세포주 은행에서 분양을 받아 3차 계대하였다.
효모 펩톤 덱스트로스(Yeast peptone dextrose, YPD) 배지(1000 mL)의 조성 중 펩톤(peptone)을 대체하여 상기 분말화된 갈색거저리 유충 분말을 사용하고, 계대배양된 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주 (KCTC 17299)를 10㎕의 양으로 접종하여 25℃에서 교반속도 100 rpm으로 72시간 동안 발효시켰다.
(3) 추출
상기 발효된 갈색거저리 유충 발효액을 열수, 냉침, 70% 주정 가열 및 70% 주정 비가열과 같은 4가지 방법으로 환류 추출하였다.
시험군 1은 갈색거저리 유충 발효액 1L에 물 1L를 가하여 80℃에서 열수 추출하고 상등액과 침전물을 분리하여 2시간씩 2회 반복 추출하였으며, 시험군 2는 갈색거저리 유충 발효액 1L에 물 1L를 가하여 4℃에서 냉침 추출하고 12시간씩 2회 추출하였고, 시험군 3은 갈색거저리 유충 발효액 1L에 물대신 70% 주정을 사용하여 상온에서 추출하였으며, 시험군 4는 갈색거저리 유충 발효액 1L에 물대신 70% 주정을 사용하여 열수 추출과 동일한 방법으로 추출하였으며, 시험군 5는 갈색거저리 유충 발효액 1L에 물대신 주정을 사용하여 열수 추출과 동일한 방법으로 추출하였다.
상기 각각 수득된 추출물들과 발효액, 균주배양액은 와트만 여과지(Wattman No. 2 paper filter)를 이용하여 여과한 다음 회전진공농축기를 이용하여 농축하였다. 농축된 시료들을 멸균막 필터 (0.45㎛)를 이용하여 여과한 후 -80℃에서 보관하였다.
도 1은 갈색거저리 발효 추출물의 제조공정을 도식화한 것이다.
하기 모든 실험은 3반복으로 측정하여 측정치를 평균값±표준편차로 나타내었으며 실험 결과의 통계적 유의성은 Student's t-test로 하였으며 p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판단하였다.
<시험예 1> 갈색거저리 발효 추출물의 유효성분 함량 측정
(1) 축합형 탄닌 함량 측정
총 탄닌 함량은 증류수에 희석한 시료 1mL에 H2SO4용액에 녹인 바닐린(Vanillin) 2mL를 가하고 15분 동안 방치한 후 500nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 탄닌(tannin)을 사용하여 표준 검량선을 작성 후 추출물의 총 탄닌 함량은 μg TE (Tannin equivalent)/g으로 나타내었다.
(2) 총 폴리페놀 함량 측정
총 폴리페놀 정량은 증류수에 희석한 시료 25㎕에 증류수 75㎕와 Folin-Ciocalteu phenol reagent 시약 25㎕를 가하고, 6분간 반응시킨 뒤 포화용액 Na2CO3 100㎕를 가하여 혼합한 후 90분간 실온에서 방치하고, 765nm에서 흡광도를 측정한 후, 표준물질인 갈산(gallic acid)으로 미리 작성한 표준곡선의 흡광도 값과 비교하여 폴리페놀 함량을 산출하였다.
(3) 총 플라보노이드 함량 측정
총 플라보노이드 함량은 1.25 mL를 가하고 5% NaNO₂용액 75 ㎕를 넣고 5분간 방치하였다. 10% AlCl3·6H2O용액 150 ㎕를 가하고 다시 6분간 방치하였다. 위 반응액에 1M NaOH 500 ㎕와 증류수 275 ㎕를 가한 후 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질은 카테킨(catechin)을 사용하여 표준 검량선을 작성한 후 추출물의 총 플라보노이드 함량은 μg CE(catechin equivalent)/g로 나타내었다.
그 결과는 하기 표 1에 나타내었다. 비교군 1로서 효모 펩톤 덱스트로스(Yeast peptone dextrose, YPD) 배지에 계대배양된 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주 (KCTC 17299)를 접종하여 발효시킨 발효액을 사용하였으며, 비교군 2로서 갈색거저리 유충 발효액을 추가의 추출 없이 사용하였다.
Figure PCTKR2018012753-appb-T000001
상기 표 1에서, GAE는 그램 당 밀리그램 갈산 당량이고, QE는 그램 당 밀리그램 퀘르세틴 당량이고, CE는 그램 당 밀리그램 탄닌산 당량이다.
상기 표 1에서 보듯이, 총 폴리페놀, 플라보노이드, 축합형 탄닌 함량을 측정한 결과, 발효물을 추출하는 방법에 있어서는 주정을 이용하는 것이 가장 회수율이 높음을 확인할 수 있었다.
<시험예 2> 갈색거저리 발효 추출물의 전자공여능 측정
전자공여능(EDA; electron donating ability)은 Blois의 방법을 응용하여 측정하였다. 각 시료용액 120㎕에 0.45mM의 1,1-디페닐-2-피크릴하이드라질 (DPPH) 60㎕를 넣고 15분간 방치한 다음 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 감소율로 나타내었다.
Figure PCTKR2018012753-appb-M000001
도 2는 갈색거저리 발효 추출물의 전자공여능 측정 결과를 나타낸 그래프이다. 여기에서, 1은 비교군 1이고, 2는 비교군 2이고, 3은 시험군 1이고, 4는 시험군 2이고, 5는 시험군 3이고, 6은 시험군 4이고, 7은 시험군 5이고, 8은 양성 대조군으로서 비타민 C(아스코브산)을 나타낸다.
도 2에서 보듯이, 시험군 농도가 증가할수록 전자공여능이 증가하는 경향을 나타내었고 갈색거저리 발효 열수 추출물(시험군 1)과 70% 주정 추출물(bulk)(시험군 5)이 가장 높은 활성을 나타내었으며, 또한 양성 대조군에 비교해 보았을 때도 매우 우수한 전자공여능을 나타내었다. 특히 1000㎍/mL 농도에서 양성대조군인 비타민 C의 10㎍/mL 농도와 동일한 활성을 갈색거저리 발효 열수 추출물(시험군 1)과 70% 주정 추출물(bulk)(시험군 5)이 나타내었다. 또한, 다른 갈색거저리 발효 추출물들도 발효액 보다 높은 활성을 나타내었다.
<시험예 3> 갈색거저리 발효 추출물의 ABTS 양이온 라디칼 소거능 측정
ABTS 라디칼을 이용한 항산화력 측정은 ABTS+ 양이온 탈색 분석(decolorization assay)에 의하여 측정하였다. 7mM 2,2-아지노-비스(3-에틸-벤티아졸린-6-술폰산)와 2.45mM 과황산칼륨을 혼합하여 실온에서 24시간 동안 방치하여 ABTS+을 형성시킨 후 에탄올로 희석하여 ABTS+ 100㎕에 시료 100㎕를 가하여 7분 동안 방치한 후 734nm에서 흡광도를 측정하였다.
Figure PCTKR2018012753-appb-M000002
도 3은 갈색거저리 발효 추출물의 ABTS 양이온 라디칼 소거능 측정 결과를 나타낸 그래프이다. 여기에서, 1은 비교군 1이고, 2는 비교군 2이고, 3은 시험군 1이고, 4는 시험군 2이고, 5는 시험군 3이고, 6은 시험군 4이고, 7은 시험군 5이고, 8은 양성 대조군으로서 비타민 C(아스코브르산)을 나타낸다.
도 3에서 보듯이, 모든 시료에서 농도가 증가할수록 양이온 라디칼 소거능이 증가하는 경향을 나타내었고 양성 대조군에 비교해 보았을 때도 매우 우수한 전자공여능을 나타내었다. 또한 균주보다 발효액 및 발효 추출물의 효능이 더 높음을 확인 할 수 있었다.
<시험예 4> 갈색거저리 발효 추출물의 Fe3 + 환원력 측정
Fe3+ → Fe2+ 환원력의 측정은 Oyaizu의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 1 mL에 200 mM 인산 완충액(pH 6.6) 및 1%의 페리시안화 칼륨(potassium ferricyanide)을 각각 1 mL씩 차례로 가하여 교반한 후 50℃의 수욕 상에서 20분간 반응시킨 뒤, 10% TCA 용액 1 mL 가하여 13,500Xg에서 15분간 원심분리하였다. 그 후 상등액 증류수 및 염화제2철을 각각 1 mL씩 혼합하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 4는 갈색거저리 발효 추출물의 Fe3 + 환원력 측정 결과를 나타낸 그래프이다. 여기에서, 1은 비교군 1이고, 2는 비교군 2이고, 3은 시험군 1이고, 4는 시험군 2이고, 5는 시험군 3이고, 6은 시험군 4이고, 7은 시험군 5이고, 8은 양성 대조군으로서 비타민 C(아스코브르산)을 나타낸다.
도 4에서 보듯이, 농도가 증가할수록 Fe3 + 환원력이 증가하는 경향을 나타내었고 갈색거저리 발효 추출물 중 주정을 사용한 것이 높은 활성을 나타내었으며, 그 중에서도 70% 주정 추출물(bulk)(시험군 5)이 조금 더 높은 환원력을 나타내었다. 1000㎍/mL 농도에서 발효물보다 열수 및 주정 추출물들이 약 2배의 환원력을 나타내었다.
<시험예 5> 갈색거저리 발효 추출물의 FRAP 분석
300 mM 아세테이트 완충액(pH 3.6), 40 mM HCl에 용해한 10 mM TPTZ (2,4,6-tripyridyl-S-triazine) 용액 및 20 mM FeCl3·6H2O를 각각 10:1:1(v/v/v)의 비율로 미리 혼합한 다음 37℃ 수욕상에서 가온한 것을 사용하였다. 추출물 100 ㎕를 차례로 혼합하여 37℃에서 4분간 반응시킨 후 UV 분광계를 사용하여 593nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 5는 갈색거저리 발효 추출물의 갈색거저리 발효 추출물의 FRAP 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 여기에서, 1은 비교군 1이고, 2는 비교군 2이고, 3은 시험군 1이고, 4는 시험군 2이고, 5는 시험군 3이고, 6은 시험군 4이고, 7은 시험군 5이고, 8은 양성 대조군으로서 비타민 C(아스코브르산)을 나타낸다.
도 5에서 보듯이, Fe3 +의 환원력을 다른 방법으로 측정한 결과 Fe3 +→Fe2 + 환원력과 유사한 활성 패턴을 나타내었다. 농도가 증가할수록 환원력이 증가하는 경향을 나타내었고 갈색거저리 발효 추출물 중 주정을 사용한 것이 높은 활성을 나타내었으며, 1000㎍/mL 농도에서 발효물보다 주정 추출물들이 약 2배의 환원력을 나타내었다. 이전 방법과는 다르게 열수 추출물에서는 발효물과 유사한 활성을 나타내었다.
<시험예 6> 갈색거저리 발효 추출물의 Cu2 + 환원력(CUPRAC) 측정
환원력의 측정은 Apak et al. (2006)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 0.25 mL에 CuCl2 용액(0.25 mL, 0.01 M), 에탄올 네오크프로인 용액(ethanolic neocuproine solution) (0.25 mL, 7.5 X 103M) 및 NH4Ac 완충액 (0.25 mL,1.0 M), H2O 1mL을 차례로 가하여 30분간 반응 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 6은 갈색거저리 발효 추출물의 갈색거저리 발효 추출물의 Cu2 + 환원력(CUPRAC) 측정 결과를 나타낸 그래프이다. 여기에서, 1은 비교군 1이고, 2는 비교군 2이고, 3은 시험군 1이고, 4는 시험군 2이고, 5는 시험군 3이고, 6은 시험군 4이고, 7은 시험군 5이고, 8은 양성 대조군으로서 비타민 C(아스코브르산)을 나타낸다.
도 6에서 보듯이, Cu2 + 환원력을 측정한 결과 농도가 증가할수록 환원력이 증가하는 경향을 나타내었고 갈색거저리 발효 추출물 중 주정을 사용한 것이 높은 활성을 나타내었으며, 1000 ㎍/mL 농도에서 발효물 및 발효추출물 보다 70% 주정 추출물(bulk)이 조금 더 높은 환원력을 나타내었다. 또한 양성대조군인 비타민 C와 비교하였을 때 100㎍/mL의 농도보다 높은 환원력을 나타내었다.
<시험예 7> 갈색거저리 발효 추출물의 Fe2 + 킬레이트화(chelating) 평가
Fe2 + 킬레이트화 측정은 Dinis et al. (1994)의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 0.4 mL에 FeCl2 용액 (0.1 mL, 0.6 mM), 바이피리딜 용액 (0.1 mL, 5mM)을 차례로 가하여 10분간 반응 후 562 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 7은 갈색거저리 발효 추출물의 갈색거저리 발효 추출물의 Fe2 + 킬레이트화 측정 결과를 나타낸 그래프이다. 여기에서, 1은 비교군 1이고, 2는 비교군 2이고, 3은 시험군 1이고, 4는 시험군 2이고, 5는 시험군 3이고, 6은 시험군 4이고, 7은 시험군 5이고, 8은 양성 대조군으로서 EDTA을 나타낸다.
도 7에서 보듯이, Fe2 + 킬레이트화의 효과는 미비하게 나타났다. 이는 환원력과 반대되는 경향을 주로 나타냄으로 환원력 및 라디칼 소거능에 특화된 효능을 나타다고 예상하게 한다.
<시험예 8> 아미노산 분석
(1) 구성 아미노산 분석
아미노산 분석은 Daniel과 Steven의 방법에 따라 분해 및 유도체화 과정을 거친 후 HPLC(Agilent Technologies 1200 Series FLD)로 분석하였다. 시료 0.5 g을 시험관에 넣고 6 N-HCl 10 mL를 넣은 후 시험관 끝을 불러 녹여 앰플로 만들어 밀봉 후 오토클레이브 110℃에서 24시간 가수분해시킨 후 앰플을 깨고 여과지로 여과화면서 메탄올 50 mL로 정용하여 감압농축하여 20 mM HCl 5 mL로 정용한다. 0.45 μm 막여과기로 여과하여 얻은 여액을 일정량 취한 후 AccQ-Tag 시약을 사용하여 유도체화 시킨 후 HPLC로 분석하였다. 함량은 인테그래이터(integrator)에 의한 외부표준법으로 계산하였고 분석조건은 하기 표 2에 나타내었으며, 그 결과는 표 3에 나타내었다.
Figure PCTKR2018012753-appb-T000002
Figure PCTKR2018012753-appb-T000003
(2) 유리 아미노산 분석
유리 아미노산 분석은 유리당 정량과 같은 방법으로 얻은 여액을 Ohara와 Ariyosh의 방법으로 분석하였다. 즉 시료 5 g을 유리당 전처리 방법과 같이 처리한 여액 10 mL에 설파살리실산(sulfa salicylic acid) 25 mg을 첨가하여 4℃에서 4시간 동안 방치시킨 후 원심분리(50,000 rpm, 30 min)하여 단백질 등을 제거하고, 상층액을 0.45 ㎛ 막여과기로 여과하여 얻은 여액을 일정량 취하여 AccQ-Tag 시약을 사용하여 유도체화 시킨 후 HPLC로 분석하였다. 함량은 인테그래이터(integrator)에 의한 외부표준법으로 계산하였고 분석조건은 구성아미노산과 같다. 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
Figure PCTKR2018012753-appb-T000004
구성 아미노산 분석을 3가지 시료인 비교군 1, 시험군 1 및 시험군 5를 사용하여 진행한 결과 시험군 1에서 가장 높게 나타났으며, 유리아미노산의 경우에는 시험군 5가 가장 높게 나타났다. 또한, 목표였던 필수 아미노산의 경우에는 전체적으로 증가를 하였으며, 그 중 히스티딘, 발린, 이소류신, 류신, 리신이 증가하였다. 이는 체내에서 유익한 활성을 나타내는 아미노산 (류신, 이소류신, 발린 등) 들로 근력향상 아미노산은 무리한 운동으로 인한 근육 손상을 막아주고 근육세포를 활성화시켜 근력 향상에 도움을 주며, 이소류신, 글루타민 등은 체지방 분해를 도와주기 때문에 운동하기 전 아미노산을 섭취 후 운동을 하면 더 큰 운동효과를 얻을 수 있습니다. 이 외에도 면역력 증강 등의 다양한 활성들을 나타낸다고 보고되어 있어 시험군 5의 갈색거저리 발효 추출물의 유리아미노산 함량은 기능성 소재로의 가능성을 확인할 수 있었다.
이상과 같이 효모를 이용한 갈색거저리 발효물 및 추출물들의 개발을 통해 얻은 산물들의 항산화 활성 및 아미노산 변화를 확인한 결과 발효시 갈색거저리를 첨가함에 따라 활성이 증가한다는 점을 확인 할 수 있었으며, 또한 발효물을 이용한 추출시 시험군 5의 갈색거저리의 발효 후 주정 가열 추출물이 가장 높은 활성을 나타냄을 확인 할 수 있었다.
유리아미노산의 함량이 높은 시험군 5의 갈색거저리의 발효 후 주정 가열 추출물이 항산화 활성에서도 가장 높은 활성을 나타내는 것을 보아 연관성이 있음을 예상할 수 있으며, 이는 피로회복 등의 좋은 소재로 활용가능하다고 판단된다.
이와 같이, 본 발명의 갈색거저리 발효 추출물은 총 폴리페놀, 플라보노이드, 탄닌 및 필수구성 아미노산 함량이 증가 및 변화되고, 갈색거저리 유충 이용 효모단백질이 생성되며, 항산화 활성이 증대되는 효과가 있다. 따라서, 본 발명에 따른 갈색거저리 발효 추출물을 포함하는 항산화용 조성물로서 이용될 수 있다.

Claims (4)

  1. 갈색거저리 유충을 유기용매로 추출하여 갈색거저리 유충에 함유된 유지 및 지방 성분을 제거한 다음 동결건조하고, 효모 균주를 이용하여 발효시키고 물 또는 유기용매를 이용하여 추출하여 수득된 것을 특징으로 하는 총 폴리페놀, 플라보노이드, 탄닌 및 필수구성 아미노산 함량이 증대된 갈색거저리 발효 추출물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 효모 균주가 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주인 것을 특징으로 하는 갈색거저리 발효 추출물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 갈색거저리 발효 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화용 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 갈색거저리 발효 추출물이 조성물 총 중량을 기준으로 하여 0.005 내지 50 중량%의 양으로 포함된 것을 특징으로 하는 항산화용 조성물.
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